Оценка устойчивости цыплят к колибактериозу по микробиологическим и биохимическим показателям

Малинин, Михаил Леонидович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка устойчивости цыплят к колибактериозу по микробиологическим и биохимическим показателям
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оценка устойчивости цыплят к колибактериозу по микробиологическим и биохимическим показателям"

На правах рукописи

003467713

Малинин Михаил Леонидович

ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ ЦЫПЛЯТ К КОЛИБАКТЕРИОЗУ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ И БИОХИМИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ

03.00.07 - микробиология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 з АПР а*3

Саратов - 2009

003467713

Работа выполнена в государственном научном учреждении Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные руководители: доктор ветеринарных наук

Ласкавый Владислав Николаевич,

доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Васильев Дмитрий Аркадьевич, кандидат биологических наук, доцент Мельников Геннадий Васильевич

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская

государственная академия ветеринарной медицины»

Защита состоится «14» мая 2009 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04. при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат диссертации разослан «. 2009 г. и

размещен на сайте www.sgau.ru. /

Отзыв на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

Карпунина Л.В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Колибактериоз наносит значительный экономический ущерб птицеводству (Бессарабов, 2008; Akashi, 1993). Колибактериоз встречается у многих видов сельскохозяйственных животных. Заболевание может протекать в острой, подострой и хронической форме, и часто вызывается токсигенными штаммами Escherichia coli. У птиц, в отличие от млекопитающих, колибактериоз представляет собой типичную секундарную инфекцию и протекает как конечная стадия развития других инфекционных заболеваний (Голубева, 1985).

Вирулентность штаммов Е. coli для птиц значительно варьирует при параллельном заражении возбудителями других болезней, такими как вирус инфекционного бурсита, микоплазмы; необходимая для развития колибактериоза заражающая доза в этом случае снижается в 1000 и более раз. Чаще других вызывают колибактериоз у птиц штаммы К coli, принадлежащие к серовариантам Ol, 02, 035, 078, Ol 11. В то же время, более 58% эпизоотических штаммов не типируется коммерческими коли-сыворотками отечественного производства (Виноходов, 2003). Большинство современных вакцин против колибактериоза, выпускаемых медико-биологической промышленностью, являются инактиви-рованными. Имеется много сообщений об успешном приготовлении и применении инактивированных вакцин против колибактериоза птиц из серотипов Е. coli 02 и 078 (Агр, 1989; Виноходов, 2003; Орехов, 2008). Есть сообщения о применении живых вакцин на основе штамма Е. coli Б-5 для профилактики колибактериоза телят и поросят (Ласкавый и др., 2005, 2007). Вышеизложенное определяет актуальность исследования биологических характеристик штаммов Е. coli, как вызывающих колибактериоз у цыплят производственно значимых кроссов, так и способных формировать протективный иммунитет.

В возникновении, развитии и исходе заболевания колибактериозом резистентность организма играет важнейшую роль (Гуткин, 1984). В этой связи изучение реактивности организма птиц приобретает актуальность для понимания патогенеза заболевания и механизмов формирования к нему эффективного иммунитета. Для адекватной оценки физиологического состояния организма интактных и зараженных цыплят необходима разработка методических подходов к определению наиболее информативных биохимических показателей крови, отражающих метаболические изменения в организме.

Цель работы состояла в сравнительном анализе свойств вирулентных штаммов Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078), Е. coli №1'и оценке механизмов формирования устойчивости к ним в организме цыплят при введении бактерий штамма Е. coli Б-5.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ морфологических, культуральных, биохимических и серологических свойств вирулентных штаммов Е. coli № 388 (02), Е. coli №389 (078), Е. coli №1, их антигенного сходства и способности продуцировать токсины.

2. Определить наиболее оптимальный возраст цыплят для проведения иммунизации против колибактериоза с учетом особенностей метаболических процессов в организме цыплят.

3. Проанализировать бактерицидную активность и токсиннейтрализую-щую способность сыворотки крови цыплят яйценоского кросса «Родонит-2», иммунизированных штаммом Е. coli Б-5.

4. Оценить способность сыворотки крови цыплят, иммунизированных штаммом Е. coli Б-5, образовывать in vitro иммунокомплексы с антигенами различных вирулентных культур эшерихий.

5. Изучить метаболические изменения в организме иммунизированных цыплят при заражении различными вирулентными культурами Е. coli и отобрать наиболее информативные показатели, характеризующие устойчивость цыплят к колибактериозу.

Научная новизна. Выявлено, что различия изученных вирулентных для птиц штаммов Е. coli связаны не только с их липополисахаридом и мембранными белками, но и со способностью продуцировать токсины. Впервые показано влияние иммунизации цыплят бактериями штамма Е. coli Б-5 на способность их сыворотки крови нейтрализовывать токсический материал вирулентных штаммов различных серогрупп Е. coli и образовывать in vitro иммунные комплексы с антигенами этих штаммов. Проведено комплексное исследование метаболических и иммунологических процессов в организме цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» при формировании устойчивости к колибактериозу. Обоснован оптимальный возраст цыплят кросса «Родонит-2» для проведения иммунизации против колибактериоза по широкому спектру биохимических, гематологических и иммунологических показателей. Проведен сравнительный анализ метаболических изменений по показателям белкового, углеводного и липидно-го обменов в организме цыплят, иммунизированных и инфицированных вирулентными штаммами Е. coli. Показано снижение значений индекса ферменте-мии у интактных цыплят и его дозозависимое увеличение у иммунизированных после заражения смесью вирулентных штаммов.

Практическая значимость работы. Полученные данные обосновывают возможность использования бактерий авирулентного штамма £ coli Б-5 для иммунизации цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» с целью создания эффективного антитоксического иммунитета против колибактериоза. Доказано положительное влияние иммунизации на основные производственные показатели у птиц (среднесуточные привесы). Отобран комплекс наиболее информативных микробиологических и биохимических показателей, свидетельствующих о формировании иммунитета против колибактериоза цыплят, который может быть рекомендован к использованию в промышленном птицеводстве.

Материалы диссертации используются в научно-практической работе ГНУ Саратовская НИВС Россельхозакадемии и при чтении лекций на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».

Основные положения, выносимые на защиту

1. При введении бактерий штамма Е. coli Б-5 у цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» формируется эффективный антитоксический иммунитет к изученным вирулентным штаммам Е. coli №388 (02), Е. coli №388 (078), Е. coli №1. Иммунизация цыплят наиболее эффективна в возрасте 22 дня.

2. Устойчивость организма цыплят яйценоского кросса «Родонит-2», иммунизированных бактериями штамма E.coli Б-5, связана со способностью сыворотки крови нейтрализовывать токсический материал вирулентных штаммов различных серогрупп Е. coli и образовывать in vitro иммунные комплексы с различными антигенами этих штаммов.

3. Определение индекса ферментемии, отражающего взаимосвязь ферментов аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, креатинкиназы, лактатдегидрогеназы и отношение активности катаболических процессов центральной зоны к анаболическим процессам периферической зоны метаболизма, позволяет судить о метаболических изменениях в организме иммунизированных и инфицированных Е. coli цыплят.

Работа выполнена в ГНУ Саратовская научно-исследовательская ветеринарная станция Россельхозакадемии в период с 2003 по 2008 годы в рамках научно-исследовательской темы: «Изучение основных закономерностей взаимодействия организма животных и микроорганизмов, обеспечивающие между ними стойкое биологическое равновесие» программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ: «Разработка молекулярно-биологических основ совершенствования и создания новых высокоэффективных и экологически безопасных методов, средств, технологий и систем диагностики, профилактики и терапии болезней животных, обеспечивающих устойчивое ветеринарное благополучие и получение продукции животноводства высокого санитарного качества».

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Российской конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях» (Краснодар, 2006); VII Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2007); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК»» (Новочеркасск, 2008); Четвертой Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка использованных литературных источников и приложений. Материалы диссертации изложены на 156 страницах, иллюстри-

рованы 35 таблицами и 11 рисунками. Список литературных источников содержит 238 наименований, в том числе 138 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Материалы и методы

В экспериментах было использовано 300 цыплят, в том числе цыплят-бройлеров кросса ROSS-308 - 100 голов и цыплят яйценоского кросса «Родо-нит-2» - 200 голов.

Исследовали штаммы Е. coli Б-5 (из музея культур Саратовской научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН), К coli №388 (02) и Е. coli № 389 (078) (получены из Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной медицины), а также полевой изолят Е. coli №1, выделенный из костного мозга павшего цыпленка с признаками колибактериоза.

Микробиологические исследования включали изучение основных морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических характеристик с использованием общепринятых методов (Колычев, Госманов, 2006), антигенного сходства штаммов методами обратной радиальной иммунодиффузии (Фри-мель, 1987) и твердофазного иммунодота с антителами, меченными коллоидным золотом (Дыкман, 2008), изучение токсинообразования.

Цыплятам кросса «Родонит-2» в возрасте 14 и 22 дня вводили однократно перорально бактерии штамма Е. coli Б-5 в дозе 1 млн. м.к. (группа А - в 14 дней), а также 0,5; 1; 2 и 1000 млн. м.к. (соответственно группы 1, 2,3 и 4 - в 22 дня), Интакгные и иммунизированные цыплята были подвергнуты экспериментальному заражению вирулентными для птиц штаммами Е. coli №1, Е. coli №388 (02) и Е. coli № 389 (078).

Кровь у цыплят брали пунктированием подкрыловой вены. Сыворотку крови получали по общепринятой методике. Иммунологические исследования включали определение параметров фагоцитоза (Рудик, Тихомирова, 2006), бактерицидной активности сыворотки крови, образования иммунокомплексов in vitro (Hashkova, 1978), наличия в крови специфических антител, нейтрализующих ТСМ указанных выше штаммов Е. coli.

Биохимические исследования сывороток крови цыплят проводили на полуавтоматическом биохимическом анализаторе BS 3000 Р. Концентрацию общего белка, альбуминов, глобулинов, мочевины, креатинина, мочевой кислоты, глюкозы, общего холестерина и его фракций, триглицеридов, индекс атероген-ности, активность ферментов аланинаминотрансферазы (AJIT), аспартатами-нотрансферазы (ACT), креатинкиназы (КК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), у-глутамилтрансферазы (ГТТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), кислой фосфатазы (КФ), а-амилазы, липазы, а также содержание кальция и железа определяли по общепринятым методикам (Камышников, 2000). Выбор биохимических параметров определялся необходимостью отражения метаболических изменений по основным видам обмена.

Липополисахарид (ЛПС) выделяли методом водно-фенольной экстракции (Westphal, 1965). Наличие токсинсодержащего материала (ТСМ) в культураль-

ных жидкостях определяли на перитонсальных клетках мыши (ПКМ) с помощью НСТ-теста (Маянский, 1979)

Гематологические исследования проводили на фотометре КФК-3 и микроскопе БИМАМ Р-14. Концентрацию гемоглобина определяли унифицированным гемиглобинцианидным методом, количество эритроцитов и лейкоцитов -методом подсчета клеток в определенном количестве квадратов счетной сетки Горяева (Козинец, 1997). Анализ лейкоформулы проводили по общепринятой методике (Ромейс, 1954). Количество тромбоцитов определяли в мазке периферической крови (Фонио, 1959).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятым методикам (Ашмарин и др., 1962; Лакин, 1990). Расчётные величины определяли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 (for Windows; «Stat Soft Inc.», США), Statgraph (Version 2.6; Coulter), Microsoft Excel 2003 (for Windows XP).

Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств штаммов Е. coli №1, Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078) и их токсинпродуцирующей способности

На первом этапе работы были изучены основные характеристики исследуемых штаммов Е. coli. Бактерии вирулентных штаммов Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078), Е. coli №1 и авирулентного для птиц штамма Е. coli Б-5 соответствовали свойствам типового вида и представляли собой грациликутные палочки. При росте на МПБ культуры образовывали равномерное помутнение среды с образованием незначительного, легко разбивающегося при встряхивании осадка. На среде Эндо культуры Е. coli давали колонии малиново-красного цвета, с металлическим блеском, на среде Левина - колонии темно-фиолетового цвета.

Все культуры Е. coli сбраживали лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу, ара-бинозу, не сбраживали инозит, не усваивали цитрат натрия, не разжижали желатину, выделяли индол, не восстанавливали серу до сероводорода, восстанавливали нитраты в нитриты, не обладали фенилаланиндезаминазной и цитохро-моксидазной активностью.

Для изучения формирования у иммунизированных клетками штамма Е. coli Б-5 цыплят кросс-иммунитета к поверхностным антигенам изученных в работе вирулентных штаммов использовали тест обратной радиальной имму-нодиффузии. Результаты теста показали, что для штамма Е. coli №1 квадрат радиуса зоны преципитации находился в линейной зависимости как от дозы иммунизации, так и от кратности разведения сывороток крови. Это свидетельствует о том, что антитела к штамму Е. coli Б-5 образовывали иммунокомплек-сы in vitro не только с антигенами этого штамма, но и штамма Е. coli №1. В то же время для штаммов Е. coli №388 (02) и №389 (078) не было обнаружено зависимости размера зоны преципитации ни от дозы предшествующей иммунизации цыплят, ни от кратности разведения сыворотки крови.

Использовали также метод твердофазного иммунодота с антителами, меченными коллоидным золотом. На мембране PVDF адсорбировались антигены - ЛПС и внешняя мембрана указанных штаммов (исходная концентрация 2 и 4 мг/мл соответственно) - в титре от 1/1 до 1/512. Положительным контролем служили ЛПС и внешняя мембрана клеток штамма Е. coli Б-5, отрицательным контролем - ЛПС и внешняя мембрана бактерий Pseudomonas aeruginosa (Ra-wadi, 1996). Установлено, что сыворотки крови цыплят, иммунизированных бактериями штамма Е. coli Б-5, не содержали антител к ЛПС штаммов Е. coli №1, №388 (02) и №389 (078), но имели антитела к ЛПС штамма Е. coli Б-5. Это указывает на то, что бактерицидные свойства сыворотки крови иммунизированных цыплят не были связаны с выработкой специфичных антител к ЛПС вирулентных штаммов. В иммунодоте с внешней мембраной штаммов Е. coli Б-5 и Е. coli №1 было показано образование комплексов антиген-антитело. При этом для штамма Е. coli Б-5 титр сыворотки крови составил 1/512, а для штамма Е. coli №1 - 1/32. С внешней мембраной штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078) комплексы антиген-антитело не образовывались. Это свидетельствовало о том, что во внешней мембране клеток штамма Е. coli №1, в отличие от штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078), есть структуры, взаимодействующие с антителами сыворотки крови цыплят, иммунизированных бактериями штамма Е. coli Б-5.

Была проведена серия экспериментов по получению токсинсодержащего материала (ТСМ) из культуральных жидкостей штаммов Е. coli №1, Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078). Токсичность проб определяли по изменению дыхания ПКМ (Mosmann, 1983). Результаты свидетельствовали о том, что ТСМ, угнетающие дыхание перитонеальных клеток мыши, присутствуют в культуральных жидкостях всех исследованных штаммов Е. coli (рис. 1).

штаммы £?. со//

Ns38S<02) Nä3S9<07S)

оразность"токсин-кантроль" для культур с токсинами ■ разность"токсин~контроль" для смесей токсии+сыворотка

Рис. 1. Разность «токсин-контроль» (мкг формазана на 106 ПКМ) для взвеси ПКМ с ТСМ вирулентных штаммов и сывороткой крови цыплят, иммунизированных Е. coli Б-5 в дозе 1 млрд. м.к.

Определяли наличие в сыворотке крови цыплят специфических антител, нейтрализующих токсины указанных штаммов (рис. 1). Сыворотка крови им-

мунизированных цыплят кросса «Родонит-2» содержала антитела, в полной мере нейтрализующие термолабильный токсин штамма Е. coli Б-5 и на 60% -ТСМ штамма £. coli №1. ТСМ штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078) нейтрализовывались сывороткой крови иммунизированных цыплят на 22% и 24% соответственно. Мы предположили, что токсиннейтрализующая активность сыворотки крови зависит от термолабильности ТСМ. Поэтому ТСМ всех исследуемых штаммов были проанализированы на наличие термолабильного токсина, аналогичного токсину штамма Е. coli Б-5, по изменению способности тромбоцитов к агрегации. Средний радиус агрегатов в обогащенной тромбоцитами плазме крови при добавлении нативной культуральной жидкости штамма Е. coli №1 увеличивался на 40% по сравнению с действием прогретой культуральной жидкости, что свидетельствовало о термолабильности токсина. В то же время, радиус частиц в обогащенной тромбоцитами плазме крови при добавлении нативной культуральной жидкости штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078) достоверно не изменялся по сравнению с действием культуральной жидкости, прогретой при 56°С. Это указывало на отсутствие в культуральной жидкости данных штаммов термолабильного токсина.

Метаболические особенности цыплят разных кроссов

Показано отсутствие достоверных возрастных изменений у интактных цыплят кросса «Родонит-2» в возрасте 14-64 дней для большинства изученных биохимических показателей (табл. 1).

Полученные данные указывали на стабильность обмена веществ цыплят этого кросса.

Для более точной оценки состояния метаболизма в целом нами предложено определение индекса ферментемии, увязывающего активность ферментов ACT, АЛТ, КК и ДЦГ. ACT и КК отражают активность катаболических процессов, т.е. статус, главным образом, центральной зоны метаболизма, связанной с реакциями цикла Кребса, а АЛТ и ЛДГ - активность периферической зоны метаболизма, включающей реакции гликолиза, цикла аланина, цикла Кори и др. Индекс ферментемии (ИФ) представляет собой безразмерную величину и определяется по формуле:

ИФ = [АСТ]/[АЛТ] + [АСТМЛДГ] + [КК]/[ЛДГ]

Чем выше значение ИФ, тем выше относительная активность катаболических процессов центральной зоны метаболизма. Изменение индекса ферментемии может быть более достоверным свидетельством системных нарушений обмена веществ, чем дрейф активности отдельных индикаторных ферментов.

Определение этого индекса позволило выявить глубокие метаболические различия у цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» и цыплят-бройлеров кросса «ROSS-308»: у первых индекс ферментемии сохранял стабильность в течение первых двух месяцев жизни, у вторых достоверно снижался с возрастом.

Таблица 1

Биохимические показатели сыворотки крови интактных цыплят кросса __ «Родонит-2» в зависимости от возраста____

\Возраст Параметрь1\ 14 22 29 35 57 64 88 105 112

АЛТ 0,23 ±0,02 0,24 ±0,02 0,22 ±0,02 0,29 ±0,02 0,26 ±0,02 0,22 ±0,02 0,24 ±0,02 0,24 ±0,02 0,22 ±0,02

ACT 2,89 ±0,3 2,81 ±0,2 2,48 ±0,2 2,93 ±0,3 2,73 ±0,2 2,43 ±0,2 3,33 ±0,3 2,55 ±0,2 3,23 ±0,3

Коэффициент де Ритиса 12,56 ±1,0 11,71 ±1,1 11,27 ±1,0 10,10 ±1,0 10,50 ±0,9 11,04 ±1,0 13,88 ±1,2 10,62 ±1,0 14,68 ±1,3

КК 23,08 ±2,1 24,54 ±2,4 23,99 ±2,3 25,88 ±2,4 25,20 ±2,4 23,82 ±2,2 22,67 ±2,1 15,07 ±1,5 14,86 ±1,4

лдг 10,34 ±1,0 12,69 ±1,1 12,52 ±1,2 14,28 ±1,3 13,76 ±1,0 11,73 ±1,1 7,76 ±0,8 8,02 ±0,8 11,19 ±1,1

Индекс ферментемии 15,08 ±1,1 13,86 ±1,2 13,39 ±1,1 12,12 ±1,1 12,53 ±1,1 13,28 ±1,2 17,23 ±1,5 12,82 ±1,3 16,30 ±1,3

Общий белок 31,30 ±2,0 34,75 ±2,5 36,80 ±3,3 36,40 ±3,3 36,24 ±3,5 35,78 ±3,3 32,60 ±2,9 33,77 ±3,0 34,76 ±3,3

Глюкоза 12,5 ±1,1 12,4 ±1,0 13,35 ±1,1 11,40 ±1,0 11,80 ±1,0 12,68 ±1,1 10,60 ±1,0 11,07 ±1,1 10,76 ±1,0

Общий холестерин 2,60 ±0.2 4,40 ±0.3 4,40 ±0,2 2,70 ±0,2 3,20 ±0,2 3,43 ±0,3 2,50 ±0,2 1,58 ±0,05 1,62 ±0,1

Хс-ЛПВП 1,97 ±0,2 3,05 ±0,3 3,54 ±0,3 2,01 ±0,2 1,95 ±0,2 2,08 ±0,2 1,80 ±0,1 1,17 ±0,1 1,21 ±0,1

Хс-ЛПНП 0,13 ±0,05 0,76 ±0,05 0,29 ±0,05 0,24 ±0,05 0,52 ±0,05 0,85 ±0,05 0,16 ±0,05 0,15 ±0,05 0

Хс-ЛПОНП 0,50 ±0,05 0,59 ±0,05 0,57 ±0,05 0,45 ±0,05 0,73 ±0,1 0,50 ±0,05 0,54 ±0,05 0,26 ±0,01 0,63 ±0,05

Индекс атерогенности 0,32 ±0,05 0,44 ±0,05 0,24 ±0,05 0,34 ±0,05 0,64 ±0,05 0,65 ±0,05 0,39 ±0,05 0,35 ±0,05 0,34 ±0,05

Триглицериды 1,10 ±0,1 1,30 ±0,1 1,25 ±0,1 1,00 ±0,1 1,60 ±0,1 1,10 ±0,1 1,20 ±0,1 0,58 ±0,05 1,38 ±0,1

Оценка эффективности иммунизации цыплят кросса «Родонит-2» бактериями Е. coli Б-5 Изучение гемограммы трехнедельных цыплят кросса «Родонит-2» выявило наибольшее содержание фагоцитов - гетерофилов и моноцитов (рис. 2), что позволило предположить наибольшую фагоцитарную активность крови в этом возрасте. Это послужило основанием для последующего сравнительного изучения динамики формирования клеточного и гуморального иммунитета против колибактериоза при введении цыплятам в возрасте 14 или 22 дней бактерий штамма Е. coli Б-5. Анализ полученных данных показал, что динамика индекса бактерицидности и фагоцитарного индекса у контрольных цыплят и у цыплят, иммунизированных в различном возрасте, практически совпадала.

Индекс, бактерицидности через 3-4 недели после иммунизации незначительно возрастал, а фагоцитарный индекс снижался в контрольной и опытных

группах на 33-36%. Это подтверждало вывод о возрастном характере изменений фагоцитарного индекса и индекса бактерицидное™ крови цыплят кросса «Родонит-2». Отмечено, что фагоцитарный индекс был тем выше, чем больше было в крови содержание гетерофилов и меньше - моноцитов.

Рис. 2. Соотношение количества гетерофилов (Г) и моноцитов (М) в крови цыплят разного возраста, иммунизированных против колибактериоза

В отношении бактерий штамма Е. coli №1 бактерицидная активность сыворотки крови иммунизированных в возрасте 14 дней цыплят была выше, чем в отношении клеток штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078), но ниже, чем против клеток штамма Е. coli Б-5, для которого титр бактерицидных антител оказался равен 1/8.

При дозе иммунизации 0,5 млн. м.к. титр бактерицидных антител достоверно не изменялся (рис. 3).

0 12 3 4

время, недели

I —♦—0.5 ~-Я~1 Z —1000

Рис. 3. Динамика титров бактерицидных антител к штамму Е. coli Б-5 в сыворотке крови цыплят кросса «Родонит-2», иммунизированных против колибактериоза в возрасте 22 дня

С увеличением дозы иммунизации возрастали и значения титров бактерицидных антител: в 4 раза при иммунизации дозой 1 млн. м.к. (группа 2), в 6

раз - дозой 2 млн. м.к. (группа 3), в 18 раз - дозой 1 млрд. м.к. (группа 4). У цыплят экспериментальных групп титры бактерицидных антител через 4 недели после иммунизации возвращались к исходным значениям. Таким образом, динамика параметров фагоцитоза и дозозависимого роста титров бактерицидных антител сыворотки крови свидетельствовала о более эффективной иммунизации цыплят кросса «Родонит-2» бактериями штамма Е. coli Б-5 в возрасте 22 дня, чем в 14 дней.

Результаты исследований позволили также установить зависимость титра бактерицидных антител от дозы иммунизации: показан рост значений титра антител к клеткам всех вирулентных штаммов, использованных в работе (табл. 2).

Доля погибших микробных клеток разных штаммов Е. coli после инкубации с крови, полученной через 3 недели после иммунизации цыплят кросса «Родонит-

Таблица 2 сывороткой •2» в возрасте

Разведения ^\СЫВОрОТКИ ^^крови Группы ЦЫПЛЯТ^\ 1/8 1/32 1/128 1/512 1/2048

штамм Е. coli №388 (02)

1 15% 10% 0% 0% 0%

2 19% 18% 0% 0% 0%

3 21% 20% 1% 0% 0%

4 25% 24% 10% 5% 0%

штамм £ coli №389 (078)

1 6% 3% 0% 0% 0%

2 8% 5% 3% 0% 0%

3 12% 9% 6% 1% 0%

4 19% 12% 10% 3% 0%

штамм Е, coli Xsl

1 20% 13% 9% 3% 0%

2 25% 17% 12% 5% 0%

3 30% 21% 18% 8% 0%

4 34% 27% 22% 12% 0%

При этом наибольшая бактерицидная активность сыворотки крови иммунизированных цыплят отмечена к клеткам штамма Е. coli №1, наименьшая - к клеткам штамма Е. coli №389 (078). Значения титров бактерицидных антител к вирулентным штаммам кишечной палочки в крови иммунизированных цыплят оказались ниже, чем к штамму Е. coli Б-5, в отношении которого отмечался до-зозависимыЙ эффект (рис. 4). Титр бактерицидных антител менялся от 1/16 при дозе 0,5 млн. м.к. до 1/112 при дозе 1 млрд. м.к.

Далее исследовали эффективность и длительность гуморального иммунитета против колибактериоза у иммунизированных цыплят кросса «Родонит-2». Было проведено их экспериментальное заражение в возрасте 6 недель вирулентными штаммами Е. coli №1, £ coli №388 (02) и Е coli №389 (078). Через

две недели после заражения в сыворотке крови цыплят определяли величину титров бактерицидных антител ко всем использованным штаммам.

Установлено, что у цыплят, иммунизированных в дозе 1 млрд. м.к. и затем зараженных смесью вирулентных штаммов, титр бактерицидных антител к штамму Е. coli Б-5 составил 1/4, к штамму Е. coli №1 - 1/25, к штамму Е. coli №388 (02) - 1/4, к штамму Е. coli №389 (078) - менее 1/4. Иммуногенность штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078) слабо зависела от предварительной иммунизации бактериями штамма £ coli Б-5.

—1-Я Н*Д«ЛЯ .....2-я нфдфля

—*—3-ян*д*ля 4-я м*д»ля

-......— ЛОГ»рифМИЧФСК*Я11«Я Н*Д*ЛЯ) — Л о гари фмич*ская (2- п и «д«л я)

——'Лог»рифмичвская(Э-я м»д*ля) ——~ Л мм«йиая {4-я м*д*ля)

Рис. 4. Зависимость значений титра бактерицидных антител в сыворотке крови цыплят кросса «Родонит-2» от дозы иммунизации бактериями штамма Е. coli Б-5

Для проверки предположения о том, что иммунизация цыплят штаммом Е. coli Б-5 создает не столько антибактериальную, сколько антитоксическую защиту, было предпринято определение в сыворотке крови иммунизированных и зараженных через 3 недели смесью вирулентных штаммов Е. coli цыплят, концентрации и титра образующихся in vitro иммунокомплексов (ИК) к токсинам и к липопротеинам указанных штаммов. Результаты представлены в таблице 3. В сыворотке крови цыплят 1-й группы образование ИК с ТСМ штамма Е. coli Б-5 отмечено при кратности разведения сыворотки крови 1/4; с ТСМ штаммов Е. coli №1 и Е. coli №388 (02) - 1/16,-а с ТСМ штамма Е. coli №389 (078) - 1/64. У иммунизированных цыплят групп 2, 3, 4 максимальная кратность разведения сыворотки крови, при которой образовывались ИК in vitro с ТСМ всех изученных штаммов, составляла 1/64 (табл. 3).

Параллельно в этих же сыворотках крови были определены титры бактерицидных антител к Е. coli. Установлено, что у цыплят 1 группы титр бактерицидных антител к Е. coli Б-5 превышал титры к вирулентным штаммам Е. coli в 2 раза; у цыплят 2 группы - в 3,5 раза, 3 группы - в 5 раз, а у 4 группы - в 14 раз. Полученные результаты указывают на низкие значения титров бактери-

цидных антител к вирулентным штаммам Е. coli в отличие от высоких значений титров сыворотки, при которых образовывались ИК.

Таблица 3

Концентрация ИК к ТСМ штаммов Е. coli в сыворотке крови цыплят, иммунизированных _клетками штамма Е. coli Б-5 в возрасте 22 дня, мг/мл_

Штаммы Е. coli Группь1\_ цыплят Б-5 №1 №388 (02) №389 (078)

1 18,48(1/4)* 16,22(1/16) 17,10(1/16) 12,34(1/64)

2 13,78 (1/64) 11,12(1/64) 13,22 (1/64) 9,14(1/64)

3 10,22(1/64) 9,24(1/64) 10,86(1/64) 8,38(1/64)

4 20,90 (1/64) 19,18(1/64) 17,74(1/64) 16,40(1/64)

Примечание: в скобках указан титр иммунокомплексов — максимальная кратность разведения сыворотки крови, при которой концентрация иммунокомплексов in vitro составляет не менее 0,01 мг/мл.

Это подтверждало наше предположение о формировании в организме иммунизированных против колибактериоза цыплят преимущественно антитоксической защиты.

Биохимические показатели крови у зараженных и иммунизированных против колибактериоза цыплят

При экспериментальном заражении цыплят смесью штаммов Е. coli №1, Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078) активность ACT повышалась (р<0,05), что указывало на более интенсивное поступление субстратов в цикл трикарбоновых кислот и активизацию катаболического звена обмена веществ. Активность АЛТ достоверно не изменялась в результате заражения. В то же время концентрация глюкозы повышалась (р<0,05) и в сыворотке крови цыплят, зараженных смесью штаммов, была наибольшей, а активность щелочной фосфатазы и липазы -наименьшей (р<0,05) по сравнению с другими группами инфицированных цыплят. Активность ЛДГ у инфицированных цыплят повышалась в 5 раз (р<0,01), что указывает на понижение pH за счет увеличения образования лактата и возможность возникновения анаэробного токсикоза.

Изучение динамики биохимических параметров у иммунизированных цыплят после заражения вирулентными штаммами Е. coli показало, что активность КК и ACT в сыворотке крови цыплят 1 группы (доза иммунизации 0,5 млн. м.к.) была наибольшей и превышала 130 и 15 мккат/л, соответственно. Это указывало на то, что в организме данных цыплят была наиболее активна центральная зона метаболизма.

У этих же цыплят была отмечена ферментемия по АЛТ, достигавшая 1,7 мккат/л, что отражало высокую активность глюкозоаланинового шунта. Активность ЛДГ также была наибольшей в этой группе, превышая 100 мккат/л. Очень высокие значения ACT и ЛДГ и довольно высокая активность АЛТ свидетельствуют о сдвиге равновесия в обратимой реакции окисления лактата до пирувата вправо. Это понижает pH крови, что в свою очередь сдвигает вправо

равновесие в реакции: креатин + АТФ -+ креатинфосфат + АДФ. Таким образом, в организме цыплят этой группы энергетическое обеспечение внутриклеточных процессов происходит за счет, прежде всего, аэробных процессов катаболизма. У цыплят 2 группы были отмечены сходные тенденции, но выражены они были слабее, чем у цыплят 1 группы.

Сыворотки крови цыплят 4 группы характеризовались высокими значениями коэффициента де Ритиса, а также сравнительно низкой концентрацией общего белка, низкой активностью ГГТ, высокой активностью КК. Гиперфер-ментемия по ACT в сочетании с гипоферментемией по AJ1T указывает на торможение периферических путей обмена с одновременной стимуляцией центральной зоны метаболизма; интенсивность белкового обмена при этом может быть понижена. Высокая активность КК сопряжена с интенсификацией катаболизма углеводов, а через него - с поддержанием энергетического статуса организма. У цыплят 4 группы можно предполагать глубокие метаболические изменения: повышенный коэффициент де Ритиса на фоне высокой активности КК и низкой концентрации общего белка свидетельствует о выраженном торможении белкового обмена. В организме цыплят 3 группы отмечались похожие тенденции, но выражены они были слабее, чем у цыплят 4 группы.

Через 2 недели после заражения не иммунизированных цыплят смесью вирулентных штаммов Е. coli индекс ферментемии уменьшался по сравнению с интактными цыплятами в 4,9 раза; у цыплят, иммунизированных в возрасте 14 дней - в 1,5 раза (рис. 5). При иммунизации цыплят в возрасте 22 дня значения ИФ изменялись дозозависимо: при введении доз 1 млн. и 1 млрд. м.к. достоверных отличий по сравнению с контролем не выявлено, при дозе 2 млн. м.к. ИФ возрастал в 1,4 раза(р<0,05), а при дозе 0,5 млн. м.к.-в 1,8 раза (р<0,01).

Индекс ферментемии

К г к tliip А X Z>. 3 4

1>уппы цыплят

Рис. 5. Значения индекса ферментемии в сыворотке крови иммунизированных против колибактериоза цыплят кросса «Родонит-2», спустя 2 недели после заражения их вирулентными штаммами Е. coli

У не иммунизированных цыплят метаболические изменения, наблюдавшиеся при экспериментальном заражении вирулентными штаммами Е. coli, свидетельствовали о смещении метаболизма в сторону преобладания анаболического звена.

У цыплят, иммунизированных в возрасте 14 дней, изменения метаболизма были направлены в ту же сторону, но менее выражены. У цыплят, иммунизированных в 22 дня, значения ИФ свидетельствовали либо об отсутствии достоверных метаболических изменений (группы 2 и 4), либо о смещении метаболизма в сторону преобладания катаболических реакций (группы 1 и 3).

Таким об^разом, предложенное нами определение индекса ферментемии дает возможность не только судить о метаболических изменениях в организме цыплят в результате инфицирования Е. coli, но и оценивать метаболический статус с точки зрения восприимчивости к инфекции.

Анализ изменений биохимических показателей сыворотки крови цыплят кросса «Родонит-2» при инфицировании их вирулентными штаммами кишечной палочки позволил из большого числа определенных параметров выделить наиболее информативные показатели: активность креатинкиназы, лактатдегид-рогеназы, щелочной фосфатазы, аланинамино-трансферазы, аспартатами-нотрансферазы, концентрация общего белка, глюкозы, холестерина и его фракций, триглицеридов и их фракций. Выбор этих показателей был подтвержден результатами представленных ранее биохимических исследований; их определение позволяет получить более объективное представление о состоянии обмена веществ и энергетического статуса организма цыплят.

Для уточнения влияния иммунизации на основные производственные показатели проводили сравнительный анализ динамики среднесуточных привесов у цыплят, зараженных вирулентными штаммами Е. coli после предварительной иммунизации клетками Е. coli Б-5 и без таковой. У цыплят, зараженных вирулентными штаммами, отмечены отвесы (отрицательные привесы), а у цыплят, зараженных после предварительной иммунизации, - положительные среднесуточные привесы, причем в группе 1 они были выше, чем у интактных цыплят того же возраста.

Таким образом, проведенные нами исследования показали, что при однотипности культурально-морфологических и биохимических свойств изученных вирулентных для птиц штаммов Е. coli, выявленные различия связаны не только с их липополисахаридом и мембранными белками, но и с ТСМ. Установлено, что при введении бактерий Е. coli Б-5 резистентность цыплят к колибакте-риозу была связана, преимущественно, с образованием антител к ТСМ вирулентных штаммов. Определение предложенного нами индекса ферментемии позволяет судить о метаболических изменениях в организме инфицированных цыплят и оценивать метаболический статус организма с точки зрения восприимчивости к колибактериозу.

Выводы

1. Показано, что вирулентные для птиц штаммы E.coli №388 (02) и Е.coli №389 (078) являются продуцентами термостабильного токсина, а штамм E.coli №1 - термолабильного токсина, сходного по свойствам с термолабильным токсином штамма E.coli Б-5.

2. Отмечено отсутствие достоверных изменений концентрации общего белка и глюкозы, а также активности ключевых ферментов крови интактных цыплят кросса «Родонит-2» в возрастной период с 14 до 64 дней. У цыплят-бройлеров кросса «ROSS-308» наблюдались значительные возрастные колебания важнейших биохимических показателей.

3. Установлен возрастной характер изменений фагоцитарного индекса крови интактных цыплят кросса «Родонит-2», значения которого коррелировали с содержанием гетерофилов в крови; величина индекса бактерицидности в большей степени была связана с числом моноцитов.

4. Изменения фагоцитарного индекса и индекса бактерицидности у иммунизированных цыплят не зависели от возраста иммунизации. Наибольшая бактерицидная активность сыворотки крови иммунизированных цыплят отмечена в отношении Е. coli №1, наименьшая - Е. coli №389 (078).

5. Сыворотка крови иммунизированных цыплят содержала антитела, нейтрализующие термолабильный токсин штамма Е. coli Б-5 на 100% и ТСМ штамма Е. coli №1 на 60%, а также антитела к ЛПС штамма Е. coli Б-5, но не имела антител к ЛПС штаммов Е. coli №1, Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078). ИК образовывались in vitro только с ТСМ исследованных вирулентных штаммов Е. coli.

6. Показано снижение значений индекса ферментемии у интактных цыплят в 4,9 раза (Р<0,01) Е. coli и его дозозависимое увеличение (Р<0,05) у иммунизированных после заражения смесью вирулентных штаммов. Наибольшее клинико-диагностическое значение принадлежало таким тестам, как: определение ТСМ в культуральной жидкости, определение термолабильности ТСМ, активности креатинкиназы, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, аланина-минотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, концентрации общего белка, глюкозы, холестерина и его фракций, триглицеридов и их фракций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Малинин, МЛ. Изменения лейкоцитарной формулы цыплят при инфицировании эшерихиями / М.Л. Малинин, В.М. Стремоусов, В.Н. Ласкавый // Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях: сб. материалов юбил. конф. - Краснодар, 2006. - С. 182 - 184.

2. Малинин, М.Л. Биохимические показатели крови интактных и инфицированных цыплят / М.Л. Малинин // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: материалы Междунар. научно-практ. конф. -Щелково, 2007. - С. 255 - 259.

3. Малинин, М.Л. Биохимические показатели сыворотки крови цыплят, инфицированных эшерихиями / М.Л. Малинин // Материалы IV Междунар. конф., посвящ. 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ им. Пастера и 120-летию Парижского института Пастера. - СПб, 2008. - С. 130.

4. Малинин, М.Л. Биохимические и гематологические показатели у цыплят кросса «Родонит-2» в норме и при инфицировании эшерихиями /

M.J1. Малинин // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова.-2008.-№3.-С. 34-38.

5. Малинин, М.Л. Использование стандартного метода определения общего белка при исследовании сыворотки крови животных / М.Л. Малинин // Успехи современного естествознания. - 2008. - №3. - С. 105 - 106.

6. Малинин, М.Л. Триглицеридовый индекс как дополнительный показатель при оценке липидного профиля сыворотки крови животных / М.Л. Малинин // Успехи современного естествознания. - 2008. - №3. - С. 106 - 107.

7. Малинин, М.Л. Биохимические и патологоанатомические показатели при эшерихиозе у цыплят кросса «Родонит-2» / М.Л. Малинин, В.М. Стремо-усов, И.В. Бородавкин // Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК»: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. - Новочеркасск, 2008. - С. 102 - 107

8. Малинин, М.Л. Использование агрегометра для определения бактериальных токсинов / М.Л. Малинин, Т.Н. Тарасенко Современное состояние и перспективы развития патологии, морфологии и онкологии животных: сб. материалов Всерос. науч.-практ. конф. - Новочеркасск, 2008. - С. 167 - 170.

9. Малинин, М.Л. Особенности формирования иммунитета к колибакте-риозу цыплят при введении бактерий штамма Е. coli Б-5 / М.Л. Малинин, В.Н. Ласкавый, Е.И. Тихомирова // Естественные и технические науки. - 2009. - №2. -С. 24-28.

10. Малинин, М.Л. Характеристика свойств различных вирулентных для птиц штаммов Е. coli и их способности продуцировать токсины / М.Л. Малинин, Е.И. Тихомирова, К.П. Габалов // Успехи современного естествознания. -2009.-№3.-С. 48-49.

Малинин Михаил Леонидович

ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ ЦЫПЛЯТ К КОЛИБАКТЕРИОЗУ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ И БИОХИМИЧЕСКИМ ПОКАЗАТЕЛЯМ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 1.04.09. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать офсетная. Печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 59.

Типография Издательства Саратовского университета 410012, Саратов, Астраханская, 83

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Малинин, Михаил Леонидович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Краткая характеристика возбудителей колибактериоза.

1.2. Современные представления о профилактике колибактериоза.

1.3. Свойства бактериальных токсинов эшерихий.

1.4. Клинико-диагностическое значение ферментемий.

1.5. Биохимические показатели крови у птиц.

Собственные исследования и их обсуждение.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Микробиологические методы исследования.

2.3. Иммунизация и заражение цыплят.

2.4. Методы исследования сыворотки крови цыплят.

2.5. Биохимические методы исследования.

2.6. Гематологические методы исследования.

2.7. Методы статистического анализа результатов.

Глава 3. Метаболические особенности цыплят разных кроссов.

3.1. Возрастные изменения биохимических показателей сыворотки крови интактных цыплят разных кроссов.

3.2. Изучение особенностей метаболизма цыплят разных кроссов и выявление наиболее информативных биохимических тестов.

3.3. Морфологические исследования периферической крови цыплят кросса «Родонит-2» различного возраста.

Глава 4. Оценка эффективности иммунизации цыплят кросса «Родонит-2» бактериями E.coli Б-5.

4.1. Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств штаммов Е. coli №1, Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078).

4.2. Изучение токсинпродуцирующей способности штаммов Е. coli, вызывающих колибактериоз у птиц.

4.3. Изучение антигенного сходства исследуемых штаммов Е. coli.

4.4. Оценка состояния клеточного иммунитета у цыплят кросса «Родонит-2», иммунизированных против колибактериоза.

4.5. Оценка состояния гуморального иммунитета у цыплят кросса «Родонит-2», иммунизированных против колибактериоза.

4.6. Оценка состояния гуморального иммунитета у иммунизированных против колибактериоза цыплят кросса «Родонит-2», зараженных вирулентными штаммами Е. coli.

4.7. Оценка состояния антитоксических свойств сыворотки крови иммунизированных против колибактериоза цыплят кросса «Родонит-2».

4.8. Оценка формирования иммунной памяти у иммунизированных против колибактериоза цыплят кросса «Родонит-2».

Глава 5. Биохимические показатели крови у зараженных и иммунизированных против колибактериоза цыплят.

5.1. Оценка биохимических показателей сыворотки крови цыплят кросса «Родонит-2» при формировании иммунитета к колибактериозу.

5.2. Изучение биохимических параметров сыворотки крови иммунизированных цыплят при заражении вирулентными штаммами кишечной палочки.

Глава 6. Изучение привесов и патоморфологических изменений у цыплят

При экспериментальном заражении вирулентными штаммами Е. coli.Ill

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка устойчивости цыплят к колибактериозу по микробиологическим и биохимическим показателям"

Актуальность темы. Колибактериоз встречается у многих видов сельскохозяйственных животных. Заболевание может протекать в острой, подост-рой и хронической форме и часто вызывается токсигенными штаммами Escherichia coli. Колибактериоз наносит значительный экономический ущерб птицеводству [11, 203]. У птиц, в отличие от млекопитающих, колибактериоз представляет собой типичную секундарную инфекцию, развивающуюся на фоне сниженного иммунитета, и часто протекает как конечная стадия других инфекционных заболеваний [97, 195].

Вирулентность штаммов Escherichia coli для цыплят значительно варьирует при параллельном заражении возбудителями других болезней, такими как вирус инфекционного бурсита VVIBDV, микоплазмы; необходимая для развития колибактериоза заражающая доза в этом случае может снижаться в тысячу раз и более [127, 154]. Чаще других вызывают колибактериоз у птиц штаммы Е. coli, принадлежащие к серовариантам Ol, 02, 035, 078, 0111 [11, 108]. Более 58% выделенных эпизоотических штаммов Е. coli не типируются коммерческими коли-сыворотками отечественного производства [15, 130]. Большинство современных вакцин против колибактериоза, выпускаемых медико-биологической промышленностью, являются инактивированными. Имеется много сообщений об успешном приготовлении и применении инактивирован-ных вакцин против колибактериоза птиц из серотипов Е. coli 02 и 078 [15, 71, 107]. Есть сообщения о применении живых вакцин на основе штамма Е. coli Б-5 для профилактики колибактериоза телят и поросят [74, 83, 84]. Вышеизложенное определяет актуальность исследования биологических характеристик штаммов Е. coli, как вызывающих колибактериоз у цыплят производственно значимых кроссов, так и способных формировать протективный иммунитет.

В возникновении колибактериоза, развитии и исходе заболевания резистентность организма играет важнейшую роль [19, 159]. В этой связи изучение реактивности организма птиц приобретает актуальность для понимания патогенеза заболевания и механизмов формирования к нему эффективного иммунитета [103]. Для адекватной оценки физиологического состояния организма ин-тактных, зараженных и иммунизированных цыплят необходима разработка методических подходов к определению показателей, наиболее информативно отражающих метаболические изменения в организме.

Цель работы состояла в сравнительном анализе свойств вирулентных штаммов Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078), Е. coli №1 и оценке механизмов формирования устойчивости к ним организма цыплят при введении бактерий штамма Е. coli Б-5.

Задачи исследования:

2. Определить наиболее оптимальный возраст для проведения иммунизации птиц против колибактериоза с учетом особенностей метаболических процессов в организме цыплят.

3. Проанализировать бактерицидную активность и токсиннейтрали-зующую способность сыворотки крови цыплят яйценоского кросса «Родонит-2», иммунизированных штаммом Е. coli Б-5.

4. Оценить способность сыворотки крови цыплят, иммунизированных штаммом Е. coli Б-5 образовывать in vitro иммунокомплексы с антигенами различных вирулентных культур эшерихий.

Практическая значимость работы. Полученные данные обосновывают возможность использования бактерий авирулентного штамма Е. coli Б-5 для иммунизации цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» с целью создания эффективного антитоксического иммунитета против колибактериоза. Доказано положительное влияние иммунизации на основные производственные показатели у птиц (среднесуточные привесы). Отобран комплекс наиболее информативных микробиологических и биохимических показателей, свидетельствующих о формировании иммунитета против колибактериоза цыплят, который может быть рекомендован к использованию в промышленном птицеводстве.

Материалы диссертации используются в научно-практической работе ГНУ Саратовской НИВС Россельхозакадемии и при чтении лекций на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».

Основные положения, выносимые на защиту

2. Устойчивость организма цыплят яйценоского кросса «Родонит-2», иммунизированных бактериями штамма Е. coli Б-5, связана со способностью сыворотки крови нейтрализовать токсический материал вирулентных штаммов различных серогрупп Е. coli и образовывать in vitro иммунные комплексы с различными антигенами этих штаммов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Юбилейной конференции «Актуальные проблемы ветеринарии в современных условиях» (Краснодар, 2006); VII Всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития» (Саратов, 2007); Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы, задачи и пути научного обеспечения приоритетного национального проекта «Развитие АПК»» (Новочеркасск, 2008); IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 2. статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Малинин, Михаил Леонидович

ВЫВОДЫ

1. Показано, что вирулентные для птиц штаммы E.coli №388 (02) и E.coli №389 (078) являются продуцентами термостабильного токсина, а штамм E.coli №1 — термолабильного токсина, сходного по свойствам с термолабильным токсином штамма E.coli Б-5.

3. Установлен возрастной характер изменений фагоцитарного индекса крови интактных цыплят кросса «Родонит-2», значения которого коррелировали с содержанием гетерофилов в крови: величина индекса бактерицидности в большей степени была связана с числом моноцитов.

4. Изменение фагоцитарного индекса и индекса бактерицидности у иммунизированных цыплят не зависело от возраста иммунизации. Наибольшая бактерицидная активность сыворотки крови иммунизированных цыплят отмечена в отношении Е. coli №1, наименьшая —Е. coli №389 (078).

5. Сыворотка крови иммунизированных цыплят содержала антитела, нейтрализующие термолабильный токсин штамма Е. coli Б-5 на 100% и ТСМ штамма Е. coli №1 на 60%, а также антитела к ЛПС штамма Е. coli Б-5, но не имела антител к ЛПС штаммов Е. coli №1, №388 (02) и №389 (078). ИК образовывались in vitro только с ТСМ исследованных вирулентных штаммов Е. coli.

6. Показано снижение значений индекса ферментемии у интактных цыплят в 4,9 раза (Р<0,01) Е. coli и его дозозависимое увеличение (Р<0,05) у иммунизированных после заражения смесью вирулентных штаммов. Наибольшее клинико-диагностическое значение принадлежало таким биохимическим тестам, как: активность креатинкиназы, лактатдегпдрогеназы, щелочной фосфатазы, аланинами-нотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, концентрация общего белка, глюкозы, холестерина и его фракций, триглицеридов и их фракций

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У птиц колибактериоз представляет собой типичную секундарную инфекцию и зачастую протекает как конечная стадия различных инфекционных заболеваний [97]. В возникновении, развитии и исходе заболевания важнейшую роль играет как резистентность макроорганизма, так и вирулентность возбудителя [19]. В этой связи изучение вирулентных для птиц штаммов кишечной палочки и реактивности организма птиц приобретает актуальность для понимания патогенеза заболевания и механизмов формирования устойчивости к нему.

В настоящее время известно более 170 серологических групп Е. coli, объединяющих как вирулентные, так и авирулентные штаммы. В данной работе использовались штаммы, вирулентные {Е. coli №388 (02), Е. coli №389 (078), полевой изолят Е. coli №1) и авирулентный (Е. coli Б-5) для птиц. Бактерии всех штаммов Е. coli, изучавшихся в данной работе, характеризовались типичными для Е. coli культурально-морфологическими и биохимическими свойствами. При росте на МПБ культуры образовывали равномерное помутнение среды с образованием незначительного, легко разбивающегося при встряхивании осадка. На среде Эндо культуры образовывали колонии малиново-красного цвета, с металлическим блеском. На среде Левина — колонии темно-фиолетового цвета.

Все культуры Е. coli сбраживали лактозу, глюкозу, маннит, дульцит, сахарозу, арабинозу, но не сбраживали адонит и инозит. Также изучавшиеся в работе культуры Е. coli не усваивали цитрат натрия, не разжижали желатину, выделяли индол, не восстанавливали серу до сероводорода, давали положительную реакцию с метилротом и отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра, восстанавливали нитраты в нитриты, не обладали фенилаланиндезаминазной и ци-тохромоксидазной активностью, не росли на средах с цианидом калия.

Для изучения сходства штаммов по соматическому О-аптигену использовался тест ОРИД и иммунодот с антителами, меченными коллоидным золотом. Размер зоны преципитации в тесте ОРИД находился в линейной зависимости как от дозы иммунизации цыплят, так и от кратности разведения сывороток крови. ИК образовывались in vitro с антигенами штаммов Е. coli Б-5 и Е. coli №1. В то же время для штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078) не было обнаружено зависимости размера зоны преципитации ни от дозы предшествующей иммунизации цыплят, ни от кратности разведения сыворотки крови. В дот-блоте с коллоидным золотом в качестве антигенов использовались ЛПС и внешняя мембрана изучавшихся штаммов. Результаты тестов свидетельствовали о том, что сыворотки крови иммунизированных цыплят содержали антитела к ЛПС только штамма Е. coli Б-5. Это указывает на то, что бактерицидные свойства сыворотки крови иммунизированных цыплят не были связаны с выработкой специфичных антител к ЛПС вирулентных штаммов кишечной палочки. В дот-блоте с внешней мембраной штамма Е. coli Б-5 было показано образование комплексов антиген-антитело вплоть до титра сыворотки крови 1:1024, а с внешней мембраной Е. coli №1 — до титра 1:64. С внешней мембраной штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078) комплексы антиген-антитело не образовывались. Это свидетельствовало о том, что во внешней мембране клеток штамма Е. coli №1, в отличие от штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078), есть структуры, взаимодействующие с антителами сыворотки крови цыплят, иммунизированных бактериями штамма Е. coli Б-5.

Была проведена серия экспериментов по получению ТСМ из культураль-ных жидкостей штаммов Е. coli №1, Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078). Показано, что ТСМ, угнетающие дыхание ПКМ, присутствовали в культуральных жидкостях всех исследованных штаммов Е. coli.

Определялось наличие в сыворотке крови цыплят антител, нейтрализующих токсины указанных штаммов. Установлено, что сыворотки крови иммунизированных цыплят кросса «Родонит-2» содержали антитела, в полной мере нейтрализующие термолабильный токсин штамма Е. coli Б-5 и на 60% — ТСМ штамма Е. coli №1. ТСМ штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078) ней-трализовывались сывороткой крови цыплят, инфицированных клетками Е. coli Б-5, в меньшей степени.

ТСМ штаммов были проанализированы на наличие термолабильного токсина, аналогичного токсину штамма Е. coli Б-5, по изменению способности тромбоцитов к агрегации. Показано, что радиус агрегатов тромбоцитов под действием прогретой культуральной жидкости штамма Е. coli №1 уменьшался на 40% по сравнению с действием нативной культуральной жидкости, что свидетельствует о термолабильности ТСМ штамма Е. coli №1. В то же время, при добавлении нативной культуральной жидкости штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078) радиус частиц достоверно не изменялся по сравнению с культуральной жидкостью, прогретой при 56°С. Это указывает на термостабильность ТСМ данных штаммов.

При изучении биохимических показателей крови цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» показано отсутствие достоверных возрастных изменений в возрасте 14-64 дней для большинства изученных биохимических показателей, что свидетельствует о стабильности обмена веществ.

Для более точной оценки метаболических сдвигов нами предложено определение индекса ферментемии, увязывающего активность ферментов ACT, AJIT, КК и ЛДГ. ACT и КК отражают активность катаболических процессов центральной зоны метаболизма, AJ1T и ЛДГ - активность анаболических процессов периферической зоны метаболизма. Индекс ферментемии представляет собой безразмерную величину и определяется по формуле:

ИФ = [АСТ]/[АЛТ] + [АСТ/[ЛДГ] + [КК]/[ЛДГ] Чем выше значение ИФ, тем выше активность катаболических процессов центральной зоны метаболизма. Изменение индекса ферментемии может быть более достоверным свидетельством системных нарушений обмена веществ, чем дрейф активности отдельных индикаторных ферментов. Определение ИФ позволило выявить метаболические различия у цыплят яйценоского кросса «Родонит-2» и цыплят-бройлеров кросса «ROSS-308». У первых ИФ сохраняет стабильность в течение первых двух месяцев жизни, у вторых — достоверно снижается с возрастом, начиная с 8 дней.

Изучением гемограммы установлено наибольшее содержание в крови фагоцитов (гетерофилов и моноцитов) у цыплят кросса «Родонит-2» в возрасте 3 недели. Показано, что динамика индекса бактерицидное™ и фагоцитарного индекса у контрольных цыплят и у цыплят, иммунизированных в возрасте 14 и 22 дня, практически совпадала. Это подтверждало вывод о возрастном характере изменений этих параметров крови цыплят кросса «Родонит-2». Фагоцитарный индекс тем выше, чем больше в крови содержание гетерофилов.

В отношении клеток штамма Е. coli №1 бактерицидная активность сыворотки крови иммунизированных в возрасте 14 дней цыплят оказалась выше, чем в отношении штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078), но ниже, чем в отношении клеток штамма Е. coli Б-5, для которого титр бактерицидных антител оказался равен 1/8. При дозе иммунизации 0,5 млн. м.к. титр бактерицидных антител не претерпевал достоверных изменений. Однако с увеличением дозы иммунизации значения титров бактерицидных антител возрастали: в 4 раза при иммунизации дозой 1 млн. м.к., в 6 раз - дозой 2 млн. м.к., в 18 раз — дозой 1 млрд. м.к. Через 4 недели после иммунизации титры бактерицидных антител возвращались к исходным значениям.

Динамика параметров фагоцитоза и бактерицидных титров свидетельствовала о том, что иммунизация цыплят кросса «Родопит-2» бактериями штамма Е. coli Б-5 в возрасте 22 дня была более эффективна, чем в 14 дней. Рост титра бактерицидных антител происходил дозозависимо. Увеличение дозы иммунизации сопровождалось ростом титров антител к клеткам всех изучавшихся в работе вирулентных штаммов. Наибольшая бактерицидная активность сыворотки крови иммунизированных цыплят отмечалась к клеткам штамма Е. coli №1, наименьшая - штамма is. coli №389 (078). Титры бактерицидных антител к бактериям вирулентных штаммов оказались ниже, чем к «слеткам штамма Е. coli Б-5; в отношении последнего отмечался дозозависимый эффект, от 1/16 при дозе 0,5 млн. м.к. до 1/112 при дозе 1 млрд. м.к.

Было проведено экспериментальное заражение цыплят в возрасте 6 недель бактериями вирулентных штаммов Е. coli. У цыплят, иммунизированных бактериями Е. coli Б-5 в дозе 1 млрд. м.к., после заражения смесью вирулентных штаммов титр бактерицидных антител к клеткам штамма Е. coli Б-5 составил 1/4, Е. coli №1 - 1/25, к штамму Е. coli №388 (02) - 1/4. к штамму Е. coli №389 (078) — менее 1/4. Иммуногенность штаммов Е. coli №388 (02) и Е. coli №389 (078), в отличие от Е. coli №1, слабо зависела от предварительной иммунизации бактериями штамма coli Б-5.

Для проверки предположения об антитоксическом характере устойчивости цыплят к вирулентным штаммам кишечной палочки при иммунизации клетками штамма Е. coli Б-5 определяли в сыворотке крови иммунизированных и затем зараженных смесью вирулентных штаммов Е. coli цыплят концентрацию и титр образующихся in vitro ИК к ТСМ и к липопротеинам изучавшихся штаммов.

В сыворотках крови цыплят группы 1 образование in vitro ИК с ТСМ штамма Е. coli Б-5 отмечено при кратности разведения сыворотки крови 1/4; с ТСМ штаммов №1 и №388 (02) - 1/16, а с ТСМ штамма №389 (078) - 1/64. В сыворотках крови цыплят групп 2-4 максимальная кратность разведения сыворотки крови, при которой концентрация специфических антител была достаточна для образования РЖ in vitro с ТСМ всех использованных штаммов, составляла 1/64. Это указывало на то, что образование ИК в сыворотке крови цыплят, иммунизированных против колибактериоза в возрасте 22 дня, с ТСМ вирулентных штаммов представляло собой реакцию взаимодействия антигенов со специфическими антителами.

Установлено, что титр антитоксических антител к Е. coli Б-5 в сыворотке крови цыплят группы 1 превышал титры к вирулентным штаммам в 2 раза, в группе 2 - в 3,5 раза, в группе 3 - в 5 раз, в группе 4 — в 14 раз. Концентрация ИК к ТСМ штамма Е. coli №389 (078) достигала 16,4 мг/мл, к ТСМ штамма Е. coli №388 (02) - 17,74 мг/мл, к ТСМ штамма Е. coli №1-19,18 мг/мл, к ТСМ штамма Е. coli Б-5 — 20,9 мг/мл. Это подтверждало наше предположение о формировании в организме иммунизированных против колибактериоза цыплят не столько антибактериальной, сколько антитоксической защиты от гетерологич-ных штаммов Е. coli.

При изучении биохимических показателей не иммунизированных цыплят наиболее выраженные изменения выявлены при заражении их смесью вирулентных штаммов. Активность ACT достоверно повышалась (р<0,05), что указывало на более интенсивное поступление субстратов в цикл трикарбоновых кислот и активизацию катаболического звена обмена веществ. Активность АЛТ достоверно не изменялась в результате заражения, что отражало интенсивность глюконеогенеза, которая у цыплят после заражения оставалась на прежнем уровне. В то же время концентрация глюкозы достоверно (р<0,05) повышалась, а активность ЩФ (р<0,05) и липазы — уменьшалась. Активность ЛДГ повышалась в 5 раз (р<0,01), что свидетельствовало о снижении рН за счет увеличения образования лактата. Равновесие в катализируемой КК обратимой реакции креатин + АТФ <-> креатинфосфат + АДФ при этом сдвигается влево. При высокой концентрации глюкозы увеличивается активность гликолитического расщепления глюкозы с превращением ее в лактат, что еще больше сдвигает рН в кислую сторону и может приводить к возникновению анаэробного токсикоза.

Изучение динамики биохимических показателей у иммунизированных цыплят после экспериментального заражения вирулентными штаммами Е. coli показало, что активность КК и ACT в сыворотках крови цыплят группы 1 была наибольшей и превышала 130 и 15 мккат, соответственно. Это указывает на высокую активность катаболических реакций центральной зоны метаболизма. У этих же цыплят отмечалась ферментемия по АЛТ, достигавшая 1,7 мккат. Это указывало на высокую активность глюконеогенеза наряду с ЦТК. Активность ЛДГ также была наибольшей в этой группе, превышая 100 мккат. Очень высокая активность ACT и ЛДГ и довольно высокая активность АЛТ свидетельствовала о сдвиге вправо равновесия в обратимой реакции окисления молочной кислоты до пировиноградной. Это повышало рН крови, что в свою очередь сдвигало равновесие в реакции образования креатинфосфата вправо. У цыплят группы 1 энергетическое обеспечение внутриклеточных процессов происходило за счет, прежде всего, процессов аэробного окисления. У цыплят группы 2 отмечались сходные тенденции, но выраженные слабее, чем у цыплят группы 1.

Сыворотки крови цыплят группы 4 характеризовались высокими значениями коэффициента де Ритиса и активности КК, а также низкими концентрацией общего белка и активностью ГГТ. Гиперферментемия по ACT в сочетании с гипоферментемией по АЛТ указывает на торможение периферических путей обмена с одновременной стимуляцией центральной зоны метаболизма. Высокая активность КК сопряжена с интенсификацией катаболизма углеводов, а через него - с поддержанием энергетического статуса организма. Повышенный коэффициент де Ритиса на фоне высокой активности ICK и низкой концентрации общего белка свидетельствует о торможении белкового обмена и о слабой интеграции его с углеводным обменом. В организме цыплят группы 3 отмечались похожие тенденции, но выражены они были слабее, чем у цыплят группы 4.

Через 2 недели после заражения не иммунизированных цыплят смесью вирулентных штаммов ИФ уменьшался по сравнению с интактными цыплятами того же возраста в 4,9 раза, а у цыплят, иммунизированных в возрасте 14 дней, - в 1,5 раза. У цыплят, иммунизированных в возрасте 22 дня, ИФ менялся дозо-зависимо. При введении доз 1 млн. и 1 млрд. м.к. достоверных ртличий по сравнению с контролем не выявлено, при дозе 2 млн. м.к. ИФ возрастал в 1,4 раза (р<0,05), а при дозе иммунизации 0,5 млн. м.к. - в 1,8 раза (р<0,01).

При заражении вирулентными штаммами Е. coli не иммунизированных цыплят наблюдались метаболические изменения, свидетельствовавшие о смещении метаболизма в сторону преобладании анаболического звена. У цыплят, иммунизированных в возрасте 14 дней, при экспериментальном заражении метаболизм смещался в ту же сторону, но менее выраженно, а у цыплят, иммунизированных в возрасте 22 дня, ИФ свидетельствовал либо об отсутствии достоверных метаболических изменений, либо о смещении метаболизма в сторону преобладания катаболических реакций.

Таким образом, предложенное нами определение индекса ферментемии дает возможность судить о метаболических изменениях в организме цыплят в результате инфицирования Е. coli и оценивать метаболический статус с точки зрения восприимчивости к инфекции.

Анализ динамики биохимических показателей сыворотки крови цыплят кросса «Родонит-2» при инфицировании вирулентными штаммами Е. coli, позволил из большого числа определявшихся параметров выделить наиболее информативные аналиты. Наиболее информативными биохимическими тестами при инфекционной патологии цыплят показали себя следующие: активность ферментов КК, ЛДГ, ЩФ, АЛТ, ACT, концентрация общего белка, глюкозы, холестерина и его фракций, триглицеридов и их фракций. Определение этих параметров позволяет получить более объективное представление о состоянии обмена веществ и энергетического статуса организма.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малинин, Михаил Леонидович, Саратов

1. Адо, А.Д. Современное состояние учения о фагоцитозе/ А.Д. Адо, А.Н. Маянский// Иммунология. 1983. - № 1. - С. 20-26.

2. Алексанкин, А.П. Разработка иммунохимических методов диагностики LT подобных токсинов: автореф. дис. . канд. биол. наук/ Алексанкин А.П. — Москва, 2006. 24 с.

3. Алимова, Е.К. Липиды и жирные кислоты в норме и при ряде патологических состояний/ Е.К. Алимова, А.Т. Аствацатурьян, Л.В. Жаров// М.: Медицина. 1975. - 279 с.

4. Аниховская, И.А. Выявление групп риска, выбор тактики обследования и оценка эффективности лечения различных заболеваний по показателям анти-эндотоксинового иммунитета: автореф. дис. . канд. мед. наук/ Аниховская И.А. Москва, 2001. - 18 с.

5. Анохин, В.А. Патогенетическое значение эндотоксинемии и изменение активности систем антиэндотоксической защиты при ОРВИ у детей: автореф. дис. . докт. мед. наук/ Анохин В.А. Казань, 1994. - 40 с.

6. Антифосфолипидный синдром у новорожденных детей от женщин с пороками сердца/ В.А. Таболин и др.// Международный журнал иммунологии. 1999. -№ 12. - С. 160-161.

7. Ашмарин, И.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях/ И.А. Ашмарин, А.А. Воробьёв// Л.: Изд-во мед. лит. 1962. - 180 с.

8. Бельчик, Ю.Ф. Коррекция нарушений антиэндотоксинового иммунитета при гнойно-воспалительных заболеваниях у доношенных новорожденных детей: автореф. дис. . канд. мед. наук/ Бельчик Ю.Ф. — Москва, 1998. — 19 с.

9. Бессарабов, Б.Ф. Лабораторная диагностика клинического и иммунобиологического статуса у сельскохозяйственной птицы/ Б.Ф. Бессарабов, С.А. Алексеева, Л.В. Клетикова// М.: КолосС. 2008. - 151 с.

10. Биохимические методы исследования в клинике: Справочник/ Под ред. А.А. Покровского// М.: Медицина. — 1969. 651 с.

11. Блинов, В.А. Основы клинической биохимии человека и животных/ В.А. Блинов, И.И. Калюжный// Саратов: Приволж. кн. изд-во. 1996. — 248 с.

12. Валенкевич, Л.Н. Клиническая энтерология/ Л.Н. Валенкевич, О.И. Яхонтова// СПб.: Гиппократ. 2001. - 288 с.

13. Виноходов, Д.О. Биотестирование в птицеводстве и ветеринарии: Введение в биотестирование/ Д.О. Виноходов, Н.Л. Поляков// Ветеринария в птицеводстве. 2003. - № 5-6. - С. 41-46.

14. Вирусология. Методы/ Под ред. Б. Мейхи. М.: Мир. - 1988. - 344 с.

15. Владимиров, В.Л. Активность аминотрансфераз у цыплят разных пород в онтогенезе/ В.Л. Владимиров// Труды Всесоюз. научно-исслед. ин-та физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных. Боровск: Изд-во МСХ СССР. - 1965. - Т. 2. - С. 127-138.

16. Волкова, М.В. Разработка экспериментальной живой вакцины для профилактики колибактериоза свиней: автореф. дис. . канд. биол. наук/ Волкова М.В. Саратов, 2006. - 24 с.

17. Гуткин, B.C. Лизосомы в антибактериальном иммунитете животных/ B.C. Гуткин, В.А. Горбатов, Т.А. Феоктистова// М.: Колос. 1984. - 304 с.

18. Дворецкий, Л.И. Железодефицитные анемии/ Л.И. Дворецкий// М.: Ньюдиамед. 1998. - 40 с.

19. Демин, В.В. Зависимость адаптационных возможностей организма цыплят от возраста кур-несушек: дис. . канд. биол. наук/ В.В. Демин — Мичуринск, 2000. 150 с.

20. Диагностика иммунодефицита птиц (иммунологические методы)/ Э.Д. Джавадов и др.//Ветеринария. —2003. — № 10.-С. 11-13.

21. Домарадский, И.В. Перекрестный иммунитет: состояние, проблемы перспективы/ И.В. Домарадский// Иммунология. 1993. - № 3. - С. 6-9.

22. Дыкман, JI.A. Золотые наночастицы. Синтез, свойства, биомедицинское применение/ Л.А. Дыкман// М.: Наука. 2008. - 319 с.

23. Дыкман, Л.А. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа/ Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев// Биохимия. 1997. - Т. 62, № 4. - С. 411-418.

24. Дыкман, Л.А. Наночастицы золота: получение, функционализация, использование в биохимии и иммунохимии/ Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев// Успехи химии. 2007. - Т. 76, № 2. - С. 199-213.

25. Ертанов, И.Д. Дальнейшее расширение перечня унифицированных методов: Инструкция Минздрава СССР/ И.Д. Ертанов//Лабораторное дело. — 1987.-№ 10.-С. 784-786.

26. Жосан, Н.С. Состояние естественной резистентности и иммунологической реактивности у новорожденных телят при колибактериозе: дис. . докт. вет. наук/ Жосан Н.С. Кишинев, 1998. - 137 с.

27. Заболотников, А.А. Справочник птицевода/ А.А. Заболотников// М.: Моск. Рабочий. 1984. - 255 с.

28. Зайчик, А.Ш. Основы общей патологии/ А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурилов// СПб.: Изд-во ЗАО ЭЛБИ. 1999. - 624 с.

29. Иванов, И.И. Введение в клиническую биохимию/ И.И. Иванов// Л.: Медицина. 1969. - 616 с.

30. Изучение влияния термолабильного энтеротоксина бактерий рода Еп-terobacter на функциональную активность перитонеальных макрофагов в эксперименте/ А.А. Ахтариева и др.// Известия Челябинского научного центра. — 2006. Вып. 2 (32). - С. 120-122.

31. Иммунологические методы /Под ред. Г. Фримеля// М.: Медицина. — 1987.-472 с.

32. Иммуноморфологическая оценка резервов связывания эндотоксина поли-морфноядерными лейкоцитами/ Н.К. Пермяков и др.//Архив патологии. 1995.-№2.-С. 47.

33. Иммуноферментная тест-система для определения термолабильного энтеротоксина эшерихий/ А.П. Алексанкин и др.// Вопросы физико-химической биологии в ветеринарии: Сб. научн. тр. М.: Изд-во ФГОУ ВПО МГАВМиБ. - 2005. - С. 53-56.

34. Исследование системы крови в клинической практике/ Под ред. Г.И. Козинца, В.А. Макарова// М.: Триада-Х. 1997. - 480 с.

35. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2 т. Т. 1/ B.C. Камышников// Мн.: Беларусь. 2000. — 495 с.

36. Камышников, B.C. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2 т. Т. 2/ B.C. Камышников// Мн.: Беларусь. - 2000. — 463 с.

37. Кирьянов, Е.А. Колибактериоз животных и его профилактика/ Е.А. Кирьянов, А.Т. Больных// Уссурийск: Изд-во Приморск. СХИ. 1986. - 46 с.

38. Климов, А.Н. Липопротеиды, дислипопротеидемии и атеросклероз/ А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева// Л.: Медицина. 1984. - 164 с.

39. Климов, А.Н. Обмен липидов и липопротеидов и его нарушения/ А.Н. Климов, Н.Г. Никульчева// СПб: Питер Ком. 1999. - 512 с.

40. Клиническая лабораторная аналитика. Том II. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории/ Под ред. В.В. Меньшикова// М.: Ла-бинформ-РАМЛД. 1999. - 352 с.

41. Клиническая лабораторная диагностика/ Сост. В.Н. Ослопов, А.Р. Са-дыкова, Р.А. Абдулхаков// М.: МЕДпресс. 2001. - 64 с.

42. Колб, В.Г. Справочник по клинической химии/ В.Г. Колб, B.C. Камышников// Мн.: Минск. 1982. — 365 с.

43. Колычев, Н.М. Ветеринарная микробиология и иммунология. 3-е изд., перераб. и доп./ Н.М. Колычев, Р.Г. Госманов// М.: КолосС. - 2006. - 432 с.

44. Коляков, Я.Е. Ветеринарная иммунология/ Я.Е. Коляков// М.: Агро-промиздат. 1986. - 272 с.

45. Комаров, Ф.И. Биохимические исследования в клинике/ Ф.И. Комаров, Б.Ф. Коровкин, В.В. Меньшиков// Элиста: АПП Джангар. 1999. - 250 с.

46. Коровкин, Б.Ф. Ферменты и изоферменты сердечной мышцы и сыворотке крови в норме и при остром инфаркте миокарда: автореф. дисс. . докт. мед. наук/ Коровкин Б.Ф. Ленинград, 1966. 37 с.

47. Коромыслов, Г.Ф. Инфекционные болезни при промышленном скотоводстве/ Г.Ф. Коромыслов, М.А. Сидоров, Н.Н. Крюков// Животноводство и ветеринария. 1980. - Т. 13.-С. 119.

48. Краткий определитель бактерий Берги/ Под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир. - 1980.-496 с.

49. Кудрявцев, А.А. Клиническая гематология животных/ А.А. Кудрявцев, Л.А. Кудрявцева// М.: Колос. 1974. - 322 с.

50. Лабораторная гематология/ С.А. Луговская и др. j// М: Юнимед-пресс, 2002.- 115 с.

51. Лабораторные методы исследования в клинике/ Под ред. В.В. Менши-кова// М.: Медицина. 1987. - 365 с.

52. Лакин, Г.Ф. Биометрия: уч. пособие для биол. спец. ВУЗов 4-е изд., перераб. и доп./ Г.Ф. Лакин// М.: Высш. Школа. - 1990. - 352 с.

53. Лиходед, В.Г. Роль эндотоксина грамотрицательных бактерий в инфекционной и неинфекционной патологии/ В.Г. Лиходед, Н.Д. Ющук, М.Ю. Яковлев//Архив патологии. -1996. ~№ 2. С. 813.

54. Маянский, А.Н. Патогенетические аспекты нейтрофилзависимых реакций/ А.Н. Маянский// Патологическая физиология. 1989. -№ 6. - С. 66-72.

55. Мелехин, Г.П. Физиология сельскохозяйственной птицы/ Г.П. Меле-хин, Н.Я. Гридин// М.: Колос. 1977. - 288 с.

56. Мельников, В.И. Ферменты патогенности и токсины бактерий/ В.И. Мельников, М.Г. Гимранов// М.: Медицина. 1995. - 252с.

57. Методические подходы к оценке безопасности наноматериалов/ Г.Г. Онищенко и др.// Гигиена и санитария. — 2007. № 6. — С. 3-11.

58. Методические рекомендации по получению, очистке энтеротоксинов эшерихий и изготовлению антитоксических сывороток/ Сост. А.Н. Головко и др.// Харьков: Изд-во НИР ИЭКВМ. 1995.-23 с.

59. Медоды оценки свойств мононуклеарных фагоцитов и их изменений под влиянием биологически активных веществ/ И.С. Фрейдлин и др.// Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии. Научные труды. 1978.-Т. 63.-С. 43-45.

60. Мишанин, Ю.Ф. Основы ветеринарной медицины/ Ю.Ф. Мишанин, М.Ю. Мишанин// Ростов-на-Дону: Феникс. 2007. - 665 с.

61. Мосолов, В.В. Протеолитические ферменты/ В.В. Мосолов// М.: Наука. 1971414 с.

62. Мосс, Д.В. Энзимология и медицина/ Д.В. Мосс, П.Дж. Баттерворт// М.: Медицина. 1978. - 288 с.

63. Нагоев, Б.С. Ферментативная и фагоцитарная активность нейтрофилов при бактериальной дизентерии/ Б.С. Нагоев// Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии. Научные труды. — 1978. — Т. 63. — С. 70-72.

64. Назаренко, Г.И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований/ Г.И. Назаренко, А.А. Кишкун// М.: Медицина. 2002. - 544 с.

65. О регуляции соотношения окисления янтарной кислоты и НАД-зависимых субстратов производными индола. В кн.: Регуляция процессов окисления и сопряжения/ М.Н. Кондрашова и др.// М.: Наука. 1974. — С. 145-163.

66. Одна из возможных причин повышения активности кислых гидролаз в гомогенатах сердечной мышцы при экспериментальном инфаркте миокарда/ Т.Ю. Стрежнева и др.// Вопр. мед. химии. 1977. - № 2. - С. 251-254.

67. Определитель бактерий Берги/ Под ред. Дж. Хоулта М.: Мир. — 1990.-800 с.

68. Орехов, Д.А. Иммунобиохимическая характеристика крови птицы при применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза: автореферат дисс. канд. вет. наук/ Д.А. Орехов. Санкт-Петербург, 2008. -20 с.

69. Осадченко, А.А. Применение синтетических дипептидов при вакцинации птиц против ньюкаслской и инфекционной буреальной болезней: авто-реф. дис. . канд. вет. наук/ А.А. Осадченко. Иваново, 2007. - 23 с.

70. Острый респираторный дистресссиндром при эндотоксиновом шо-ке/М.Ю. Яковлев и др.//Архив патологии. 1988. - № 11. - С. 81-89.

71. Патент № 2248393 Российская Федерация, МПК7 C12N1/20. Штамм Escherichia coli Б-5, используемый для получения термолабильного экзотоксина/ В.Н. Ласкавый, А.А. Щербаков, М.В. Волкова 2005. - Бюл. № 8.

72. Патогенетические механизмы и клинические аспекты действия термостабильного эндотоксина кишечной палочки/ В.А. Таболин и др.// Вестник клинико-диагностического общества. — 2002. Вып. 3. — С. 69.

73. Пермяков, Н.К. Эндотоксин и система полиморфноядерного лейкоцита/ Н.К. Пермяков, М.Ю. Яковлев, В.Н. Галанкин//Архив патологии. 1989. -№5.-С. 3-11.

74. Породы, линии и гибриды птицы. -М.: Россельхозиздат. — 1979. —236с.

75. Пособие для врачей-лаборантов по методу определения гемоглобина/ Сост. А.А. Козлов, Т.М. Простакова, А.Л. Берковский. — М.: Изд-во НПО Ре-нам. 2000. - 30 с.

76. Предтеченский, В.Е. Руководство по лабораторным методам исследования/ В.Е. Предтеченский, В.М. Боровская, JT.T. Марголина// М.: Медгиз. -1950.-804 с.

77. Приказ МЗ СССР №1175 от 21.11.79г. «Об унификации клинических лабораторных методов исследования».

78. Пупкова, В.И. Определение гемоглобина в крови. Информационно-методическое пособие/ В.И. Пупкова// Кольцово: Вектор-Бест. — 2001. — 18 с.

79. Раби, К. Локализованная и рассеянная внутрисосудистая коагуляция/ К. Раби// М.: Медицина. 1974. - 239 с.

80. Рекомендации по специфической профилактике колибактериоза поросят/ Сост. В.Н. Ласкавый, М.В. Волкова// Саратов. Изд-во ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ». - 2007. - 9 с.

81. Рекомендации по специфической профилактике колибактериоза телят/ Сост. В.Н. Ласкавый, М.В. Волкова, Д.С. Волков// Саратов. Изд-во ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ». - 2005. - 8 с.

82. Ромейс, Б. Микроскопическая техника/ Б. Ромейс// М.: Изд-во иностр. лит. 1954.-718 с.

83. Рослый, И.М. Ферментемия адаптивный механизм или маркер цитолиза?/ И.М. Рослый, С.В. Абрамов, В.И. Покровский// Вестник РАМН. - 2002. -№ 8. - С. 3-9.

84. Сазонова, И.А. Разработка технологии стабилизации, биотрансформации и применения пивной дробины: автореф. дис. . канд. биол. наук/ И.А. Сазонова — Саратов. 2007. - 22 с.

85. Скоупс, Р. Методы определения белков/ Р. Скоупс// М.: Мир. 1985. —360 с.

86. Современный справочник врача ветеринарной медицины: учебное пособие для студентов сельскохозяйственных вузов по специальности «Ветеринария»/ В. Г. Гавриш и др.// Ростов-на-Дону: Феникс. — 2007. — 600 с.

87. Состояние антиэндотоксинового иммунитета у доношенных новорожденных с инфекционной и неврологической патологией/ А.В. Чемлев и др.// Сборник трудов 1-ой сессии РМАПО. 1995. - С. 74.

88. Фридрих, П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы/ П. Фридрих// М.: Мир. 1986. - 288 с.

89. Хочачка, П. Биохимическая адаптация/ П. Хочачка, Дж. Сомеро// М.: Мир. 1988. - 568 с.

90. Цынкаловский, Р.Б. Фагоцитоз и теория иммунитета/ Р.Б. Цынкалов-ский// Актуальные вопросы иммунологии, аллергологии и молекулярной биологии. Научные труды. — 1978. — Т. 63. — С. 35-42.

91. Чегер, С.И. Транспортная функция сывороточного альбумина/ С.И. Чегер// Бухарест: Изд-во Академии Социалистической Республики Румынии. — 1975.- 183 с.

92. Шехтман, М.М. Материнская заболеваемость и смертность при экст-рагенитальной патологии/ М.М. Шехтман, 3.3. Токова// Акуш. и гин. — 1991. — С. 54-57.

93. Шмитт, К.К. Характеристика бактериальных токсинов/ К.К. Шмитт, К.С. Мейсик, А.Д. О'Браэн// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. - Т. 2, №1. - С. 4-15.

94. Энтеробактерии/ И.В. Голубева и др.// М.: Медицина. 1985. - 320 с.

95. Энциклопедия клинических лабораторных тестов/ Под ред. Н.У. Тица. М.: Лабинформ. - 1997. - 510 с.

96. Яковлев, М.Ю. Роль системной эндотоксипемии в физиологии и патологии человека/ М.Ю. Яковлев// Сборник трудов 1-ой сессии РМАПО. -1995. -С. 10-11.

97. Яковлев, М.Ю. Системная эндотоксинемия в физиологии и патологии человека: автореф. дис. . докт. мед. наук/ М.Ю. Яковлев. — Москва,1993. -55 с.

98. A General Regression Procedure for Method Transformation/ W. Bablock et al.// J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1988. - V. 26. - P. 783-790.

99. A metabolic comparasion between human blood monocytes and neutrophils. Macrophages and lymphocytes: nature, functions and interaction/ D. Roos et al.// Proc. Int. Congr. Reticuloendothel. Soc.: New York London. - 1980. - P. 4652.

100. A new polyvalent vaccine against enteral infections in newborn calves/ J. Stepanek et al.// J. Franz. Vet. Med. 1987. - V. 32, № 2. - P. 65-80.

101. An outbreak of gram-negative bacteremia traced to contaminated origins in reprocessed dialyzers/ J.P. Flacherty et al.// Ann. Intern. Med. 1993. - V. L196. - P. 1072-1078.

102. Arp, L.H. Colibacillosis/ L.H. Arp// In Purchase: A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens. PA. — Kennett Square. — 1989.-P. 12-13.

103. Arp, L.H. Effect of passive immunisatios on phagocitosis of blood-home Escherichia coli in spleen and liver of turkeys/ L.H. Arp// Am. J. Vet. Res. 1982. -V. 43, P. 1034-1040.

104. Arp, L.H. Interaction of blood-bome Escherichia coli with phagocytes of spleen and liver of turkeys/ L.H. Arp, Cheville// Am. J. Vet. Res. 1981. - V. 42. -P. 650-657.

105. Artiss, J.D. Trends in Analytical Chemistry/ J.D. Artiss Zak B.// Am. J. Cardiol. 1987.-V. 6.-P. 185-191.

106. Assays of serum lipase: analytical and clinical considerations/ J. Lott et al.// Clin. Chem. 1986. - V. 32. - P. 1290-1302.

107. Assmann, G. Relation of high-density lipoprotein cholesterol and triglycerides to incidence of atherosclerotic coronary artery disease (the PROCAM experience)/ G. Assmann, H. Schulte// Am. J. Cardiol. 1992. - V. 70. - P. 733-737.

108. Bacterial colonization and in vivo expression of F1 (type 1) fimbrial an gens in chickens experimentally infected with pathogenic Escherichia coli/ C.M. Do-zois et al.// Avian Dis. 1994. - V. 38. - P. 231 -239.

109. Barnes, H.J. Colibacillosis in poultry: In Pfizer Veterinary Practicum/ H.J. Barnes, F. Lozano// Pfizer Animal Health. 1994. - P. 45.

110. Berkhoff, H.A. Congo red medium to distinguish between invasive and non-invasive Escherichia coli pathogenic for poultry/ H.A. Berkhoff, A.C. Vinal// Avian Dis.- 1986.-V. 30.-P. 117-121.

111. Bessey, O.A. A method for the rapid determination of alkaline phosphatase with five cubic millimeters of serum/ O.A. Bessey, O.H. Lowry, M.J. Brock// J. ^ Biol. Chem. 1946. - V. 164. - P. 321 -329.

112. Black, S.J. Analysis of Propionibacterhim acnes-induced non-specific immunity to Trypanosoma brucei in mice/ S.J. Black, M. Murray, S.Z. Shapiro// Parasite Immunol. -1989. V. 11. - P. 371-383.

113. Bodansky, O. Acid phosphatase/ O. Bodansky// Adv. Clin. Chem. -1972. -V. 15.-P. 143-147.

114. Borgstrum, B. The action of bile salts and other detergents on pancreatic lipase and the interaction with colipase/ B. Borgstrum// Biochimicf et Biophisika Acta. 1977. - V. 488. - P. 381-391.

115. Boyd, F.M. The effect of dietary protein on the course of various infections in the chick/ F.M. Boyd, H.M. Edwards// J. Infect. Dis. 1963. - V. 112. - P. 53-56.

116. Bree, A. Comparative infectivity for axenic and specific-pathogen-free chickens of 02 Escherichia coli strains with or without virulence factors/ A. Bree, M. Dho, J.P. LafontII Avian Dis. 1989. - V. 33. - P. 134-139.

117. Brent, P. MicromethocI for Serogrouping Escherichia coli/ P. Brent, K.L. Vosti// Applied Microbiology. 1973. - Y. 2. - P. 208-211.

118. Butler, A.R. The Jaff reaction: Identification of the colored species/ A.R. Butler// Clin. Chim. Acta. 1976. - V. 59. - P. 227-232.

119. Cessi, D. Prophylaxis о {'Escherichia coli infection in fowls with emulsified vaccines/ D. Cessi// Clin. Vet. 1979. - V. 102. - P. 270-278.

120. Chapatwala, K. Effect of intraperitoneal^ injected cadmium on renal and glycogenic enzymes in the rats/ K. Chapatwala, M.A. Boykin, B. RajannaII Drug & Chemical Toxicol. 1982. - V. 5. - P. 305-317.

121. Characterization of an avirulent mutant of a virulent avian Escherichia coli isolate/ L.K. Nolan et al.// Avian Dis. 1994. - V. 38. - P. 146-150.

122. Chulasiri, M. Antimicrobial resistance of Escherichia coli isolated from chickens/ M. Chulasiri, O. Suthienkul// Vet. Microbiol. 1989. - V. 21. - P. 189194.

123. Circulating complexes of antigens-antibodies in patients with immuno-complex diseases and after kidney transplantation/ V. Hashkova et al.// Chehoslo-vatscaja Medicina. 1978.-V. 2.-P. 117-122.

124. Comparison of a complement resistance test, a chicken embryo lethality test and the chicken lethality test for determining virulence of avian Escherichia coli/ L.K. Nolan et al.// Avian Dis. 1992. - V. 36. - P. 395-397.

125. Creatine kinase and B-subunit activity in serum in cases of suspected myocardial infarction/ W. Gerhardt et al.// Clin. Chem. 1982. - V. 28. - P. 277283.

126. Dallas, W. Amino acid sequence homology between cholera toxin and Escherichia coli heat-labile toxin/ W. Dallas, S. Falkow// Nature. 1980. — V. 288. -P. 499-500.

127. Deb, J.R. Laboratory trials will inactivated vaccines against Escherichia coli 02:K1 infectiol in fowls/ J.R. Deb, E.G. Harry// Res. Vet. Sci. 1978. - V. 24. -P. 308-313.

128. Dho, M. Adhesive properties and iron uptake ability in Escherichia coli lethal and noi lethal for chicks/ M. Dho, J.P. Lafont// Avian Dis. 1984. - V. 28. - P. 1016-1025.

129. Dho, M. Escherichia coli colonization of the trachea in poultry: Comparison of virulent an avirulent strains in gnotoxenic chickens/ M. Dho, J.P. Lafont// Avian Dis. 1982. - V. 26. - P. 787-797.

130. Effect of dietary linoleic acid content on the distribution of triacylglycerol molecular species in rat adipose tissue/ Y.S. Huang et al.// Lipids. 1992. - V. 27. -P. 711-715.

131. Enterobacter bacteriemia an analysis of 50 episodes/ Bouza E. et al.// Arch. Intern. Med. - 1985. - V. 145. - P. 1024-1027.

132. Experience with Enterobacter bactaeremia in a Dublin teaching hospital/ A.L. Ansari et al.// J. Hosp. Infect. 1994. - V. 27. - P. 69-72.

133. Experimental vaccination of young chickens with a live, non-pathogenic strain of Escherichia colil A. Frommer// Avian Pathol. 1994. - V. 23. - P. 425-433.

134. Farmer, J.J. Enterobacteriaceael J.J. Fanner, M.T. Kelly// In A. Balow et al.// Manual of Clinical Microbiology. Washington. - DC. - 1991. - P. 360-383.

135. Giannella, R.A. Escherichia coli heat-stable enterotoxins, guanylins, and their receptors: what are they and what do they do?/ R.A. Giannella// J. Lab. Clin. Med. 1995.-V. 125.-P. 173-181.

136. Glick, M.R. Graphical Comparisons of Interferences in Clinical Chemistry Instrumentation/ M.R. Glick, K.W. Ryder, S.A. Jackson// Clin. Chem. 1986. -V. 32.-P. 470-474.

137. Gross, W.B. Effect of short-term exposure of chickens to corticosterone on resistance to challenge exposure with Escherichia coli and antibody response to sheep erythrocytes/ W.B. Gross// Am. J. Vet. Res. 1992. - V. 53. - P. 291-293.

138. Gyimah, J.E. Adhesin-receptor interactions mediating the attachment of pathogenic Escherichia coli to chicken tracheal epithelium/ J.E. Gyimah// Avian Dis. 1988.-V. 32.-P. 74-78.

139. Haemoglobin Cyanide Standart Preparation. International Committee for Standartisation in Haematology/ Wld. Hlth. Org. Tech. Rep. 1967. - S. 384. - 14 p.

140. Harnett, M.M. Analysis of G-proteins regulating signal transduction pathways/ M.M. Harnett// Methods Mol. Biol. 1994. - V. 27. - P. 199-211.

141. Harry, E.G. The association between the presence of septicaemia strains of Escherichia coli in the respiratory and intestinal tracts of chickens and the occurrence of coli septicaemia/ E.G. Harry, L.A. Hemsley// Vet. Rec. 1965. - V. 77. — P. 35-40.

142. Harry, E.G. The relationship between environmental contamination with septicaemia strains of Escherichia coli and their incidence in chickens/ E.G. Harry, L.A. Hemsley// Vet. Rec. 1965. - V. 77. - P. 241-245.

143. Heller, E.D. Pathogenic Escherichia coli strains prevalent in poultry flocks in Israel// E.D. Heller, M. Perek// Br. Vet. J. 1968. - V. 124. - P. 509-513.

144. Heller, J.E. Prostatic acid phosphotase: its current clinical status/ J.E. Heller//J. Urol. 1987. - V. 137.-P. 1091-1103.

145. Heller, E.D. Some characteristics of pathogenic Escherichia coli strains/ E.D. Heller, N. Drabkin// Br. Vet. J. 1977. - V. 133. - P. 572-578.

146. Henderson, R.J. Hydrolysis of fish oils containing polymers of triacylgly-cerols by pancreatic lipase in vitro! R.J. Henderson, I.C. Burkow, R.M. Millar// Lipids. 1993.-V. 28.-P. 313-319.

147. High mortality of domestic turkeys associated with Ascaridia dissimilis/ R.A. Norton et al.// Avian Dis. 1992. - V. 36. - P. 469-473.

148. Holmgren, J. Cholera toxin and cholera-B subunit as oral mucosal adjuvant and antigen vector systems/ J. Holmgren, N. Lycke, C. Czerkinsky// Vaccine. — 1993.-V. 11.-P. 1179-1184.

149. Horsfall, D.J. The Titre of Bactericidal Antibody Against Salmonella gal-linarum in Chicks/ D.J. Horsfall, D. Rowley, C.R. Jenkin// Immunology. 1970. -V. 18.-P. 595.

150. Hughes, G.R.V. Thrombosis, abortion, cerebral disease and the lupus anticoagulant/ G.R.V. Hughes// Brit. Med. J. 1983. - V. 287. - P. 1088-1089.

151. Identification of the predominant substrate for ADP-ribosylation by islet activating protein/ G.M. Bokoch et al.// J. Biol. Chem. 1983. - V. 258. - P. 20722075.

152. In vitro and in vivo characterization of avian Escherichia coli. Factors associated with pathogenicity/ J.K. Rosenberger et al.// Avian Dis. 1985. — V. 29. -P. 1094-1107.

153. In vitro and in vivo characterization of avian Escherichia coli. Serotypes, metabolic activity and antibiotic sensitivity/ S.S. Cloud et al.// Avian Dis. — 1985. -V. 29.-P. 1084-1093.

154. International Committee for Standartisation in Haematology: Recomenda-tion for Haemoglobinometry in Human Blood/ Brit. J. Haemat. 1967. - V. 13. - P. 71-75.

155. Jaffe, M. Uber den Niederschlag welchen Pikrinsaure in normalen Harn erzeugt und uber eine neue Reaktion des Kreatinins/ M. Jaffe// Z. Physiol. Chem. — 1886. -V. 10, P. 391-400.

156. Jimoh, F.O. Changes in the activities of some diagnostic enzymes in some rat tissues following the consumption of thermally oxidized groundnut oil/ F.O. Jimoh, A.A. Odutuga// Nig. J. Biochem. & Mol. Biol. 2001. - V. 16. - P. 173-176.

157. John, J.F.J. Enterobacter cloacae: bacteremia, epidemiology, and antibiotic resistance/ J.F.J. John, R.J. Sharbaugh, E.R. Banniser// Rev. Infect. Dis. — 1982. — V. 4.-P. 228-235.

158. Kaplan, M.M. Alkaline phosphatase/ M.M. Kaplan// New England Journal of Medicine. 1972. - V. 286. - P. 200-203.

159. Karnad, A.S. Enterobacter pneumonia/ A.S. Karnad, S.L Berk// South. Med. J. 1987. - V. 80. - P. 601-604.

160. Kaufmann, S. Immunity to bacteria and fungi/ S. Kaufmann// Gurr. Opin. Immunol.- 1989.-V. l.-P. 431-444.

161. La Due, J. Serum GOT activity in human acute transmural myocardial infarction/ J. La Due, F. Wrobleuski, A. Karmen// Science. 1954. - V. 120. - P. 497498.

162. Laboratoiy diagnostics of acute myocardial infarction/ Ed. by W. Stein// Darmstadt. 1988. -73 p.

163. Lafont, J.-P. Bactene conjugation in the digestive tracts of gnotoxenic chickens/ J.-P. Lafont, A. Bree, M. Plat// Appl. Environ. Microbiol. 1984. - V. 47. < -P. 639-642.

164. Lang, H. Creatine Kinase enzymes/ H. LangII Springer Verlag. — 1981. —317 p.

165. Leitner, G. Colonization of Escherichia coli in young turkeys and chickens/ G. Leitner, E.D Heller// Avian Dis. 1992. - V. 36. - P. 211-220.

166. Leybold, A. Importance of colipase for the measurement of serum lipase activity/ A. Leybold, W. Jung ell Adv. Clin. Enzymol. 1986. - V. 4. - P. 60-67.

167. Lior, H. Classification of Escherichia coli. In: Escherichia coli in Domestic Animals and Humans/ H. Lior// Wallingford.: CAB. 1994. - P. 31-72.

168. Lipopolysaccharide recognition, intemalisation, signalling and other cellular effects/ S.H. Diks et al.// Journ. of Endotoxin Research. 2001. - V. 7, № 5. -P. 335-348.

169. List of Analites; Preanalytical Variables. Brochure in Samples: From the Patient to the Laboratory/ W.G. Guder et al.// Darmstadt: GIT Verlag. 1996. - 810 P

170. Lorentz, K. Einfuhrung der neuen Standardmethoden 1994 zur Bestim-mung der katalischen Enzymkonzentrationen bei 37°С/ K. Lorentz, G. Rohle, L. Siekmann// Klinische Chemie Mitteilungen. 1995. - V. 26. - P. 190-192.

171. Lorentz, K. Lipase. In: Clinical laboratory diagnostics/ K. Lorentz// Frankfurt.: TH-Books Verlagsgesellschaft. 1998. - P. 95-97.

172. Lynn, W. Lipopolysachcharide antagonists/ W. Lynn, D. Golenbook// Immunol. Today. 1992. - V. 13. - P. 127.

173. Melamed, D. A vaccine against avian colibacillosis based on ultrasonic inactivation of Escherichia coli/ D. Melamed, G. Leitner, E.D. Heller// Avian Dis. — 1991.-V. 35.-P. 17-22.

174. Mercen, D. Separation of tissue and serum creatine kinase isoenzymes by ion exchange chromatography/ D. Mercen// Clin.Chem. — 1974. — V.20. — P. 36-40.

175. Michael, J.G. Studies on natural antibodies to gram negative bacteria/ J.G. Michael, J.L. Whitby, M. Landy// J. exp. Med. 1962. - V. 115. - P. 131.

176. Molecular cloning of an Escherichia coli plasmid determinant that encodes for the production of heat-stable enterotoxin/ M. So et al.// J. Bacteriol. — 1976.-V.128.-P. 463-472.

177. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays/ T. Mosmann// J. Immunol. Methods. 1983. - V. 65. - P. 55-63

178. Moss, D.W. Clinical enzymology. In: Tietz Textbook of Clinical Chemistry/ D.W. Moss, A.R. Henderson// Philadelphia: W.B. Saunders Company. 1999. -721 p.

179. Moss, D.W. Digestiv enzymes of pancreatic origin. In: Tietz Textbook of Clinical Chemistry/ D.W. Moss. A.R. Henderson// Philadelphia: W.B. Saunders Company. 1999.-P. 721

180. Mu, H. Intestinal absorption of specific structured triacylglycerols/ H. Mu, C.E. Hoy// J. Lipid Res: 2001. - V. 42. - P. 792-798.

181. Myers, R.K. Pulmonary clearance and lesions of lung and air sac in passively immunized and unimmunized turkeys following exposure to aerosolized Escherichia coli/ R.K. Myers, L.H. Arp// Avian Dis. 1991. - V. 31. - P. 622-628.

182. Nair, G.B. The heat stable enterotoxins/ G.B. Nair, Y. Takeda// Microb. Pathog.- 1998.-V. 24.-P. 123-131.

183. Nakamura, K. Comparison of the effects of infectious bronchitis and infectious laryngotracheitis on the chicken respiratory tract/ K. Nakamura, K. Imai, N. Tanimura// J. Сотр. Pathol. 1996 - V. 114. - P. 11 -21.

184. Neer, E.J. Heterotrimeric G proteins: organizers of transmembrane signals/ E.J. Neer// Cell. 1995. - V. 80. - P. 249-257.

185. Neill, R. Synthesis and secretion of the plasmid-coded heat-labile entero-toxin of Escherichia coli in Vibrio cholerael R. Neill, M. Ivins, R. Holms// Science. — 1983.-V. 221.-P. 299-291.

186. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development/ M. Levine et al.// Microbiol. Rev. 1983. - V. 47. - P. 518-550.

187. Newman, D.J. Renal Function and nitrogen metabolites. In: Tietz Textbook of Clinical Chemistry/ D.J. Newman, C.P. Price// Philadelphia: W.B. Saunders Company. 1999.-P. 1204.

188. Nolan, L.K. Transposon mutagenesis used to study the role of complement resistance in the virulence for avian Escherichia coli isolate/ L.K. Nolan, R.E. Woolcy, R.K. Cooper// Avian Dis. 1992. - V. 36. - P. 398-402.

189. Olson, N. Biochemical, physiological and clinical aspects of endotoxae-mia/N. Olson/ZMol. Aspects Med. 1988. -V. 10, №6. - P. 511-529.

190. Passing, H. A New Biometrical Procedure for Testing the Equality of Measurements from two Different Analytical Methods/ H. Passing, W. Bablock// J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1983. - V. 21. - P. 709-720.

191. Passive immunization of chicks against Escherichia coli/ E.D. Heller et al.// Avian Pathol. 1990. -V. 19. - P. 345-354.

192. Persijn, J.P. A new methods for the determination of gamma-glutamyltransferase/ J.P. Persijn, W. van der Silk// J. Clin. Chem. Biochem. 1976. — V. 4.-P. 421.

193. Pesce, M.A. The CK isoenzymes: Findings and their meaning/ M.A. Pesce// Lab. Management. 1982. - V. 20. - P. 25-37.

194. Presence and expression of aerobactin genes in virulent avian strains of Escherichia coli/ J.-P. Lafont et al.// Infect. Immun. 1987. - V. 55. - P. 193-197.

195. Price, C.P. Analytical reviews in clinical biochemistry: The measure-ment of urate/ C.P. Price, D.R. James// Ann. Clin. Biochem. 1988. - V. 25. - P. 484-498.

196. Production of heat-stable enterotoxin II by chicken clinical isolates of Escherichia coli/ N. Akashi et al.// FEMS Microbiol. Lett. 1993. - V. 109. - P. 311-316.

197. Ramires, J.A. The choice of empirical antibiotic therapy for nosocomial pneumonia/ J.A. Ramires// J. Cheother. 1994. - V. 6, № 2. - P. 47-50.

198. Rawadi, G. Mycoplasma membrane lipoprotein induce proinflamma-tory cytokines by a mechanism distinct from that of lipopolysaccharid/ G. Rawadi, R.-R. Sergio// Infection and Immunity. 1996. - V. 64, № 2. - P. 637-643.

199. Recommendation of the Second Joint Task Force of European and other Societies on Coronary Prevention. Prevention of coronary heart disease in clinical practice.-Eur. Heart. J.- 1998.-V. 19.-P. 1434-1503.

200. Recommendations for reference method for haemoglobinometry in human blood (ICSH standard 1995) and specifications for international haemiglobinocyanide standard (4th edition)/ A. Zwart et al.// J. Clin. Pathol. 1996. - V. 49. - P. 271274.

201. Rifai, N. Lipids, lipoproteins and apolipoproteins. In: Tietz Textbook of Clinical Chemistry/ N. Rifai, P.S. Bachorik, J.J. Albers// Philadelphia: W.B. Saunders Company. 1999. - P. 809-861.

202. Roux, E. Contribution a l'etude de la diphtheria/ E. Roux, A. Yersin// Ann. Inst. Pasteur. 1888. - P. 629-661.

203. Rowley, D. Sensitivity of rough gramnegative bacteria to the bacterial action of serum/ D. Rowley// J. Bact. 1968. - V. 95. - P. 1647.

204. Schaefer, E.J. Overview of the diagnosis and treatment of lipid dis-orders. In: Handbook of lipoprotein testing/ E.J. Schaefer, J. McNamara// Washington: AACC press. 1997. - P. 448.

205. Schlessinger, D. Bacterial toxins. In: Mechanisms of microbial disease/ D. Schlessinger, M. Schaechter// Baltimore: Williams and Wilkins. 1993. - P. 162175.

206. Smith, D.G.E. Activities of antilipopolysaccharide immunoglobulins/ D.G.E. Smith// Edinburgh: University of Edinburgh. 1988. - P. 115-121.

207. Snider, D.P. The mucosal adjuvant activities of ADP-ribosylating bacterial enterotoxins/ D.P. Snider// Crit. Rev. Immunol. 1995. - V. 15. - P. 317-348.

208. So, M. Nucleotide sequence of transposon Tnl681 encoding a heat-stable toxin (ST) and its identification in enterotoxigenic Escherichia coli strains/ M. So, ; B.J. McCarthy// Proc. Nation. Acad. Sci. USA. 1980. - V. 77. - P. 4011-4015.

209. Solomon, J.B. Immunity to Salmonella gallirtarum during ontogeny of the chicken/ J.B. Solomon// Immunology. 1968. - V. 15. - P. 219.

210. Spenser, K. Analytical reviews in clinical biochemistry: The estimation of creatinine/ K. Spenser// Ann. Clin. Biochem. 1986. - V. 23. - P. 1-25.

211. Stein, W. Creatine kinase (total activity), creatine kinase isoenzymes and variants. In: Clinical laboratory diagnostics/ W. Stein// Frankfurt: TH-Books Ver-lagsgesellschaft. 1998. - P. 71-80.

212. Studies on the detergent inhibition of pancreatic lipase activity/ Y. Gar-gouri et al.// J. of Lipid Research. 1983. -V. 24. - P. 1336-1342.

213. Studies on the serology of the Escherichia coli groups/ W.H. Ewing et al.// U.S. Departament of Health Education & Welfare. Public Health Service. — Atlanta. - GA. - 1956. - 42 p.

214. Szasz, G. A kinetic photometric method for serum y-glutamyltrans-ferase/ G. Szasz//J. Clin. Chem. 1969. - V. 15.-P. 124-136.

215. Talke, H. Enzymatische Harnstoffbestimmung im Blut und Serum im op-tischen Test nach Warburg/ H. Talke, G.E. Schubert// Klin. Wschr. 1965. - V. 43. -P. 174-175.

216. Thomas, L. Alanine aminotrasferase (ALT), Aspartate aminotrasferase (AST). In: Clinical laboratory Diagnostics/ L. Thomas// Frankfurt: TH-Books Ver-lagsgesellschaft. 1998. - P. 565.

217. Tietz, N.W. Clinical Guide to Laboratory Tests/ N.W. Tietz// Philadelphia: W.B. Saunders Company. 1995. - P. 629.

218. Tietz, N.W. Fundamentals of clinical chemistry/ N.W. Tietz// Philadelphia: W.B. Saunders Company. 1987. - P. 761.

219. Tietz, N.W. Lipase in serum — the elusive enzyme: an overview/ N.W. Tietz, D.F. Shuey// Clin. Chem. 1993. - V. 39. - P. 746-756.

220. Triacylglycerol composition in colostrum, transitional and mature human milk/ S.M. Pons et al.// Eur. J. Clin. Nutr. 2000. - V. 54. - P. 878-882.

221. Urea: its distribution, in and. elimination from the animal body/ E.K. Marshall et al.// J. Biol. Chem. 1914. -V. 18. - P. 53-80.

222. Use of the dot-blot immunogold assay to identify a proliferative antigen in the initial cells of a wheat stem meristem/ M.V. Sumaroka et al.// J. Immunoassay. 2000. -V. 21, № 4. - P. 401-410.

223. Virulence factors of Escherichia coli associated with colisepticemia in chickens and turkeys/ D.A. Emery et al.// Avian Dis. 1992. - V.36. - P. 504-511.

224. Weinstein, R.A. Epidemiology and control of nosocomial infections in adult intensive care units/ R.A. Weinstein// Am. J. Med. 1991. - V. 91, №3B. - P. 179-184.

225. Wiegel, J. Isolation of Lipopolysaceharides and the Effect of Polymyxin В on the Outer Membrane of Corynebacterivm autotrophicum! J. Wiegel, F. Mayer// Arch. Microbiol. 1978. -V. 118. - P. 67-69.

226. Wolter, J. Hepatic clearence of endotoxins: differences in arterial and portal venous infusion/ J. Wolter, H. Liehr, M. Grun// J. Reticuloendoth. Soc. —1978. — V. 23, №2.-P. 145-152.

227. Wroblewski, F. Lactate dehydrogenase activity in blood/ F. Wroblewski, J.S. La Due// Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1955. - V. 90. - P. 210.

228. Wu, A. Cardiac markers/ A. Wu// New Jersey. 1998. -225 p.

229. Yamomoto, T. Evolutioncry origin of pathogenic determinants in enterotoxigenic Escherichia coli and Vibrio cholerae! T. Yamomoto, T. Gojobri, T. Yoko-to//J. Bactariol. 1987. - V. 169.-P. 1332-1357.

230. Yogaratnam, V. Analysis of the causes of high rates of carcass rejection at a poultry processing plant/ V. Yogaratnam// Vet. Rec. 1995. - V. 137. - P. 215217.

231. Zhou, Z. The vascular response to adrenergic stimulation in pithed rats following endotoxin/ Z. Zhou, B. Iones// Circulat. Shock. 1990. - V. 32. - P. 55-66.

Информация о работе

Малинин, Михаил Леонидович
кандидата биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Оценка устойчивости цыплят к колибактериозу по микробиологическим и биохимическим показателям - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы