Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение особенностей механизма генозащитного действия ретинол-ацетата

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение особенностей механизма генозащитного действия ретинол-ацетата"

АКАдШН НАУК АЗЕРЬМУаМСЛОЙ РЙ&Ъ/Ь&Ш ИНСТИТУТ ГШЬ'ГМ! И СЕШЩИ

На тграьах ру копией •УдК 631.523:575

МАМЗДШ. СЕВИЛЪ ШФ газы

ИЗУЧШИЕ ОООБЫ1л ОСТЕЙ М2ХАШ13МА ГШОЗАЫШОГО дШСТаШ РШШОл-ШТАТА

.Специальность 03.00.15 - Генетика

ЫГиРйШ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

о л

1 Ь : -да

Баку - И'35

г Работа выполнена г отделе устойчивости генетических систем Института генетики и селекции Акаде^п наук Азербайджанской Республики

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, академик У.К,Алекперов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А. С. Исмайлов кандидат биологических наук И.Т.Аскеров

¿едущее учреждение: Институт ботаники Академии неук Азербайджанской Республики

Защита состоится " (Р " 5.005 г> в Час,

на заседании Специализированного совета Д.004.20.01 при Институте генетики и селекции Акадеши наук АзирЗаДнаанской Республики: 3701С6, г.Баку, пр. Азадушг, 155. ' ■

С диссертацией мокко ознакомиться в библиотеке Института генетики и селекции АН Азербайджанской Республика.

Автореферат разослан ^^(^^г^Л/Д^бт.

С^геуО)!

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук, профессор А.А.Алиев

_ а -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Управление процессами устойчивости организмов-с помощью анткмутагенов считается на сегодняшний цень одним из наиболее радикальных а перспективных путей поддержания на оптимальном уровне частоты спонтанных мутаций, а такзе профилактики и нейтрализации индуцированного мутагенеза (Алекперов, 1984; НатвХ, Alekperov et ей., 1.986; De i'iora, 1989)'. Систематическое изучение зтой актуальной, проблемы углубит познета молекулярной природы мутационного процесса и создаст реальные предпосылки для развития теории антимутагенеза и для решения'ряда стоящих перед современной генетической наукой прикладных задач, которые заключаются в обеспечении структурно-функциональной целостности и стабильности функционирования генома.

В плане решения поставленных задач особую остроту оря-", обретает вопрос изучения еозшжеых ыеханязиоэ доЗствея ге-яозащитных препаратов. Признано, что решение этого вопроса дашю быть основано на теория ыутациошого процесса» з , частности на известных данных об этапностг процесса возникновения а становления мутаиМ'и, ароме тся?о, юаашсачзаао с изучением в'изменяющихся условиях существования эволщион- о во'сформировать'адаптивных систем бнорегуляция и координации различных функций организма, которые защищают:от пора-, жения наследственные структуры клеток и участвую® в коррекции процесса реализации предмутациЯ в конечные нутационные события (Тарасов, 1982; Дорошенко, Абнлев, 1988; Алиев,1989; ¡.Haaßel, Hartman,-■ 1990; Гончарова, 1990).

-¿ажаейшей из этих систем является> система механизмов клеточной репарации, которая обусловлена активностью конститутивных и кэдуцдбедьнкх процессов, имеет ферментативную природу и от .состояния активности функционирования которой зависит судьба конкретного первичного повреждения молекулы ДНК. Однако, несмотря на некоторые, достигнутые особенно в последние года, успехи в познании антимутаторных механизмов в занимающей ключевую позицию в биологических процессах молекуле ДНК, вопрос особенностей механизма коррекции .антиму-

тагенами спонтанного и индуцированного мутагенеза, прекде всего на уровне репарационных процессов остается открытым и требует исследовательских .усилий с использованием новых методических подходов.

. Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении феномена и особенностей механизма гене защитного действия ретинол-ацетата на контрастных по репарационной активности клетках E.coü. При этом ставились следующие основниё-задачи:

Х.Уставовить концентрационную зависимость действия ретинол-ацетата по критериям его влияния на выживаемость • клеток и эффективность мутационного процесса.

^.Проанализировать"эффективность модификации ретинол-ацетатоа индуцированного йзутационвого процесса в связи с его влиянием ва различные этапы процесса возникновения и становления стадий.

,3.Выявить особенности механизма антимутагонного действия ретинол-ацетата при образовании в молекуле ДНК различных типов первичных повредцений - пиримидиновых димеров ' и кекнитевых сиявок ДНК.

4.Проанализировать ■ антимутагенную активность ратинол-ецетата, а'Tasse витаминов Kj- и В при их л з олар о ваян ом использований и'при применении в отдельных сочетаниях.

' .Натчн'ая новизна -работы. Впервые выполнено детальное исследование-феномена и особенностей гзнозащитного действия ретинол-ацетата в условиях спонтанного и индуодрован-ного мутагенеза. Доказаны ранее неизвестные свойства этого ' витамина ингибировать мутационный процесс и на этапах, . предавствуидих образования первичных повреждений молекулы ДДК, и на базе ухе образовавшихся предмутаций. Впервые установлено, что на этапе реализации лредмутаций а конечные вдтацаонныб события механизм коррекции ретинол-ацетатом имеет в своей -основе как обпдае пути, независимо от того не' сет ли в своей основе молекула ДНК довреадзаия типа пириын данових димеров, Либо ковалентных мег&итевых сшивок, так в частные отличительные особенности, зависимые от конкретног

Tj. а первичного повреждения. Общие ,путн коррекция а у слови с УФ- и митошциы С-индуцированного .мутагенеза связаны с юстоянием активности кодируемой геном uytab эндонук-лоязы, которая функционирует на инициальных этапах экспл-зисчной а пострешшкатизной репарации, принимая участив в • оы ^магическом надрезании нити ЛДК вблизи повреждения., а •raic;.8 с состоянием активности продукта гена гесР,'. прек-де всего с той;;его функцией, которая проявляется не на уровне процессов рекомбинации, а, связана с влиян'-эм на контролируемые этим геном безошибочные' процессы репарации» Пути яе, зависимые от конкретного типа первичного цовредцендя, в частности при образовании мехнитевкх сшиаок. ДНК» кроме того связана с состоянием активности продуктов генов гесА а г.. -ас, пренде всего с той, частью их функций« которые определяют эффективность процессов рекомбинация. Полученные экспериментальные данные могут быть полезны для совершенство' ¡лня познания молекулярной природы мутационного процесса, а также при разработке теории антшутагенеза.

f зучно-практическоа- значение работа... Апробированный, номп^-хсныЗ методический подход, вктогааздий использование з экг:* .шкментах контрастных по репарационной ахссаваостн стамго> ¿.coli, а такие мутагенов, обр'азукхдих спектр повреждений определенного-типа, может найта широкое применение п.;. определении механизмов антимутагенеза в целом п, в части :-огч, 'в-'отношении конкретного генозащитного препарата. Экспериментально доказана способность ретинол-ацетата инги-бировать индуцированный мутагенез при различной вариабельности an. комбинированного применения в сочетании с мутагенным фактором» что расширяет диапазон его применеши в. практическом антимутагенезе в качестве и профилактического, s терапевтического средства. Установлено, что витамины А, Е и % а отдельных сочетаниях несовместимы з плане проявления антимутагьнной активности, что следует учитывать при составления специальных диет и создании продуктов питания геноза-зитного назначения.

t

г Апробадкя работы. Материала диссертации докладывались, демонстрировались Е обсуждались: яа Л1 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные ыех&шзш генетических 'процессов" (Москва,1990); Ш Национальной конференции по медицинской биологии и генетика ( Vurn£.f ßuijjaria, . 1990); екегодных конференциях Европейских общей® по вдтагбдам и канцерогенам окружающей среды в Греции (Родосу 1989) в в Англии ÜbpK, ISS0); У1 съезде Азербайджанского общества генетиков к селекционеров (Баку, ISS4).

; Публикации. По материала!/ диссертации опубликовано 6 работ. ;

Объем и.структура диссертации. Диссертация состоит из вве дедин, обзора литературы, описания материала в методов г.сследо ванся, четырех глав, посвященных излечению результатов к их об .суждению, заключения, , выводов'в сшска литературы. Работа изло жена на 173 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы е 10 рисунков. Список литературы включает 258 наименований, в том числе 18? иностранных источников.

. 15агернал в методы исследования.

йрподьзуемые в работе шташы Escheric|iia coli и их генотипы представлены в таблице I.

Таблица I

• , Штаммы £.coii ж их генотипы

Штамм

Генотип

AB 115¿

АВ1885

¿hl1 .

JC5519

JC92Í9

JC7&89

wp2

S1Í561

F"*, thx» leu 66, proA2, biß4, srsE3í lacXI, galK2, ara14, xy15, ortll, 1'1-S, strR, дикий тип

Производный AB1157, uvra

-Производный Í31157, recA

Производный AB1157, recBC

Производный ¿¿1157» retí' -

'Производный ¿Ü-.157» sbcß

E/r, trp£~, дикий тип

Производный WP2, Kexl.

f

-

Пнтательные среди и растворы. В качестве полноценных среде для вырацивааия бактерий использовали глясо-пептодвый агар (!£ПА) и ьисо-пептодный. бульон (МПБ) производства НШЭяМ йм.Н.Ф.Гамалеи РАН (!/,союза). В качестве минимальной '• полноценной среда (МПС) использовали■ среду ¿Э (на I л. диет. водк:йа2Н°о4-& г;1Ш2РО,-Зг; ЫаС1-0,5г; ffi^CL-tr ). После автоклевирования непосредственно перед употреблением ua I л М9 добавляли: 0,01 М р-р СаС12 -Ю мл; ;2С$-ный р-р MgS04x7H,,0 -1,5 мл; 2С$~ный раствор глюкозк - 10 г-.гл; витамин % до конечной концентр^ии I-мкг/мл; необходимые'-аминокислоты - до конечной концентрации 40 мкг/ьуи В качестве бу«:ерного р-ра для минимального агара использовала фосфатный буфер концентрированный (SEK; на I л диет, годи с^о^Иа^ 2 г; к2>1?04 - 42 г; £й2К>4- - IS т;■ ímg Q^ -4 г). Для ресуспевдирования клеток использовали <¡¿BK pH = 7,0.

Минимальный агар - к 900 ид водного агара добавляли: ЖС - 300 1'гл; 20^-аый p-pHg3Ö4 - 1,2 ал; 20^-аый. р-р Глюкозы - 12 - мл; 1%-шШ витгудн - 0,6 ил; необходимо аканонаслоты до «конечной концентрации 40 мкг/мзг. ■

Химические соединения, н -нетал- й'-нятро- Я -нитрозо-гуанядин (" Serva "); ьштомиция С С Serva "); дпыот&лсуль--® Ф-оксид С berva'7 ); твин-40 С" Merck "); ретинол-ацетат (виталлии А) производства Московского завода витаганянх препаратов. '

Метода зналяза.1) Учет обратных мутаций от ауксотрофно-сти по триптофану к протстройности у штакмов линии З.соИ з/г. 2) Учет прямых мутаций к валанустойчпвости у штшлмоз линии л'.coli K-I2. 3} Учет выаиваемостк по числу выливших коло-. кий через 18 чааоа после, внеева клеток на чашш. с МПА.

Значимость изменения эффективности мутагенеза (к) в мутант них клетках по сравнения с клетками дикого типа, либо, при введении витамина Адили других модификаторов мутационного процесса) оценивали при помощи критерия Стьщдента по

формула t = 4г~— , где к - частное от деления частоты мутаний в мутантньсс линиях на соответствующую частоту в метках дикого тала или частное от деления частоты мутаций без

'„ *

: витамина А (или других модификаторов) яа соответствуяцую частоту мутаций с витамином А (или других модификаторов).

Ъ'к определяли по формуле Ъ к » к ^Щ-J + ^г где 5Г- средняя частота мутаций. * '

hx определяли по формуле = ^Цг" » где xi -частота мутаций каэдого опыта, а - количество опытов.

Относительные величины эффективности модификации мутагенеза рассчитывали ш форвдле У.К.Алекперова CI97S).

Условия проведения экспериментов.

Д,яя выявления концентрационной' зависимости влияния ре-тк^ол-а^ет^та на вшшваемйсть в на спонтанный мутагенез бак-тори^ш^х н^ет.ок, клетки ¿'-coli .в/г йр2 (дпкий тип) выращивали ва МПС яра 37°С до плотности 2-5 * 107 кл/мл, обраба-гдв^лг ретинол-ацетатом (0,001-100 мкг/мл), добавляя его в •гу су^ду," и инкубировали с азрршей при t -ре 37°С на качаяка. 0сазд$Л1| центрифугированием 10 млн при 5000 об/мин, ресуосвЕетровшш в фосфатном буфере ( pH = 7,0) и высевали на МПА. для подсчета вшивших клеток, а также голодный агар с с'оотввтствуадаш добавкгда аминокислот для подсчета црототрофных .ревертаатов.

Для выявления концентрационной зависимости влияния ретинол-ацетата на индуцированный мутагенез, выращенные и обработанные ретинол-ацетат ом аналогичным образом клетки ¿.col: й/r wp2 после и ресусдвадирования обрабатывали дополнительно УННГ в концентрации 5 мкг/мл. Через 30 мин после инкубации 'клетки отмывала от мутагена, ресуспеядаровалв в фосфатном буфере к высевала ва МПА. и ва голодный агар.- Отдельная серия экспериментов предусматривала различную временную экспозицию обработки-' ШИТ ( 0, 20, 40, 60, 80 и ТОО ккн), при stok ретинол-ацетат использовался по описанной схеме в концентрации 0,001 мкг/мл. При использовании в качестве мутагена У&-излучейий клетки, вуращенкие до плотности 2-5*10 гл/mj вносили в чашка Петри е облучали в течение 3 сек. двумя па-...раллельшша квврцевыма ламяаии БУВ-15 ва расстоянии 50 см от

источника облучения (10 эрг/сек/ш^). Зетец клетка обрабатывали ретинол-ацетатом (0,001-100 мкг/из), опытную смесь инкубировали 30 шп при 37°С на качалке, клетки осуждали центрифугированием, ресуапеллировали в фосфатной буфере в высевали на ША и ва голодный агар. ■

Для выявления антимутагекного действия ретинол-ацетата в зависимости от вариабельности ■ по следо ват ельвости его комбинированного применения в сочетании с ШНГ эксперименты выполнены по приведенной низа схеме.

I

I 30 мину г с ^ аэрациеи

I

(У

/С0ЯГРМ6

I 1

о

О О

ретег/га*

мм///*

О

м/нп

О О О.

о

О

реп/юл

О

о

я

"о §

н

V4*

С**

£ £ 5? *

>1

Схема опыта.

Для определения особенясстэй путай коррекция ретинол-ацетатом УФ-шшуцароваааого мутагенеза клетка линии К-12 дикого типа и его щтантных етвкков .вкраивала до стационарной фазы на среде -¿¿э с соответствующим! -добавками аминокислот, вносили в чап;кз Петря а облучали 2 сек аа установке БУБ-15. Затем в суспензию клеток вносили ретинол-ацетат 40,001 мкг/кд) Опытную сг.:есь инкубировала яа качалке 30 мин. при 37°С. Пробы брала через 30 ?шз. а высевала на ЙПА- а яа голодошй агар

■для подсчета цряшх мутаций к валкиустойчивостк. Схема другого опыта была аналогичной предыдущей. Отличие состшло б той, что клетки облучали в течение 3, 6 и 9 секунд, а пробы для анализа брала-через 0, 30, 60 и 90 шв.

Для определения особенностей путей коррекции ретзнол-ааетатом цдтошцее с-индуцировадаого мутагенеза бактериальные клетки линии в/г и K-I2 .выралглвада до стационарной фазы на среде иэ .. с -соатвзтртвущгкн. добавила аминокислот ? обрабатывали Еатоыицакоы С (0,01 ют/ь-л). Затем клетки отливали ог кутаг еда и в суспеврш вносили ретинол-ацетат (0,001 ■икг/хлл). Оцытлув «¡ось инкубировали 30 tsm при 37°с. Лробы брали через 30. рд и высевали на 1»ша и на голодный агар для подсчета шоготрэд.аыг по тр;шго?-аяу тзевертантсз ( хслетка линии ü/r ) i: пряных цутаоий к ваяинуехрячивостк (клетки лишш K-I2).

Схека опытов, выполненных на клетках ¿¡.coli в/г *'Р2 аналогична "огзданяой в экспериментах, целью которых являлась оценка антилутагенног.о действия ретинол-ацетата в условиях спонтанного и индуцированного цутагеаеза. Отличие заключалось в тон, что, дараду с витаминов А (0,001 икг/кя), исш-гывалиоь так&е витамины Е (0,1 ыкг/ыл) и Kj (Х-,0 usr/ük), как изолированно, так и в отдельных сочзтаниях.

■ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОВСЛЩШИЕ

Антиштагенная активнооть т>етино.я-апетата' в клетках а.coli в/г Va'fо при спонтанном я инетпированно!', мутагенезе

Полученными ь этой части работа эксперименгаяьныш дааныш установлено, что ратиаол-едетат в пределах используемых концентраций не подавляет выживаемость клеток е.coli, дикого типа а/г wp2 (рис. Ха) и, наряду с этим, не обладает в широком диапазоне концентраций и собственник генотокси-ческям действаеи, а в определенных дозах даже сникает частоту спонтанных trp^irp+ ревертактов (рис. 2а). Его гено-зздптное действие в опытах на клетках е.coli дикого тала дозозависиао, наиболее эффе?®ивно в дозе 0,001 щр/ыл, про-

far y<P GOOt 0,0! Û,/ !.â fû m

i-'a C.I. ¿лаяние ловдентрсилй ' -:ата аа* югиух С а) ал?.1 л/г а т,

всз.д^лс-в:

разлх'лнкх ^танод-аце--••¡кость лнта-

ТОК ¿.coli

ахгг rcefeaec-is;.

èisifT.o,cû/c,£/ ej í,c & .w /fewest граи ¿v AÇ, даг /s*.?

Рас.2;Вдияаае различных концентраций' ретинол-ацетата- на спон-тшшнй мутагенез Ca), а такгэ аадуцаровашшЗ в клетках ¿.сои

¿/г .¡'i*2 ;.íbhr íu) з наята \ в).

■.■■-: t, ; - 12,- . . .

'является также яри воздействии УФ-излучений (рис. 26) и. ШНГ (рис. 2в), основным типом образуемых первичных повреждений первого из которых являются пиримидиновые цимерн, а второго - метилированные основания и близкосцешшнше кластерные мутации в вилке репликации хромосом. Причэм. на фоне не: специфического иягибаровааля генотоксдчности .«утагеноа, механизм мутагенеза которых протекает с образованием различных Типов первичных повреждений молекулы ДНК, ретинол-ацетат увеличивает резистентность клеток к их летальному воздействию как при кратковременной, так и при длительной обработке.

Принципиально вашшма для задач настоящего исследования являются результаты испытания ретинол-ацетата -л ангимутаген-ную активность в зависимости от вариабельное?;' л оследователь-носта его комбинированного »применения в сочетала с мутаген" ным воздействием. При этом установлено, что ретинол-ацетат - проявляет достоверное геаозащитное действие (табл.2).и повышает резистентность клеток s.coii ¿/г «?2 (рис.3) при его введении в среду культавярозандя до воздействия ШКГ, одновременно о ним и поело него, однако предмута^енная обработка оказалась наиболее эффективной по обоим регистрируемым крите

ряям. Из итоженного, в частности из более высокой эффективности предмутаген-аого воздействия ретинол-ацетата, следует, что этот витамин участвует в корре* «ии индуцированного мутаг« аеза на этапах, предлюствз ицих образов лшш первичнш повреждений молекулы ДНК. Отведения о. такой роли это: витамина в литературе изв< стаы и авторы в случае во; действия радиазда и хяшч< ких мутагеноь прямого тип« действия саяз х ют его уч; тие в коррекн-л ккдуцпров; a^f/v /ее -\г -уТ-л-кз ретмал-ацат&- дого мутаген«г е ого аня с/ u^M^bc^^JciMiiptiM^Li/. окяащтельныда свойствами,

Рис.3. Выживаемость клеток ¿.coli а/г ш>2 в зависимости от е;-._;5иабельности последователь-

Таблица 2

Анммута? энная активность ретинол-ацетата в зависим'* от?, от вариабельности последовательности его дб* нтоованного применения в сочетании с нитразогу 1нидином. .

\ Варианты Контроль ШНГ 'ШНГ + ретинол-ацетат

\обработки РА+ШНГ : РА+ШНГ1 ШВГ+РА

й \ . - одновременно

I 2,2- 340 95 ■ 94 - 220

2 2,4 200 100 • 41 140 '

3 2,0 150-. 61 170 37

X 2,2 230 85,7 102 132

к 2,7 2,3 1,7

г 8,76 8,33 3,66

Р -- 0,001 -0,001 •'0,001

ФЭА 0,63 • 0,55 0,43

*с регуляцией обмена тиолозых аминокислот и архитектонике строения биомембран, в случае же воздействия промутагенов -с подавлением активности ферментов, принимающих, участие в. метаболической активации этих веществ непрямого типа мутагенного действия '.см. Пороаенко, Абилев, 1388; Алиев, 1989).

Другой, наиболее вашшй для развития теории в решения прикладных задач аатимутагенеза вывод основан на результатах учета частоты мута:щй. при введении ретинол-ацетата одновременно с ¡¿-¡ЬГ и после его воздействия, а такае на сопоставлении эффективности генозащитного действия этого витамина по вариантам эксперимента. Он заключается в обнаруженном ранее неизвестном для ретинол-ацетата фзномёне участия в коррекции индуцированного мутагенеза на базе уже возникших предмутаций, тем или иныц образом влияя на процессы репарации и мутагенеза, которые находятся под контролем специальных генов. Для определения молекулярной природа участия ретинол-ацетата з этих процессах н-ч модели .разлкчащихся репарационными генотипам клеток я", «он выполнены специальные эксперимента, цель?) хоторкх выявление особенностей механизма антп-

мутагенного действия этого витамина на.примера типов первичных повреждений, возникающих под воздействием У£-луч<зл и обширного класса химических мутагенов, к числу которых относит ся к митомадин С. ; .

Особенности путей коррекции ретинол-ацетатом УФ-иадуцированного мутагенеза

Кривые зшшзаомоста клеток е.coli K-I2 с иазлачныма репарационными ■■ генотипами при их Уф-облученаа 12 , анализ через 30») изолированно и в сочетании с обработкой ретинол-ацетатом (0,001 мкг/мл) представлены на рас» .4,. йлдео, что

вое дефектные по репарация лицеи более, чувствительны к мутагену, чем клетки дикого тида. Среди серна мутантов 'наиболее чувствительны uvro a pccßC .-мутанты. По cpas нению с ними несколько боле высокую резистентность проявляет мутант recr, a тки sbcá . -мутанта лишь- «е значительно отличаются по чувствительности от клеток дакого типа. Из этого следу ст, что продукты генов u-vr¿ recáC, гесР и sbcß 3 большей.или меньшей степенг принимает участие в контра-: процесса репарации ДйК. при образовании в ней первичны:; повреждений ткпа парамздшк вых дамеров.

Ретинол-ацетат, избар.л-соетоя!

Рис. 4. ¿КЕПваемость клеток ¿.coli i\-I2 с .различными репарацией ниш генотипами при У4-сблученяа <2 ) изоли-

рованно и в сочетании с обра- тедьк0 M0ÄEimBpjeT ботко£ ретинол—ацетатом (0,001 _то3чцзоетЕ „,вток

ат/кл).. I-контроль,2-рэтанол-

устолчиэоста клеток дикого па

__ ¿.coli, а гакае штамм;

! ацетат,3-УФ-ойлучеше,4-УФ-об- д0фзкгаых п0 ^anbWlM Г0К;

лучение + ретинм-ацетет. Щт 3T0Mi 0Й пошааё* выюс

s

j

• 40 -л

sf V..

5 ■

/- ■

-f.. 'S

зо' -H—

-4—-

fkf'

/-0 -~ia*tttt r^/7

g-hi-wp

-wir

Рис.-. лшишаемость клеток s.coli K-T2 с различим:.«

гевотипама пра, УФ-облученян to , а тахзе при

УФ.-облучении (з") с последущей обработкой ре~

тххея-щеГ&г&к £ü,00I нкг/мя).

емость клеток дикого типа, aboa а гаслс -ыутаьтоз, но ° ¿фактически не ьдияет на хпзпеспособноеть облученных УФ-сэе-том uvra и гее? -едтаятов. Выпвло:шая. закономерность нааяа лодтвераденае я в другой серии опытов, результаты которых представлены на кривых зависимости зизизаемостз клеток диких и мутантянх штаммов от экспозиции УФ п поодолаи-тельностл обработки ретинол-ацетатом. На рис.5 представлены результата, полученяма при 3-х секундной экспозиции УФ. При других срока:, зкссоагдеш (5 и 9 ) зарегистрировано увелпча-тае чУвотзкт*л:-аостн'зевх лгнай таеток х'УФ-лучам.с возрастание?^ теодог^тельнсэтп ойлученая,.а витамин-А с соответству--й указг.-юй шла спецафиностьа повышает нх резистентность ■» .^.глитуда различай.шаду'; сопосгааяяекн:ля

; зависимо от продолжительности '-^¿зиции

л'¿л -Зля;'чих значений. </п.г\ ^.^-заввсадач избирательность чо

еу !5Цтаа'2вм'зсг; ^нарузана и при изучении. эффеетизаоста УФ-

«ч^аново,

>4 0-""f>.T "Г >. - - '-k^v -v S* • * — 1

-шщудироваваого лфтагенеэ& (10 эрг/сек/мм2; 2", анализ через 30») изолированно и в сочетании с последующей обработкой реуййоя-ацететом (0,001 мкг/ма) (табл.3). При этом за-регйотрлровано; снижение частоты угадай в клетках дикого типа, а также в гесЗС ж вЬ&а мутантах. В случае же итгв а тес? мутантов, хотя в отмечена некоторая тенденция к иа-гибнрованию УФ-мутагенеза, однако эффективность задиты значительно снижена и различия ыевду сопоставляемыми вариантами недостоверны, ¿ целом все это указывает на то, что, если функция хеовс в «ЬсВ генов в требуется для проявления '' адтвмутагенного:действая ретинол-ацетата в условиях Уф-инду! ровавного адтагенеза, *о ее йеобходамооть негначительаа. Из этого следует,геноэзртаое ретинол-ацетата в

данном сдучае ве ойязшо с еоотоянаем активное - и корректор ской функцией кодируемого геном геевс фермента - экэонук-леазн У, котораяконтродарует один из' путей пострешшкатив-ней редареюш, отдельные ветви которой вхлшают в себя реког бинацар. Айтвмутагеннеяактивностъ ретинол-ацетата ае находится в непоередственной евязи и с состоянием активности продукта гена вЪс£ - зкзонуклеаьи I,; которая играет, существенную роль при протекании процессов рекомбинации в которая активна в клетках дикого :тгпа и ¿^активирована в- еЪса-

Отсутстаав *« влияния ретинол-ацетата на выживаемость и эффективность мутагенеза в клетках шггв и гесУ. мутантов свидетельствует о том, что функция этих генов на этапе реализащш предмутадий в конечные мутационные события соаер шенно.необходимы доз проявления его аатимутагень^о действия, во всяком случае в отношении определенного повре-адений - дириквдиаовых димеров. 3 репарации этих фотопроду тов,вршшмавт 5чаотие ферменты а эксцазиоаной, и пострепли-катЕВной. репарации в эта процессы вклшаот в себя несколько незавиашкх путей, которые имеют разный генетический контроль, но в целом завися'?! от адлельиого состояния генов шггЛ.1 шгг£ в цугС. а а основании полученных данных можно полагать, что эффективность аатимутагенного проявления рети вол-ацетата тем или иным образом связана с состоянием актив

Таблица 3

Частота нутаций а антамутагвнная активность ретинол-ацетата в условиях УФ-иидуцпровенного мутагенеза в зависимости от генотипа используемых

линий клеток а. с он

' ч/м X Ю-7 :

1!тамм, Контроль Частота мутаций под " генотип _ воздействием УФ

без ретинол- о ретинод-• ацетата ацетатом

Изменение эффективности мутагенеза

по сравнении о коит- при введении рвтинол-•ролем шетата

г

м

К-12'

дикий ТИП 119+12,27 7120+734 »«В 6,5+0,67 2315+238 тара0 16,3+1,68 1044+108 ■ в&ой 110+11,34 532+65 гво? .12,8+1,32 ' 61+6,3 '

3350+345 28,1 5,97 с 0,001 2,1 42,3^0,0010,53

2236+271 ооЗ 6,33 <0,001 1,007 0,5 >0,05

534+55 32,8 40,25 <0,001 1,9 4,28<0,001 0,49

151+15,6 1,37 3,74 <-0,001 3,5 ^.б^О.ОЙ 0,72

56+11,3 4,37 5,04 ¿0,001 1,09 0,91Ю,05 -

г ности одного из ключевых ферментов мутагенеза и репарации uvrAB -зависимой эндонуклеазы, скорее всего со стимуляцией инициальных этапов процесса репарации ДНК - этапов энзи-каткчиского надрезания нити >ЩК вблизи повреждения и в стабилизации этого возникающего надреза* Этот процесс осуществляется uvr&a -зависицой эндовуклеазой, однако при отсутствии ее в ?о>тапте uvri, равно как и в мутанте. uvrA, подавляется шшда&льнай функция надрезания нити ДНК вблизи • гдришдинового дккера, повышается чувствительность клеток к /•¿-лучам и, как показано соботвеншши.ксслёдоваюигж,; не про явлкетот антпг^тагенная актвднссть ретинол-ацетата. .

. Для проявления антимутэтеныой активности вйташша.'А- нет обходив/, является и нормачьное функционирование гена recF, кодируешй, продукт которого принимает участие в коррекии;, щтагенсза на разных этапах репарации и рекомбинации. Полученные данные дают основания полегать, что в условиях У4<~пн-дуцированвого мутагенеза корректорская функция ретинол-ацетата проявляется не на уроЕне' процессов рекомбинации, два пути которого контролируется-продуктом гена red:, так как в одиночном гис? -мутанте ' гее? -путь рекомбинации нормально инп'.С'.'рован продуктом гена abed -экзенуклеазой 1. Сле дсвательно, в этой ситуации не реализуется роль гена abcii как "переключателя" процесса рекомбинации с геезе- пути на reoi* -путь, что происходит в ге«д1гес"и_-г,мутантах с икакти-вироваяной охзовукдеазой У при дополнительной в результате мутации в гене shed инактивации экзенуклеазы I.

Более реальна срязь корректорской реткнод-аце-

тата с его влиянием на •xoia'pnjkjjyeb'Kt; гене?- recF гроцессн репарации, так как, в отличие от рекокбинащж, контролируемая тенсц р^ я? зависит от аллельного соето-якг.я гена abesi и, следовательно, от состояа;^: активности экзонуглеазы I и элективно протекает в клетках дикого тгпа, контролируя незамкекш11: от ..'Зйов -гесЖГ . путь постранг^.чати! ной репарации. 3 частности, процесс згеелления брегг., ка-: н: ранне?л этапе s коопэрзлик с продуктом.гена uvi-ab, полное?: контролируя' iipOiiticc Цострсшшкативной репарации, так и на позднем, оцраделял один из общих путей этого процесса.

Особенности путей..коррекции ретипол-адвтатом

митр:ягцкн С-индуцированного мутагенеза

При возникновения в клетках ü.coli другого типа первичных повреждений - козалентннх мешштевнх свивок ДНК, образующихся под воздействием обширного'класса химических соединений, к числу■котсрих относится и штомицин С ~ установлено, что в данном случае, пошмо генов uvrB и гесР, аи-тккутагенное действие ретинол-ацетата связано и с ^унл'глона-льикм состоянием продуктов тепой гесА, геыо и 1ехл, Основанием такого заключению являются результаты изучения вютва-емости (рис. 6) и эффективности мутагенеза' (табл. 4) под воздействием китошцина С (Q,Qi ккг/ш) изолированно и в сочетании о- последувдей обработкой ретинол-ацетатом клеток ß.coli K~-i2 Л á/т ДИКИХ ТИПОВ Л МУГаН-ТИИХ 12Га:я,'0В.-

■ X-/Z-

—. S/r—i

штамму

Рис.б.^ыяиваемость клеток в,coli ли- ■ : HJ1Ä К-12 и ¿ÍX с различными - репарацп-еншл-и ге нот!" нами. при позде2стзии штоулци-па С изолированно и з сочетании с после--дуиаей обработкой ре-таяол-аг.етпток.

шетп?„ 3;-:.з:?окацин С, 4TtuiTc:-iiiiHH С + ретинол-ацетат.

' . ' . . : Таблица 4

Частота мутаций и антимутагенная ..активность ретинол-ацетат« в условиях ■ мнтомяцин С-индуцированного катагенеза в зевисимости от генотипа ис-пользуошх линий меток ¿«coli • • , :

• ч/м X ю-7

Штамм, генотип

Контроль Чйстота мутаций- под воздействием што-

■ Изменение ,э№остивности мутагенеза •• ■

по сравнении с контролем пг^и г введении ретинол-ацетата

без рети- нол-аце- тета с ретк-нол-аце- , тагом >'• к '•t Р ■k1 ФЭА .

К-12 , 0 • • -'0,51-

дикий' тип 12,3+1,32 209+18 . 102+9 7,97 6,00 : 0,001 2,05 8,53 <0,001

UVrj3 6,5+0,67 315+31 301+29 43,6 6,06 0,001 " 1,05 '1,61 -0,05 0,044'

гесА 9,6+0,83 410+42 400+38, 4Х,бб'. 5,33 ¿0,001 '1,025 0,62 ' 0,05 •0,025'

rectfC 16,3+1,74 365+31 341+29 20,92 9,09 • 0,001' 1,07 2,0 -0,05 . 0,066'

abcrf 20,1+2,07 262,4+27 48,1+4,9 . 2,95 з,п ■0,001 5,45 10,35 0,001 0,82

reül'1 12,8+1,24 349+33 '316+28 24,68 6,86 .0,001 1,10 2,32 ,0,05 0,094*

ri/r ii'i-'p liüvl2,27 185+19,07 87+8,97 1,37 ' 4,11 ;0,001 2,13 8,31 <0,001 0,53'

дякиН тЗ'.п iVr ЮЛА 55+6,7 к;2о+27,1 218+26,3 3,96 8,70 -0,001 1,04 0,71 ■0,05' 0,35'

ZL -

Как и в случав шримидаяовых димеров, продукты генов uvrA и uvr3 npEHPjüajoT участие в генетическом контроле эк-сцизяонной репарации межкитевых саавок ДНК. Отличиэ в механизме мутагенеза и репарации этих двух типов первичных пов-рекдешщ заключается в том, что в-случае пирймидиновых диме- • ров uvrAB -эндонуклеаза производит надрезы по обе стороны пириклдинового дикера, тогда как при образовании сшивок ДНК-ДНК - в кооперации с продуктом гена uvrc лишь первый надрез нити ДНК вблизи сшивки. Надрезание tog же ней по другую сторону плеча сшивки осуществляется —^З^ - окзону-клеазной активностью, связанной с ДНК - полимеразой 1.: Тем не менее, участие продукта гена uvrв в инициальном этапе репарации, отсутствие анткмутагенноЯ активности.ретинол-аце-тата в uvrtí мутанте, у которого подавлен матомицин С-инду-вдроваяний мутагенез и проявление генозащитного действия этого зитймша в клетках а. coli с нормальной репарационной способностью, прямо указывает на взаимосвязь его генозащитг-ног о действия с состоянием активности, uvr A3 -зависимой ' эЕдонухаеазы. И _ это является одной из общих особенностей антимутагеаного действия ретинол-ацетата, во всяком случае в отношении двух типов первичных повреждений - пнримидиновюс димеров и межнитевих сшивок ДНК. -

В репарации мажнитевых сшивок ДНК исключительную роль, играют процессы рекомбинации, которые протекает как гесл-зависимым путем, так и по двум независимым,путям, контролируемым, соответственно, генами гесВС и recí*. Результаты исследований определили" отсутствие эффекта модификации в агашах, несущих дефекты по этим генам, что при-образовании этого типа первичных повреждений делает реальным связь анти-гдутагенвого действия* ретинол-ацетата с состоянием активности продуктов генов reck, гесВС и гес?. Во всяком случае, с той честью.функций продуктов генов гесд а тесво, которые определяют эффективность процессов рекомбинации.

Такой вывод в отношении продукта гена гесА основан на тем, что мутант гесА суперчувствителеа к индукции сии-вок ДНК и в этих клетках полностью подавлено воссоедияенио питой в ходе репарации кежнитеенх. сливок - отал мутагенеза,: •

-в норме осуществляющийся с участием .процессов рекомбинации. Кроме того, известно, что мутация в гесА ; генах, помимо подавления активности собственного продукта, блокирует рекомбинации как в.гёсВ+госС*-,'. , так и в гесР+ штаммах (коЧ.ч-jpaai Kp,to et ; al., 1075). И"это, в целом, препятствует проявлению антамутагеацой активности ретинол-ацетата в клетках, дефектнш:--по гейу:■ re.pÄ'v'■..:■ равно,: как и в гесдС- кутантах, у которых аваетиварована; racdC -экзонуклеаза а -блокирован ■ .x-eoA...-чвезавЕСймий 'процесс 'рекоыбнв.аоди.

Что ".касается части опытов; выполненных с. использование! гее? -мутантов, то,.'вероятно, как к в случае 'образования пириищиновых дилеров,-.' при возникновении иидояевах сшивок JiilK, коррекция' ьутагенеза связана не с рек.омбииацконной активностью продукта гена гес?» а с функцией контроле друга: ветЕой Еострешшкативйой репарации,'в ходе которых стации не возникаю!-. Зта..кодируемая геном recF фувкцая ке завис«' от алделького-состояния гена, зьсв к субстратом для ее про явления' служит обширный«' класс '..первичных;повреждений,' включа . пиришди'ковке ликеры и ковалентные .меанитевые сажвки -ДНК.

■ В цел§м,'результаты экспериментов определили но которые особенности ■ аит&ьфгагенного действия 'ретинол-ацетата но зть пах реализации.'оредмутаций в .конечный цутециошше события. •Они имеют в своей основе как общие механизмы коррекции индуцированного мутагенеза, которые?,'независимо от того, ньсет •ли молекула'ДШС повреждения -типа .гарикидиш»»» дкмеров, лай . кежкитевих сшибок 'ДИК,'' связаны .с состоянием активности продуктов генов и7то е rcci , так а некоторые, заваепмке ех типа повреждения, .частные. пу-tjl, например, связанные с. состо • ят:ем активности продуктов генов гсса и тесиз. ¿> рамка,; выполненного исследована«!- установлено, что и з тем, г. в д;.;, гом случаях геиезедатвее действа© ретакол-ацет&т^ о;;лз-::ло с -' коррекцией бззоиабочных путей репарации й муггачнеаа, г:,а протекании которых мутации не возникал!'.

Антимутстукне-й активность п-;-- ^с.--.'-

тюязяног.} его пт:-у меренга .-,; к сочу;'?.Г-".л с ?.

оаслукиваах особого вникания результаты оксверккбк'я». выполненных на клетках- ¿.--coli (дик^Л tüh),- з ч:сч-;

'Габлшш 5

Влияние вихиикноа Л., Kt и В при раздельно« щшиеиошш на штошдан Си У^-индуцированний мутагенез в.клетках ¿.coli а/т vü>2 (дикий тип)

Вари- .Контроль Штоми-анты ция С

мктомкцин С

УФ

УФ

Критерии учета

+

+

витамин А

вита- витамин мин Е

вкта-laia А-

вита- вита-ыин Kj_ ' кин Б

X

к

• t • р

ФЭА

0,4

¿5 ^ ^

12,6

2

2,91

< 0,01 0,50

7,77

. 2,24

5,23

•с 0,001 0,69

11,2

2,25

3,10

¿0,01. 0,55

378,1 119,5

3,2

13,25

-0,001 0,63

173,2

2,2

11,68

<0,001 0,54

162

.2,03

11,49

-'0,001 0,52

Ö I

+

.'рнх витамины А, Б и Kj (в дозах, наиболее элективных для какого из них, сортветственно, 0.0Q1; 0»1 и 1,0 мкг/ул} ''исиктывались цр^ изолированном применении, а также в отде-' льнкх сочетаниях'.. При этом установлено, что указанные вита шш ни в отдельности, ни в отдельных сочетаниях не проявл. от собственной генотоксичности. Более того каздкй из нкх в отдельности и сочетании A+Kjj и А+К^+Е снижают уровень спон 'тайного мутирования. Сочетание ке А+Е обладает генетическо. нейтральностью. 'f .

Что касается их.влияния на .индуцированный мутагенез, то на ¿оне даоявления антимутагенной активности каждого из витаминов в отдельности (,табл.5), сочетания A+Kj- а А+К^+Е достоверно ингибируют и митошцин G, и УФ-индуцированный м тагенф^ (рогда как сочетание А+2 не ингибирует образование мутаций, возникающих под воздействием ттоьтяпа С (Р> 0,0 и с низким значениями показателя достоверности различий м жду сопоетавлямгыки вариантами (Р-- 0,05) влияет на УФ-кнду дарованный мутагенез. _ '

Долучешше -впервые данные о несовместимости отдельных витгшшов следует учитывать 'цри составлении специальных ди рекогтендуеигх для практического использования в целях позы над генетической устойчивости организма, а также при подбо компонентов для. создания продуктов питания антимутагенного назначения. Данннй внвод'.правомочен как в отношении витаки нов, так е в отношении других классов веществ,'даке если к вддё из них в отдельности и обладает аятимутагенной активя стью.

ßJBOÄii .

1.Бнервце на-модели клеток ¿.coli с нормальной репе рационной способностью к с различными дефектами - систем рэп рации изуч'ена -^еномеи-и 'некоторые особенности кеханизыа кс рекшш ретинол-ацетатом спонтанного гдугагенеза и индупкроЕ кого мутационного процесса.

2.6 условиях воздействуя метшшитрозогуанидина, кот-ог ■индуцирует -в-MiK широкий.спектр первичных повреждений, час которых вызывает мутации вследствие оаабок. репарации, тог;. как другие - в'.¿еще ошибок репликации-," показали ранее

ernue свойства ретинол-ацетата ингибировать мутагенез не только на этапах, предшествующих образована» первичных повреждений молекулы ДНК, но и на базе уже возникших .повреждений.

3.На этапах реализации предыутаций в конечные мутационные события ретляол-ацетаг зависимо от типа первичных повре— ддений и от генотипа агаммов клеток к.-со?! избирательно по-вшает их выживаемость и подавляет мутационный процесс.

4.Установлено, что при возникновении в клетках УФ-инду-царованннх пиримидааовых. димеров аятимутагенная активность ретинол-ацетата сачзана с состоянием активности uvrAS- Зависимой эндонуклеазы, игращей ктчевув роль на инициальных этапах процесса репарации, а такяё с состоянием активности продукта гена гее?, прежде зеего с его функцией контроля ветвей пострепликативяой репарации, не зависящих от аллель-ного состояния гена зЬсЗ,

5.При возникновении в клетках митомиция С-индуцирован-ных межнитевых сшивок молекулы ДНК, наряду с продукталй ге-ноз uvrB и гесР, . антимутагенная активность ретинол-ацетата связана также -с процессам рекомбинации, находящимися под контролем генов' *есА и гесВС.

в.Влияние ретинол-ацетата, яа процесс формирования качественно различающихся дахашгёмама. мутагенеза и репарации первичных повреждений молекулы ДНК имеют в своей основэ как общие особенности коррекции, так и зависимые ¡?т тица повреждения отличные пути, однако все они св^заац с безошибочными механизмами репарации, при просекании'которых мутации не возникают.

7.Установлено, что витамины А, £ а Кг в отдельных сочетаниях не обладают аяти^тагеняой активностью,, что-, следует учитывать при составлен^ специальных диет, а такке'пра под-борз компонентов для создания продуктов питания геяозадатного назначения.

-Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Ktaaedova S.A. ïbe features of trie re-tiaol-aoetate correction of induced by ultra-violet raya ciutageaesi3 // 13ta Annual ¿*eetiag of iltäüS, Greece, Rhodes, 19S9.Ï.133

2.üardarli g,, Moaedova S.A., Alekperov U.K. Antiüiuta-geaic activity of retiailacetäte in the case of crogiaal of

pyriiuidi,n diuers // In III Hational Congress of kedical Biology and üeno-tics. 28-30 Septeaider. 1990. Varna, ¿iulga-ria. P.104. ;

3.Маиедова O.A. Аитщдутагейиое действие ретинола на спонтанный и индуцированный НГ и УФ-лучами мутагенез в клетках ii. coli // В маг. УИ Всесопзного симпозиума "Молекулярное механизмы генетических процессов"; М.: Наука, I9SQ. .

с,us-120,. ' ■ : ■.',•■;

4. ¿.'¿д ей ova S.A. 2uo features of oatiatutageuic ei'i'öct of retinal .acetate by appearance o'i> the iat.eruolccular sewings .of in ii.coli cells // Annual meeting of Ati-iä. iork, P.39. .../ ' . '

о.Намедова O.A.Особенности коррекции ретинолом мутагенеза, индуцированного УФ-излучет5яг»ж' и алкилируюкаала соедине-няяма // В мат. УХ- съезда АзОГиС. Баку, Азернешр, 1934. С.145.

б.Цакедона С.А.Антаьзтагенная актквкссть ретинол-ацетата в зависимости от вариабельности последовательности его кокби-вироваакого применения в сочетании с вятоозогуашдашом ;// ВИНИТИ, H572-BÖ4. от IS.OS.94 г., 1994."

ie2"acд-зсетатын. kgиигЬа'^зе se'aC£p uexa-аиз;л;н*.ш'хуоуовз2етЛпр!п«ш вЗреявливов-

йаиаедоза С .А.

X ï н С 8 ■

.¡ля оларар рзгинол-езеЕатыЕ кенкгЬа^изе ïs!,c;;p -¿акотле— ер xvep строили ^едгаг вдияцаайвр. Б* su?..-, "шш Lou

нДТ ле/срлувдв ил:-: гЕДввкп ел&ле кём:еовнб с&беб озан згапда-рлада, L-i<a дг ареиг е::&лк кежйш Згд*гэрг;н базаек есаоя:;;;а ...угасав ¡:; ссес.;'азал^-.аг вггввдер це"луц osr.ajaa ,xvc;;c:í j-.frv.; о: ú^:;:: р. ?б1^аол-гасег8сик каррвкйор.'нвхоккз'лзнхв \уугл ^íT njKSi? яздваекгяа гшрйшдзв д^.:ерлог>:ши кятир-ij'CMi. [î'ï. oseare?, ксэалеяс глхййлер ¿;лк;:а заделгн:.:злор-

ác-u еко'Дсрцеззел ав^ь&глардан 'aysacaja про-

аео::т.;л л.^а? гвбкеггх ófciacu Ьаггикда абилуца2дарыы ?гкиил- .

дс-ад^рилиескайе, зяечэ де амиаугакекзз кезорк¿¿еспник,-сзлекиб-Ьаи;рлан;.;асындй ех^ек олар. : ' i

A,S BeKj в'лзаьзклори- а^рыдыгда ылаиутекек 'w'cEp©■ иаляхдар-• I лс-р, appu-ajpn ксйбвиасй^алар^а.вса бу ©зтаг'догр^зииадагиадан, > веЬрязяераа нз дехаз едйл&ркен ' ввзэре альш^алыдар. .