Оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры

Касина, Ирина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры"

На правах рукописи

КАСИНА Ирина Владимировна

ОЦЕНКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 ЯНЭ 20DD

Саратов - 2008

003460207

Работа выполнена в ФГУН «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Саяпина Лидия Васильевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Девдариани Зураб Леванович

доктор медицинских наук Малецкая Ольга Викторовна

Ведущая организация:

ФГУЗ «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится « 2009 г. в /О часов на заседании

диссертационного совета Д 208,078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Ученый секретарь диссертационного coi доктор биологических наук, старший научный сотрудник

А.А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Анализ эпидемиологической обстановки по холере в мире, странах СНГ' и России показывает, что прогноз по этой инфекции на ближайшие годы остается неблагоприятным. Это связано, прежде всего, с существующей реальной возможностью завоза инфекции из эндемичных по холере стран. Уникальная вариабельность генома Vibrio cholerae позволяет говорить также о дальнейшей эволюции патогенности возбудителя, что способствует возникновению новых высоковирулентных штаммов, которые могут представлять опасность для человечества [Онищенко Г.Г. с соавт, 2005; Смирнова Н.И. с соавт., 2004; Faruque S .M. et. al, 2004; Sur D. et. ai, 2004]. Кроме этого не исключается возможность эпидемического распространения холеры при биотерроризме [Ломов Ю.М., с соавт. 2007].

Для предотвращения возникновения эпидемических вспышек холеры большое значение отводится проведению эпидемиологического надзора на всех этапах выявления заболевших, или подозрительных на заболевание, а также постоянному контролю за объектами окружающей среды [Москвитина Э.А. с соавт., 2006; Топорков B.II. с соавт., 2003; Урбанович Л.Я. с соавт., 2007; Di Pinto А., 2005].

Противоэпидемические мероприятия во многом определяются своевременной диагностикой, соответственно, чувствительностью и специфичностью препаратов. За последние годы для диагностики холеры в практическое здравоохранение недостаточно активно внедряются высокочувствительные препараты и тест-системы с использованием новых технологий для выявления возбудителя холеры [Кутырев В.В., Куличенко А.Н., 2002; Саягшна Л.В. с соавт., 2002; Королев Ю.С. с соавт., 2004]. Исходя из вышеизложенного, актуальным и своевременным является совершенствование диагностики холеры, направленной на внедрение в практику новых специфичных и высокочувствительных препаратов и тест-систем [Воробьев A.A., 1999; Куличенко А.Н., 2003; Саяпина Л.В. с соавт., 2007].

В дополнение к традиционным методам определения биохимической активности микроорганизмов с помощью бумажных индикаторных систем (СИБ), сред Гисса и Меллера лабораторного приготовления, в филиале ФГУП «НПО Микроген» НПО "Питательные среды" в г. Махачкала разработаны микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) по 11 тестам, а для ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-X) - по 3 тестам [Меджидов М.М., Абдуллаева З.Г., 2001].

Разработка и усовершенствование препаратов фагодиагностики остается важной задачей [Адамов А.К., 1971; Быстрый Н.Ф., 1974; Кудрякова Т.А. с соавт., 2003; Brussow H. et. al, 2004; Mukerjee S., 1970; Sarkar B.L., 1999]. Одним из аспектов ее решения является совершенствование методов определения эпидемической значимости холерных вибрионов. В связи с этим специалистами ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» разработаны бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие для ускоренной идентификации и

дифференциации эпидемически опасных ctx+ и эпидемически неопасных ctx" холерных вибрионов биовара эльтор [Остроумова Н.М. с соавт., 1998].

Для индикации штаммов, выделяемых из биологического материала и объектов окружающей среды, в последние годы широко используют метод ПЦР, который позволяет определять в выделенных штаммах V. cholerae генетические маркеры токсигенности и эпидемической значимости [Балахонов C.B. с соавт., 2000; Водопьянов С.О. с соавт., 1999; Смирнова Н.И. с соавт., 2001; Varela P. et. al, 3993; Miyagi К., 1999; Reen F.J. et. a!, 2005].

С целью повышения информативности генной диагностики холеры специалисты ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (г. Киров) разработали тест-систему, для выявления ДНК V. cholerae, основанную на одновременной амплификации двух генетических детерминант - ctxA гена, отвечающего за синтез холерного токсина и tcpA гена - за синтез токсинкорегулируемых пилей адгезии [Парамонов И.В. с соавт., 1999].

Для внедрения в практику здравоохранения новых диагностических препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры нами были проведены настоящие исследования по определению их диагностической ценности с использованием унифицированных схем аттестации, выбора препаратов сравнения; подбора необходимого количества микроорганизмов для определения специфической активности препаратов; определение области применения новых МИБП, уточнение Инструкций по применению, совершенствование контроля качества при их масштабированном выпуске.

Цель исследования - оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры.

Задачи исследования:

1. Сравнительное изучение диагностической ценности новых, микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-Vj и ускоренного определения их групп по Хейбергу (МТС-Х).

2. Оценка эффективности бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких, предназначенных для ускоренной идентификации и дифференциации эпидемически опасных ctx+ и эпидемически неопасных ctx' холерных вибрионов биовара эльтор.

3. Изучение качества диагностической тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA* tcpA+) методом полимеразной цепной реакции в экспериментальных исследованиях.

4. Анализ результатов приемочных испытаний для определения диагностической ценности новых препаратов и решения вопроса о целесообразности их внедрения в практику здравоохранения, а также совершенствование контроля их качества и уточнение ФСП и Инструкций по их применению.

Научная новизна. Впервые разработаны научные принципы аттестации и оценки качества новых диагностических препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры в медицинских приемочных испытаниях с использованием препаратов сравнения аналогичного назначения. Сформулированы критерии и разработаны требования к основным показателям качества МИБП при их серийных выпусках.

Впервые на представленном материале установлена диагностическая эффективность и обосновано внедрение в практику здравоохранения микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-Vj и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х). Новыми являются данные изучения биохимической активности большого набора музейных штаммов микроорганизмов V. cholerae 01, V. cholerae не OI и Vibrio других видов с помощью микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V; и определения их групп по Хейбергу (М'ГС-Xj в сравнении с системами индикаторными бумажными, средами Гисса и Меллера лабораторного приготовления. Идентифицировано 12 видов вибрионов рода Vibrio и подтверждено соответствие их классификации по Берджи [Í 8]. Разработана таблица идентификации по биохимической активности 12 видов рода Vibrio: V. cholerae 01 и не 01, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. mimicus, V.fluvialis, V. metschnicovii, V. vulnificus, V. anguillarum, V.furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, V. carchariae.

Впервые научно обоснованы принципы оценки диагностической эффективности бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких. Предложена усовершенствованная схема определения эпидемической значимости вибрионов эльтор. Разработаны требования к методам контроля специфической активности и специфичности фагов и требования к контрольным штаммам.

Разработаны методы и критерии оценки качества новой тест-системы диагностической для выявления ДНК Vibrio cholerae методом полимеразной цепной реакции на основе двух праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гену cixAответственного за ведущий фактор вирулентности - токсинообразование и трех праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гену tcpA+, кодирующего основную субъединицу токсинкорегулируемых пилей адгезии. Показано, что тест-система обнаруживала V. cholerae (ctxAт tcpA ') в дозе МО3 м.к. и 1-Ю4 м.к. в пробе, то есть в 100-1000 раз была чувствительнее многих, используемых в лабораторной практике, сертифицированных диагностических препаратов.

Использованные нами в работе критерии оценки качества испытуемой тест-системы позволили доказать возможность одновременного выявления возбудителя холеры, определения его эпидемической значимости и дифференцирования по биовару.

Практическая значимость. Работа имеет практическую направленность и посвящена усовершенствованию методов контроля, определяющих качество новых препаратов для диагностики холеры.

Сформулированы критерии и разработаны требования к основным показателям качества МИБП при их серийных выпусках.

На основании проведенных исследований новые иммунобиологические препараты одобрены Комитетом МИБП и внедрены в практику здравоохранения:

1. Микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V). ФСП 42-0504-7631-06 и определения их групп по Хейбергу (MTC-V) производства филиала ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ НПО "Питательные среды" в г. Махачкала, ФСП 42-0504-7632-06, протокол Комитета МИБП № 8 от 26.12.97 г.

2. Бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие производства ФГ'УЗ РосНИПЧИ "Микроб" (г. Саратов), ФСП 42-0020-2038-01, протокол Комитета МИБП № 7 от 05.07.00 г.;

3. Тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxАtcpA") методом полимеразной цепной реакции производства ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (г. Киров), составлен проект ФСП, протокол Комитета МИБП №7 от 19.12,02 г.

4. Усовершенствованные требования к основным показателям качества новых препаратов для диагностики холеры внесены в утвержденные нормативные документы (ФСП и Инструкции по применению).

Акт внедрения рекомендаций в НД (ФСП и Инструкцию по применению) на микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х) утвержден начальником Управления регистрации к обеспечения качества лекарственных средстз ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ 23.10.2007 г.

Акт внедрения рекомендаций в НД (ФСП и Инструкцию по применению) на бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие утвержден директором ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 11.02.2008 г.

Акт внедрения рекомендаций в НД (проект ФСП и Инструкции по применению) на тест-систему для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ ícpA') методом полимеразной цепной реакции утвержден начальником ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» 07.11.2007 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Внедрение в практику новых микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х) позволит расширить диапазон идентификации видов рода Vibrio семейства Vibrionaceae.

2. Новые микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и ускоренного определения групп вибрионов по Хейбер1у (МТС-Х) имеют преимущества по экономической эффективности и простоте постановки перед средами Гисса и Меллера и системами индикаторными бумажными (СИБ).

3. Сравнительная оценка в приемочных испытаниях чувствительности, специфичности и воспроизводимости новых бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких показала их преимущество перед монофагами диагностическими холерными ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5 при определении эпидемической значимости выделенных холерных вибрионов.

4. Обоснована целесообразность внедрения в практику здравоохранения тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA* tcpAметодом полимеразной цепной реакции, предназначенной одновременно выявлять возбудителя холеры и определять его эпидемическую значимость по наличию гена ctxA, ответственного за токсинообразование и по наличию гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин корегулируемых пилей адгезии.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2000 г., 2003 г.); научных конференциях и Ученых Советах ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Москва, 1999 г., 2000 г., 2003 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства питательных сред в решении задач по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения России» (Оболенск,1999); Первой Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000 г.); VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 2003 г.); Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004 г.).

Материалы диссертации вошли в научные отчеты по законченным медицинским приемочным испытаниям, которые были проведены в период с 1997 по 2003 годы. Результаты наших исследований были использованы при составлении и утверждении 6 нормативных документов.

Публикации. Основные положения диссертации отражены в 13 публикациях, в том числе в 2 - рекомендованных ВАК Российской Федерации научно-практических изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 302 источника литературы, в том числе 184 отечественных и 118 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 2 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Изучение диагностической ценности (чувствительность, специфическая активность, специфичность, частота выделения из объектов внешней среды и биологического материала при лабораторных и клинико-эпидемиологических обследованиях) новых диагностических препаратов для выделения холерного вибриона проводились в соответствии с Программами приемочных медицинских испытаний в сравнительных исследованиях с коммерческими аналогами, выпускаемыми в соответствии с нормативной документацией (ФСП, РП, Инструкция по применению) в период их срока годности.

Биохимическую идентификацию микроорганизмов с помощью сред Гисса и Меллера проводили согласно "Инструкции и методическим указаниям по клинической и лабораторной диагностике, лечению и профилактике холеры" (М.: Медгиз, 1984).

Необходимым условием всех испытаний было шифрование исследуемых материалов.

Материалами для исследования служили испытуемые (новые) препараты для диагностики холерного вибриона:

- микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-V) и для ускоренного определения их групп по Хейбергу (МТС-Х), разработанные филиалом ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ НПО "Питательные среды" в г. Махачкала.

- бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие, разработанные ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб" Роспотребнадзора;

- тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA*) методом полимеразной цепной реакции, разработанная ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (г. Киров);

Препаратами сравнения были контрольные (коммерческие) диагностические препараты и питательные среды для диагностики холерного вибриона:

- системы индикаторные бумажные для ускоренной идентификации вибрионов (СИБ), производства ФГУ «НПО «Микроген» МЗ РФ филиала в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио», ФСП 42-0504-3827-04;

- монофаги диагностические холерные ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5 сухие производства ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб", ФС 42-3544-98;

- тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции (ГенХол), разработанная ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб", ФСП 42-0020-3806-03.

- питательные среды Гисса и Меллера лабораторного приготовления.

Для определения диагностической ценности сравниваемых препаратов

использовали микроорганизмы II, III и IV групп патогенности. Общее количество, используемых штаммов - 407, из них 167 - Vibrio cholerae

eltor Ol (ctxAB94 - Vibrio cholerae eltor Ol (ctxAB'), 42 - Vibrio cholerae cholerae Ol, 51 - Vibrio cholerae не 01, 35 - рода Vibrio (V.parahemolyticus, V. metschnikovii, V. alginolyticus, V. albensis, V. ßuvialis V. vulnificus, V. furnissii, V. mimicus, V. anguillarum, V. carchariae, V. cincinatiensis), микроорганизмы других родов и семейств (Aeromonas, Commamonas, Plesiomonas, Pseudomonas, Alcaligenes faecalis, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Escherichia coli , Shigella disenteria sonnae, Shigella disenteria Hissa, Shigella flexneri - 18).

Результаты исследований

Изучение диагностической ценности микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (К'ГГС-Х)

В настоящем разделе изложены результаты работы по испытанию микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х) производства филиала ФГУЛ «НПО Микроген» МЗ РФ НПО "Питательные среды" в г. Махачкала. Микротестсистема MTC-V представляет собой контейнер, состоящий из 11 изолированных ячеек с сухими питательными субстратами. МТС-Х представляет собой контейнер с сухими питательными субстратами трех углеводов: арабинозы, сахарозы и маннозы.

Диагностическую ценность микротестсистем MTC-V и МТС-Х изучали по проценту совпадения результатов определения биохимических свойств микроорганизмов с препаратами сравнения, количеству правильно идентифицированных штаммов, по совпадению результатов при определении 10 положительных и 10 отрицательных пробах. Кроме этого нами оценивались технологичность, доступность постановки метода и скорость получения результатов.

Были проведены исследования по изучению ферментативных свойств 151 штамма микроорганизмов рода Vibrio: V. cholerae Ol классического и эльтор биоваров, V. cholerae не Ol, Vibrio других видов: V.parachaemolyticus, V. metschnikovii\ V. alginolyticus и V. albensis, а также представителей других родов и семейств: Aeromonas, Commamonas, Plesiomonas, Pseudomonas, Alcaligenes faecalis, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris. Нами в шифрованном опыте также изучена ферментативная активность патогенных для человека вибрионов других видов, таких как V. ßuvialis V. vulnificus, V. furnissii, V. mimicus, V. anguillarum, V. carchariae, V. cincinatiensis.

Результаты, полученные с помощью микротестсистем MTC-V (И тестов) и МТС-Х (3 теста), сопоставляли с результатами изучения биохимической активности штаммов с помощью классических нробирочных методов (среды Гисса и Меллера), систем индикаторных бумажных (СИБ) и с данными литературы [Берджи, 1997; Данилкина Е.Б., 1995].

При изучении музейных штаммов представителей Vibrionaceae и других микроорганизмов было доказано, что микротестсистемы MTC-V и МТС-Х по своей специфической активности соответствуют коммерческим системам индикаторным бумажным (СИБ) и средам Гисса и Меллера. Анализ

биохимической активности холерных вибрионов по 11 тестам для микротестсистемы MTC-V показал, что совпадения результатов, полученных с помощью испытуемой микротестсистемы и коммерческой системы СИБ, для разных реагентов составили от 76,0 до 100,0 %, средние данные по 11 тестам -93,0±2,0 %. Частота совпадений реакций с помощью MTC-V со средами Гисса и Меллера для отдельных тестов отмечалась от 78,0 % до 100,0 %, среднее по 11 тестам - 93,0±3,0 %. Нами установлено, что через 2-3 ч инкубации при температуре 37 °С совпадение результатов, полученных с помощью испытуемой микротестсистемы МТС-Х и коммерческой системы СИБ, для разных реагентов составило от 57,0 до 100,0 %, средние данные по 3 тестам -88,0±3,0 %. Частота совпадений реакций с помощью МТС-Х со средами Гисса и Меллера для отдельных тестов отмечалась от 85,0 % до 100,0 %, среднее по 3 тестам - 91,0±2,0%. При этом статистически достоверных различий (р>0,10) между методами исследования не обнаружено. Предварительный учет результатов биохимической активности штаммов с помощью микротестсистемы MTC-V проводили через 2-3 ч, окончательный - через 18-20 ч. При изучении воспроизводимости получено 100 % совпадение результатов положительных и отрицательных реакций биохимической активности микроорганизмов с помощью микротестсистем MTC-V и МТС-Х.

Полученные нами результаты свидетельствовали о высокой диагностической ценности микротестсистем MTC-V и МТС-Х. Показано их преимущество перед СИБ, средами Гисса и Меллера по возможности одновременного испытания на одном планшете несколько подозрительных колоний, исключению необходимости проведения большого объема подготовительных работ и сокращения времени постановки и получения результатов, технологичности, так как не требуют приготовления дорогостоящих питательных сред с аминокислотами и сахзрами.

Результаты наших исследований явились основанием для внесения изменений в ФСП и Инструкцию по применению на микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (МТС -V) и определения их по группам Хейберга (МТС-Х).

Усовершенствование контроля качества микротестсистем MTC-V и МТС-Х состояло в оптимизации методики постановки реакции, заключающейся в изменении, вносимых в ячейки объема взвеси микроорганизмов; дополнение среды, используемой для приготовления взвеси микроорганизмов (пептонная вода); в подборе тест-штаммов для контроля специфической активности, обеспечивающих проверку каждого реагента, в расширении диапазона биохимической идентификации вида Vibrio cholerae и дифференциации их от других видов Vibrio и близкородственных микроорганизмов.

В результате проведенных нами исследований установлено, что тест на сероводород в микротестсистеме MTC-V не работал. Учитывая, что образование сероводорода для холерных вибрионов является не постоянным признаком, рекомендовано исключить данный тест из состава микротестсистемы MTC-V.

В Инструкцию по применению на микротестсистему для биохимической идентификации вибрионов MTC-V включена таблица биохимической характеристики 12 видов, относящихся к роду Vibrio: V. cholerae 01 и не OI, V. parachaemolyticus, V. alginolyticus, V. mimicus, V. fluvialis, V. metschnikovii, V. vulnijicus, V. anguillarum, V. furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, V. carchariae (таблица 1).

Таблица 1. Биохимическая характеристика видов рода Vibrio

Утилизация Обнаружение! Наличие

Тест-штаммы ГЛЮКОЗЫ маннозы арабинозы i сахарозы j ¡ маннита 1 j индол оксидазы сероводорода лизиндекарбоксилазы аргининдегидролазы орнитиндекарбоксилэзы контроль аминокислот

V. cholerae 01 + + + + + + " + +

V. cholerae не 01 + - + + + + - + 4-

К parachaemolyticus -i- 4-, ± - + + + + - +

V. alginolyticus + + - + + -t- - +

V. mimicus + + - - + + + - +

V. fiiivialis + + + + + + - + -

V. metschnikovii + ± - + + - - ± + -

V. vulnijicus + - - - ± + 4- +

V. anguillarum + + - + + + + + -

V. furnissii -r * + + + + -t- +

V. albensis + + - + + 4-

!■■'. cincinaciensis + i + +

V. carchariae + + „ f

Примечание: "пропуск" - исследования не проводились.

Таким образом, на основании результатов, полученных при проведении приемочных испытаний, микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (МТС-У) и определения их по группам Хейберга (МТС-Х) внедрены в лабораторную практику.

Сравнительная оценка качества бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx* и ctx~ жидких

Важной задачей лабораторной диагностики холеры является определение токсигенности и эпидемической значимости выделенной культуры Vibrio cholerae. Для дифференциации штаммов вибрионов эльтор, выделенных из объектов внешней среды, от вибрионосителей и от больных на вирулентные и авирулентные использовались холерные монофаги ХДФ-3,4,5. Однако, начиная с 1991 года, на территории нашей страны стали выделяться от больных и носителей штаммы V. cholerae eltor, которые в 85-96 % случаев были устойчивы к фагам ХДФ-3,4,5 (Ломов Ю.М., 1992; Москвитина Э.А., 1999). При выделении они идентифицировались как авирулентные, что противоречило их эпидемиологической, клинической, и генетической характеристикам.

В связи с этим специалистами ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб" разработаны бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие для ускоренной идентификации и дифференциации эпидемически опасных и эпидемически неопасных ctx' холерных вибрионов биовара эльтор. Следующим этапом нашей работы была сравнительная оценка качества бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx"" и ctx' жидких с коммерческими монофагами диагностическими холерными ХДФ-3, ХДФ-4 и ХДФ-5 (ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб").

Испытания проводили по схеме определения эпидемической значимости холерных вибрионов эльтор, состоящей из 8 вариантов - эпидемически опасные; эпидемически неопасные и штаммы, для определения эпидемической значимости которых, необходимо привлечение дополнительных методов исследования, таких как определение токсигенности на модели кроликов-сосунков и метода полимеразной цепной реакции для выявления генов оснозного фактора патогенности холерных вибрионов -холерного токсина ctx. Эпидемическую значимость испытуемых штаммов определяли по 3-м признакам - чувствительности к фагам ctx+ и ctx" и гемолитической активности.

Проведенные исследования позволили установить, что с помощью испытуемых бактериофагов ctx* и ctx" и гемолитической активности идентифицировано 100 % эпидемически опасных штаммов (п=116), в том числе 108 штаммов (93,1 %) (вариант 1 - гемолиз "-" , ctx+ - "+", ctx" - "-") к числу эпидемически опасных отнесены без дополнительных исследований; 8 штаммов (6,9 %) были отнесены к числу эпидемически значимых при дополнительных исследованиях методом ПЦР на наличие ctxAB. С помощью контрольных монофагов ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности идентифицировано только 65,5 % эпидемически опасных штаммов.

Тестирование эпидемически неопасных штаммов V. cholerae eltor (ctxA") (п=87) с помощью бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx' жидких и контрольных монофагов ХДФ-3,4,5 показало, что используемые препараты по диагностической ценности равнозначны. С помощью испытуемых бактериофагов холерных эльтор ctx+ и ctx' и гемолитической активности идентифицировано 87 % штаммов, в том числе к числу

эпидемически неопасных отнесены 63 (72,4 %) штамма без дополнительных исследований; 13 штаммов (15 %) были отнесены к числу эпидемически неопасных при дополнительных исследованиях, с помощью контрольных мопофагов ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности - 85 %.

С целью сравнительной оценки диагностической эффективности указанных бактериофагов была изучена их специфичность. Установлено, что специфичность бактериофага холерного эльтор ctx+ составила 81,6 %, бактериофага холерного эльтор ctx' - 98 %. Бактериофаг холерный эльтор ctx' был недостаточно специфичен, поскольку лизирозал эпидемически неопасные холерные вибрионы. У данных штаммов выявлены гены биосинтеза токсинкорегулируемых пилей адгезии (tcpA) - ведущего фактора колонизации холерных вибрионов. Поэтому штаммы с таким генотипом считаются потенциально эпидемически опасными, способными вызывать спорадические единичные и множественные случаи диареи. Выделение штаммов V. cholerae eltor (ctxA~ tep/f) из объектов внешней среды и от людей, свидетельствует о заносе на территорию эпидемически опасного возбудителя холеры, который утратил отдельные гены или блок вирулентности под воздействием факторов внешней среды [Костромитина Е.А., 2004]. В связи с этим идентификация и дополнительное изучение таких культур является важной задачей лабораторной диагностики.

Анализ данных по 5 базам испытаний показал, что по предложенной схеме с учетом гемолитической активности идентифицировано 100% из 350 музейных и свежевыделенных штаммов V. cholerae eltor {ctxA+). В том числе 95,1 % отнесены к числу эпидемически опасных без дополнительных исследований, т.е. к варианту 1, а 17 штаммов (4,9 %), выделенные от больных, носителей и сточных вод, были отнесены при дополнительных исследованиях на наличие генов ctx А В методом ПЦР также к числу эпидемически значимых (варианты 3, 4, 5). В то время, с помощью контрольных монофагов ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности правильно идентифицировано из числа эпидемически опасных только 157 штаммов из 350 исследованных, что составило 55 %.

Нами была проанализирована частота совпадений эпидемической значимости штаммов V. cholerae eltor с помощью бактериофагов и паспортных данных по 1ЩР - тестированию на наличие генов ctx А В по всем 5 - ти базам испытаний (таблица 2). Из этой таблицы видно, что из 570 изученных штаммов V. cholerae eltor, имеющих и не имеющих структурные гены ctxAB, результаты тестирования по ПЦР совпали с определением эпидемической значимости по фагам ctx+ и ctx" в 92,8 % (529 штаммов), по фагам ХДФ - в 66,6 % (380 штаммов). Данные определений с помощью испытуемых и контрольных фагов совпали в 64,4 % (367 из 570 штаммов).

Изучение воспроизводимости испытуемых ctx+ и ctx' бактериофагов показало 100% совпадение результатов в 10 положительных и 10 отрицательных параллельных определениях.

Полученные результаты исследований свидетельствовали о достаточно высокой активности и специфичности, диагностической ценности и

информативности, простоте использования (применяются в цельном виде) испытуемых бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" по сравнению с контрольными монофагами холерными ХДФ-3,4,5.

Таблица 2. Данные о частоте совпадений результатов исследования эпидемиологической опасности штаммов V. cholerae eltor с помощью их гемолитической активности и чувствительности к бактериофагам ctx+и ctx" и ХДФ-3,4,5

Базы испытаний Места выделения штаммов Количество изученных штаммов Количество штаммов с совпадением результатов эпидзначимости

с пасиорггнкг Фаги ctx+ и ctx" № данными ХДФ-3,4,5 между фагами ctx*'и ctx" и ХДФ-3,4,5

ГИСКим. Л.А. Тарасевича Зарубежье 8 8 8 8

Азербайджан 5 4 5 4

Таджикистан 11 7 5 1 5

Туркмения 62 58 55 56

Украина 40 36 33 33

Дагестан 35 30 7 6

Прочие города России 42 38 33 33

Дагестанская ПЧС 155 149 84 82

Элистинская ПЧС 8 8 7 7

Читинская ПЧС 4 4 4 4

Ростовский ПЧИ 200 187 139 139

Всего абс. 570 529 380 367

%¿m 92,8±U 66,6±2,0 64,4±2,0

Р<0.001

Примечание: Паспортные данные - штаммы охарактеризованы в гемолитической активности в пробе Грейга, на наличие гена с1х АВ методом ПЦР и выборочно по гоксигенности на кроликах-сосунках.

Результаты сравнительного изучения бактериофагов позволили разработать требования, способствующие повышению их качества, и внести изменения в нормативную документацию. В соответствии с проектом Инструкции по применению авторами была предложена схема распределения тестируемых штаммов по отношению их чувствительности к бактериофагам с(х+ и йх" и гемолитической активности на 8 вариантов. В схеме предусмотрена дифференциация штаммов только на 2 группы: эпидемически опасные йх , включающие 2 варианта, и эпидемически неопасные с1х" штаммы, включающие 6 вариантов. В схеме не была четко обозначена группа штаммов, требующих дополнительных исследований.

Специалистами Ростовского-на-Дону НИПЧИ была предложена схема оценки эпидемической значимости холерных вибрионов эльтор, где штаммы разделены на 3 группы: I группа - эпидемически опасные (включает 1 вариант),

II группа - эпидемически неопасные (включает 4 варианта), III группа -требующая дополнительного определения наличия генов с1хА, 1срА или токсигенности на кроликах-сосунках (включает 3 варианта). Нами изменен порядок групп и для каждой группы определены и уточнены варианты. На основании полученных результатов один вариант характеристики штаммов по признакам - гемолиз - «+», с1х+ -+, с1х"-+, отнесенный ранее в группу «эпидемически неопасные», нами был отнесен ко II группе - «требующей дополнительного определения наличия генов с1хА, 1срА или токсигенности на кроликах -сосунках».

С учетом полученных результатов приемочных испытаний бактериофагов нами была усовершенствована предложенная авторами и специалистами Ростовского-на-Дону НИПЧИ схема оценки эпидемической значимости вибрионов эльтор по чувствительности к бактериофагам диагностическим холерным эльтор с1х+ и с1х" и внесена в Инструкцию по применению и в Методические указания МУ 4.2.1097-02. 2002 «Лабораторная диагностика холеры» (Москва, 2002).

В итоге диагностическая ценность бактериофагов холерных эльтор с1х+ и с1х" в сравнительных испытаниях была оценена по предложенной нами схеме (таблица 3).

Таблица 3. Схема оценки эпидемической значимости V. скокгае еНог по чувствительности к бактериофагам сгх* и с1х" и гемолитической активности

| Груп- Варианты Гемолиз по Грейгу Чувствительность к фагам Оценка эпидемической опасности

пы . + с!х «х"

1 1 - + - Эпидемически опасны

И 2 - Для оценки эпидемической значимости необходимы дополнительные исследования на наличие генов ОхАВ, 1срА или токсигенности на крольчатах сосунках

3 + +

4 + + +

5 + 4- -

III 6 + - + Эпидемически неопасны

7 + - -

8 - - +

В ФСП уточнены требования в разделе «Специфическая активность и специфичность фагов», а также требования к тест-штаммам для контроля». Рекомендовано для контроля активности бактериофагов холерных эльтор ах* и специфичности бактериофагов с1х" использовать 5 штаммов эпидемически опасных, относящихся к 1 варианту; для контроля специфической активности

бактериофагов ctx' и специфичности бактериофагов ctx+ использовать по 2 эпидемически неопасных из 3 группы (варианты 6,7,8). Для сохранения стабильности препарата и увеличения срока его годности авторам рекомендовано в последующем разработать лиофилизированную форму выпуска бактериофагов ctx+ и ctx".

Таким образом, нами проведено сравнительное определение диагностической ценности испытуемых бактериофагов и обоснована целесообразность внедрения их в практику. Благодаря простоте, метод доступен для лабораторий любого уровня оснащения и может быть использован в комплексе с другими методами для предварительной оценки эпидемической значимости холерных вибрионов биовара эльтор.

Изучение диагностической значимости тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA* tcpA') методом полгшеразной цепной реакции

Совершенствование методов индикации возбудителя холеры в клиническом материале и объектах внешней среды остается актуальной задачей. В настоящее время для характеристики эпидемической значимости выделяемых штаммов возбудителя холеры широко применяется ПЦР с использованием специфических праймеров, предназначенных для выявления генов, кодирующего синтез холерного знтеротоксина (ctxAB). Учитывая что вирулентность V. cholerae обусловлена не только этой детерминантой, для более полной оценки эпидемического потенциала изучаемых штаммов, необходимо выявление широкого набора генов, отвественных за экспрессию вирулентности холерного вибриона.

Тест-системы оценивали по чувствительности (определению минимального количества, выявленных в ПЦР, микробных клеток холерного вибриона), по проценту выявленных штаммов V. cholerae (ctxA*tcpA+) к числу исследованных, по проценту выявленных положительных проб биологического материала и объектов внешней среды к числу искусственно инфицированных V. cholerae (ctxA+tcpA*) проб, взятых на исследование. При изучении специфичности определяли процент неспецифических реакций при исследовании проб, инфицированных V. cholerae. не 01 (ctxA') и гетеролошчными микроорганизмами.

На этапах изучения чувствительности и специфической активности тест-системы было исследовано 54 штамма микроорганизмов. В результате проведенных приемочных испытаний показано, что обе тест-системы равнозначны по способности определять эпидемическую значимость выделенных холерных вибрионов, имеющих ген ctxA. Обе тест-системы выявляли в концентрации 1-103м.к./мл одинаковое количество штаммов

V. сИокгае (с1хЛ') (испытуемая - 33, контрольная - 32 из 37 исследованных штаммов). Также обе тест-системы характеризуются высокой специфичностью. Отрицательные результаты испытуемой тест-системы зарегистрированы в 95 %, контрольной - 97 % случаев (таблица 4).

Таблица 4. Сводные данные о диагностической ценности тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной

реакции.

№ № п/п Показатели Чис ло иссл проб Испытуемая тест-система Контрольная тест-система

ctx А tcpA По двум ctxA tcpA

1. Процент (Р±р) положительных проб V. cholerae (ctxA+) (чистые культуры) для дозы 102 м.к. 37 54,0+8,2 16,2+6,0 64,9+7,8 рек < 0,5 59,4+8,1

2. Процент (Р+р) положительных проб V. cholerae (ctxA+) (чистые культуры) для дозы 103 м.к. 37 89,2+5,1 43,2+8,1 91,9+4,4 рск=0,5 86,5+5,6

3. Процент (Р±р) положительных проб V. cholerae (ctxA+) (чистые культуры) для дозы 104 м.к. 37 100,0 94,6+3,7 100 100

4. Процент (Р±р) положительных проб при исследовании смывов с объектов внешней среды, воды, рвотных масс, испражнений, инфицированных V. cholerae (ctxA+) в дозе 104 м.к. 36 100,0 100,0 100,0

5. Процент правильно идентифицированных проб V. cholerae от V. eltor (дифференцирующие свойства) 37 100,0 не идентифи цирует

6. Специфичность в процентах (Р+р) отрицательных реакций при исследовании гетерологичных проб 40 95,0+3,4 95,0+3,4 97,5+2,5

Воспроизводимость оценивали в процентах совпадений результатов исследования 10 положительных проб У.сЬокгае (с/хА 1срА) и 10 отрицательных проб V. сИо!егае не 01 (с1хА~ /срА~) при постановке анализа разными исполнителями в разные сроки исследования. При учете результатов установлена 100% воспроизводимость положительных и отрицательных результатов. Продолжительность анализа от начала исследования до получения заключительного ответа для обеих тест-систем составила 8 ч.

В сравнительных испытаниях доказано преимущество испытуемой тест-системы перед контрольной гю способности выявлять дополнительную детерминанту патогенности холерных штаммов - ген к"пА, ответственный за синтез основной субъединицы токсин-корегулируемых пилей; дифференцировать холерные вибрионы на классический и эльтор биовары. выявлять штаммы 0139 серогруппы на основании амплификации в Г1ЦР 1срА гена, нуклеотидная последовательность которого отличается у штаммов классического биовара и штаммов биовара эльтор и 0139 серогруппы.

Рис. 1. Амплификация tcpA гена у штаммов V. cholerae Ol, 0139.

К+ К-

На фореграмме (рис. 1) штаммы холерного вибриона классического биовара, имеющие tcpA' субъединицу, обеспечивают специфическую амплификацию фрагментов ДНК размером 264 п.н. (на фореграмме - нижняя полоса), а для штаммов биовара эльтор и вибрионов 0139 серогруппы - 455 п.н. (верхняя полоса).

Испытуемая тест-система в отличие от контрольной обнаруживает штаммы V cholerae по наличию гена tcpA при отсутствии гена ctxA. Идентификация штаммов с генотипом ctxÄtcpA очень важна, гак как они считаются потенциально эпидемически опасными и способными вызывать спорадические случаи диареи [Колякина A.B. с соавт., 2006]. Штаммы V. cholerae (ctxA~ tcpA') обусловили локальные вспышки холеры в Узбекистане (1961, 1963, 1980-1990 годы), Азербайджане (с 1970 по 1993 г.г.). Туркмении, в Ростовской области в 2005 г. [Ломов Ю.М., с соавт., 2007].

На основании проведенных исследований по нашей рекомендации в ФСП включены дополнительные критерии оценки качества препарата: подобраны контрольные штаммы, определены к ним требовании и обоснованы дозы, используемые при контроле тест-систем; уточнены показатели чувствительности тест-системы. Авторами была заявлена чувствительность

тест-системы 1103 м.к./мл. В результате наших испытаний было показано, что тест-система выявляла 89,2 % штаммов V. cholerae (ctxA+) и только 43,2% штаммов V. cholerae (tcpA+) в концентрации 1'103 м.к./мл. Штаммы V. cholerae (tcpA*) в концентрации МО4 м.к./мл испытуемая тест-система выявляла 94,6 % случаев. Учитывая полученные результаты, нами было рекомендовано внести в нормативную документацию чувствительность тест-системы для штаммов V. cholerae (cíxA+) равную 1103 м.к./мл, для штаммов V. cholerae (tcpA') 1-Ю4 м.к./мл.

Кроме этого нами было рекомендовано внести изменения в комплектацию тест-системы. Авторами была предложена смесь праймеров, обеспечивающих специфичную амплификацию фрагмента ДНК размером 302 п.н, комплементарных нуклеотидной последовательности структурного гена ctxA и праймеров, обеспечивающих специфичную амплификацию фрагментов ДНК размером 455 п.н. (для возбудителя холеры биовара эльтор и серогруппы 0139) и 264 п.н. (для возбудителя холеры классического биовара), соответствующего нуклеотидным последовательностям структурного гена tcpA. В ходе проведения сравнительных испытаний нами показано, что это влияет на чувствительность тест-системы. В связи с этим для сохранения чувствительности тест-системы в течение срока годности нами было рекомендовало разделение праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности структурным генам ctxA и tcpA, на отдельные компоненты.

Внедрение тест-системы в лабораторную практику способствует раннему выявлению эпидемически значимых штаммов V. cholerae в исследуемом материале, своевременному проведению санитарно-профилактических и лечебных мероприятий.

Таким образом, в результате проведенных испытаний получены новые данные о преимуществе испытуемой тест-системы перед контрольной по диагностической эффективности. Разработанные нами в процессе исследования требования оценки основных показателей качества диагностической тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA* tcpA') введены в утвержденную нормативную документацию. Проведенная аттестация позволила внедрить в практику отечественный препарат нового поколения для усовершенствования лабораторной диагностики холеры.

Вышеизложенное обеспечило условия для внедрения в практику новых отечественных препаратов для индикации и идентификации возбудителя холеры и осуществление надзора за качеством препаратов при последующих их серийных выпусках. Это позволит усовершенствовать диагностику холеры в лабораторной практике, своевременно и объективно изучать вопросы распространения и сохранения в природных условиях холерного вибриона и прогнозировать эпидемическую ситуацию по холере.

ВЫВОДЫ

1. В лабораторных и полевых испытаниях по разработанным программам медицинских приемочных испытаний изучены и рекомендованы в практику

здравоохранения 4 новых диагностических препарата, предназначенных для индикации и идентификации возбудителя холеры: микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-V), микротестсистемы для ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х), бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие, тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA* tcpA+) методом полимеразной цепной реакции.

2. В сравнительных испытаниях новых микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-V) и ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х) показано, что по диагностической ценности они равноценны традиционным методам биохимического тестирования микроорганизмов, но имеют преимущества по скорости получения результатов и экономичности.

3. Изучение диагностической ценности микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-V) позволили расширить диапазон биохимической идентификации холерных вибрионов до 12 видов рода Vibrio: V. cholerae 01 и не 01, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. mimicus, V. fluvialis, V. metschnicovii, V. vulrdftcus, V. anguillarum, V.furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, V. carchariae,

4. Лабораторные и полевые исследования новых бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких показало их высокую диагностическую эффективность при определении эпидемической значимости выделенных холерных вибрионов по сравнению с мснофагами холерными ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5.

5. По усовершенствованной схеме оценки эпидемической значимости V. cholerae eltor по чувствительности к бактериофагам ctx+ и ctx" и гемолитической активности отнесены 100% эпидемически опасных штаммов вибрионов эльтор. По чувствительности к монофагам ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности из числа эпидемически опасных идентифицировано 65,5 % штаммов. По результатам тестирования эпидемически неопасных штаммов V. cholerae eltor (ctxA') испытуемые и коммерческие бактериофаги равноценны.

6. Доказано, что новая тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA* tcpAметодом ПЦР на основе двух праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности генам ctx А+ и трех праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гену tcpA" позволяет одновременно выявлять биовар возбудителя холеры и определять его эпидзначимость. Определен порог чувствительности тест-системы для штаммов V. cholerae (ctxA+) - в концентрации 1103 м.к./мл, для штаммов V. cholerae (tcpA+) - 1-104 м.к./мл.

7. Впервые экспериментально обоснованы и введены в нормативные документы (ФСП, ЭПР, Инструкции по применению) стандартизованные и усовершенствованные методы контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

]. Саяпина Л.В., Грачева И.В., Анисимова Т.И., Касина И.В., Плотников О.П. Использование микротестсистем для изучения и биохимической идентификации представителей семейства Vibrionaceae. II Холера и патогенные для человека вибрионы: Информ. пробл. комис. межведомственного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ. - Ростов н/Д, 1999. -Вып. 12.-С. 74-75.

2. Sayapina L.V., Anisimova T.I, Kasina I.V. - New microtest systems for biochemical identification of vibrios and express definition of group by Heibirg // Scientific Journal. -Ulaanbaator, 1999. -№7.- P. 275-276.

3. Саяпина Л.В., Анисимова Т.И., Малахаева A.H., Адамова Г.В., Касина И.В., Тучков И.В., Майоров Н.В., Гаранина С.Б., Давыдова H.A., Шведун Г.П., Грачева И.В., Ливанова Л.Ф., Куличенко А.Н., Шарова И.Н. Новые тест-системы для индикации возбудителя К peatis и V. cholerae методом полимеразной цепной реакции // Сб. тез. докл. юбилейной науч. конф., поев. 25-летию ГНЦприкладной микробиол.-Оболенск, 1999.-С. 135.

4. Саяпина Л.В., Анисимова Т.И.. Адамова Г.В., Касина И.В., Остроумова Н.М., Грачева И.В., Казакова Е.С., Ливанова Л.Ф., Миронова Н.П., Резников Ю.Б. - Сравнительные испытания диагностической ценности новых бактериофагов ctx+, ctx' и ХДФ-3,4,5 // Холера и патогенные для человека вибрионы: Информ. пробл. комис. межведомств, совета по санитарпо-эпидемиол. охране тер. РФ. - Ростов н/Д, 2С00. - Вып. № 13. - С. 43-45.

5. Саяпина Л.В., Анисимова Т.И., Адамова Г.В., Касина И.В., Малахаева А.Н., Куличенко А.Н., Майоров Н.В., Тучков И.В. Определение эффективности новых диагностических тест-систем для индикации возбудителей особо опасных инфекций /7 Генная диагн. особо опасных инф. - Саратов, 2000. - С. 11-13.

6. Саяпина Л.В., Анисимова Т.И., Адамова Г.В., Касина И.В., Остроумова Н.М., Грачева И.В., Казакова Е.С., Ливанова Л.Ф., Миронова Н.П. Сравнительное изучение диагностической ценности новых бактериофагов холерных эльтор ctx+ и ctx- и ХДФ -3,4,5 // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2001. - № 3. - С. 69-72.

7. Саяпина Л.В., Анисимова Т.И., Сергеева Г.М., Адамова Г.В., Касина И.В., Малахаева А.Н. Новые питательные среды и иммунобиологические препараты для диагностики возбудителей особо опасных инфекций // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2002.-№ 3.-С. 115-117.

8. Саяпина Л.В., Анисимова Т.Н., Касина И.В., Малахаева А.Н., Адамова Г.В. Изучение диагностической ценности тест-системы диагностической для выявления ДНК V. choleras (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ: Реф. Сборник. - Саратов, 2002.- С. 19.

9. Касина И.В., Саяпина Л.В., Анисимова Т.И., Малахаева А.Н., Адамова Г.В., Осина H.A., Шарова И.Н., Парамонов И.В., Савельев В.Н., Еременко Е.И., Замараев B.C., Антонов В.А. // Внедрение новой тест-системы диагностической

для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxAtcpA) методом ПЦР. Молекулярная диагностика холеры: Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по проблеме «Холера». - Ростов н/Д, 2003. - С. 203-206.

10. Малахаева А.Н., Саяпина Л.В., Тихвинский М.С., Осина H.A., Шарова И.Н., Анисимова Т.И., Адамова Г.В., Касина И.В. Характеристика реагентов для подготовки проб возбудителей особо опасных инфекций к анализу методом ПЦР в государственных испытаниях // Матер. Межгос. науч.-практ. конф. государств участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней». - Саратов, 2003. - С. 109-110.

11. Саяпина Л.В., Волкова P.A., Анисимова Т.И., Малахаева А.Н., Касина И.В, Характеристика тест-систем для генодиагностики особо опасных бактериальных заболеваний И Тез. 1-й Всерос. конф. по вакцинологии. «Вакцинология-2007. Медицинские иммуно-биологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальн. инфекций». - 2004 г. - С. 61.

12. Саяпина Л.В., Грачева И.В., Касина И.В., Барулина И.С. Оценка результатов определения эпидемической значимости холерных вибрионов биовара эльтор с помощью диагностических холерных бактериофагов clx* и ctx // Холера и патогенные для человека вибрионы: Сб. матер, проблемной комиссии, Координационного научного совета по сан. охране тер. РФ.- Ростов н/Д, 2007,- Вып. № 20, С. 66-68.

13. Саяпина Л.В., Грачева И.В., Касина И.В., Барулина И.С., Абдрашитова A.C. Оценка эпидемической значимости холерных вибрионов биовара эльтор с помощью холерных диагностических бактериофагов СТХ+ СТХ" и определения гемолитической активности // Биопрепараты (Профилактика' диагностика' лечение).- М., 2007. - № 4. - С. 16-19.

Подписано в печать 17.12.08 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать трафаретная. Объем 1,0 ус.псч. л. Тираж 100 экз. Заказ 226 Типография АВП «Саратовский источник» г. Саратов, ул. Университетская, 42, оф. 106 т. 52-05-93

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Касина, Ирина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы биохимической идентификации.

1.2. Использование бактериофагов в лабораторной диагностике холеры.

1.3. Молекулярно-генетические методы индикации и идентификации холерных вибрионов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Испытуемые (новые) и контрольные (коммерческие) диагностические препараты.

2.1.2. Штаммы микроорганизмов.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Разработка Программ медицинских приемочных испытаний новых и коммерческих МИБП для выявления и идентификации возбудителя холеры.

2.2.2. Определение биохимической активности микроорганизмов.

2.2.3. Исследование активности, специфичности и воспроизводимости бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких.

2.2.4. Выявление V. cholerae с помощью тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae OI (ctxA+ tcpA+) методом ПЦР методом полимеразной цепной реакции.

2.2.5. Безопасность работы.

2.2.6. Статистические методы оценки результатов исследования.

ГЛАВА 3. Идентификация микроорганизмов рода Vibrio по биохимической активности с помощью микротестсистем.

3.1. Изучение диагностической ценности микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-V).

3.2. Изучение диагностической ценности микротестсистемы для ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х).

ГЛАВА 4. Сравнительная оценка качества бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких.

ГЛАВА 5. Изучение диагностической значимости тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. На основании анализа эпидемиологической обстановки по холере в мире, странах СНГ и России прогноз по этой инфекции на ближайшие годы остается неблагоприятным. Это связано, прежде всего, с существующей реальной возможностью завоза инфекции из эндемичных по холере стран. Уникальная вариабельность генома Vibrio cholerae позволяет говорить также о дальнейшей эволюции патогенности возбудителя, что способствует возникновению новых высоковирулентных штаммов, которые будут представлять особую опасность для человечества [91; 112; 129; 160; 168; 205; 235; 237; 223; 274; 276; 278; 291].

Кроме этого не исключается возможность эпидемического распространения холеры при биотерроризме. На основании критериев, использованных при отборе биологических агентов, V. cholerae относится к категории В - высокоприоритетных патогенов, которые должны быть учтены при стратегическом планировании готовности к вспышкам, вызванным биотеррористичесими актами [93].

Для своевременного предотвращения возникновения эпидемических вспышек холерой большое значение отводится проведению эпидемиологического надзора на всех этапах выявления заболевших, или подозрительных на заболевание, а также постоянному контролю за объектами окружающей среды. Для прогнозирования эпидемического процесса важным является проведение мониторинга фенотипических и генотипических свойств выделяемых штаммов [7; 83; 92; 143; 173; 214; 224; 240].

Проведение противоэпидемических мероприятий во многом определяется своевременной диагностикой, соответственно, чувствительностью и специфичностью лабораторных методов исследования. Из-за неодинаковой информативности существующих методов и препаратов до настоящего времени остается проблемой определения эпидемической значимости холерных вибрионов.

За последние годы для диагностики холеры в практическое здравоохранение недостаточно активно внедряются высокочувствительные препараты и тест-системы с использованием новых технологий для выявления возбудителя холеры [69; 85; 152]. Исходя из вышеизложенного, актуальным и своевременным является совершенствование диагностики холеры, направленной на внедрение в практику новых специфичных и высокочувствительных препаратов и тест-систем [33; 54; 60; 81; 103; 126; 154].

В последние годы взамен традиционных пробирочных биохимических тестов широко применяются экономичные и чувствительные наборы микротестов разных конструкций, которые значительно облегчают и упрощают процесс дифференциации бактерий [101; 1]. В дополнение к традиционным методам определения биохимической активности микроорганизмов с помощью бумажных индикаторных систем (СИБ), сред Гисса и Меллера лабораторного приготовления, в филиале ФГУП «НПО Микроген» НПО "Питательные среды" в г. Махачкала разработаны микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (МТС-У) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х) [99] .

С момента открытия д' Эреллем холерного бактериофага, фагодиагностика остается ценным специфическим тестом при идентификации холерных вибрионов. Поэтому разработка и усовершенствование препаратов фагодиагностики является важной задачей [5; 9; 24; 76; 93; 136; 163; 199; 203; 266; 285]. Одним из аспектов ее решения является совершенствование методов определения эпидемической значимости холерных вибрионов [8; 23; 51; 75; 77; 137; 158; 197; 226; 238; 287; 294]. В связи с этим специалистами ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» разработаны бактериофаги диагностические холерные эльтор с1х+ и с1х" жидкие для ускоренной идентификации и дифференциации эпидемически опасных с1х+ и эпидемически неопасных с!х" холерных вибрионов биовара эльтор [136].

Для индикации штаммов, выделяемых из биологического материала и объектов окружающей среды, в последние годы широко используют молекулярно-генетические методы, основанные на выявлении генов, ответственных за синтез основных факторов патогенности, в том числе с помощью ПЦР [14; 28; 41; 79; 84; 126; 249].

ПЦР позволяет выявлять в выделенных штаммах V. cholerae генетические маркеры токсигенности и эпидемической значимости, прежде всего ctxA гена, кодирующего синтез А-субъединицы холерного энтеротоксина. Это дает возможность одновременно с индикацией холерных вибрионов определять их токсигенность [14; 42; 46; 94; 139; 157; 176; 225; 261; 281; 288; 295].

Важная роль в патогенезе холеры и появлении новых токсигенных штаммов принадлежит токсин-корегулируемым пилям адгезии, которые являются рецептором для нитевидного фага СТХф, детерминирующего продукцию холерного токсина [63; 155; 210; 211; 219; 242; 269; 297]. Показано, что наличие генов tcp кластера напрямую связано с эпидемической значимостью штаммов холерных вибрионов [221; 241]. Учитывая вышеизложенное для повышения информативности генной диагностики холеры специалисты ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (г. Киров) разработали тест-систему, для выявления ДНК Vibrio cholerae основанную на одновременной амплификации двух генетических детерминант - ctxA и tcpA генов, отвечающих за синтез холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии, соотвественно [139].

Таким образом, затронутые некоторые актуальные вопросы по совершенствованию лабораторной диагностики холеры, указывают на значимость проблемы для обеспечения эпидемиологического благополучия населения страны. В связи с этим дальнейшие исследования, направленные на изучение диагностической ценности новых препаратов для диагностики холеры с целью внедрения их практическое здравоохранение, несомненно, является своевременными.

Необходимым условием внедрения в практику здравоохранения новых медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) является проведение контролируемых испытаний, а для их выполнения наличие адекватных и стандартных методов контроля, а также требований к их качеству. К началу исследований методы оценки качества препаратов для диагностики холеры, являлись неизученными. Чтобы определить диагностическую ценность новых МИБП для выявления и идентификации возбудителя холеры необходимо было всесторонне изучить их с использованием унифицированных схем аттестации, включающих разработку и стандартизацию методов оценки их качества, выбор препаратов сравнения; подбора необходимого количества микроорганизмов для определения специфической активности препаратов; провести стандартизацию и аттестацию методов контроля; систему регистрации оценки результатов испытаний; определение области применения новых МИБП, уточнение Инструкций по применению, требований к качеству при их масштабированном выпуске [12; 16; 17; 103; 153].

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Сравнительное изучение диагностической ценности новых микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (МТС-У,) и ускоренного определения их групп по Хейбергу (МТС-Х).

2. Оценка эффективности бактериофагов диагностических холерных эльтор с1х+ и сХк" жидких, предназначенных для ускоренной идентификации и дифференциации эпидемически опасных ctx+ и эпидемически неопасных ctx" холерных вибрионов биовара эльтор.

3. Изучение качества диагностической тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции в экспериментальных исследованиях.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые разработаны научные принципы аттестации и оценки качества новых диагностических препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры в медицинских приемочных испытаниях с использованием препаратов сравнения аналогичного назначения. Сформулированы критерии и разработаны требования к основным показателям качества МИБП при их серийных выпусках.

Впервые на представленном материале установлена диагностическая эффективность и обосновано внедрение в практику здравоохранения микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х). Новыми являются данные изучения биохимической активности большого набора музейных штаммов микроорганизмов V cholerae 01, V. cholerae не 01 и Vibrio других видов с помощью микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (MTC-Xj в сравнении с системами индикаторными бумажными, средами Гисса и Меллера лабораторного приготовления. Идентифицировано 12 видов вибрионов рода Vibrio и подтверждено соответствие их классификации по Берджи [18]. Разработана таблица идентификации по биохимической активности 12 видов рода Vibrio: V. cholerae OI и не 01, V parahaemolyticus, V. alginolyticus,

V. mimicus, V. fluvialis, V. metschnicovii, V. vulnificus, V. anguillarum, V. furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, V. carchariae.

Впервые научно обоснованы принципы оценки диагностической эффективности бактериофагов диагностических холерных эльтор СТХ+ и СТХ" жидких для лабораторной практики. Предложена усовершенствованная схема определения эпидемической значимости вибрионов эльтор. Разработаны требования к методам контроля специфической активности и специфичности фагов и требования к контрольным штаммам.

Разработаны методы и критерии оценки качества новой тест-системы диагностической для выявления ДНК Vibrio cholerae методом полимеразной цепной реакции на основе двух праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гену ctxA+, ответственного за ведущий фактор вирулентности - токсинообразование и трех праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гену tcpA+, кодирующего основную субъединицу токсинкорегулируемых пилей адгезии. Показано, что тест-система обнаруживала V. cholerae (ctxA+ tcpA+) в дозе 1 -103 м.к. и 1Т04м.к. в пробе, то есть в 100-1000 раз была чувствительнее многих, используемых в лабораторной практике, сертифицированных диагностических препаратов.

Использованные нами в работе критерии качества испытуемой тест-системы позволили доказать возможность одновременного выявления возбудителя холеры, определения его эпидемической значимости и дифференцирования по биовару.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ И ВНЕДРЕНИЯ. Работа имеет практическую направленность и посвящена усовершенствованию методов контроля, определяющих качество новых препаратов для диагностики холеры.

1. Микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V), ФСП 42-0504-7631-06 и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х) производства филиала ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ НПО "Питательные среды" в г. Махачкала, ФСП 42-0504-7632-06, протокол Комитета МИБП № 8 от 26.12.97 г.

2. Бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие производства ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб" (г. Саратов), ФСП 42-0020-2038-01, протокол Комитета МИБП № 7 от 05.07.00 г.;

3. Тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae {ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции производства ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (г. Киров), составлен проект ФСП, протокол Комитета МИБП №7 от 19.12.02 г.

По результатам проведенных испытаний в ФСП и Инструкцию по применению на микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) внесены изменения, касающиеся методики постановки реакции, дополнительно введены штаммы для контроля чувствительности, включена таблица биохимической характеристики 12 видов, относящихся к роду Vibrio-. V. cholerae OI и не OI, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. mimicus, V. fluvialis, V. metschnicovii, V. vulnificus, V. anguillarum, V furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, V. carchariae. Акт внедрения рекомендаций в НД (ФСП и Инструкцию по применению) утвержден начальником Управления регистрации и обеспечения качества лекарственных средств ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ 23.10.2007 г.

В ФСП на Бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие уточнены требования к «Специфической активности и специфичности» фагов и требования к штаммам для контроля. В Инструкцию по применению на бактериофаги - для более четкой оценки результатов в схему оценки эпидемиологической значимости вибрионов эльтор рекомендовано внести изменения в схему оцениваемых штаммов - помимо разделения на варианты, обобщить в группы. Акт внедрения рекомендаций в НД (ФСП и Инструкцию по применению) утвержден директором ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 11.02.2008 г.

В проект ФСП на тест-систему для выявления ДНК Vibrio cholerae {ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции, внесены изменения, касающиеся определения ее специфической активности и специфичности. Определен порог чувствительности тест-системы для штаммов V cholerae (ctxA+) - в концентрации Г103 м.к./мл, для штаммов V. cholerae (tcpA+) - в концентрации 1-104 м.к./мл. Подобраны тест-штаммы, используемые для контроля чувствительности и специфичности препарата. Для повышения чувствительности тест-системы в течение срока годности рекомендовано разделение праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гена ctxA и гена tcpA. Акт внедрения рекомендаций в НД (проект ФСП и Инструкции по применению) утвержден начальником ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» 07.11.2007 г.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

2. Новые микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х) имеют преимущества по экономической эффективности и простоте постановки перед средами Гисса и Меллера и системами индикаторными бумажными (СИБ).

3. Сравнительная оценка в приемочных испытаниях чувствительности, специфичности и воспроизводимости новых бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких показала их преимущество перед монофагами диагностическими холерными ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ,5 при определении эпидемической значимости выделенных холерных вибрионов.

4. Обоснована целесообразность внедрения в практику здравоохранения тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции, предназначенной одновременно выявлять возбудителя холеры и определять его эпидемическую значимость по наличию гена ctxA, ответственного за токсинообразование и по наличию гена tcpA, кодирующего основную субъединицу токсин корегулируемых пилей адгезии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2000 г., 2003 г.); научных конференциях и Ученых Советах ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Москва, 1999 г., 2000 г., 2003 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и производства питательных сред в решении задач по обеспечению санитарно-эпидемиологического благополучия населения России» (Оболенск,1999); Первой Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000 г.); VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 2003 г.); Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004 г.).

ГТУБЛИКАЦИИ. Основные положения диссертации отражены в 13 публикациях, в том числе в 2 - рекомендованных ВАК Российской Федерации научно-практических изданиях.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 140 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 302 источника литературы, в том числе 184 отечественных и 118 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 2 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Касина, Ирина Владимировна

выводы

1. В лабораторных и полевых испытаниях по разработанным программам медицинских приемочных испытаний изучены и рекомендованы в практику здравоохранения 4 новых диагностических препарата, предназначенных для индикации и идентификации возбудителя холеры: микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-Y), микротестсистемы для ускоренного определения групп вибрионов по Хейбергу (МТС-Х), бактериофаги диагностические холерные эльтор ctx+ и ctx" жидкие, тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции.

3. Изучение диагностической ценности микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов рода Vibrio (MTC-V) позволили расширить диапазон биохимической идентификации холерных вибрионов до 12 видов рода Vibrio: V. cholerae Ol и не Ol, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. mimicus, V. fluvialis, V. metschnicovii, V. vulnificus, V anguillarum, V furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, V. carchariae.

4. Лабораторные и полевые исследования новых бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких показало их высокую диагностическую эффективность при определении эпидемической значимости выделенных холерных вибрионов по сравнению с монофагами холерными ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5.

5. По усовершенствованной схеме оценки эпидемической значимости V. cholerae eltor по чувствительности к бактериофагам ctx+ и ctx" и гемолитической активности отнесены 100 % эпидемически опасных штаммов вибрионов эльтор. По чувствительности к монофагам ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности из числа эпидемически опасных правильно идентифицировано 65,5 % штаммов. По результатам тестирования эпидемически неопасных штаммов V cholerae eltor (ctxA') испытуемые и коммерческие бактериофаги равноценны.

6. Доказано, что новая тест-система для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом ПЦР на основе двух праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности генам ctx/V и трех праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности гену tcpA+ позволяет одновременно выявлять биовар возбудителя холеры и определять его эпидзначимость. Определен порог чувствительности тест-системы для

Ь Я штаммов V cholerae (ctxA ) - в концентрации 110 м.к./мл, для штаммов V cholerae (tcpA+) - 1 -104 м.к./мл.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Холера продолжает оставаться одной из актуальных социально-значимых опасных инфекций, единичные вспышки которой рассматриваются с возможностью эпидемического распространения [90; 128; 172; 186; 223; 229; 245; 262; 263; 275; 286; 291]. Прогноз по холере для России, в связи с продолжающимися масштабными эпидемиями в странах Африки и Азии, возможностью завозов инфекции, остается неблагоприятным [44; 112]. Имевшие место в последнее десятилетие вспышки холеры в Приморском крае (1999), Республике Татарстан (2001) и Ростовской области (2005) были завозного происхождения [116; 120; 127]. Также эпидемиологическая ситуация в России определяется ежегодным выделением холерных вибрионов, в том числе токсигенных, из водных объктов внешней среды [15; 93; 95; 117]. Все это диктует необходимость осуществления регламентированного объема мероприятий, предусмотренных системой эпидемиологического надзора при холере, обеспечения готовности медицинских учреждений специального назначения, в том числе микробиологических лабораторий для проведения исследований на холеру и индикации возбудителя [84; 92; 102; 169].

В соответствии с концепцией развития Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека приобретают особую значимость разработка и внедрение в практику Федеральной службы Роспотребнадзора современных методов и средств лабораторной диагностики, профилактики и борьбы с инфекционными болезнями [85; 93; 129].

В связи с этим совершенствование методов лабораторной диагностики возбудителя холеры и разработка новых препаратов на их основе является актуальной задачей [31; 77; 92; 136; 130; 152; 158; 167; 181; 249; 298]. Для внедрения препаратов в практику Федеральной службы Роспотребнадзора необходима разработка соответствующей нормативной базы, стандартных схем отбора, проведение объективных испытаний и как следствие разрешение к применению в практических целях сертифицированных препаратов [12; 16; 17; 103; 105; 152; 153].

В наших исследованиях была проведена оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры: микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х), бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких и тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции для последующей рекомендации их к регистрации в Российской Федерации.

Система оценки качества диагностических препаратов включала в себя показатели чувствительности - процент обнаружения положительных проб, процент выявления возбудителей при клинических или полевых испытаниях, специфичности, воспроизводимости и экономичности. Наиболее важными из них являются показатели чувствительности и специфичности. Именно они определяют способность препарата объективно обеспечивать определение эпидемического потенциала территорий, оценивать эпидемиологическую обстановку, осуществлять эпидемиологический надзор и своевременно проводить мероприятия по санитарно-эпидемиологической охране территории России.

Испытания диагностической ценности препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры проводили по разработанным нами Программам испытаний на базах научно-исследовательских институтов соответствующего профиля и противочумных станциях. Число опытных баз определяли в зависимости от общего объема запланированных исследований, но не менее двух. Этапы испытаний с соблюдением принципов полевых контролируемых экспериментов распределялись между базами.

Испытания образцов новых диагностических препаратов по всем показателям на всех стадиях проводили в сравнительных опытах с коммерческим препаратом аналогичного назначения. Выбор аналога сравнения проводился конкретно для каждого испытуемого препарата.

Чувствительность и специфичность препаратов оценивали на штаммах, полученных от людей и из объектов внешней среды. При этом оценивали способность и надежность методов контроля, изложенных в проектах ФСП, обеспечивать необходимый уровень качества препаратов в соответствии с их назначением.

Для проведения исследований в лабораторных, клинических и полевых испытаниях определяли объем работы. Для этого в опыт брали те объекты и клинический материал, при исследовании которых, регистрируется наибольшая частота выявления возбудителя.

Информативность лабораторных методов контроля определяли по соответствию результатов лабораторных и полевых опытов. Для этого устанавливали критерии оценки диагностических препаратов, результаты вносили в разработанные определенные формы документации, в том числе таблицы шифрования, протоколы результатов исследований. По окончании испытаний проводили статистическую обработку результатов с определение средних величин, достоверности различий между опытными и контрольными диагностическими препаратами. Полученные в ходе лабораторных и анализе полевых испытаний данные были использованы при составлении окончательного варианта ФСП и Инструкций по применению.

Диагностическую ценность микротестсистем для биохимической идентификации вибрионов (МТС-У) и определения их групп по Хейбергу (МТС-Х) производства филиала ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ НПО "Питательные среды" в г. Махачкала изучали по проценту совпадения результатов определения биохимических свойств микроорганизмов с препаратами сравнения, количеству правильно идентифицированных штаммов, по совпадению результатов при определении 10 положительных и 10 отрицательных пробах. Кроме этого нами оценивались технологичность, доступность постановки метода и скорость получения результатов.

При изучении музейных штаммов (п=151) представителей семейства УЛпопасеае и других микроорганизмов было доказано, что микротестсистемы МТС-У и МТС-Х по своей специфической активности соответствуют коммерческим системам индикаторным бумажным (СИБ) и средам Гисса и Меллера. Анализ биохимической активности холерных вибрионов по 11 тестам для микротестсистемы МТС-У показал, что совпадения результатов, полученных с помощью испытуемой микротестсистемы и коммерческой системы СИБ, для разных реагентов составили от 76,0 до 100,0%, средние данные по 11 тестам - 93,0±2,0 %. Частота совпадений реакций с помощью МТС-У со средами Гисса и Меллера для отдельных тестов отмечалась от 78,0 % до 100,0 %, среднее по 11 тестам - 93,0±3,0 %. Анализ биохимической активности микроорганизмов по 3 тестам для микротестсистемы МТС-Х показал, что совпадения результатов, полученных с помощью испытуемой микротестсистемы и коммерческой системы СИБ, для разных реагентов составили от 57,0 до 100,0 %, средние данные по 3 тестам - 88,0±3,0 %. Частота совпадений реакций с помощью МТС-Х со средами Гисса и Меллера для отдельных тестов отмечалась от 85,0% до 100,0%, среднее по 11 тестам -91,0±2,0 %. При этом статистически достоверных различий (р>0,10) между методами исследования не обнаружено. Предварительный учет результатов биохимической активности штаммов с помощью микротестсистемы МТС-У проводили через 2-3 ч, окончательный - через 18-20 ч. С помощью микротестсистемы МТС-Х окончательный учет результатов биохимической активности микроорганизмов проводился через 2-3 ч. При изучении воспроизводимости получено 100 % совпадение результатов положительных и отрицательных реакций биохимической активности микроорганизмов с помощью МТС-У и МТС-Х.

Полученные нами результаты свидетельствовали о высокой диагностической ценности микротестсистем MTC-V и МТС-Х. Показано преимущество микротестсистем MTC-V и МТС-Х перед СИБ, средами Гисса и Меллера по возможности одновременного испытания на одном планшете несколько подозрительных колоний, исключению необходимости проведения большого объема подготовительных работ и сокращения времени постановки и получения результатов, технологичности, так как не требуют приготовления дорогостоящих питательных сред с аминокислотами и сахарами, возможности проведения анализа в полевых условиях без сред Гисса или Меллера на месте или транспортировки сред, приготовленных ранее в стационарных условиях.

Усовершенствование контроля качества микротестсистем MTC-V и МТС-Х состояло в оптимизации методики постановки реакции, заключающейся в изменении, вносимых в ячейки объема взвеси микроорганизмов; дополнение среды, используемой для приготовления взвеси микроорганизмов (пептонная и дистиллированная вода); в подборе тест-штаммов для контроля специфической активности, обеспечивающих проверку каждого реагента, в расширении диапазона биохимической идентификации вида Vibrio cholerae и дифференциации их от других видов Vibrio и близкородственных микроорганизмов.

В Инструкцию по применению на микротестсистему для биохимической идентификации вибрионов MTC-V включена таблица биохимической характеристики 12 видов, относящихся к роду Vibrio: V. cholerae 01 и не 01, V. parachaemolyticus, V alginolyticus, V. mimicus, V. fluvialis, V. metschnikovii, V. vulnificus, V anguillarum, V furnissii, V. albensis, V. cincinnatiensis, К carchariae.

Таким образом, на основании результатов, полученных при проведении приемочных испытаний, микротестсистемы для биохимической идентификации вибрионов (MTC-V) и определения их по группам Хейберга (МТС-Х) внедрены в лабораторную практику.

Диагностическую ценность бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" жидких производства ФГУЗ РосНИПЧИ "Микроб" (г. Саратов) определяли в сравнении с монофагами диагностическими холерными ХДФ-3, ХДФ-4 и ХДФ-5. Испытания проводили по схеме определения эпидемической значимости холерных вибрионов эльтор, состоящей из 8 вариантов - эпидемически опасные; эпидемически неопасные и штаммы, для определения эпидемической значимости которых, необходимо привлечение дополнительных методов исследования. Эпидемическую значимость испытуемых штаммов определяли по 3-м признакам — чувствительности к фагам ctx+ и ctx" и гемолитической активности.

Проведенные исследования позволили установить, что с помощью испытуемых бактериофагов ctx+ и ctx" и гемолитической активности идентифицировано 100 % эпидемически опасных штаммов (п=116), в том числе 108 штаммов (93,1 %) (вариант 1 - гемолиз , ctx+ - "+", ctx" - "-") к числу эпидемически опасных отнесены без дополнительных исследований, а 8 штаммов (6,9 %) были отнесены при дополнительных исследованиях (метод ПЦР) на наличие ctxAB также к числу эпидемически значимых. С помощью контрольных монофагов ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности идентифицировано только 65,5 % эпидемически опасных штаммов.

Тестирование эпидемически неопасных штаммов V. сНоЫгае еНог (с(хА~) (п=87) с помощью бактериофагов диагностических холерных эльтор с1х+ и с1х" жидких и контрольных коммерческих монофагов диагностических холерных ХДФ-3,4,5 показало, что используемые препараты по диагностической ценности равнозначны. С помощью испытуемых бактериофагов холерных эльтор с!х+ и с1х" и гемолитической активности правильно идентифицировано 87 % штаммов, с помощью контрольных монофагов ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности — 85 %.

С целью сравнительной оценки диагностической эффективности указанных бактериофагов была изучена их специфичность. Установлено, что специфичность бактериофага холерного эльтор с1х+ составила 81,6 %, специфичность бактериофага холерного эльтор с1х" - 98 %. Бактериофаг холерный эльтор йх+ был недостаточно специфичен, поскольку лизировал эпидемически неопасные холерные вибрионы. У данных штаммов выявлены гены биосинтеза токсинкорегулируемых пилей адгезии (7срА) - ведущего фактора колонизации холерных вибрионов, поэтому штаммы с таким генотипом считаются потенциально эпидемически опасными, способными вызывать спорадические единичные и множественные случаи диарей. Выделение штаммов холерных вибрионов с генотипом сЬс" £ср+ из объектов внешней среды и от людей, свидетельствует о заносе на территорию эпидемически опасного возбудителя холеры, который утратил отдельные гены или блок вирулентности под воздействием факторов внешней среды [Костромитина Е.А., 2004]. В связи с этим идентификация и дополнительное изучение таких культур является важной задачей лабораторной диагностики.

Анализ данных по 5 базам испытаний показал, что по предложенной схеме с учетом гемолитической активности идентифицировано 100% из 350 музейных и свежевыделенных штаммов V. сксЯегае еЬог (с(хА+). В том числе 95,1 % отнесены к числу эпидемически опасных без дополнительных исследований, т.е. к варианту 1, а 17 штаммов (4,9 %), выделенные от больных, носителей и сточных вод, были отнесены при дополнительных исследованиях на наличие генов с£хАВ методом ПЦР также к числу эпидемически значимых (варианты 3, 4, 5). В то время, с помощью контрольных монофагов ХДФ-3,4,5 и гемолитической активности правильно идентифицировано из числа эпидемически опасных только 157 штаммов из 350 исследованных, что составило 55 %.

Нами была проанализирована частота совпадений эпидемической значимости штаммов V. ско1егае еНог с помощью бактериофагов и паспортных данных по ПЦР - тестированию на наличие генов ОхАВ по всем 5 - ти базам испытаний (таблица 4.4.). Из этой таблицы видно, что из 570 изученных штаммов V. ско1егае еНог, имеющих и не имеющих структурные гены МхАВ, результаты тестирования по ПЦР совпали с определением эпидемической значимости по фагам и с!х" в 92,8 % (529 штаммов), по фагам ХДФ - в 66,6 % (380 штаммов). Данные определений с помощью испытуемых и контрольных фагов совпали в 64,4 % (367 из 570 штаммов). Изучение воспроизводимости испытуемых и ^х" бактериофагов показало 100% совпадение результатов в 10 положительных и 10 отрицательных параллельных определениях.

Полученные результаты исследований свидетельствовали о достаточно высокой активности и специфичности, диагностической ценности и информативности, простоте использования (применяются в цельном виде) испытуемых бактериофагов диагностических холерных эльтор йх+ и с1х" по сравнению с контрольными монофагами холерными ХДФ-3,4,5.

Результаты сравнительного изучения бактериофагов позволили разработать требования, способствующие повышению их качества, и внести изменения в Нормативную документацию. Предложенная авторами и специалистами Ростовского-на-Дону НИПЧИ схема оценки эпидемической значимости вибрионов эльтор по чувствительности к бактериофагам диагностическим холерным эльтор с1х+ и с1х" была усовершенствована нами с учетом результатов приемочных испытаний бактериофагов. Оценку эпидемиологической значимости холерных вибрионов было рекомендовано проводить по 3 признакам — чувствительности к фагам ctx+, ctx" и гемолитической активности в соответствии со схемой, состоящей из 8 вариантов, обобщенных в 3 группы: эпидемически опасные (I группа); штаммы, для определения эпидемической значимости которых, необходимо привлечение дополнительных методов исследования, таких как определение токсигенности на модели кроликов-сосунков и метода полимеразной цепной реакции (II группа) и эпидемически неопасные (III группа). Для каждой группы определены и уточнены варианты. Усовершенствованная нами схема была внесена в Инструкцию по применению на препарат и в Методические указания МУ 4.2.1097-02. 2002 «Лабораторная диагностика холеры».

В ФСП уточнены требования к «Специфической активности и специфичности фагов, а также требования к тест-штаммам для контроля». Рекомендовано для контроля активности бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и специфичности бактериофагов ctx" использовать 5 штаммов заведомо эпидемически опасных, относящихся к 1 варианту; для контроля специфической активности бактериофагов ctx" и специфичности бактериофагов ctx+ использовать по 2 эпидемически неопасных из 3 группы (варианты 6,7, 8).

Для сохранения стабильности препарата и увеличения срока его действия авторам рекомендовано в последующем разработать лиофилизированную форму выпуска бактериофагов ctx+ и ctx".

Благодаря простоте метод идентификации с помощью бактериофагов диагностических холерных эльтор ctx+ и ctx" доступен для лабораторий любого уровня оснащения и может быть использован в комплексе с определением гемолитической активности в пробе Грейга и с другими методами для предварительной оценки эпидемической значимости холерных вибрионов биовара эльтор.

Нами было проведено сравнительное испытание диагностической эффективности сконструированной специалистами ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) методом полимеразной цепной реакции и контрольной тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+) методом полимеразной цепной реакции производства ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». Тест-системы оценивали по чувствительности (определению минимального количества, выявленных в ПЦР, микробных клеток холерного вибриона), по проценту выявленных штаммов V. cholerae (ctxA+tcpA+) к числу исследованных, по проценту выявленных положительных проб биологического материала и объектов внешней среды к числу искусственно инфицированных V. cholerae (ctxA+tcpA+) проб, взятых на исследование. При изучении специфичности определяли процент неспецифических реакций при исследовании проб, инфицированных V cholerae не OI (ctxA*) и гетерологичными микроорганизмами.

На этапах изучения чувствительности и специфической активности тест-системы всего было исследовано 54 штамма микроорганизмов. В результате проведенных исследований показано, что обе тест-системы равнозначны по способности определять эпидемическую значимость выделенных холерных вибрионов, имеющих ген ctxA, ответственного за токсинообразование. Обе о тест-системы выявляли в концентрации 1Т0 м.к./мл одинаковое количество штаммов V cholerae (ctxA+) (испытуемая - 33, контрольная - 32 из 37 исследованных штаммов). Также обе тест-системы характеризуются высокой специфичностью: специфичность испытуемой тест-системы составила 95 %, контрольной — 97 %. Воспроизводимость оценивали в процентах совпадений результатов исследования 10 положительных проб V. cholerae (ctxA+tcpA+) и 10 отрицательных проб V. cholerae не 01 {ctxA~ tcpA') при постановке анализа разными исполнителями в разные сроки исследования. При учете результатов установлена 100 % воспроизводимость положительных и отрицательных результатов. Продолжительность анализа от начала исследования до получения заключительного ответа для обеих тест-систем составила 8 ч.

В сравнительных испытаниях доказано преимущество испытуемой тест-системы перед контрольной по способности выявлять дополнительную детерминанту патогенности холерных штаммов - ген 1срА, ответственный за синтез основной субъединицы токсин-корегулируемых пилей; дифференцировать холерные вибрионы на классический и эльтор биовары, выявлять штаммы 0139 серовара, а также по способности обнаруживать дополнительно штаммы V. ско1егае по наличию гена ^рА при отсутствии гена с1хА. Идентификация штаммов с генотипом сгхА~1срАл очень важна, так как они считаются потенциально эпидемически опасными и способными вызывать спорадические случаи диареи [61]. Штаммы V. сИо!егае с характеристикой (с£хА~ 1срА+) обусловили локальные вспышки холеры в Узбекистане (1961, 1963, 1980-1990 годы), Азербайджане (с 1970 по 1993 г.г.), Туркмении, в Ростовской области в 2005 г. [93].

На основании проведенных исследований по нашей рекомендации в проект ФСП включены дополнительные критерии оценки качества препарата: подобраны контрольные штаммы, определены требования к этим штаммам, обоснованы их дозы, используемые при контроле тест-систем, уточнены показатели чувствительности тест-системы. Авторами была заявлена о чувствительность тест-системы 110 м.к./мл. В результате наших исследований было показано, что тест-система выявляла 89,2 % штаммов V. ско1егае (с(хА+) и только 43,2% штаммов V. с!ю1егае (/срА ) в концентрации НО м.к./мл. Штаммы V. ско1егае (/срА+) в концентрации 1-104 м.к./мл испытуемая тест-система выявляла 94,6 % случаев. Учитывая полученные результаты, нами было рекомендовано внести в нормативную документацию чувствительность тест-системы для штаммов V. ско1егае (с(хА+) равную НО3 м.к./мл, для штаммов V. ско\егае {1срА- 1 ТО4 м.к./мл.

Кроме этого нами было рекомендовано внести изменения в комплектацию тест-системы. Авторами была предложена смесь праймеров, обеспечивающих специфичную амплификацию фрагмента ДНК размером 302 п.н, комплементарных нуклеотидной последовательности структурного гена ctxA и праймеров, обеспечивающих специфичную амплификацию фрагментов ДНК размером 455 п.н. (для возбудителя холеры биовара эльтор и серогруппы 0139) и 264 п.н. (для возбудителя холеры классического биовара), соответствующего нуклеотидным последовательностям структурного гена tcpA. В ходе проведения сравнительных испытаний нами показано, что это влияет на чувствительность тест-системы. В связи с этим для сохранения чувствительности тест-системы в течение срока годности нами было рекомендовано разделение праймеров, комплементарных нуклеотидной последовательности структурным генам ctxA и tcpA, на отдельные компоненты.

Таким образом, в результате проведенных испытаний получены новые данные о преимуществе испытуемой тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) перед контрольной по диагностической эффективности. Разработанные нами в процессе исследований требования оценки основных показателей качества диагностической тест-системы для выявления ДНК Vibrio cholerae (ctxA+ tcpA+) введены в утвержденную нормативную документацию. Проведенная аттестация позволила внедрить в практику отечественный препарат нового поколения для усовершенствования лабораторной диагностики холеры.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Касина, Ирина Владимировна, Саратов

1. Аболина Т.А., Грижебовский Г.М., Дедовская А.П. Изучение отношения к аминокислотам представителей семейства Vibrionaceae с использованием бумажных индикаторных систем // Тез. докл. Особо опасные инфекции на Кавказе. Ставрополь, 1987. - С. 149-150.

2. Авдеева Е.П., Мазрухо Б.Л., Воронежская Л.Г. с соавт. Характеристика энтеропатогенных холерных вибрионов не 01/0139 серогрупп, выделенных в Узбекистане // ЖМЭИ. 2005. - N 3. - С. 80-82.

3. Адамов А.К., Наумшина М.С. Применение полиуглеводной среды при исследовании материала на присутствие холерного вибриона // Особо опасные природно-очаговые инфекции: Сб. науч. работ противочум. учрежд. М., Медгиз, 1962. -с. 238-240.

4. Адамов А.К., Быстрый Н.Ф., Шмеркевич Д.Л., Середин В.Г. Методика дифференциации патогенных и апотогенных вибрионов Эль-Тор // В кн.: Проблемы ООИ .- Саратов, 1971.-№ 1.-С. 116-123.

5. Адамов А.К., Бугоркова Т.В., Наумшина М.С. Определение образования сероводорода в культурах холерных вибрионов при их идентификации // Информ. бюл. изобретения, рацпредложения и межд. рекоменд. Саратов, 1990.-№29.-С. 14.

6. Адамов А.К. Основные направления в совершенствовании лабораторной диагностики в противочумной системе // Матер, науч.-практ. конф., поев. 100-летию образования противочумной службы в России. — Саратов, 1997. Т.1. -С. 171-172.

7. Адамов А.К., Омарова Б.К. Сравнительная оценка некоторых методов определения вирулентности холерных вибрионов // Сб. научн. трудов, поев. 50-летию Дагестанской противочумной станции Махачкала, 2002. - С. 104-108.

8. Адаме М.Н. Бактериофаги// Пер. с англ. М. Изд.-во иностр.лит., 1961.

9. Алексеенко В.В., Лысенко З.А., Доброштам Е.В. Чувствительность холерных вибрионов к специфическим фагам // Микробиол. журн. 1984. - т. 46,-№ 5.-е. 65-69.

10. Балахонов С.В., Ганин B.C., Урбанович Л.Я. с соавт. Определение генных детерминант холерного энтеротоксина методом полимеразной цепной реакции // Журнал инфекционной патологии. 1998. - Т.5, N 4. - С. 52-54.

11. Бектимиров Т.А., Шобухова Т.С. Состояние и перспективы разработки для диагностики управляемых инфекций // Матер. VII съезда Всерос. общества эпидемиол., микробиол. и паразитол. -М., 1997. — С. 419-420.

12. Бектимиров Т.А. Экспертиза и испытание иммунобиологических препаратов // Вакцинология: Тез. Перв. Всерос. конф. по вакцинол. «Медицине, иммунобиол. препар. для профилакт., диагн. и лечения актуальн. инфекц.».-Москва, 2004.-С. 10-11.

13. Берджи. Определитель бактерий // В 2-х т. Т.1: Пер. с англ./Под. Ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П.Снита, Джю. Дейли, С. Уильямса.- М.: Мир, 1997. 432 С.

14. Брильман Я.Е. Дополнительный тест для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae и некоторых представителей рода Vibrio II Клиническая лабораторная диагност. 1995. - N 3. - С. 7-11.

15. Быстрый Н.Ф. Бактериофаг для дифференциальной диагностики холерных вибрионов//В кн.: Производст. бакпреп.-Саратов,1966 С.261-268.

16. Быстрый Н.Ф., Остроумова Н.М., Царева С.А. с соавт. Селекция фагов к вибрионом Эль Тор // В кн.: Матер. Межинстит. науч.конфер., посвящ. пам. Л.А.Тарасевича.- Москва, 1967.- С.53-55.

17. Быстрый Н.Ф., Волосивец А.И., Лучникова И.К. Дифференциация холерных и Эль-Тор вибрионов при помощи специфических холерных монофагов // ЖМЭИ. 1968.- №9.-С.41-45.

18. Быстрый Н.Ф., Середин В.Г., Урюпина Н.В. с соавт. Метод дифференциации вирулентных и авирулентных вибрионов с помощью специфических бактериофагов // Пробл. особо опасных инф.- 1970.- вып.1(П).-С.141-146.

19. Быстрый Н.Ф. Холерные бактериофаги// Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. докт. биолог, наук.- Саратов, 1974 30 С.

20. Власов В.П., Монахова Е.В., Ушакова И.Е. с соавт. Гемолизин Vibrio cholerae eltor: клонирование и экспрессия генов в Е. coli II Мол. ген., микробиол. и вирусол. 1992, N 7-8. - С. 14-20.

21. Водопьянов С.О., Мишанькин М.Б., Олейников И.П. с соавт. Разработка способа выявления гена tcpA холерного вибриона биотипа эльтор и сероварианта 0139 Бенгал с помощью полимеразной цепной реакции // Биотехнология. 1999. - N 6. - С. 19-23.

22. Водопьянов С.О., Парамонов И.В., Сучков И.Ю. с соавт. Конструирование специфических праймеров для выявления гена toxR холерного вибриона // Биотехнология. 2001. - N 5. - С. 70-74.

23. Воробьев A.A. Современные направления в разработке новых иммунобиологических препаратов // ЖМЭИ. 1999. - N 5. - С. 16-21.

24. Гаевская Н.Е. Характеристика умеренных фагов, выделенных из атоксигенных штаммов холерных вибрионов эльтор, изолированных от людей //Пробл. особо опасн. инфекц.- Саратов, 2005.- №2 (90).- С.40-43.

25. Гальцева Г.В., Зайденов A.M., Черноусова Э.Л. с соавт. Холероподобный гастроэнтерит, обусловленный V. fluvialisll Сб. науч. трудов. Новороссийск, 1994.-Вып. 1.-С. 129.

26. Гальцева Г.В., Либинзон А.Е., Леванова Г.Ф. История становления таксономического положения вибрионов Мечникова // Сб. науч. трудов. — Новороссийск, 1994а. Вып. 1. - С. 163-169.

27. Гальцева Г.В. Таксономия и идентификация холерных и других вибрионов // Дис. д-ра мед. наук, в форме науч. докл. Саратов, 1995. - 66 с.

28. Гаранина С.Б. Конструирование тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции, для детекции возбудителя бруцеллеза// Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 1996. - 20 с.

29. Гинцбург А.Л., Брюханов А.Ф., Янишевский Н.В. Определение наличия гена токсинообразования у холерного вибриона: Методич. рекомендации. М., 1986.

30. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний // Клиническая лабораторная диагност. 1998. - №2.- С. 35-39.

31. Глухов А.И., Онищенко Г.Г., Гордеев С.А. с соавт. Определениесодержания гена холерного токсина в составе ДНК из штаммов Vibrio cholerae методом "гнездовой" полимеразной цепной реакции // Журн. микробиол. 1996. -N5. - С. 20-22.

32. Грижебовский Г.М., Аболина Т.А., Дедовская А.П. Определение биохимических групп представителей семейства Vibrionaceae II Тез. докл. Особо опасные инфекции на Кавказе. Ставрополь, 1987. - С. 157-158.

33. Давыдова H.A. Конструирование тест-системы для выявления возбудителя холеры методом полимеразной цепной реакции // Автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. биолог, наук.- Саратов, 2001.- 21С.

34. Данилкина Е.Б. Совершенствование методов выделения и идентификации патогенных для человека вибрионов // Автореф. дис. на соискание ученойстепени канд. мед. наук., Саратов, 1995. 19 с.

35. Дрожевкина М.С., Арутюнов Ю.И. Типирование холерных вибрионов новым набором фагов // Журн. гиг., эпид., микробиол. и иммунолог.- 1979.-Т. 23.-№ З.-С. 306-312.

36. Дрожевкина М.С., Киселева В.И., Македонова Л.Д. с соавт. Полилизогения у вибрионов эльтор// Вопросы вирусологии. 1982. - Т.27, №4. - С.81-83.

37. Дрожевкина М.С., Харитонова Т.И. Специфические фаги наг-вибрионов // Тез. Обл. науч.-практ. конф. по проблеме «Холера».- Ростов-на-Дону, 1984.-С. 113-115.

38. Ермольева З.М. Бактериофагия холеры // ЖМЭИ.- 1942.- № 11-12.- С.55.

39. Ефременко В.И., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н. с соавт. Новые препараты для экспресс-диагностики опасных инфекционных заболеваний и их применение в чрезвычайных ситуациях // ЖМЭИ. 2001. - N 6, прил. - С. 55-58.

40. Жданова Л.П., Грагер Р.И., Краснова И.Н. с соавт. Фагочувствительность неаглюцинирующихся вибрионов // ЖМЭИ.-1974.- № 12.-С. 110-111.

41. Жуков-Вережников Н.Н. К вопросу о сущности и значении бактериофагии. Значение феномена Д'Эрелля для изучения биологии бактерий.-ЖМЭИ.- 1936.-Т.17.- вып.4.-С. 571-579.

42. Заднова С.П., Исаев Н.Д, Конов Н.П. с соавт. Биохимический анализ двух фенотипически различных клонов штамма Vibrio cholerae Дакка 3501// Пробл. ООИ.- 2004.- Вып. №1,- С.42-45.

43. Зинина О.С. Умеренные фаги V cholerae не OI серовара, элементы их классификации и респектива практического использования в лабораторной диагностике наг-инфекций // Автореф. дис. на соискание уч. степ. канд. мед. наук., Саратов, 1990. 18 с.

44. Кондрашкова Т.В., Никитина Г.П., Дальвадянц С.М. Некоторые особенности приготовления сред Гисса для диагностики возбудителей холеры и чумы // Пробл. особо опасных инф. Саратов,1973. - Вып. 5(33). - С. 79-82.

45. Костромитина E.A. Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона эльтор с различной эпидемической значимостью// Автореф. дис. на соискание ученой степени канд. мед. наук., Саратов, 2004. — 22 с.

46. Коровкина Г.И., Мельникова А.Т., Остроумова Н.М. Разработка технологии изготовления препаратов ДДФ // Иммуная и специф. профилакт. ООИ. Саратов, 1986.-С. 55-61.

47. Коровкина Г.И., Синичкина Н.А., Мороз В.П. с соавт. Разработка технологии производства фага диагностического vet- холерных вибрионов эльтор жидкого //РосНИПЧИ «Микроб»-Саратов , 1998.-С. 7.

48. Коробкова Е.И. Эпидемиология и микробиология холеры. М.-1959.

49. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Качкина Г.В., Саямов С.Р. Бактериофаги Vibrio cholerae 0139 // ЖМЭИ. 2000. - N 6. - С. 28-30.

50. Кудрякова Т.А., Македонова Л.Д., Качкина Г.В. с соавт. Лизогенные системы и свойства умеренных холерных бактериофагов // Карантинные и зоонозные инф. в Казахстане Алматы, 2001. - N 3. - С. 142-145. - Библиогр.: 8 назв.

51. Кудрякова Т.А., Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н. с соавт. Бактериофаги патогенных вибрионов и их применение // Холера: Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по пробл. "Холера" (4-5 июня 2003 г. Ростов-н/Д). Ростов-н/Д, 2003. - С. 208-210.

52. Куличенко A.A. Конструирование молекулярно-генетических систем для детекции возбудителей особо опасных инфекций: чумы, бруцеллеза исибирской язвы // Автореф. дис. на соискание ученой степени д-ра мед.наук. Саратов, 1995. - 38 с.

53. Куличенко A.A. Детекция возбудителей инфекционных болезней в биологическом материале и объектах внешней среды с помощью полимеразной цепной реакции // Диагност, возбудителей опасных инф. забол. Саратов, 1998. -Т.2.-С. 162-169.

54. Куличенко А.Н., Морозов В.В., Саяпина JI.B. с соавт. Молекулярная диагностика холеры // Холера: Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по пробл. "Холера" (4-5 июня 2003 г. Ростов-н/Д). Ростов-н/Д, 2003. - С. 191-192.

55. Куличенко А.Н., Портенко С.А., Алексеев Д.И. с соавт. Разработка мультилокусной тест-системы для выявления возбудителя холеры методом ПЦР в реальном времени (Real time-PCR) // Медицинская микробиология 21 век. - 2004. - С. 126-127.

56. Кутырев В.В., Куличенко А.Н. Многоуровневая система генной диагностики особо опасных инфекций // Сб. труд. 6-ой всероссийской науч.-практ. конфер. с международ, участием.- «Молекулярная диагностика-2007».-Москва, 2007.-Т. 1. С. 380-381.

57. Ломов Ю.М., Шестиалтынова И.С., Фецайлова О.П. с соавт. Характеристика штаммов холерного вибриона, выделенных на Украине в 1991 году // Холера: Матер. Рос. науч. конф. (18-19 ноября 1992 г. Ростов-н/Д). -Ростов-н/Д, 1992. С. 71-73.

58. Ломов Ю.М. Пандемии холеры и эволюция возбудителя // Холера: Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по пробл. "Холера" (4-5 июня 2003 г. Ростов-н/Д). -Ростов-н/Д, 2003. С. 13-23.

59. Ломов Ю.М., Москвитина Э.А., Горобец А.В. с соавт. Эпидемиологический надзор за холерой в России: состояние и перспективы // Противочум. учрежд. России и их роль в обеспечении эпид. благополучия населения страны.- Москва, 2004. с. 101-102.

60. Ломов Ю.М. Эволюция возбудителя холеры и прогноз по этой инфекции на ближайшее будущее // Эпидемиол. и инфекц. бол. 2004. - N 1. - С. 7-12.

61. Мацуга В.Г., Оптякова А.Ф. Ускоренный метод фагодиагностики холерных вибрионов // Инф. бюл. Изобретения, рацпредложения и метод, рекомендации. -Саратов, 1983.-№ 18.

62. Меджидов М.М., Абдуллаева З.Г. Микротестсистема для биохимической идентификации холерных вибрионов // Разраб. и произв. диагн. сухих питат. сред и микротестсистем: Матер. 3-й Междунар. науч.-практ. конф., 20-22 июня 2001 г. Махачкала, 2001. - С. 73.

63. Медуницын Н В. Экспертный комитет по биологической стандартизации ВОЗ// Биопрепараты. Профилактика. Диагностика. Лечение.- № 4(12).- декабрь, 2003.- С. 25-26.

64. Медуницын Н.В. Принципы государственного контроля иммунобиологических препаратов необходимо сохранить// Эпидемиология и вакцинопрофилактика.- № 6 (31).- 2006.- С. 5-7.

65. Мишанькин Б.Н., Шиманюк Н.Я., Рябухина О.Ю. с соавт. Молекулярное клонирование генов нейраминидазы V. cholerae El Тог: перспективы использования // Вест. Всесоюз. микробиол. об-ва. Ростов, отд. Ростов - н/Д, 1989.-Вып. 1.-С. 149-156.

66. Михайлова А.Е., Хайтович А.Б. Vibrio cholerae OI биовара eltor в окружающей среде // ЖМЭИ. 2002. - N 2. - С. 14-17. - Библиогр.: 18 назв.

67. Монахова Е.В., Михась Н.К., Смоликова Л.М., Мишанысин Б.Н. Изучение генетических детерминант токсинов кассеты вирулентности инейроминидазы холерных вибрионов с помощью молекулярного зондирования //ЖМЭИ. 2001. - N 2. - С. 25-29.

68. Мороз В.Г., Остроумова Н.М., Шмеркевич Д.Л. с соавт. К усовершенствованию фагодиагностики холерных вибрионов // Саратов, 1983 -8 с. Реф.: Мед. реф. журн. Разд.З, 1983.- № 12.- С. 721.

69. Морозов В.В. Организация и проведение противохолерных мероприятий во время вспышки холеры в Казани в 2001 году // Холера: Матер. VIII Рос. науч.-практ. конф. по пробл. "Холера" (4-5 июня 2003 г. Ростов-н/Д). Ростов-н/Д, 2003. - С. 79-85.

70. Мурначев Г.П. Особенности циркуляции вибрионов эльтор в поверхностных водоемах Приморья// Холера и патогенные для человека вибрионы. Сб. матер, пробл. комиссии (50.04) НС по сан.-эпид. охране территории РФ. Ростов-на-Дону, 2007. - № 20. - С. 34-36.

71. Методические указания МУ 4.2.1097-02. 2002 «Лабораторная диагностика холеры».- Москва, 2002.

72. Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А., Кологоров А.И. с соавт. Холера в Казани. Организация и проведение противохолерных мероприятий // ЖМЭИ. -2002.-N 2.-С. 17-22.

73. Онищенко Г.Г. Контроль за инфекционными заболеваниями стратегическая задача здравоохранения России в XXI веке // Эпидемиол. и инфекц. бол. 2002. - N 6. - С. 4-16.

74. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвитина Э.А. с соавт. Холера в начале XXI века. Прогноз // ЖМЭИ. 2005. - N 3. - С. 44-48.

75. Осин A.B., Нефедов К.С., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ геномов холерных вибрионов эльтор, выделенных до начала и в разные периоды седьмой пандемии холеры // Генетика, 2005. Т. 41, N 1. - С. 53-62.

76. Остроумова Н.М. Перспективы фаготипирования энтеропатогенных вибрионов // Саратов , 1983.- С.12,- Мед. ред. журн. разд.З, 1983,- № 9.-2710.

77. МО.Пилипенко A.B. Биологическая характеристика бактериофагов ТЭПВ и практическое их применение для фаготипирования энтеропатогенных вибрионов не О 1 серовара // Автореф. дис. на соискание ученой степени канд. мед. наук Саратов, 1990-21с.

78. Подосинникова JI.C. Холерные вибрионы, выделенные на территории

79. СССР в период седьмой пандемии // Автореф. дис. на соискание ученойстепени доктора мед. наук., Саратов, 1993. 44 с.

80. Савельев В.Н. Холера Эльтор (эпидемиологические и микробиологическиеаспекты)// Автореф. дис. на соискание ученой степени доктора мед. наук.,1. Саратов, 1998.-48 с.

81. Саяпина Л.В., Анисимова Т.И., Грачева И.В. с соавт. Оценка системы мультимикротестов для биохимической идентификации Vibrionaceae MMT-V по результатам Государственных испытаний // Пробл. особо опасных инф.-Саратов, 1998.- С. 105-110.

82. Саяпина Л.В., Анисимова Т.И., Адамова Г.В. с соавт. Определение эффективности новых диагностических тест-систем для индикации возбудителей особо опасных инфекций// Генная диагн. особо опасных инф.-Саратов, 2000.-С. 11-13.

83. Смирнова Н.И. Генетический контроль патогенности Vibrio cholerae: умеренный нитевидный фаг СТХ, кодирующий холерный токсин, и "остров патогенности" // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 1999. - N 4. - С. 3-11.

84. Смирнова Н.И., Кириллина O.A., Кутырев В.В. Генетические маркеры эпидемических штаммов Vibrio cholerae // ЖМЭИ. 2000. - N 5. - С. 87-91.

85. Смирнова Н.И. Возбудитель холеры новой 0139-серогруппы: молекулярно-генетические особенности и происхождение // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 2002. - N 3. - С. 23-33.

86. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры // Молекуляр. Генетикаб микробиология и вирусол.-2004,- Вып. 4.- С. 313.

87. Сомова А.Г. Холерные вибрионы и их бактериофаги // Дисс. докт. мед.наук. Ростов-на-Дону, 1968. - 595 с.

88. Сомова А.Г. Современные представления о таксономии рода Vibrio II Микробиол., лабораторная диагност, и специфическая профилакт. карантинных инф. Саратов, 1989. - С. 148-152.

89. Суриков H.H., Пономарев Н.Г., Огарев H.H. Исследование ферментативной активности штаммов возбудителей чумы с помощью бумажных индикаторных систем // Иммунохимия и лаб. диагност, особо опасных инф. Саратов, 1985. -С. 53-58.

90. Телесманич Н.Р. Механизмы гемолитической активности холерных вибрионов: Автореф. дис. .докт. биол. наук. Ростов-на-Дону, 2006. - 38 с.

91. Четина Е.В., Гинцбург А.Л., Грижебовский Г.М. Исследование эпидемической значимости некультивируемых форм холерных вибрионов методом полимеразной цепной реакции // ЖМЭИ. 1992. - N 3. - С. 21-25.

92. Четина Е.В., Грижебовский Г.М., Брюханов А.Ф. с соавт. О возможном механизме эндемичности современной холеры (роль некультивируемых форм Vibrio cholerae Ol) II Мол. ген., микробиол. и вирусол. 1993. - N 6. - С. 18-22.

93. Шарова И.Н. Совершенствование тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР// Автореф. дис. на соискание ученой степени канд. мед. наук., Саратов, 2001. 19 с.

94. Щелканова Е.Ю., Ерошенко Г.А., Смирнова Н.И. Умеренные фаги Vibrio cholerae 0139 II Холера и патогенные для человека вибрионы. Информ. пробл. комиссии (46.04) МНС по сан.-эпид. охране территории РФ. Ростов-на-Дону,2001.-N14.-С. 38-39.

95. Якобсон Л.М. Современное состояние проблемы бактериофагии // В кн.: Бактериофагия.- Тбилиси, 1957.- С. 19-33.

96. Ascermann H.-W., Furniss A. G., Kasatiya S. S. et. al. Morphology of Vibrio cholerae typing phages // Ann. Virol.-1983.-V 134E.-№ 3.-P. 387-404.

97. Alam M., Sultana M., Nair G.B. et. al. Toxigenic Vibrio cholerae in the aquatic environment of Mathbaria, Bangladesh // Appl. Environ. Microbiol. 2006. - V. 72, N 4. - P. 2849-2855.

98. Albert M. Epidemiology & molecular biology of Vibrio cholerae 0139 Bengal // Indian J. Med. Res. 1996 Jul;104:14-27

99. Ansari M.Q., Pal S.C. Phage typing of vibrio cholerae Ol biotype El Tor strains// Jndian. J. Med. Res.-1990.-V.91.- July.-P. 263-265.

100. Attridge S.R., Voss E., Manning P.A. Pathogenic and vaccine significance of toxin-coregulated pili of Vibrio cholerae El Tor // J. Biotechnol. 1999. - V. 73, N 2-3.-P. 109-117.

101. Attridge S.R., Fazeli A., Manning P.A., Stroeher U.H. Isolation and characterization of bacteriophage-resistant mutants of Vibrio cholerae 0139 // Microb. Pathog. 2001. - V. 30, N 4. - P. 237-246.

102. Baffone W., Pianetti A., Bruscolini F., Barbieri E., Citterio B. Occurrence and expression of virulence-related properties of Vibrio species isolated from widelyconsumed seafood products // Int. J. Food. Microbiol. 2000. - V. 54, N 1-2. - P. 918.

103. Basu.S., Mukerjee S. Специфический фаг для патогенных Vibrio cholerae биотип Эль-Тор // Бюл.ВОЗ, 1970. -т. 43,-№ З.-С. 524-527.

104. Baudry В., Fasano A., Ketly J., Kaper J.B. Cloning of a gene (zot) encoding a new toxin produced by Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 428434.

105. Borroto R.J. Ecology of Vibrio cholerae serogroup 01 in aquatic environments. // Rev. Panam. Salud. Publica . 1997 Jan;l(l):3-8.

106. Boyd E.F., Davis B.M., Hochhut B. Bacteriophage-bacteriophage interactions in the evolution of pathogenic bacteria // Trends. Microbiol. 2001. - V. 9, N 3. - P. 137-144.

107. Bradley M., Shakespeare R., Ruwende A. et. al., A Epidemiological features of epidemic cholera (El Tor) in Zimbabwe. Trans R Soc Trop Med Hyg 1996 Jul;90(4):378-382

108. Brussow H., Canchaya C., Hardt W.D. Phages and the evolution of bacterial pathogens: from genomic rearrangements to lysogenic conversion // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. - V. 68, N 3. - P. 560-602.

109. Castro-Rosas J, Escartin E.F. Adhesion and colonization of Vibrio cholerae Ol on shrimp and crab carapaces // J. Food Prot. 2002. - V. 65, N 3. - P. 492-498.

110. Chakraborty S., Mukhopadhyay A.K., Bhadra R.K. et. al. Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66, N 9. - P. 4022-4028

111. Chakrabarti A.K., Ghosh A.N., Nair G.B. et. al. Development and evaluation of a phage typing scheme for Vibrio cholerae 0139 // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38, N 1. - P. 44-49.

112. Chatterjce S.N., Maiti M. Vibriophages and vibriocins: physical, chemical and bioligical properties // Jn: Adv. Virus. Res.- Orlando e. a., 1984.-V.29.-p.263-312.

113. Chen C.H., Shimada T., Elhadi N. et. al. Phenotypic and genotypic characteristics and epidemiological significance of ctx+ strains of Vibrio cholerae isolated from seafood in Malaysia // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V. 70, N 4. -P. 1964-1972.

114. Codeco C.T. Endemic and epidemic dynamics of cholera: the role of the aquatic reservoir // BMC Infect. Dis. 2001. - V. 1, N 1. - P. 1

115. Coffey J.A., Harris R.L., Rutledge M.L. et al. Vibrio damsella: another potentially virulent marine Vibrio II J. Inf. Dis. 1986. - V.153. - 800-802.

116. Colwell R.R., Briton P.R., Grimes D.J. et al. Viable but nonculturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment: implication for the release of genetically engineered microorganisms // BioTechnology. 1985. - Vol. 3. - P. 817820.

117. Davis B.M., Moyer K.E., Boyd E.F. et. al. CTX prophages in classical biotype Vibrio cholerae: functional phage genes but dysfunctional phage genomes // J. Bacteriol. 2000. - V. 182, N 24. - P. 6992-6998.

118. Davis B.M., Waldor M.K. Filamentous phages linked to virulence of Vibrio cholerae II Curr. Opin. Microbiol. 2003. - V. 6, N 1. - P. 35-42.

119. DePaola A., Hwang G-C. Effect of dilution, incubation time, and temperature of enrichment on cultural and PCR detection of Vibrio cholerae obtained from the oyster Crassostrea virginica II Mol. and Cell. Probes. 1995. - Vol. 9. - P. 75-81.

120. Di Pierro M., Lu R., Uzzau S. et. al. Zonula occludens toxin structure-function analysis: identification of the fragment biologically active on tight junctions and of the zonulin receptor binding domain // J. Biol. Chem. 2001. - N 14.

121. Di Pinto A., Ciccarese G., Tantillo G. et. al. A collagenase-targeted multiplex PCR assay for identification of Vibrio alginolyticus, Vibrio cholerae, and Vibrio parahaemolyticus // J. Food. Prot. 2005. - V. 68, N 1. - P. 150-153.

122. Dutta N.K., Habby M.K. Experimental cholerae in infant rabbits: a method for chemotherapentic investigation // Br. J. Pharmocol. Chemother.- 1955.-V. 10. № 2. -p. 153-159.

123. Dziejman M., Balon E., Boyd D. et. al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and pandemic disease I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. - V. 99, N 3. - P. 1556-1561.

124. Faruque S.M., Albert M.J., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics and ecology of toxigenic Vibrio cholerae II Microbiol, and Molecular Biology Rev. 1998 a. -Vol. 62, N4.-P. 1301-1314.

125. Faruque S.M., Asadulghani , Rahman M.M. et. al Sunlinght-induced propagation of the lysogenic phage encoding cholera toxin // Infect. Immun. 2000. -V. 68, N8. - P. 4795-4801.

126. Faruque S.M., Kamruzzaman M., Meraj I.M. et. al Pathogenic potential of environmental Vibrio cholerae strains carrying genetic variants of the toxin-coregulated pilus pathogenicity island // Infect. Immun. 2003. - V. 71, N 2. - P. 1020-1025.

127. Faruque S.M., Sack D.A., Sack R.B. et. al. Emergence and evolution of Vibrio cholerae 0139 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100, N 3. - P. 1304-1309.

128. Faruque S.M., Chowdhury N., Kamruzzaman M. et. al. Genetic diversity and virulence potential of environmental Vibrio cholerae population in a cholera-endemic area// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V. 101, N 7. - P. 2123-2128.

129. Fields P.A., Popovic T., Wachsmuth K., Olsvilc Q. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae Ol strains from the Latin American cholera epidemic // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 2118-2121.

130. Ghosh A.N., Ansari M.Q., Datta G.C. Isolation and morphological characterization of EL Tor cholera phages // J.Gen.Virol.-1989.-V. 70,- № 8.-P. 2241-2243.

131. Gubala A.J. Multiplex real-time PCR detection of Vibrio cholerae // J. Microbiol. Methods. 2006. - V. 65, N 2. - P. 278-293.

132. Hartley D.M., Morris J.G. Jr, Smith D.L. Hyperinfectivity: a critical element in the ability of V. cholerae to cause epidemics? // PLoS Med. 2006. - V. 3, N 1. - P. 7.

133. Heiberg B. Des reactions de fermentation chez les Vibrions, II C.R.Soc. Biol. — 1934. — V.31. — № 12.-P. 898.

134. Honda Sh.-I., Shinoirisa T., Adochi A. et al. Clinical isolates of Vibrio cholerae Ol not-producing cholera toxin // Lancet. 1988. - Vol. 2, N 8626/8627. - P. 1486.

135. Hood M.A., Hadwood Sears J., Winter P.A. Prophage in environmental and clinical strains of Vibrio cholerae serotype non Ol// Abstr.Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol. 1987.- 87th Annu. Meet., Atlanta,Ya,l-6 March, 1987,-Washington, D.C. - 1987.-P. 256.

136. Hoshino K., Yamasaki S., Mukhopadhyay A.K. et al. Development and evolution of a multiplex PCR assay for rapid detection of toxigenic Vibrio cholerae Ol and 0139 //FEMS Immun. and Med. Microbiol. 1998. - Vol. 20. - P. 201-207.

137. Ihema M., Honma Y. A nobel filamentous phage, fs-2, of vibrio cholerae 0139.-Microbiology.-1998.-V. 144, № 7-P. 1901-1906.

138. Ingole KV, Jalgaonkar SV, Fule C. et. al. Changing pattern of Vibrio cholerae serotype EL TOR and 0139 in Yavatmal (Maharashtra, India) during 1992 to 1994. Indian J Pathol Microbiol 1997 Jul.-40(3).-P. 369-371

139. Islam M.S., Talukder K.A., Khan N.H. et. al. Variation of toxigenic Vibrio cholerae Ol in the aquatic environment of Bangladesh and its correlation with the clinical strains II Microbiol. Immunol. 2004. - V. 48, N 10. - P. 773-777.

140. Jiang S., Chu W., Fu W. Prevalence of cholera toxin genes (ctxA and zot) among non-01/0139 Vibrio cholerae strains from Newport Bay, California // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69, N 12. - P. 7541-7544.

141. Kapley A., Purohit H.J. Detection of etiological agent for cholera by PCR protocol // Med. Sei. Monit. 2001. - V. 7, N 2. - P. 242-245.

142. Karaolis D.K., Kaper J.B. Vibrio cholerae TCP: a trifunctional virulence factor?: Response // Trends. Microbiol. 1999. - V. 7, N 10. - P. 393.

143. Karaolis D.K., Somara S., Maneval D.R. Jr. et. al. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type-IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria // Nature. 1999. - V. 399, N 6734. - P. 375-379.

144. Karaolis D.K., Lan R., Kaper J.B. et. al. Comparison of Vibrio cholerae pathogenicity islands in sixth and seventh pandemic strains // Infect. Immun. 2001. -V. 69, N3.-P. 1947-1952.

145. Kelley J.T., Parker C.D., Blake P.A. Prage typing of recent vibrio cholerae Ol isolates from trom the United states // Jn . Abstrs 79th Annu. Meet. Amer. Soc. -Microbiol.- Los Angeles.- Calif., 1979.- Washington, D. C., 1979.- P. 312.

146. Khazaei H.A., Rezaei N., Bagheri G.R., Moin A.A. A Six-Year Study on Vibrio cholerae in Southeastern Iran // Jpn. J. Infect. Dis. 2005. - V. 58, N 1. - P. 8-10.

147. Kimsey N.N., Balakrish G., Ghosh A. et. al. Diverse ctx and evolution of new patogenetic Vibrio cholerae // Lancet. -1998.- V. 352.- N 9126.- P. 457-458.

148. Koch W.H., Payne W.L., Wentz B.A., Cebula T.A. Rapid polymerase chain reaction method for detection of Vibrio cholerae in foods // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - Vol. 59. - P. 556-560.

149. Lee C.A. Vibrio cholerae TCP: a trifunctional virulence factor? // Trends. Microbiol. 1999. - V. 7, N 10. - P. 391-392.

150. Le Roux W., Masoabi D., de Wet C. et. al. Evaluation of a rapid polymerase chain reaction based identification technique for Vibrio cholerae isolates // Water Sci Technol. 2004. - V. 50, N 1. - P. 229-232.

151. Lee J.V., Furniss A.L. Фаготипирование Vibrio Cholerae биотипа Эль-Тор// Folio microbiol. -1976.- 21. №4.-321.- Реф. РЖ «Биология».-1977.-4Л873.

152. Magalhaes M. Gastroenterite humana associada ao Vibrio fluvialis no Recife // Arg.gastroenterol. 1990. - V.27. - №.3. - P. 141-143.

153. Magalhaes M., da Silva G.P., Magalhaes V. et al. Vibrio fluvialis and Vibrio furnissii associated with infantile diarrhea // Rev. Microbiol. — 1990a. V.21. - № 4. -P. 295-298.

154. Magalhaes V., Lima R.A., Tateno S. et al. Gastroenteritis human associated a Vibrio parachemoliiticus no Recife, Brasil // Rev. Inst. Med. trop. 1991. - V.33. -№ l.-P. 64-68.

155. Makino S., Iinuma-Ocada Y., Maruyama T. et al. Directed detection of B. anthracis DNK in analisis by polimerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. -1993. V.31. —№ 3. -P. 547.

156. Manning P.A., Brown M.H. Cloning of the structural gene (hly) for the hemolysin of Vibrio cholerae El Tor strains 017 // Gene. 1984. - Vol. 31. - P. 225231.

157. Matsushita S, Noguchi Y, Yanagawa Y. et. al. Sporadic diarrhea caused by Vibrio cholerae non-Ol and characteristics of the isolates. Kansenshogalcu Zasshi 1997 Dec;71 (12): 1204-1209.

158. Mecalanos J J., Swartz D.J., Pearson G.D. et al. Cholera toxin genes: nucleotidesquences deletion analysis and vaccine development // Nature. 1983. -Vol. 306, N 5943. - P. 551-557.

159. Mitra S., Kar S., Ghosh R. et. al. Presene of lysogenec phage in the outbreak strians of vibrio cholerae 0139// J. Med. Microbiol-1995.-V.42- № 6-p.399-403.

160. Miyagi K., Omura K., Noda K. et al. The first cholera case diagnosed early in the clinical laboratory by DNA probe method // J. Jap. Assoc. Infect. Dis. 1992. -Vol. 66, N 12. - P. 1645-1650.

161. Miyagi K., Sano K., Morita C. et. al. An improved method for detecting faecal Vibrio cholerae by PCR of the toxin A gene // J. Med. Microbiol. 1999. - V. 48, N 10.-P. 883-889.

162. Miyagi K., Nakano T., Yagi T., Hanafusa M., Imura S., Honda T., Nakano Y., Sano K. Survey of Vibrio cholerae Ol and its survival over the winter in marine water of Port of Osaka// Epidemiol. Infect. 2003. -V. 131, N 1. - P. 613-619.

163. Mourino-Perez R.R., Worden A.Z., Azam F. Growth of Vibrio cholerae Ol in red tide waters off California // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V. 69, N 11. - P. 6923-6931.

164. Mukerjee S. Characterisation of the cholera tyhing phages// Morphology of plagues.-Ann.Biochem.fnd exp Med., 1961.- V. 21. № 9. -P. 257-264.

165. Mukerjee S. Bacteriophage typing of cholerae // Bull. Wld Hlth Org., 1963.-V. 28,-№3.-P. 337-345.

166. Mulcergee S. Cholera phages // In: Cholera.A review for WHO Seminars. -Geneva, WHO, 1970.- P. 20-27.

167. Mukerjee S., Takeya K. Vibriophages and vibriocins // Jn. Cholera. -Philadelphia. London - Toronto, 1974.- ch.4.-P. 61-83.

168. Ndour С.Т., Manga N.M., Ка R. et. al. Cholera epidemic of 2004 in Dakar, Senegal: epidemiologic, clinical and therapeutic aspects. // Med. Trop. (Mars). -2006.-V. 66, N1.- P. 33-38.

169. Newman F.S. and Eisenstark A . Phage host relations ships in Vibrio cholerae 11 Jn. Infect. Dis.- 1964.-V.114.-№ 3.-P. 217-225.

170. Nicolle P., Yallut J., Schraen Marie-France. Vibrions choleriques et bacteriophages // Med. гор. France.- 1971.-31.- № 1.- P.59-65.

171. Pascual M, Bouma M.J, Dobson A.P. Cholera and climate: revisiting the quantitative evidence // Microbes. Infect. 2002. - V. 4, N 2. - P. 237-245.

172. Pichel M, Rivas M, Chinen I. et. al. Genetic diversity of Vibrio cholerae Ol in Argentina and emergence of a new variant // J. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41, N 1. -P. 124-134.

173. Plesnik V, Prochazkova E. Vibrio cholerae 01 in a fish aquarium. // Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 2006. - V. 55, N 1. - P. 30-31.

174. Pourshafie M.R, Grimont F, Saifi M, Grimont P.A. Molecular epidemiological study of Vibrio cholerae isolates from infected patients in Teheran, Iran // J. Med. Microbiol. 2000. - V. 49, N 12. - P. 1085-1090.

175. Popovic T., Fields P.A., Olsvilc Q. Detection of cholera toxin genes // In: K. Wachsmuth, P.A. Blake and Q. Olsvik (ed.) Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. ASM Press, Washington, D.C. - 1994. - P. 41-52.

176. Ramamurthy T., Yamasaki S., Takeda Y. et. al. Vibrio cholerae 0139 Bengal: odyssey of a fortuitous variant // Microbes. Infect. 2003. - V. 5, N 4. - P. 329-344.

177. Rivera I.N., Lipp E.K., Gil A. et. al Method of DNA extraction and application of multiplex polymerase chain reaction to detect toxigenic Vibrio cholerae Ol and 0139 from aquatic ecosystems // Environ. Microbiol. 2003. - V. 5, N 7. - P. 599606.

178. Roszah D.B., Colwell R.R. Survival strategies of bacteria in the natural environment // Microbiol. Rev. 1987. - Vol. 51. P. 365-379.

179. Salles C.A., Momen H., Vicente A.C.P., Coelho A. Vibrio cholerae in South America: polymerase chain reaction and zymovar analysis // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1993. - Vol. 87. - P. 272.

180. Sarkar B.L., Roy M.K., Chakrabarti A.K. et. al. Distribution of phage type of Vibrio cholerae Ol biotype El Tor in Indian scenario (1991-98) // Indian. J. Med. Res. 1999. - V. 109. - P. 204-207.

181. Sepulveda J., Valdespino J.L., Garcia-Garcia L. Cholera in Mexico: the paradoxical benefits of the last pandemic // Int. J. Infect. Dis. 2006. - V. 10, N 1. -P. 4-13.

182. Shigeno H. Fundamental studies on the bacteriophages for typing of Vibrio cholerae // Trop. Med.- Nagasaki, 1982.- V. 24.- № 2.- P. 53-63.

183. Shirai U.H., Nishibuchi M., Ramamurthy S.K. et al Polymerase chain reaction for detection of the cholerae toxin operon of Vibrio cholerae II J. Clin. Microbiol. -1991,-Vol. 29.-P. 2517-2521.

184. Siddique A.K., Akram K., Zaman K. et. al. Vibrio cholerae 0139: how great is the threat of a pandemic? // Trop. Med. Int. Health. 1996 Jun;l(3):393-398

185. Singh D.V., Matte M.H., Matte G.R. et. al. Molecular Analysis of Vibrio cholerae 01, 0139, non-Ol, and non-0139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates // Appl. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67, N 2. -P. 910-921.

186. Sur D., Sarkar B.L., Manna B. et. al. Epidemiological, microbiological & electron microscopic study of a cholera outbreak in a Kolkata slum community // Indian. J. Med. Res. 2006. - V. 123, N 1.-P. 31-36.

187. Tamayo M. Koblavi S., Crimont F. et al. Molecular epidemiology of Vibrio cholerae 01 isolates from Colombia // J. Med. Microbiol. 1997. - Vol. 46. - P. 611616.

188. Takeya K., Zinnaka Y., Shimodori S. et. al. Lisogeny in El Tor vibrio // Proc. of cholera Res. Symp.- Jan. 24-29, 1965. Honolulu.- Hawaii. - Washington, 1965.-P.24-29.

189. Takeya K.and Shimodori S. Praphage Typing of El Tor Vibrios // d.of.Bact.-1963.- V.85- № 4. -P. 957-958.

190. Varela P., Rivac M., Binsztein N. et al. Identification of toxigenic Vibrio cholerae from the Argentine outbreak by PCR for ctxAl and ctx2-B // FEBS Lett. -1993.-Vol. 315.-P. 74-76.

191. Varela P., Pollevick G.D., Rivas M. et al. Direct detection of Vibrio cholerae in stool samples // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 1246-1248.

192. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin // Science. 1996. - Vol. 272. - P. 1910-1914.

193. Wang X.Y., Ansaruzzaman M., Vaz R. et. al. Field evaluation of a rapid immunochromatographic dipstick test for the diagnosis of cholera in a high-risk population // BMC Infect. Dis. 2006. - V. 6. - P. 17.

194. Wright A.C., Guo Y., Johnson J.A. et al. Development and testing of a nonradioactive DNA oligonucleotide probe that is specific for Vibrio cholerae cholera toxin // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. - P. 2302-2306.

195. Xu H.-Sh., Roberts H., Singleton F.L. et al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment // Microb. Ecol. 1982. - N 8. - P. 313-323.

196. Yamasaki S., Gard S., Nair G.B., Takeda Y. Distribution of Vibrio cholerae Ol antigen biosynthesis genes among 0139 and other non-Ol serogroups of Vibrio cholerae 11FEMS Microbiol. Lett. 1999. - Vol. 179. - P. 115-121.

197. Yoh M., Miyagi K., Matsumoto Y. et al. Development of an enzyme-labeled oligonucleotide probe for the cholera toxin gene // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31.-P. 1312-1314.

Информация о работе

Касина, Ирина Владимировна
кандидата биологических наук
Саратов, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Оценка и совершенствование контроля качества новых препаратов для выявления и идентификации возбудителя холеры - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы