Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Оценка спонтанного и индуцированного мутагенеза в клетках человека в зависимости от витаминной обеспеченности

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Оценка спонтанного и индуцированного мутагенеза в клетках человека в зависимости от витаминной обеспеченности"

На правах рукописи

Сиднева Екатерина Сергеевна

ОЦЕНКА СПОНТАННОГО И ИНДУЦИРОВАННОГО МУТАГЕНЕЗА В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИТАМИННОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ

03.00.15-генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена

в Государственном учреждении Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор А.Д. Дурнев Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Ю.А. Ревазова Доктор медицинских наук, профессор Г.Д. Засухина

Ведущее учреждение:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра генетики

Защита диссертации состоится

2004 г. в_

на заседании Диссертационного Совета Д.001.016.01 при ГУ МГНЦ РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета

доктор биологических наук, профессор

Л.Ф. Курило

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Разноплановыми исследованиями, проведенными во второй половине двадцатого столетия, была доказана важная роль мутагенеза в возникновении наследственных, онкологических, сердечно-сосудистых и других широко распространенных заболеваний (Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., 1989; Sobels F.H., 1989; Заридзе Д.Г., Букин Ю.В., 1990; Andreassi M.G., 2003).

Выявление этой фундаментальной причинно-следственной зависимости поставило задачу по разработке подходов к профилактике отдаленных последствий мутагенеза на основе знания его основных закономерностей (Арутюнян P.M., 1994; Дурнев А.Д., Середенин С.Б., 1998; Дурнев А.Д., 2001, Fergusson L.R., 1994; De Flora S., Ramel С, 1998).

Уровни спонтанного и индуцированного мутагенеза у человека подвержены значительным вариациям и могут меняться в зависимости от методических особенностей оценки, а также от сезона, года, изменения магнитного поля Земли, индивидуальных характеристик (Чеботарев А.Н. и соавт., 2001).

Предполагается, что реализация повреждающих эффектов мутагенов может зависеть от качества пищи и характера питания, в частности, от витаминной обеспеченности организма (Дурнев А.Д., Середенин СБ., 1998; Morley A.A., Turner D.R., 1999). Это предположение базируется, с одной стороны, на сведениях об антиоксидантных свойствах витаминов С, А, Е и каротиноидов (Halliwell В., 2001; Claycombe K.J., Meydani S.N., 2001; Collins A.R., 2001), с другой стороны, на определении свободнорадикального окисления как ведущего механизма индуцированного мутагенеза (Порошенко Г.Г., Абилев С.К., 1988; Дурнев А.Д., Середенин С.Б., 1998; Beckman K.B., Ames В., 1998).

Действие различных витаминов на мутагенез в большинстве случаев изучалось в экспериментах на животных и in vitro. Результаты таких работ

РОС. ИАЦЦОНАЛиЫАЯ БйБЛВДТИСА С. Пете?

ОЭ 200

сложно экстраполировать на человека, поскольку эксперименты in vitro не отражают реальных механизмов биологического действия витаминов in vivo, a эксперименты на животных не всегда могут быть использованы из-за принципиальных различий в процессах обмена витаминов. Кроме того, было показано, что в зависимости от дозы и состава витаминных комплексов, характера экспериментов, одни и те же витамины могут проявлять анти-, ко- и даже мутагенные свойства (Дурнев А. Д., 2001).

Исследования, посвященные взаимосвязи витаминной обеспеченности и уровня мутагенеза у человека, представлены только единичными наблюдениями, и результаты их недостаточны для обобщающих заключений (Никитина В.А. и соавт., 1999; Дурнев А.Д. и соавт., 2002; Kucuk О. et al., 1995). Взаимосвязи между параметрами, характеризующими, с одной стороны, чувствительность клеток к мутагенным воздействиям, а с другой -обеспеченность основными нутриентами, не изучены. Между тем, такие работы могут иметь значение для обоснования подходов к возможной нутрициологической регуляции мутагенеза и для разработки конкретных способов их реализации. Эти результаты также могут играть существенную роль при интерпретации данных по мониторингу наследственной изменчивости человека и анализе влияния на наследственные структуры ставшего традиционным масштабного приема витаминно-минеральных комплексов в дозах, превышающих суточные потребности. Они могут также стать научной основой для оптимизации количественного и качественного состава витаминно-минеральных комплексов.

Цель исследования

Изучить уровень спонтанных хромосомных аберраций и интенсивность химически индуцированного in vitro мутагенеза в лимфоцитах человека на фоне приема витаминно-минералыюго комплекса с параллельным определением витаминной обеспеченности организма.

Задачи исследования

1. Оценить уровень спонтанного мутагенеза в лимфоцитах доноров методом учета хромосомных аберраций до, во время и после месячного приема витаминно-минерального комплекса.

2. Определить частоту хромосомных аберраций, индуцированных in vitro химическими мутагенами (диоксидином и хлоридом кадмия), на разных сроках приема витаминно-минерального комплекса.

3. Исследовать зависимость частоты клеток со спонтанными и индуцированными хромосомными аберрациями от содержания отдельных витаминов в плазме крови обследованных доноров.

Научная новизна

Проведенное исследование показало зависимость чувствительности клеток человека к мутагенным воздействиям от обеспеченности витаминами с антиоксидантной активностью. Установлено, что увеличение концентрации основных витаминов, вызванное длительным регулярным приемом витаминно-минерального комплекса, повышает устойчивость клеток к цитогенетическому действию хлористого кадмия и диоксидина. Показано, что частота спонтанного мутирования обратно пропорциональна содержанию в плазме крови витамина С; уровень химически индуцированных хромосомных аберраций обратно пропорционален содержанию бета-каротина и суммы каротиноидов и связан экспоненциальной зависимостью с содержанием витаминов Е и В2.

Таким образом, главным научным результатом представленной работы является практическое подтверждение гипотезы о возможности модификации индуцированного мутагенеза у человека с помощью алиментарных факторов -витаминов-антиоксидантов и витамина Вг-

Теоретическая и практическая значимость

В результате проведенного исследования установлено, что применяемый витаминно-минеральный комплекс увеличивает устойчивость клеток человека к повреждающему действию химических мутагенов, не оказывает влияния на

спонтанный уровень мутирования и не вызывает комутагенной модификации цитогенетического эффекта мутагенов. Эти наблюдения открывают перспективу практического использования исследованного комплекса для профилактики индуцированного мутагенеза у человека. Кроме того, выявление зависимостей проявления цитогенетических эффектов мутагенов от концентрации витаминов в плазме крови создает доказательную базу для направленного создания витаминных комплексов с заданными антимутагенными свойствами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Прием витаминно-минерального комплекса на протяжении месяца не влияет на спонтанную частоту хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров.

2. Прием витаминно-минерального комплекса не вызывает комутагенной модификации цитогенетических эффектов хлорида кадмия и диоксидина. Напротив, он приводит к значимому снижению цитогенетических эффектов этих мутагенов. Защитный эффект приема витаминов при индукции хромосомных аберраций диоксидином зависит от его концентрации и более, выражен при использовании мутагена в меньшей концентрации.

3. Частота клеток с хромосомными аберрациями зависит от содержания отдельных витаминов в плазме крови: частота спонтанного мутирования обратно пропорциональна содержанию витамина С; уровень химически индуцированных хромосомных аберраций обратно пропорционален содержанию бета-каротина и суммы каротиноидов и экспоненциально зависит от содержания витаминов

Апробация работы

Основные положения работы доложены на II Европейской цитогенетической конференции (Вена, 1999), на научной конференции «Медико-генетическая оценка пищевых продуктов» (Москва, 2003), на III конференции молодых ученых России с международным участием

«Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), на VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2004), на Ш съезде генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), на научном семинаре Медико-генетического научного центра РАМН.

Исследование поддержано грантом РФФИ № 03-04-48591.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на стр.

машинописного текста, иллюстрирован таблицами и рисунками. Библиографический указатель включает источника отечественной и

зарубежной литературы.

Материалы и методы исследования

В эксперименте участвовали 15 практически здоровых доноров (8 женщин и 7 мужчин) в возрасте от 24 до 48 лет. Средний возраст доноров был равен 32,5 ± 2,3 года. От каждого добровольца было получено информированное согласие на участие в эксперименте. В течение последних шести месяцев доноры не подвергались рентгеновским обследованиям, не болели в течение трех месяцев вирусными заболеваниями и не контактировали с вредными производственными химическими факторами. На протяжении всего периода обследования они сохраняли привычную, индивидуальную диету, работу и индивидуальный ритм жизни. В течение 30 дней добровольцы принимали витаминно-минеральный комплекс по одной таблетке утром и вечером. Суточные дозы принимаемых веществ представлены в табл. 1.

Помимо перечисленных в табл. 1 компонентов, в состав комплекса входили гинко билоба, экстракт чеснока, коэнзим р10, экстракт виноградных косточек, корень женьшеня, гуарана, эхинацея, спирулина, маточное молочко, порошок Алфалфа, хлорелла.

Таблица 1.

Состав витаминно-минерального комплекса

Компоненты Суточные дозы Рекомендуемые нормы

принимаемых суточного потребления*

веществ

ВИТАМИНЫ

Витамин А (бета-каротин) 3200 МЕ 3333 МЕ

Витамин С 90 мг 70-100 мг

Витамин Е 98,2 МЕ 10-12 МЕ

Витамин В1 20 мг 1,1-2,1 мг

Витамин Вг 20 мг 1,3-2,4 мг

Витамин В5 30 мг 4-7 мг

Витамин Вй. 12 мг 1,8-2,0 мг

Витамин Вп 100 мкг 3,0 мкг

Витамин Б 600 МЕ 100 МЕ

Витамин К 20 мкг 65-80 мкг

Ниацинамид 50 мг 14-28 мг

Биотин 60 мкг 30-100 мкг

Фолиевая кислота 800 мкг 200 мкг

МИНЕРАЛЫ

Хром 13 мкг 50-200 мкг

Кальций 300 мг 80-800 мг

Медь 2 мг 1,5-2,0 мг

Йод 300 мкг 150 мкг

Железо 8 мг 10-18 мг

Магний 100 мг 400 мг

Молибден 50 мкг 75-250 мкг

Никель 2,5 мкг •

Калий 60 мг -

Селен 40 мкг 20-100 мкг

Кремний 20 мкг -

Ванадий 20 мкг -

Марганец 3 мг 2,0-5,0 мг

Фосфор 230 мг 1200 мг

Цинк 15 мг 15 мг

* Нормы физиологических потребностей в пищевых веществах и энергии для различных групп населения России. МЗ РФ, Москва, 1991.

Образцы крови доноров (20 мл) забирали натощак из локтевой вены в стандартные пробирки с гепарином (Vacutainer, BD, Великобритания) трижды: до начала приема витаминно-минерального комплекса, через 14 и 30 дней.

Кровь культивировали по стандартной методике. Состав культуральной смеси: среда RPMI-1640 с глутамином (Sigma, Германия) - 75 % (7,5 мл), сыворотка телячья эмбриональная (BioClot, Германия) - 15 % (1,5 мл), кровь -10 % (1 мл), фитогемагтлютинин Р (Difco, США) - 0,02 мл.

На 50-м часу культивирования вводили мутагены (диоксидин - 0,03 мг/мл и ОД мг/мл; кадмия хлорид - 0,02 мг/мл). Общая продолжительность культивирования составляла 54 часа. Колхицин вводили за 2 часа до начала фиксации клеток. Культуры фиксировали охлажденной смесью ледяной уксусной кислоты и метилового спирта в соотношении 1:3.

Цитогенетические препараты готовили стандартным суховоздушным способом, окрашивали азур-эозином. Хромосомные аберрации анализиро!али в соответствии с международными рекомендациями без кариотипирования метафаз (Бочков Н.П., 1974; Ishidate M., 1988).

Определение витаминов и их метаболитов в плазме крови доноров проводилось сотрудниками лаборатории витаминов и минеральных веществ ГУ НИИ питания РАМН. Концентрацию витамина С определяли микрометодом визуального титрования 2,6-дихлорфенолиндофенолом (реактив Тильманса). Рибофлавин определяли с помощью титрования рибофлавинсвязывающим апобелком из куриного яйца. Концентрацию витамина А, каротиноидов, и витамина Е оценивали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы «DataFit». Определяли параметры уравнений регрессии, их доверительные интервалы, значимость регрессии (по t-критсрию), адекватность уравнений регрессии экспериментальным данным (по F-критерию).

Результаты исследования и их обсуждение

1. Цитогенетические исследования

1.1. Спонтанныйуровеньхромосомных аберраций

Спонтанный уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров учитывался до начала, через 14 и 30 дней приема витаминно-минерального комплекса. Обобщенные данные по основным параметрам хромосомных аберраций представлены в табл. 2. Исходный уровень клеток с хромосомными аберрациями составил 2,8 ± 0,2 %, через 14 дней приема комплекса - 3,0 ± 0,2 %, через 30 дней - 2,7 ±0,2%.. Сравнение этих данных показало отсутствие статистически достоверных различий, следовательно, прием витаминно-минерального комплекса не оказал влияния на спонтанный уровень мутагенеза.

Частота аберрантных клеток варьировала от 1,3 до 4,3 % до начала приема комплекса, от 1,7 до 4,3 % через 14 дней и от 2,0 до 4,7 % через 30 дней. Полученные значения согласуются с современными данными литературы по частоте хромосомных аберраций у населения России (Бочков Н.П. и соавт., 2001). Соотношение типов аберраций соответствовало данным, характеризующим спонтанное мутирование в популяции. Основную долю аберраций составляли одиночные фрагменты (2,4-2,5 на 100 клеток). На разных сроках эксперимента соотношение разных типов аберраций не различалось.

1.2. Уровень хромосомных аберраций, индуцированных in vitro хлоридом кадмия

В табл. 3 представлены суммарные по группе результаты анализа уровня хромосомных аберраций при воздействии на культуру клеток хлоридом кадмия (0,02 мг/мл). Средняя частота клеток с хромосомными аберрациями составила 5,5 % до начала приема витаминно-минерального комплекса, 5,2 % через 14 дней и 4,3 % через 30 дней. Анализ полученных данных показал, что в образцах крови, взятых на 30-й день, уровень хромосомных повреждений, вызванных

Таблица 2.

Обобщенная характеристика спонтанных хромосомных аберраций

Показатель До приема комплекса Через 14 дней Через 30 дней

Число проанализированных клеток 4800 4500 4800

Клетки с аберрациями, % (размах колебаний) 2,8 ±0,2 (1,3-4,3) 3,0 ± 0,2 (1,7-4,3) 2,7 ±0,2 (2,0-4,7)

Аберрации, на 100 клеток 3,0 ±0,2 3,1 ±0,3 2,8 ± 0,2

Одиночные фрагменты, на 100 клеток 2,4 2,5 2,4

Парные фрагменты, на 100 клеток 0,3 0,4 0,3

Хроматидные обмены, на 100 клеток 0,04 0,1 0,04

Хромосомные обмены, на 100 клеток 0,1 0,1 0,04

Таблица 3.

Обобщенная характеристика хромосомных аберраций, индуцированных хлоридом кадмия

Показатель До приема комплекса Через 14 дней Через 30 дней

Число проанализированных клеток 4800 4800 4600

Клетки с аберрациями, % (размах колебаний) 5,5 ± 0,3 (4,0-7,0) 5,2 ±0,4 (2,3-7,3) 4,3 ±0,3* (2,0-6,3)

Аберрации, на 100 клеток 5,9 ±0,3 5,5 ±0,3 4,4 ± 0,3*

Одиночные фрагменты, на 100 клеток 5,0 4,7 3,9*

Парные фрагменты, на 100 клеток 0,6 0,5 0,4

Хроматидные обмены, на 100 клеток 0,2 0,09 0,04

Хромосомные обмены, на 100 клеток 0,3 0,2 0,1

Примечание: здесь и далее (в табл. 4, 5 и 6) значения, выделенные полужирным шрифтом, статистически достоверно отличаются от данных, полученных до начала приема комплекса.

*р<0,05

хлоридом кадмия, достоверно ниже, чем перед началом приема комплекса (р < 0,05).

Колебания частоты аберрантных клеток составили 4,0-7,0 % до приема витаминно-минерального комплекса, 2,3-7,3 % и 2,0-6,3 %, соответственно через 14 и 30 дней. На первом сроке эксперимента на каждые 100 клеток приходилось 5,0 одиночных фрагментов, 0,6 парных фрагментов, 0,2 хроматидных обменов и 0,3 хромосомных обменов; на втором сроке 4,7 одиночных, 0,5 парных фрагментов, 0,09 хроматидных и 0,2 хромосомных обменов; на третьем сроке - 3,9, 0,4, 0,04 и 0,1, соответственно. Сравнение распределения типов аберраций до и после приема витаминно-минерального -комплекса показало, что снижение уровня хромосомных аберраций произошло преимущественно за счет одиночных фрагментов (р < 0,05).

1.3. Уровень хромосомных аберраций, индуцированных in vitro диоксидином (0,03 мг/мл)

Обобщенные результаты анализа уровня хромосомных аберраций при добавлении в культуру диоксидина в концентрации 0,03 мг/мл представлены в табл. 4. До начала приема витаминно-минерального комплекса диоксидин в концентрации 0,03 мг/мл вызывал повреждение 10,0 % клеток. Через 14 дней уровень аберрантных метафаз составил 8,1 %, а через 30 дней - 7,2 %. Размах колебаний значений на трех сроках эксперимента составил, соответственно, 6,0-13,8 %, 6,3-11,3 % и 4,7-11,0 %. При сравнении полученных результатов было обнаружено, что уровень клеток, поврежденных диоксидином. в концентрации 0,03 мг/мл, стал достоверно ниже уже через 14 дней приема витаминно-минерального комплекса (р < 0,01). Через 30 дней различия стали еще более значимыми (р < 0,001).

Распределение обнаруженных аберраций по типам было следующим: на каждые 100 проанализированных клеток до приема комплекса, через 14 и 30 дней, соответственно, зафиксировано 9,5, 7,8 и 7,0 одиночных фрагментов; 0,7, 0,7 и 0,4 парных фрагментов; 0,2, 0,08 и 0,09 хроматидных обменов; 0,2, 0,06 и

0,09 хромосомных обменов. Сравнение распределения типов аберраций на разных сроках эксперимента показало, что после приема витаминно-минерального комплекса доля одиночных фрагментов и хромосомных обменов через 14 и 30 дней стала достоверно меньше исходной (р < 0,01 и р<0,05, соответственно).

1.4. Уровень хромосомных аберраций, индуцированных in vitro диоксидином (0,1 мг/мл)

При анализе чувствительности клеток доноров к повреждающему действию диоксидина in vitro в более высокой концентрации (0,1 мг/мл) были получены результаты, представленные в обобщенном виде в табл. 5. Уровень аберрантных метафаз до начала приема витаминно-минерального комплекса колебался от 10,8 % до 24,0 % (в среднем 17,1 %). Через 14 дней приема комплекса этот показатель составил от 13,0 % до 20,0 % (в среднем 16,3 %), через 30 дней - от 11,8 % до 20,0 % (в среднем 14,8 %). Сравнение среднегрупповых значений показало, что на 30-й день частота поврежденных клеток достоверно ниже по сравнению с исходной величиной (р < 0,05).

Среди аберраций преобладали одиночные фрагменты: на 100 клеток их было обнаружено 17,6, 16,6 и 15,6 до начала, через 14 и 30 дней приема витаминно-минерального комплекса, соответственно. Остальные типы хромосомных аберраций распределились следующим образом: на 100 клеток выявлено 1,1, 1,1 и 0,6 парных фрагментов на три срока эксперимента, соответственно; 0,1,0,3 и ОД хроматидных обменов; 0,2, 0,4 и 0,2 хромосомных обменов. Сравнение распределения типов аберраций показало значимо более низкую долю парных фрагментов после приема витаминно-минерального комплекса по сравнению с исходным значением (р < 0,05). Доля остальных типов аберраций не изменилась.

Таблица 4.

Обобщенная характеристика хромосомных аберраций, индуцированных диоксидином (0,03 мг/мл)

Показатель До приема комплекса Через 14 дней Через 30 дней

Число проанализированных клеток 4800 4600 4600

Клетки с аберрациями, % (размах колебаний) 10,0 ±0,6 (6,0-13,8) 8,1 ±0,4** (6,3-11,3) 7,2 ±0,5*** (4,7-11,0)

Аберрации, на 100 клеток 10,6 ±0,4 8,6 ±0,4*** 7,5 ±0,4***

Одиночные фрагменты, на 100 клеток 9,5 7,8 7,0***

Парные фрагменты, на 100 клеток 0,7 0,7 0,4

Хроматидные обмены, на 100 клеток 0,2 0,08 0,09

Хромосомные обмены, на 100 клеток 0,2 0,06 0,09*

* р < 0,05, ** р < 0,01, *** р < 0,001

Таблица 5.

Обобщенная характеристика хромосомных аберраций, индуцированных диоксидином (0,1 мг/мл)

Показатель До приема комплекса Через 14 дней Через 30 дней

Число проанализированных клеток 5100 4500 5100

Клетки с аберрациями, % (размах колебаний) 17,1 ± 0,8 (10,8-24,0) 16,3 ±0,6 (13,0-20,0) 14,8 ±0,6* (11,8-20,0)

Аберрации, на 100 клеток 19,0 ±0,5 18,3 ±0,6 16,5 ±0,5**

Одиночные фрагменты, на 100 клеток 17,6 16,6 15,6

Парные фрагменты, на 100 клеток 1,1 1,1 0,6*

Хроматидные обмены, на 100 клеток 0,1 0,3 0,1

Хромосомные обмены, на 100 клеток 0,2 0,4 0,2

* р < 0,05, ** р < 0,01

2. Анализ взаимосвязи между цитогенетическими параметрами и

содержанием витаминов в плазме крови доноров 2.1. Исследование содержания витаминов в плазме крови доноров В табл. 6 представлены результаты определения водорастворимых (В2, С) и жирорастворимых (Е, А, бета-каротина и суммы каротиноидов) витаминов в плазме крови доноров до начала приема витаминно-минерального комплекса, через 2 недели и через месяц.

Таблица 6.

Концентрация витаминов в плазме крови доноров

Показатель Норма До приема комплекса Через 14 дней Через 30 дней

Витамин В2, нг/мл 6,0-20,0 6,3 ±1,3 11,1 ± 1,5* 10,2 ±1,9

Витамин С, мг/мл 0,4-1,5 0,98 ±0,06 1,11 ±0,06 1,18 ±0,06*

Витамин Е, мг/дл 0,8-1,5 0,68 ±0,03 0,80 ±0,04* 1,28 ±0,08***

Ретинол, мкг/дл 30-80 49,9 ±3,2 52,9 ±3,3 54,8 ±3,9

Бета-каротин, мкг/дл 10-85 11,5 ±1,6 32,8 ±4,3*** 59,8 ±6,5***

Сумма каротиноидов, мкг/дл 80-230 35,7 ±3,3 56,6 ±5,7** 92,2 ± 8,4***

* р < 0,05, ** р < 0,01, *** р < 0,001

При исследовании концентрации витамина В2 в крови доноров оказалось, что до приема витаминно-минерального комплекса только у 1/3 обследованных лиц его уровень соответствовал норме. На 14-й день эксперимента среднегрупповое значение достоверно повысилось.

Уровень витамина С у всех доноров соответствовал значениям нормы, поэтому прием этого витамина в составе комплекса можно считать дополнительным. Через 30 дней приема его уровень был значимо выше по сравнению с исходным.

Нормальный уровень витамина Е был обнаружен только у 3-х человек из 15-ти. Повышение его уровня до нижней границы нормы у всех доноров было

зафиксировано уже на 14-й день приема витаминно-минерального комплекса, и еще большее содержание - на 30-й.

Дефицита ретинола в плазме крови доноров исходно не наблюдалось, а при анализе на последующих сроках эксперимента его концентрация достоверно не повысилась.

У всех доноров уровень бета-каротина и суммы каротиноидов был ниже нормы. Значения, полученные на 14-й и 30-й дни приема комплекса, достоверно отличаются от исходных и соответствуют норме.

2.2. Анализ зависимости частоты клеток с хромосомными аберрациями от содержания отдельных витаминов в плазме крови обследованныхдоноров

Сопряженный анализ данных по хромосомной изменчивости и витаминной обеспеченности позволил заключить, что частота спонтанного мутирования обратно пропорционально зависит от содержания в крови витамина С (рис. 1).

005

оде • • « •

0 р* - • •

0.М - • • • * •

>- 0.ПЗ - • •

ода - • • • • • •—•— • • •

0Д2 - • III • м •

оде .. г. . .. I.. . . Г . . . . Г . • •

0Е ¡0 ол> ОД] 0,90 1Д) 1,10 1,20 1Д 1,40 1.50

X

Рис. 1. Обратно пропорциональная зависимость (у=ах+^ уровня клеток со спонтанными аберрациями от содержания витамина С в плазме крови. Ось X - концентрация витамина С в плазме крови (мг/дл); ось Y - доля клеток с хромосомными аберрациями.

Проведенный регрессионный анализ показал, что проявление цитогенетического эффекта хлористого кадмия связано экспоненциальной зависимостью от содержания витамина Е (рис. 2) и обратно пропорционально зависит от содержания бета-каротина (рис. 3).

Рис. 2. Экспоненциальная зависимость (у=1-ехр(-а*Ьх)) уровня клеток с аберрациями, индуцированными хлоридом кадмия, от содержания витамина Е в плазме крови. Ось X - концентрация витамина Е в плазме крови (мг/дл); ось У - доля клеток с хромосомными аберрациями.

ол

•

0Д7 • • • »

»

• «

оде • •

* •

—■ ___• • •

ь- 0Д5 • 1 . - » » •

_ «

• • •

004 • • —

• » • •

ода • •

• •

. . 1 . . . . 1 . . . . 1 . . . . 1 . .

одо 10« ЯШ 300) Л ДО €000 60.00 X 7000 Ю0О 90/30

Рис. 3. Обратно пропорциональная зависимость (у=ах+Ь) уровня клеток с аберрациями, индуцированными хлоридом кадмия, от содержания бета-каротина в плазме крови. Ось X - концентрация бета-каротина в плазме крови (мкг/дл); ось У - доля клеток с хромосомными аберрациями.

Регрессионный анализ показал, что цитогенетический эффект диоксидина в концентрации 0,03 мг/мл обратно пропорционален содержанию бета-каротина (рис. 4) и суммы каротиноидов (рис. 5).

0,14 0,13 0,12 0,11 0.10 >-0.09

оде ода оде оде

0)М

0.00 10.00 ЯД) 30,00 40Д! 60,00 60Д) 70,00 80 яо 90.00

X

к *

Рис. 4. Обратно пропорциональная зависимость (у=ах+Ь) уровня клеток с аберрациями, индуцированными диоксидином (0,03 мг/мл), от содержания бета-каротина в плазме крови. Ось X - концентрация бета-каротина в плазме крови (мкг/дл); ось У - доля клеток с хромосомными аберрациями.

Рис. 5. Обратно пропорциональная зависимость (у=ах+Ь) уровня клеток с аберрациями, индуцированными диоксидином (0,03 мг/мл), от содержания суммы каротиноидов в плазме крови. Ось X - концентрация суммы каротиноидов в плазме крови (мкг/дл); ось У - доля клеток с хромосомными аберрациями.

014 0,13 0,12 о.и 0.10 >- ода о,ов

007

оде оде

0,04

• •

0,00 2000 40ДО Е0Д) 80ДО 100 Д) 120 Д) 140Д

X

Регрессионный анализ показал, что цитогенетический эффект диоксидина в концентрации 0,1 мг/мл обратно пропорционален содержанию бета-каротина (рис. 6) и суммы каротиноидов (рис. 7) и экспоненциально зависит от содержания витаминов Е и Вг (рис. 8,9).

Рис. 6. Обратно пропорциональная зависимость (у=ах+Ь) уровня клеток с аберрациями, индуцированными диоксидином (0,1 мг/мл), от содержания бета-каротина в плазме крови. Ось X - концентрация бета-каротина в плазме крови (мкг/дл); ось У - доля клеток с хромосомными аберрациями.

Рис. 7. Обратно пропорциональная зависимость (у=ах+Ь) уровня клеток с аберрациями, индуцированными диоксидином (ОД мг/мл), от содержания суммы каротиноидов в плазме крови. Ось X - концентрация суммы каротиноидов в плазме крови (мкг/дл); ось У - доля клеток с хромосомными аберрациями.

0.24

ОД

0.20 0,18 > • ■ • ч . . : ■ ■ • ^Ч- III 1 а

016 •

о.ч ■ * • • • • » •

0,12 •

'0,20 040 0.Б0 № 1,00 120 1,40 Ц60 130 2X0

X

Рис. 8. Экспоненциальная зависимость (^а^ехрф/х)) уровня клеток с аберрациями, индуцированными диоксидином (0,1 мг/мл), от содержания витамина Е в плазме крови. Ось X - концентрация витамина Е в плазме крови (мг/дл); ось Y - доля клеток с хромосомными аберрациями.

Рис. 9. Экспоненциальная зависимость (ехр[а+Ь/х+с*1о£(х)]) уровня клеток с аберрациями, индуцированными диоксидином (0,1 мг/мл), от содержания витамина Вг в плазме крови. Ось X - концентрация витамина В2 в плазме крови (мг/дл); ось Y — доля клеток с хромосомными аберрациями.

В России все большее распространение получает дополнительное потребление различных витаминов и других биологически активных добавок. Любые биологически активные вещества, в том числе и витамины, с генотоксической точки зрения могут быть нейтральными, но могут вызывать мутагенные, комутагенные или. защитные эффекты. Принимая во внимание высокую значимость индуцированного мутагенеза в половых и соматических клетках человека в заболеваемости в современных экологических условиях, поиск способов защиты от действия химических мутагенов является актуальной задачей. Безусловно, мутационный процесс в клетках человека является сложным и многоступенчатым явлением, но уже убедительно доказано, что модификация его возможна.

В данной работе основное внимание было сосредоточено на защите хромосом от повреждений, индуцируемых по свободно-радикальному типу (на стадии клеточного цикла G2). Защита клеток с помощью приема витаминно-минерального комплекса осуществлялась на уровне организма, а индукция аберраций - в культуре in vitro в первом митозе. Примененный комплекс можно отнести к группе адаптогенных препаратов, в которых содержание большинства витаминов превышено в 3-5 раз, а витаминов группы В - в 10-30 раз. Именно такие дозы в течение 14 дней позволили нормализовать концентрацию витаминов в крови испытуемых. Реакция клеток на прием витаминов, оцениваемая по уровню спонтанных хромосомных аберраций или по интенсивности индуцированного мутагенеза, могла быть незначительной или разнонаправленной. В связи с этим потребовалось соблюдение определенных условий эксперимента: обоснованный размер выборок анализируемых клеток, позволивший получить достоверные результаты; одинаковый размер выборок клеток контрольных и экспериментальных образцов; трехуровневая индукция хромосомных аберраций (5,. 10 и 17 % клеток с аберрациями); большая группа индивидов (15 человек), обеспечивающая «выравнивание» индивидуальных колебаний; учет не только

количества клеток с аберрациями, но и типов аберраций; строгий подход к статистической обработке данных.

Как показали экспериментальные результаты и статистический анализ, прием витаминно-минералъного комплекса не изменял уровня и характера спонтанных хромосомных аберраций, т. е. примененный комплекс не обладал генотоксичностью. Его использование безопасно с генетической точки зрения. Что касается аберраций, индуцированных химическими мутагенами -неорганическим (хлорид кадмия) и органическим (диоксидин), - то прием витаминно-минерального комплекса заметно уменьшал их частоту уже через 2 недели, а через 30 дней защитный эффект проявлялся еще больше. Защитное действие приема комплекса при высоком уровне индуцированных аберраций (диоксидин в концентрации 0,1 мг/мл) было менее выражено, что свидетельствует об ограниченных возможностях защиты. Из этого следует важный вывод: проверку модифицирующих мутагенез факторов следует проводить при умеренном уровне хромосомных аберраций (от 5 до 15 % аберрантных клеток).

Интенсивность индуцированного мутагенеза уменьшалась при повышении в крови концентрации витаминов-антиоксидантов. Поэтому антиоксидантный подход можно рассматривать как достаточно перспективный в профилактике генетических последствий воздействия мутагенных факторов окружающей среды.

Выводы

1. Прием витаминно-минерального комплекса на протяжении 30 дней не влияет на спонтанную частоту хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров.

2. Прием витаминно-минерального комплекса приводит к значимому снижению цитогенетических эффектов хлорида кадмия. Уровень клеток с

индуцированными хромосомными аберрациями на 41 % меньше через 30 дней приема комплекса.

3. Защитный эффект приема витаминно-минерального комплекса при индукции хромосомных аберраций диоксидином зависит от его концентрации. Он более выражен при использовании мутагена в меньшей концентрации. Количество клеток, повреждаемых диоксидином в разведении 0,03 мг/мл, снизилось на 29 % и 38 %, соответственно, через 14 и 30 дней приема комплекса. Количество клеток, повреждаемых диоксидином в большей концентрации (0,1 мг/мл), было на 15 % меньше, что отмечено только через 30 дней.

4. Прием витаминно-минерального комплекса в течение месяца не вызывает комутагенной модификации цитогенетических эффектов хлорида кадмия и диоксидина.

5. Частота клеток с хромосомными аберрациями зависит от содержания отдельных витаминов в плазме крови:

• частота спонтанного мутирования обратно пропорциональна содержанию витамина С;

• уровень химически индуцированных хромосомных аберраций обратно пропорционален содержанию бета-каротина и суммы каротиноидов;

• цитогенетический эффект изученных мутагенов экспоненциально зависит от содержания витаминов Е и В2

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Nikitina V.A., Voloschuk (Sidneva) E.S. Effect ofvitamin uptake on the level of chromosome aberrations in human cells // Cytogenetics and Cell Genetics. Vol. 85 (1-2), 1999, P. 101.

2. Дурнев АД., Никитина ВА, Вржесинская О.А., Жанатаев А.К., Сиднева Е.С., Коденцова В.М. Влияние приема витаминов на чувствительность лимфоцитов периферической крови к кластогенному действию мутагенов in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Том 134, № 9, 2002, с. 303-307.

3. Сиднева Е.С., Катосова Л.Д., Платонова В.И., Чеботарев А.Н. Влияние приема витаминно-минерального комплекса на спонтанный и индуцированный мутагенез в лимфоцитах человека // Хранение и переработка сельхозсырья, № 5,2003, с. 96-97.

4. Сиднева Е.С. Влияние приема витаминов на мутагенез в лимфоцитах человека // Сборник тезисов III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», М.: «Русский врач», 2004, с. 78.

5. Сиднева Е.С. Анализ спонтанного и индуцированного in vitro мутагенеза в клетках человека на фоне приема витаминов // Сборник тезисов VII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2004, с. 261262.

6. Сиднева Е.С, Катосова Л.Д., Платонова В.И., Жанатаев А.К., Дурнев А.Д. Изменение мутагенного эффекта диоксидина in vitro в зависимости от приема витаминов // Сборник тезисов III съезда генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития», Москва, 2004, Т. II, с. 472.

Принято к исполнению 14/09/2004 Исполнено 15/09/2004

Заказ № 314 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 ^'^^.аиогеГега! га

1 1683 1