Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Оценка генетического разнообразия исходного и селекционного материала ягодных культур с помощью молекулярных маркёров

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Оценка генетического разнообразия исходного и селекционного материала ягодных культур с помощью молекулярных маркёров"

005003130

На правах рукописи

ПИКУНОВА АННА ВИКТОРОВНА

ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ИСХОДНОГО И СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ЯГОДНЫХ КУЛЬТУР С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ

Специальности:

06.01.05 - селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 1 ДЕК 2011

Санкт-Петербург - 2011

005003130

Диссертационная работа выполнена на кафедре растениеводства факультета агробизнеса и экологии ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет».

Защита состоится «14» декабря 2011 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 006.041.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова по адресу: 190000, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44.

Факс: (812) 571-87-28; e-mail: v.gavrilova@vir.nw.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института

растениеводства им. Н.И. Вавилова

Автореферат размещен на сайте http://www.vir.nw.ru и направлен в Министерство образования и науки РФ для размещения в сети интернет «14» ноября 2011 г.

Автореферат разослан «_» ноября 2011 г.

Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные гербовой печатью, просим направлять ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук В.А. Гаврилова

Научные руководители:

доктор сельскохозяйственных наук Князев Сергей Дмитриевич

доктор биологических наук Павловская Нинель Ефимовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Юшев Анатолий Андреевич

доктор биологических наук Шнеер Виктория Семеновна

ФГОУ ВПО Брянская сельскохозяйственная академия

Ведущая организация:

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследований. Существенным недостатком ягодных культур, в том числе смородины черной и земляники садовой, является высокая восприимчивость к болезням и вредителям. Одним из основных, экологически безопасных, путей борьбы с болезнями и вредителями является селекция, направленная на создание невосприимчивых к ним сортов (Князев, 1995).

Важной задачей в селекции смородины черной (Ribes nigrum L.) является создание сортов устойчивых к почковому клещу (<Cecidophyopsis ribis) (Огольцова, 1992; Копань и др., 1998; Князев и др., 2004), а в селекции земляники садовой (Fragaria ananassa Duch:) -выведение сортов, устойчивых к фитофторозному увяданию (возбудитель Phytophthora fragariae Hick, subsp. fragarias) (Parikka, 2004; Ellis, 2008).

Успех селекционных исследований в данном направлении во многом зависит от изучения, подбора и систематизации исходного материала, мобилизации в селекционных программах диких сородичей, создания эффективных доноров (Вавилов, 1987; Жученко, 2001), а также применения современных методов исследований, позволяющих на ранних стадиях идентифицировать устойчивые генотипы (Чесноков, 2005; Francia et al., 2005).

Род смородина RibesL. включает более 150 видов, к нему принадлежат такие сельскохозяйственные культуры как красная и черная смородины, крыжовник. Однако филогения и таксономия рода окончательно не определены.

Одним из направлений, позволяющих существенно расширить возможности традиционной селекции растений, оценить полиморфизм селекционного материала, уточнить филогенетические связи является применение молекулярных маркеров (Гречко, 2002; Collard and Mackill, 2007). В селекционных исследованиях земляники и особенно смородины черной молекулярные маркеры используются ограниченно и, преимущественно, в зарубежных исследованиях (Brennan et al., 1997, 1998, 2002,2009; Haymes et al., 1997; Weg et al., 1997, 2006; Sargent et al., 2008).

В этой связи применение методов ДНК-генотипирования культурных растений и их дикорастущих сородичей, создание карт сцепления и физических карт генома с помощью ДНК-маркеров будет способствовать увеличению генетического разнообразия и вовлечению новых генов и аллелей в селекционный процесс (Хавкин, 2003).

Цель и задачи исследований. Цель исследований - изучить возможность использования молекулярных ДНК-маркеров и

полиморфизма спектров запасных белков семян для первичной оценки исходного и селекционного материала смородины черной и земляники садовой.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) изучить генетическое разнообразие рода Ribes с помощью RAPD анализа;

2) рассмотреть филогенетические связи между видами рода Ribesm. основании данных анализа RAPD маркеров;

3) изучить полиморфизм запасных белков семян черной смородины и оценить его возможности для генетического анализа селекционного материала;

4) оценить возможность использования SCARiviapKepa гена Се, амплифицируемого парой праймеров GMresa, для отбора устойчивых к почковому клещу генотипов;

5) составить молекулярно-генетическую карту сцепления ДНК-маркеров и гена Rpfl контролирующего устойчивость земляники к фитофторозному увяданию.

Научная новизна. Впервые в России RAPD анализ был использован для оценки генетического полиморфизма и рассмотрения филогенетических отношений коллекции рода Ribes (смородина) генбанка Всероссийского научно-исследовательского института селекции плодовых культур, включающего преимущественно сорта отечественной селекции. Впервые с помощью SDS-ПААГ электрофореза запасных белков семян оценён межсортовой и внутрисортовой полиморфизм у чёрной смородины. SCAR маркер гена Се устойчивости смородины черной к почковому клещу протестирован на отечественном материале. Картирован один из основных генов устойчивости земляники к фитофторозному увяданию {Rpfl), обнаружены и проверены на различных сортах и формах ДНК маркеры данного гена.

Практическая значимость исследований. Выявлена возможность использования SCAR маркера гена Се для отбора устойчивых к почковому клещу генотипов смородины черной на ранних стадиях селекционного процесса, что значительно ускорит выведение устойчивых сортов. Обнаруженные в настоящей работе ДНК-маркеры гена Rpfl, устойчивости земляники к фитофторозному увяданию, могут быть использованы при отборе генотипов, несущих ген. Данные о локализации гена Rpfl на генетической карте будут полезны для исследований по клонированию гена.

Установлено, что RAPD анализ выявляет высокий уровень полиморфизма между представителями рода Ribes и, таким образом,

предоставляет селекционеру дополнительную информацию о генетическом сходстве и различии селекционного материала, что позволит более обоснованно подбирать пары для скрещивания. Открываются перспективы для использования данного метода в оценке гибридов и различения генотипов смородин и крыжовников в связи с обнаружением целого ряда таксон и генотип специфичных фрагментов.

БОЗ-ПААГ электрофорез белков семян выявил межсортовой и внутрисортовой полиморфизм генотипов и может быть использован для оценки генетического разнообразия сортов и популяций смородины черной.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и доложены на Международной научно-практической конференции «РоосЬгшсб» (г.Сезена, Италия 28-29 мая, 2009); на региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященной 35-летию Орловского государственного аграрного университета «Инновационный потенциал молодых ученых - АПК Орловской области» (г. Орел, 16-19 марта 2010 года); на Международной научно-практической конференции, посвященной 155-летию со дня рождения И. В. Мичурина XXII «Мичуринские чтения» (г. Мичуринск, 26-28 октября, 2010). Первоначальные результаты исследований позволили принять участие в международном проекте 1АМОКЕТ-ГШ, реализованном в университете г. Вагенингена, Королевство Нидерландов (23.01.200923.01.2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах текста, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, рекомендаций, списка использованной литературы (241 наименование, в том числе 154 на иностранном языке), содержит 19 таблиц и 29 рисунков, 6 приложений.

Автор глубоко благодарен доктору биологических наук Павловской Нинель Ефимовне и доктору сельскохозяйственных наук Князеву Сергею Дмитриевичу за научные и методические консультации, просмотр и редакцию рукописи, ценные замечания и предложения. Автор благодарит Голяеву О.Д. (к.б.н., селекционер красной смородины, ВНИИСПК, Орел) и Курашева О.В. (к.б.н., селекционер крыжовника, ВНИИСПК, Орел) за предоставление растительного материала. Автор выражает благодарность сотрудникам Центра «Биоинженерия» РАН, Москва; лаборатории «Биохимии»,

ВНИИЗБК, Орел; отдела селекции черной смородины ВНИИСПК, Орел; научно-исследовательской группы Эрика Ван де Вега, университет Вагенингена, Королевство Нидерландов, за помощь в проведении анализов. Отдельная благодарность руководителям и ведущим научным сотрудникам вышеперечисленных учреждений: д.б.н. Кочевой Е.З., к.б.н. Корниенко H.H. и д.ф.н. Эрику Ван де Вегу за методические и научные консультации.

Основные положения, выносимые на защиту:

- генетический полиморфизм сортов черной смородины на основании анализа запасных белков семян,

- генетический полиморфизм и филогенетические отношения представителей рода Ribes L. на основании RAPD анализа,

- возможность использования молекулярных ДНК-маркеров при отборе устойчивых к почковому клещу генотипов,

- генетическая карта сцепления молекулярных маркеров и гена Rpfl устойчивости земляники к фитофторозному увяданию,

- ДНК-маркеры гена Rpfl.

Все анализы выполнялись соискателем лично и совместно с сотрудниками Центра «Биоинженерия» РАН, Москва; лаборатории «Биохимия», ВНИИЗБК, Орел; научно-исследовательской группы Эрика Ван де Вега, университет Вагенингена, Королевство Нидерландов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 2 ОБЪЕКТЫ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

RAPD анализ представителей рода Ribes был проведен в ходе научной стажировки в Центре «Биоинженерия» РАН, Москва, в группе молекулярных методов анализа генома, руководитель группы д.б.н. Кочиева Е.З.

Было проанализировано 47 сортообразцов из коллекции ВНИИСПК подродов Grossularia Rich, (крыжовник) и Ribesia Berl. (смородина) рода Ribes, последний из которых был представлен четырьмя секциями (Eucoreosma Jancz., Calobotrya Spach, Symphocalyx Berl., Ribesia Berl.), включающими дикорастущие формы и сорта, имеющие разное происхождение (СССР, Россия, Америка, Европа). Выделение растительной ДНК производили по методике, предложенной Д. Пучоа (D. Puchooa, 2004).

Для PCR анализа использовали праймеры фирмы "Operon Technologies" (США). Реакцию амплификации проводили в термоциклере GeneAmp PCR System 2700 («Applied Biosystems», США). Продукты реакции амплификации разделяли электрофорезом в

1.7 % агарозном геле в IxTBE буфере, с последующим окрашиванием бромистым этидием.

В статистический анализ включали только четкие, воспроизводимые фрагменты размером от 300 до 2000 п.н. Величины геномного полиморфизма рассчитывались как процент полиморфных фрагментов от общего числа амплифицируемых фрагментов.

Подсчет генетических различий (GD) осуществляли в программе Statistica 6.0, построение дендрограммы в программе TREECON (Van de Peer and de Wächter, 1994).

SDS-ПААГ электрофорез белков семян смородины черной проведен на базе ВНИИ ЗБК, Орел, в лаборатории «Биохимия», возглавляемой д.б.н. Павловской Н.Е.

Для анализа отобрали 7 сортообразцов черной смородины из коллекции ВНИИСПК. Проводили посемянной анализ (по 50 семян, полученных от самоопыления). Использовали водно-солевые экстракты семян. SDS-ПААГ электрофорез проводили в 12,5 % ПААГ (Конарев; Гаврилюк и др., 2000) в камере для вертикального электрофореза. Результаты электрофореза фиксировали путем консервирования пластин или сканирования с последующей записью белковых формул. Позиции компонентов были установлены с помощью скользящей шкалы для идентификации полипептидов семян бобовых (Конарев; Гаврилюк и др., 2000), в качестве эталонного спектра использовали спектр сои. Для проверки различий между сортообразцами на существенность был проведен анализ частот типов белкового спектра при помощи критерия у2 квадрат - определение достоверности различия двух распределений с одинаковой системой классов, с одинаковыми границами (Плохинский, 1980)

Маркирование гена Се. Протестировано 37 сортообразцов из коллекции ВНИИСПК, включая сорта черной смородины, смородину кроваво-красную, крыжовник и смородинно-крыжовниковые гибриды. ПЦР анализ проводили по Бреннэну с соав. (Brennan et al., 2009) с модификациями.

Картирование и маркирование zenaRpfl было проведено в ходе научной стажировки в WUR, Королевство Нидерландов совместно с научно-исследовательской группой Эрика ван де Вега.

Для картирования была использована гибридная популяция (64 сеянца), полученная от скрещивания двух сортов земляники садовой Ялова-4 и Зенга Зенгана. Наиболее перспективные маркеры были протестированы на 120 сортах и формах земляники садовой различного происхождения. ДНК выделяли по методике Томас и Тэнксли (Thomas and Tanksley,1990) с модификациями.

Двадцать четыре микросателлитных локуса и маркер SCAR-Rla (Haymes et al., 2000) были протестированы на гибридной популяции. Визуализация продуктов амплификации микросателлитов проводилась с помощью ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer. Картирование осуществляли в программе JoinMap 3.0. Генетическая карта создавалась для каждого родителя отдельно.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3. RAPD анализ генетического разнообразия и филогенетических связей у представителей рода Ribes

Исследование генетического полиморфизма рода Ribes По результатам предварительного тестирования 18 олигонуклеотидных RAPD праймеров было отобрано 9 из них для RAPD анализа всех 47 образцов рода Ribes (рис.]). На девяти полученных электрофореграммах всего выявлено 274 фрагмента размером от 330 до 2000 п.н., из которых 270 были полиморфными -выявляли различия между образцами, то есть отсутствовали хотя бы у одного из анализируемых образцов. Число фрагментов, амплифицируемых одним праймером, варьировало от 22 (OPD6) до 41 (OPN14) и в среднем на праймер составило 30.

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов ПЦР с праймером ОР№9 (вверху электрофореграммы номера сортообразцов с 1 по 48; мм -маркер молекулярного веса; справа - размеры фрагментов, п.н.; 1-ый образец - чубушник — внешний образец для сравнения, кр. -крыжовник, кр.х см.ч. - смородинно-крыжовниковые гибриды, см.ч. -сортообразцы черной смородины, сПкхИис! - гибрид смородины дикуши и смородины гудзонской, у. - потомок смородины уссурийской, м. -потомок смородины моховки, см.к. - сортообразцы красной смородины, см.з. - смородина золотистая).

Данные RAPD-анализа были использованы для оценки внутривидовой, межвидовой и межподродовой вариабельности и сходства геномов представителей различных таксонов рода Ribes. В нутр и в идо во й полиморфизм (63,3%) оказался ниже внутрисекционного (81,4 и 87,4%). Однако межсекционный полиморфизм и полиморфизм между подродами находятся приблизительно на одном уровне (93,2%;95%;97,1%). Данный факт позволяет предположить, что подроды крыжовника, черной смородины и красной смородины являются таксонами одного уровня, и подтверждает достоверность классификаций, выделяющих данные таксоны в отдельные подроды. Например, классификация Элизабет Кип (Keep, 1962), в которой в пределах рода смородина были выделены 9 подродов, включая подроды Grossularia, Symphocalyx, Ribesia, Calobotrya, за исключением объединения секции Eucoreosma и секции Calobotrya в подрод Calobotrya.

При анализе электрофореграмм нами были идентифицированы фрагменты специфичные как для отдельных образцов, так и для представителей определенных таксонов. Данный факт свидетельствует в пользу того, что RAPD маркеры могут быть использованы при анализе гибридов и различении генотипов представителей смородин и крыжовников.Всего было отмечено двадцать девять фрагментов, отличающих отдельные сортообразцы. Выявлено от одного до 6 генотип специфичных фрагментов. Три специфичных фрагмента (ОРЕ2-920, OPN14-46Û, OPD3-400) характерны для всех исследованных представителей рода, и, возможно, являются родоспецифичными. Специфичные фрагменты ОРЕ1-490, ОРЕЗ-440 характерны для всех представителей секции Ribesia (подвид красных смородин), а специфичные фрагменты OPE2-8ÛO, OPD3 -950 - для подрода Grossularia (крыжовники).

Пять специфичных фрагментов (OPN8-HOO, OPE2-77Û, ОРЕ2-1100, OPN19-22, OPD3-920) характерны для группы черных смородин, включая смородинно-крыжовниковые гибриды. Ряд фрагментов был амплифицирован только на ДНК крыжовников и смородинно-крыжовниковых гибридов (в том числе фрагменты OPN14-43Û, ОРЕ5 -710). Были обнаружены фрагменты, характерные для групп сортообразцов, объединяющих сразу несколько таксономических единиц.

Выявленный полиморфизм позволил отличить друг от друга близко родственные сорта, представителей одной сестринской линии, имеющих идентичные родословные (сорта Кипиана, Гамма, Грация).

На основании электрофореграмм были подсчитаны коэффициенты генетических различий, отображающие генетические расстояния между образцами попарно (таблица 1).

Таблица 1. Показатели генетических расстояний представителей рода ШЬея Ь., рассчитанные по результатам НАРР данных_

Группа образцов Вариабельность коэффициентов Среднее значение Стандартная ошибка

генетических к.г.р. среднего

различий (к.г.р.) значения к.г.р.

внутри группы

Межподродовые расстояния

Grossularia. nRibesia, секция Ribesia 0,13-0,19 0,16 0,0024

Grossularia. 0,12-0,17 0,14 0,0011

iiRibesia,ceKm4iEucoreosma

Calobotrya - Grossularia 0,15-0,18 0,17 0,0069

Symphocalyx - Grossularia 0,19-0,21 0,2 0,0036

Межсекционные расстояния

секция Еисогеоятаи секция 0,14-0,21 0,16 0,0006

Ribesia

Са1оЬо1гуа - ЮЬе51а 0,14-0,23 0,17 0,0078

Са1оЬо1гуа - Еисогеозта 0,12-0,16 0,14 0,0020

8утрЬоса1ух- ШЬе51а 0,15-0,18 0,16 0,0032

5утр1юса1ух- Еисогео5та 0,17-0,22 0,19 0,0022

8утрНоса1ух- Са!оЬо1гуа 0,23

Межвидовые (виды принадлежат одной секции)

R. nigrum, R. ussuriense (ceiamnEucoreosma) 0,04-0,05 0,05 0,0009

Приморская форма, R.petraeum subsp. atropurpureum, R.rubrum, R 0,05-0,13 0,08 0,006

sativum, R.warszewiczii, R.

palczewskii (секция Ribesia)

Виутрисекционные

секция Еисогео5та 0,01-0,08 0,04 0,0006

секция 0,04-0,13 0,07 0,0038

секция Еи£го55и1апаЕпф. 0,03-0,05 0,04 0,0024

Внутривидовые

R. nigrum (10-17,19) 0,02-0,05 0,03 0,0012

Межсортовые

Сорта черной смородины (27 образцов, 8-22, 24-35) 0,01-0,07 0,04 0,0004

Сорта красной смородины (5 образцов, 43-47) 0,04-0,09 0,06 0,005

Смородшшо-крыжовниковые гибриды

GrossulariaiicM.-щ). гибриды 0,08-0,11 0,1 0,003

секция Eucoreosma и см.-кр. гибриды 0,05-0,09 0,07 0,001

Установлено, что у исследованных образцов рода Ribes значения коэффициентов генетических различий варьируют в пределах от 0,01 (между двумя сортами черной смородины, представителями европейского подвида - Северянка и Отело) до 0,23 (между R. aureum Pursh секции Symphocalyx и R. sanguineum Pursh секции Calobotrya).

В целом, диапазон генетических различий 27 сортов и гибридов черной смородины секции Eucoreosma, включая образцы, в происхождении которых участвовали другие виды секции Eucoreosma (R. bracteosumDough, R.pauciflorumTurcz., R.dikuschaFisch., R.ussurienseJancz. и др.), секции Calobotrya (R.glutinosumBenth), подрода Grossularia (R. oxyacanthoidesL.) составил 0,01-0,08 и был ниже, чем у пяти образцов красной смородины секции Ribesia- 0,040,13, в родословных которых присутствуют только виды секции Ribesia: R. rubrumL., R. sativumSyme, R. warszewicziiimcz., R. palczewskii(imcz.) Pojark.

Сравнительно низкие значения генетических различий (0,030,05) были выявлены для образцов крыжовника (подрод Grossularia), что, однако, может быть связано с малой представленностью этого подрода в анализе (4 образца).

Сортообразцы Йошта и 2030-29-61, полученные от скрещивания видов, относящихся к разным подродам R. divaricatuniDoug\.(nopjpo)x Grossularia) и R. nigrum (подрод Ribesia), показали большее сходство с представителями секции черной смородины (0,05-0,09), чем с представителями крыжовников (0,08-0,11).

Наибольшие генетические различия обнаружены между представителями секции красных смородин (Ribesia) и секции черных смородин (Eucoreosma) (0,14-0,21); представителем секции Symphocalyx R. aureum (золотистая смородина) и представителями секции Eucoreosma (черная смородина) (0,17-0,22); представителем секции Symphocalyx R. aureum (смородина золотистая) и представителем секции Calobotrya R.sanguineum (смородина кроваво-красная) (0,23); представителем секции Calobotrya R.sanguineum (кроваво-красная смородина) и представителями секции Ribesia (красная смородина) (0,14-0,23).

В то же время различия между представителями подродов Grossularia и Ribesia были на том же уровне, что и вышеперечисленные межсекционные. Между представителями подрода Grossularia (крыжовник) и представителями подрода Ribesia секции Eucoreosma (черная смородина) коэффициенты генетических различий составили 0,12-0,17; между представителями подрода

СгояхЫапа (крыжовник) и представителем подрода ШЬея'ш секции Са!оЬо(гуа - Къащшпеит (смородина кроваво-красная) ОД5-ОД8.

Я. $ап%и\пеит (смородина кроваво-красная, представитель секции Са1оЬо1гуау подрод ШЬе$1а) имеет большее сходство (0,14) с образцами черной смородины, чем с образцами крыжовника (0,17) и красной смородины (0,17). В целом, согласно коэффициентам генетических различий, среди исследованных представителей рода ШЬей можно выделить три неформальные группы по степени сходства геномов: 1) представители секций Еисогеоэта и Са\оЪо1гуа подрода ШЪез1а и представители подрода Сго&уи/аг/'а, 2) представители секции ШЬейга, 3) представитель секции 8утрЬоса1ух.

Исследование таксономических и филогенетических отношений анализируемых представителей рода ШЬе$

На основании полученных КАРБ спектров методом кластерного анализа (ИРвМА) была построена дендрограмма, наглядно отражающая степень различий исследованных образцов (рис.2).

4_И.п«а-«г1хр*

5 К.втмг1*ра (13-15-3)

3~ И. цт»-сг1$р»(250)

6 К.вта-сг1х|1жхЯ.»1|пип(11»шта) 7~&кта-сг15{пхКл1£лио(г0-ЗО-2 9-61)

651 1пив I ?{Оте.1л»)

( I-14 _11-111£ГШВх? (С еясряжк*)

Г) 741- 29_котьга.1мхиыв гворяд (Гамма)

"I '-35_к»мккксвы8 гибрид (Гралвя)

I-32_К.п12Гв1«,КЛ'кп5Ь»{ив1и1ств)

8_к«>ш.1«кс1ый гябр«£(В1613Л 7) 9_к«мллексаьш гвбр*д(Кят«11») 24_Кл1^пш>|Т1^!ка1Ьа(Орлваская сгревада) 15 Кл1§гавх?(Сялг«)

28_К.1»1вгиш.1^(!1кв $Ьа(Ойрвваиве) 31_&Ш£гит/&Д|кя$1и(Е.икгстев)

Илй£ПШ/Ш1]ЦК1и(ИсК} ВШ1)

22_К.в1вгчтЛ1.а£кв51и(11а>епвая) 11_К.а1;гиш(Шмвтв Прввккт) 1 б_Бл1|пш(В 11пшгтан4 0)

34 Кл1^гиа.'К4исв$1и<'Кра11сШ«п1т(Чтдн«е игвоягнве) 2бТ1.я1|гаяь1гЛкч вкаСДатавца) 30_Чёрвая вуаль 10_Кл{$гив(Бтры сладкая) 20_К.а1§гш/К.и5Квпев5е(Твташы) 12_К.а1епш(Ртвв|евсхая) 17_К.в1вгив(Бса Сжрек) 18_.К.я1£гииДО.а($яг1ев5е(Бев Ломвцл) 19_Кл1§гшя(Одже5вм) Зб~К.аг>аНея$с{Усстрв) 37 &в1вгвт'1г^гвсввЪе 05(3864-46^2}

35)

ЗЗ^К^ан^ош »»(Кровава красная) 39~Кла1(Ш»пи»(Првэ19рскяя форма) 421Кля1Ьга/К.пЛгв1вЛ^р«квт{970-18-41) 43_Н.гяЬгпт(Виктерна) 44_К.1«1пиш(Г*.иа«хскал белая) 45_К.ааЦгвв1(ФаяяЦ.юдароаввя) 4Т_К.ра1оп зкЩСквросвелая) 4рйгпш(Т Лмп жл-рптроа ал) 40_К.ви1Ш1*гш/В.ха^п1М^рМгешв(1002-17-110) 4б_К. таге1 егЩКраглая вяксне) 48_К.вагевв1^2вйсак)

Рисунок 2. Дендрограмма кластеризации 47 образцов рода ШЬея, построенная на основании Я АРБ данных.

Отдельную ветвь в группе смородин черных формирует гибридная форма R. dikuscha х R.hudsoniamim.

На полученной дендрограмме с высокой бутстреп поддержкой (ИБ 72%) объединяются сорта, имеющие в родословной представителя скандинавского подвида смородины черной (сорт Оджебин 100% по родословной R. nigrum subsp. scandinavicum, Бен Ломонд 50% скандинавского подвида смородины черной, Бен Сарек -25% скандинавского подвида смородины черной в родословной). Однако, сорт Титания, в родословной которого R. nigrum subsp. scandinavicum составляет 25 %, в этот кластер не входит, что, вероятно, связано с присутствием в ее родословной также сибирского подвида (25%).

Среди сортов Северянка, Отело, Ртищевская, Силго, Веллингтон-30, имеющих в родословной представителя подвида R. nigrum subsp. europaeum со сравнительно высоким значением бутстреп под держки (65%) объединяются только сорта Отелло и Северянка.

Данные кластерного анализа не всегда отражают данные родословных. Так сорта Гамма, Грация и Кипиана получены из одной гибридной семьи (100 % родства по родословным), но по данным дендрограммы вместе кластеризуются только сорта Гамма и Грация.

На дендрограмме к кластеру черных смородин с высокими значениями индекса бутстрепа (ИБ 100%) примыкают смородинно-крыжовниковые гибриды (Йошта и 2030-29-61), что, вероятно, свидетельствует о преобладании у них генома смородины черной.

Второй и наиболее близкий к представителям черной смородины (секция Eucoreosma подрод Ribesia) кластер сформировали образцы крыжовника вида R grossularia, относящемуся к подроду Grossularia.

Также к черно-смородинно-крыжовниковому кластеру примыкает отдельная ветвь - образец вида R sanguineum (смородина кроваво-красная), секция Calobotrya, подрод Ribesia.

Третью группу на дендрограмме образуют представители секции Ribesia (ИБ 96%), которая подразделяется на ряд отдельных подкластеров. Наиболее крупный подкластер образуют образцы видов R. sativum (сорта Файл Плодородная, Голландская белая), R.palczewskii (Скороспелая), R ре/гаеидаШЫЦТемно-пуриуровая), R. warszewiczii (Красная Виксне), и гибридная форма 1002-17-110, имеющая в родословной генетический материал от R.multiflorum Kit., R.sativum, R. petraeum. С этим подкластером объединяются два образца (ИБ 79%), имеющие в составе своего генома генетический материал вида R.rubrum (сорт Виктория, полученный путем отбора из популяции R.rubrum, и гибридная форма 970-18-41).

Базальную ветвь в третьей группе формирует приморская форма, являющаяся предположительно образцом вида R.multiflorum или вида R.mandshuricïim (Maxim.) Кот.

По данным проведенного RAPD анализа наиболее отдаленным из анализируемых видов Ribes является вид R. аигеит (смородина золотистая, сорт Ляйсан), формирующий на дендрограмме отдельную ветвь.

4. Изучение полиморфизма белков семян черной смородины методом SDS-ПААГ электрофореза белков семян

На полученных нами спектрах запасных белков семян черной смородины можно выделить четыре зоны с соответствующими позициями компонентов: 10-40 (зона 4), 43-67 (зона 3), 85-100 (зона 2) и 105-110 (зона 1) (рис.3).

Спектр сои

f—*—.

V ЩЩ П Щ '

_!

/50 •

Спектры «"»ян сорта Искушение Спектры семян сорта Искушение

Рисунок 3. Электрофоретические спектры запасных белков семян сортообразца Искушение (справа отмечены зоны спектра, на спектре суммарного белка сои отмечены позиции реперных компонентов).

В зоне 3 (33-39 кДа) выявлено 5 возможных позиций компонентов: 46, 48, 50, 52, 53. В зоне 2 (20-22 кДа) выявлено 5 возможных позиций компонентов: 85, 86, 88, 90, 92.

У большинства исследованных сортообразцов (Искушение, 3268-4-36, Минай Шмырев, 2091-39-32, Кипиана, 3190-44-57) при посемянном анализе были обнаружены разные типы спектров, что говорит о различии генотипов проанализированных семян, единообразные типы спектров ото всех семян получены только у одного сортообразца (3122-47-29). Данный факт, видимо, обусловлен гетерозиготностью локусов,контролирующих запасные белки семян у сортообразцов, от которых после самоопыления были получены

■ , * ..¿"Г2

I1

семена. Полиморфный характер спектров наблюдался и у разных популяций смородины мало цветковой (Сабитов, 1994), а также большинства исследованных сортов красной смородины (Арсеньева, 1995).

При учете главных компонентов и их интенсивности в зонах 3 и 2 было выявлено соответственно 9 и 4 типа спектров (таблица 2).

Таблица 2. Компонентный состав белков семян исследованных

Зона 3 Зона 2

Тип спектра Позиция и интенсивность окрашивания полипептидов, балл

46 48 50 52 53 85 86 88 90 92

1 1 2 1 1 2 2

2 1 1 1 1 1 1 2 1

3 1 1 1 1 2 1

4 1 1 1 2 2 1

5 1 1 2 1

6 1 1 1

7 2 2 1 1

8 2 2 2

9 1 2 1

Рассчитанные нами частоты встречаемости типов спектров (процент числа семян с данным типом спектра от общего числа протестированных семян), показывают, что число типов спектра в пределах сортообразца колеблется от 1 (3122-47-29) до 6 (Искушение) в зоне 3 и от 1 (Кипиана, 3122-47-29 и др.) до 3 (Искушение и др.) в зоне 2 (таблица 3).

Таблица 3. Частоты встречаемости типов белкового спектра в

семянном потомстве у сортообразцов черной смородины, %

Сортообразцы Типы спектров зоны 3 Типы спектров зоны 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4

Искушение 55 29 9 2 3 2 54 30 17

3268-4-36 44 6 15 10 21 4 48 31 21

Мипай Шмырев 98 2 7 91 2

2091-39-32 25 6 66 3 100

Кипиана 70 30 100

3190-44-57 39 61 100

3122-47-29 100 100

У сортообразца Минай Шмырев более 90% встречающихся типов спектров представлены одним спектром (тип спектра №1 в зоне

3 и №2 в зоне 2). У сортообразца Искушение более 80% приходится на 2 типа спектра (№№ 1 и 2 в зоне 2 и в зоне 3). У сортообразца 3268-436 80% составляют 3 типа спектра (№№ 1,3,5 в зоне 3 и №№ 1,2 и 3 в зоне 2). Сортообразцы 2091-39-32, Кипиана, 3190-44-57 характеризуются сочетанием двух типов спектров в зоне 3 (№№ 1и 8, №№ 8 и 9, №№ 8 и 9, соответственно), в то время как в зоне 2 имеют только один тип спектра (№4).

Сортообразцы Кипиана и 3190-44-57 имеют одинаковое сочетание типов спектров в зоне 3, но частота встречаемости данных спектров различна: у Кипианы 70% приходится на тип спектра № 8 и 30% на № 9, в то время как у сортообразца 3190-44-57 тип спектра № 9 преобладает (61%).

Для проверки достоверности различий сочетаний частот типов спектра между сортообразцами был использован анализ частот встречаемости типов белкового спектра зоны 2 и 3 при помощи критерия у2 - определение достоверности различия двух распределений с одинаковой системой классов, с одинаковыми границами (Плохинский, 1980).

При анализе различий сочетаний частот типов спектра в зоне 3 была установлена достоверность различий между всеми образцами с вероятностью недостоверности различий менее 0,001. Таким образом, все исследованные сортообразцы характеризуются уникальным соотношением частот типов спектров зоны 3.

Аналогичный анализ частот типов белкового спектра зоны 2 показал наличие достоверных различий между большинством сортообразцов за исключением ряда сортообразцов, имеющих одинаковую (2091-39-32, Кипиана, 3190-44-57, 322-47-39) или близкую (3268-4-36 и Искушение) структуру белкового спектра в зоне 2. Несмотря на наличие очевидных визуальных различий спектров зоны 2 у ряда сортообразцов, использование этой зоны не позволяет различить все исследованные сортообразцы в отличие от зоны 3, характеризующейся более разнообразными спектрами и их сочетанием, индивидуальным для всех сортообразцов.

Большинство изученных сортообразцов характеризуются сочетанием определенных типов спектров с различной частотой, проявляя значительный полиморфизм генотипов, за исключением сортообразца 3122-47-29, у которого белковый спектр состоит из одного типа. По данным Арсеньевой (1995), у 86% изученных сортов смородины красной выявлен значительный полиморфизм генотипов, у оставшихся 4 сортов обнаружили отсутствие гетерогенности.

Таким образом, впервые в России проведен SDS-ПААГ электрофорез белков семян черной смородины. Установлено, что спектры запасных белков семян состоят из 4 зон. У большинства исследованных сортообразцов (за исключением формы 3122-47-29) при посемянном анализе были обнаружены различные типы спектров, что говорит о различии генотипов проанализированных семян. В данном случае полиморфность спектров - отражение гетерозиготности сорта, которая проявилась при самоопылении. По наличию очевидных визуальных различий спектров зоны 2 исследованные сортообразцы можно разделить на две группы. Каждый из изученных сортообразцов достоверно характеризуется определенным сочетанием частот типов спектра зоны 3.

5. Маркирование гена Се, контролирующего устойчивость черной смородины (R. nigrum) к почковому клещу (Cecidophyopsis ribis)

При амплификации на ДНК сортообразцов крыжовника, смородинно-крыжовниковых гибридов и смородины (Кипиана, Грация, В1613/17, 1448-14-24), имеющих ген Се по данным анализа родословных и селекционных наблюдений за поражаемостью почковым клещом, был получен фрагмент ожидаемого размера (130 п.н.), что свидетельствует о наличии SCAR маркера (рис. 4). В же время при амплификации на ДНК остальных сортообразцов, не имеющих ген Се, ПЦР продукт не был получен - SCAR маркер отсутствовал.

". ■ пн

Се Се Се Се Се Се Се Се <4-300

Ь. ' .<4-200

i М -К 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 М ;

Рисунок 4. Выявление SCAR маркера гена Се на электрофореграммах продуктов, амплифицированных на ДНК образцов черной смородины с парой праймеров Gmresa. (Надпись «Се» указывает присутствие или отсутствие гена Се у образца черной смородины по данным селекционных наблюдений; М - маркер молекулярного веса; - К - минус контроль; 2-4 - крыжовник: 2- форма 250, 3 - Гроссуляр, 4- форма 13-15-3; 5-Йошта, 6- форма 2030-29-61 -смородинно-крыжовниковый гибрид; 7 - 12 - черная смородина: 7 -В1613/17, 8 - Кипиана, 9 - Монисто, 10 - Искушение, 11 - Чудное мгновение, 12-Грация).

У смородины кроваво-красная (R. sanguineum), являющейся родственной формой смородины клейкой (R. sanguineum subsp. glutinosum) - донора олигогенной устойчивости к почковому клещу и, предположительно, также гена Се (Князев и Огольцова, 2004), SCAR маркер не выявлен. Данный факт, возможно, свидетельствует о присутствии у смородины кроваво-красной устойчивости, не обусловленной присутствием гена Се или о произошедшей рекомбинации.

Таким образом, SCAR маркер верно определил наличие или отсутствие гена Се у всех 37 сортообразцов.

В нашей работе SCAR маркер, разработанный в Шотландском Научно-Исследовательском Институте Сельскохозяйственных Культур (SCRI) и предложенный для маркер-вспомогательной селекции сортов черной смородины на устойчивость к почковому клещу, обусловленную присутствием гена Се (Brennan et. al., 2009), был протестирован на ряде сортообразцов (преимущественно отечественной селекции) и верно показал присутствие или отсутствие гена.

6. Картирование гена Rpfl, контролирующего устойчивость к фнтофторозному увяданию земляники (P. fragariae) и идентификация ДНК - маркеров данного гена

Анализ маркера SCAR-Rla и микросателлитных маркеров

Нами были протестированы 24 пары микросателлитных праймеров и SCAR маркер Ria на гибридной семье, полученной от скрещивания сортов Ялова-4 и Зенга Зенгана (64 сеянца).

В результате ПЦР анализа было амплифицировано от 2 (EMFn 228) до 14 (EMFV104, CFCT05a) фрагментов на пару праймеров, в среднем 7,7 фрагментов на пару праймеров.

В популяции по ряду локусов наблюдалось расщепление 1:1 (89 локусов) и 3:1 (16 локусов).

Картирование гена/?/)//.

Восемь микросателлитных маркеров и маркер SCAR-Rla были картированы вместе с геном устойчивости Rpfl на хромосоме 6d.

В результате картирования получена карта длинной 29 сантиморганид, которая включает 8 микросателлитных маркеров, SCAR маркер и ген Rpfl.

Вокруг гена Rpfl обнаружено несколько близко прилежащих маркеров. Некоторые из них занимают одну и ту же позицию. Это, вероятно, связано с ограниченным числом индивидов в картируемой популяции и отсутствием достаточного числа рекомбинантов, что ведет к недостаточному разрешению карты.

Порядок размещения микросателлитных локусов на полученной нами карте повторяет порядок размещения микросателлитных локусов на карте диплоидной земляники (рис. 5).

Рисунок 5. Сравнение порядка микросателлитных маркеров на полученной нами карте и карте диплоидной земляники, составленной на основании поколения F2 от скрещивания F. vesca 815 xF. nubicola 601 (Sargent et al., 2006).

Таким образов, ген Rpfl был картирован в дистальной части хромосомы 6d вместе с 8 микросателлитными маркерами и маркером SCAR-Rla. Были обнаружены близко расположенные к гену маркеры, однако в связи с низким разрешением полученной карты окончательный ответ о порядке маркеров, окружающих ген, дать нельзя.

Тестирование близко расположенных маркеров на сортах и гибридных формах

На сортах и гибридных формах различного происхождения, включая сорта, для которых данные маркера SCAR-R1 и теста на устойчивость расходились (Van de Weg etal., 2000), нами было протестировано несколько близко расположенных маркеров, находящихся с геном Rpfl в одной фазе (на одной гомологичной хромосоме), при этом отсутствующие у восприимчивого родителя (таблица 4).

Ялова-4 LG6D

FVxFN_LG6

о---Fv6l>_Y290Y2B8

ARSFL007 ' О EMFVÎ025 П 3 - Fvi6b_~t л

Маркер ЕтЙ1117 (аллель размером 179 п.н.) неверно идентифицировал 6 генотипов, верно идентифицировано 116. Ш150 (аллель 146 п.н.) верно идентифицировал все протестированные генотипы. БСАЯ-Ша неверно идентифицировал 19 генотипов. Рас4с1 (аллель 372 п.н.) встречается достаточно редко (у 4 из 89 образцов) и ассоциирована с геном Яр/7 только в двух генотипах (Ялова-4 и форма 88239, унаследовавшая ген Яр/1 от сорта Ялова-4).

Таблица 4. Результаты тестирования маркеров, картированных

вблизи гена /?р/У, на сортах и гибридных формах

Число

Генотип по локусу проанализированных

Локус, размер аллели Яр/1 маркером указан: генотипов

Rpfl* rpfl* всего

Emfnll7,179n.h. неверно 3 3 6

верно 40 76 116

Rh50, 146 п.н. неверно 0 0 0

верно 41 79 120

SCAR-Rla, неверно 13 6 19

285 п.н. верно 26 68 94

Fac4d, 372 п.н. неверно 28 0 28

верно 2 59 61

* - присутствие или отсутствие гена в образцах указано в соответствии с данными теста на устойчивость.

На основании полученных данных, наиболее вероятный порядок протестированных маркеров относительно гена Яр/1 оказался следующим: ЕтЙ1117/ ЯЬ50/ Яр/1/ 8САЯ-Я1 а.

Использование микросателлитного маркера ИЬ50 (аллель 146 п.н.) позволило верно идентифицировать генотипы всех исследованных образцов по гену Яр/7. Для всех остальных протестированных маркеров были обнаружены образцы, в которых в связи с произошедшей рекомбинацией связь между присутствием гена и маркера нарушилась.

Таким образом, ДНК маркеры БСАЯ-Ша и М50 (аллель размеров 146 п.н.) могут быть использованы в качестве фланкирующих маркеров при отборе генотипов, несущих Яр/1 ген -один из главных генов устойчивости земляники к фитофторозному увяданию.

Выводы

1. Использование ИАРБ анализа для изучения генетического разнообразия рода Я1Ье.ч выявило высокий уровень полиморфизма (в

среднем на праймер 98,5%), позволяющий различать даже близкородственные сорта. При этом коэффициенты генетических различий у группы образцов секции Ribesia выше, по сравнению с образцами секции Eucoreosma.

2. Идентифицированы RAPD фрагменты, специфичные для отдельных сортообразцов и таксономических групп рода Ribes. Полученные данные позволяют рассматривать RAPD анализ как перспективный метод изучения гибридов и различения генотипов в селекционной работе с крыжовником и смородиной.

3. Установлено, что анализ процента полиморфных фрагментов, рассчитанные коэффициенты генетических различий и топология дендрограммы поддерживают классификации, выделяющие красную смородину, черную смородину и крыжовник в отдельные подроды. Вместе с тем, смородино-крыжовниковые гибриды генетически ближе к проанализированным представителям черной смородины, чем к представителям крыжовника.

4. По данным топологии филогенетического дерева, исследованные образцы крыжовника генетически ближе к образцам секции черных смородин, нежели к образцам красной смородины; смородина кроваво красная ближе к кластеру образцов смородины и крыжовника, нежели к образцам красной смородины; а смородина золотистая является наиболее генетически отдаленной от всех исследованных представителей рода. При этом данные кластерного анализа не всегда отражают данные родословных на уровне сортов.

7. SDS-ПААГ спектры запасных белков семян черной смородины состоят из 4 зон. Для большинства сортообразцов (за исключением формы 3122-47-29) выявлен значительный полиморфизм генотипов семенного потомства, что свидетельствует о высокой степени гетерозиготности локусов, кодирующих белки семян. Выборки семян, полученных от самоопыления образцов, характеризуются определенными сочетаниями типов спектров зоны 3. По наличию очевидных визуальных различий спектров зоны 2 исследованные сортообразцы делятся на две группы (Искушение, Минай Шмырёв, 3268-4-36 входят в одну группу; Кипиана, 2091-39-32, 3190-44-57, 3122-47-29 - в другую).

8. SCAR маркер, амплифицируемый парой праймеров GMresa, был обнаружен у сортообразцов крыжовника, смородинно-крыжовниковых гибридов и смородины (Кипиана, Грация, В1613/17, 1448-14-24), имеющих ген Се по данным анализа родословных и селекционных наблюдений за поражаемостью почковым клещом.

Данный маркер может быть использован для отбора генотипов, устойчивых к почковому клешу.

9. На хромосоме 6d картирован один из главных генов (Rpfl) устойчивости к фитофторозному увяданию земляники садовой (P.fragariae) и идентифицированы фланкирующие этот ген молекулярные ДНК маркеры.

Рекомендации для ботаники, биохимической генетики, популяцнонной генетики, молекулярной генетики, маркер-вспомогательной селекции.

1. Использовать RAPD анализ для изучения полиморфизма и филогении рода Ribes в связи с высоким уровнем выявленного полиморфизма. Продолжить исследования по использованию RAPD маркеров для идентификации сортов.

2. SDS-ПААГ электрофорез белков семян, полученных от самоопыления, выявляет меж- и внутрисортовой полиморфизм локусов запасных белков семян черной смородины. SDS-ПААГ электрофорез белков семян может быть использован в качестве дополнительного метода для генетической характеристики черной смородины.

3. Использовать SCAR маркер, амплифицируемый парой праймеров GMresa, для отбора генотипов черной смородины иммунных к почковому клешу.

4. SCAR-маркер Ria и микросателлитный маркер Rh50 могут быть использованы в качестве фланкирующих маркеров для маркер-вспомогательного отбора генотипов, несущих ген Rpfl, контролирующий устойчивость к фитофторозному увяданию.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Пикунова, A.B. Использование молекулярных маркеров для оценки исходного селекционного материала ягодных культур / A.B. Пикунова // Вестник Орел ГАУ, 2011. - №3 (30). - С.29-32.

2. Пикунова, A.B. Применение RAPD-анализа для изучения генетического полиморфизма и филогенетических связей у представителей рода Ribes L / A.B. Пикунова, Е.В. Мартиросян, С.Д. Князев, H.H. Рыжова //Экологическая генетика, 2011. - Том IX. -№ 2. - С.34-44.

3. Пикунова, A.B. SDS-ПААГ электрофорез запасных белков семян смородины черной / A.B. Пикунова, H.H. Корниенко,

Н.Е. Павловская, С.Д. Князев // Вестник Орел ГАУ, 2010. - №3(24). -С.5-8.

Публикации в других изданиях

1. Пикунова, А.В. Маркерная помощь селекции смородины черной (Unigrum) на устойчивость к почковому клещу (Cecidophiopsisribes) / А.В. Пикунова, С.Д. Князев, Н.Е. Павловская // «Инновационный потенциал молодых ученых - АПК Орловской области»: сборник материалов региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященной 35-летию Орел ГАУ - Орел: Изд-во Орел ГАУ, 2010. - С.252-256.

2. Пикунова, А.В. Оценка генетического полиморфизма смородины черной с помощью ДНК RAPD анализа и SDS-ПААГ электрофореза запасных белков семян / А.В. Пикунова, Н.Е. Павловская, С.Д. Князев, Е.З. Кочиева // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: межрегиональный сборник научных работ. Выпуск 12-ВГУ: 2010г.-С.161-165.

3. Пикунова, А.В. Методическое обеспечение изучения и идентификации сортов смородины черной по белковьм и ДНК маркерам. / А.В. Пикунова // «Вклад молодых ученых в реализацию приоритетных направлений развития АПК»: сборник материалов региональной научно-практической конференции (Орел, 19-23 марта 2007) - Орел: Изд-во Орел ГАУ, 2007. - С. 32-33.

4. Pikunova, Anna. Phylogenetic relationships and genetic diversity in Ribes species revealed by RAPD markers / Anna Pikunova, Natalia Ryzhova, Elena Martirosyan, Ninel Pavlovckaya, Sergey Knyazev, Elena Kochieva //International conference on foodomics, 28-29 May, 2009. Cesena, Italy. - Abstract book. - P.95.

5. Dijk Thijs van, Pikunova Anna, Yilmaz Hulya, Meulenbroek Bert et al. Towards QTL mapping in the cultivated, octoploid strawberry: the development of a public SSR marker linkage map / Anna Pikunova //International conference on foodomics, 28-29 May, 2009, Cesena, Italy. -Abstractbook. - P. 118.

6. Князев, С.Д. Использование генетических ресурсов рода Ribes L. в селекции смородины черной / С.Д. Князев, А.В. Пикунова, А.Ю. Андрианова // Развитие научного наследия И.В. Мичурина по генетике и селекции плодовых культур: материалы междунар. науч.-практ. конф., посвященной 155-летию со дня рождения И.В. Мичурина - Изд-во ГНУ ВНИИГ и СПК имени И.В. Мичурина, 2010. - С. 166170.

Подписано в печать 10.11.2011 г. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0. Заказ 164. Тираж 100 экз.

Отпечатано в издательстве Орел ГАУ, 2011, Орел, Бульвар Победы, 19

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пикунова, Анна Викторовна

Введение.

1. Обзор литературы.

2.Материалы и методы.

2.1. Растительный материал.

2.2 Выделение ДНК.

2.3 SDS-ПААГ электрофорез запасных белков семян.

2.4 ПЦР анализ.

2.5 Статистическая обработка данных.

3. RAPD анализ генетического разнообразия и филогенетических связей у представителей рода Ribes L.

3.1.Исследование генетического полиморфизма родаЯгбез L.

3.2.Исследование таксономических и филогенетических отношений анализируемых представителей рода Ribes L.

4. Изучение полиморфизма белков семян чёрной смородины методом SDS-PAAG электрофореза.

5. Маркирование гена устойчивости (Се) чёрной смородины (R.nigrum) к почковому клешу (Cecidophyopsis ribis).

6. Молекулярно-генетическое картирование и маркирование гена Rpfl контролирующего устойчивость земляники к фитофто]розному увяданию

Paragariae subsp. fraganae).

6.1 Анализ полиморфизма SCAR-Rla и микросателлитных маркеров.

6.2.Картирование гена в расщепляющейся популяции.

6.3. Тестирование близко расположенных маркеров на сортах и гибридных формах.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Оценка генетического разнообразия исходного и селекционного материала ягодных культур с помощью молекулярных маркёров"

Актуальность темы исследований. Существенным недостатком ягодных культур, в том числе смородины черной и земляники садовой является высокая восприимчивость к болезням и вредителям. Одним из основных, экологически безопасных, путей борьбы с болезнями и вредителями является селекция, направленная на создание невосприимчивых к ним сортов (Князев, 1995).

Важной задачей в селекции смородины чёрной (Ribes nigrum) является создание сортов устойчивых к почковому клещу (Cecidophyopsis ribis) (Огольцова, 1992, Копань и др., 1998, Князев, Огольцова, 2004), а в селекции земляники садовой - выведение сортов, устойчивых к фитофторозному увя-^ ^ ^ данию (возбудитель Phytophthora fragariae Hick, subsp. fragariaé) (Parikka, С 2004, Ellis, 2008).

Успех селекционных исследований в данном направлении во многом зависит от изучения, подбора и систематизации исходного материала, мобилизации в селекционных программах диких сородичей, создания эффективных доноров (Вавилов, 1987, Жученко, 2001), а также применения современных методов исследований, позволяющих на ранних стадиях идентифицировать устойчивые генотипы (Чесноков, 2005, Francia et al., 2005).

Род смородина Ribes L. включает более 150 видов, к нему приналежат такие сельскохозяйственные культуры как красная и чёрная смородины и крыжовник. Однако огения и таксономия рода окончательно не опреде- Ч

Одним из направлений, позволяющих существенно расширить возможности традиционной селекции растений, оценить полиморфизм селекционного материала, уточнить филогенетические связи является применение молекулярных маркеров (Гречко, 2002, Collard and Mackill, 2007). В селекционных исследованиях земляники и особенно смородины черной молекулярные маркеры используются ограниченно и, преимущественно, в зарубежных лены. исследованиях (Brennan et al.,1997, 1998, 2002,2009, Haymes et al., 1997, Weg et al.,1997, 2006, Sargent et al., 2008).

В этой связи применение методов ДНК-генотипирования культурных растений и их дикорастущих сородичей, создание карт сцепления и физических карт генома с помощью ДНК-маркеров будет способствовать увеличению генетического разнообразия и вовлечению новых генов и аллелей в процесс селекции (Хавкин, 2003).

Цель и задачи исследований.

Цель исследований - изучить возможность использования молекулярных ДНК-маркеров и полиморфизма спектров запасных белков семян для первичной оценки исходного и селекционного материала смородины чёрной и земляники садовой.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) изучить генетическое разнообразие рода Ribes L. с помощью RAPD анализа; 1,

2) рассмотреть филогенетические связи между видами рода Ribes L. на основании данных RAPD маркёров;

3) изучить полиморфизм запасных белков семян чёрной смородины и оценить его возможности для генетического анализа селекционного материала;

4) оценить возможность использования SCAR маркёра гена Се, ам-плифициру^еого парой праймеров GMresa, для отбора устойчивых к почковому клещу генотипов;

5) составить молекулярно-генетическую карту сцепления ДНК-маркёров и гена Rpfl устойчивости земляники к фитофторозному увяданию.

Научная новизна. Впервые в России для оценки коллекции рода смородина Ribes Ь.генбанка ВНИИСПК., включающего преимущественно сорта *, / отечественной селекции, был использован RAPD анализ. SDS-ПААГ электрофорез запасных белков семян впервые использован для анализа полиморфизма сортов смородины чёрной. SCAR маркер гена Се устойчивости смородины чёрной к почковому клещу протестирован на отечественном материале. Картирован один из основных генов устойчивости земляники к фитофтороз-ному увяданию (Rpfl), обнаружены и проверены на различных сортах и формах ДНК маркеры данного гена.

Практическая значимость исследований. Выявлена возможность использования SCAR маркера гена Се для отбора устойчивых к почковому клещу генотипов смородины чёрной на ранних стадиях селекционного процесса, что значительно ускорит выведение устойчивых сортов.

Обнаруженные в настоящей работе ДНК-маркеры гена Rpfl устойчивости земляники к фитофторозному увяданию могут быть использованы при отборе генотипов несущих ген. Данные о локализации гена Rpfl на генетической карте будут полезны для исследований по клонированию гена, что, в свою очередь, откроет возможность получения трансгенных устойчивых сортов земляники.

Установлено, что RAPD анализ выявляет высокий уровень полиморфизма между представителями рода Ribes L. и, таким образом, предоставляет селекционеру дополнительную информацию о генетическом сходстве и различии селекционного материала, что позволит более обоснованно подбирать пары для скрещивания. Открываются перспективы для использования данного метода в оценке гибридов и различения генотипов смородин и крыжовников в связи с обнаружением целого ряда таксон-и генотип специфичных фрагментов.

SDS-ПААГ электрофорез белков семян выявил межсортовой и внутри-сортовой полиморфизм генотипов и может быть использован для оценки генетической гетерогенности сортов и популяций смородины чёрной.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и доложены на Международной научно-практической конференции «Foodomics» Се-зена (Cesena), Италия (28-29 мая, 2009); на региональной научно-практической конференции молодых учёных, аспирантов и студентов, посвященной 35-летию Орловского государственного аграрного университета

Инновационный потенциал молодых учёных — АПК Орловской области», (Орёл, 16-19 марта 2010 года); на Между-народной научно-практической конференции, посвященной 155-летию со дня рождения И. В. Мичурина XXII «Мичуринские чтения» (26-28 октября, 2010) г. Мичуринск. Первоначальные результаты исследований позволили принять участие в международном проекте IAMONET-RU, реализованном в университете г. Вагенинге-на Королевства Нидерландов (23.01.2009-23.01.2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 в рецензируемых ВАК изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах компьютерного текста, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, рекомендаций, списка литературы (241 наименование, в том числе 154 зарубежных автора), содержит 19 таблиц и 29 рисунков, 6 приложений.

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Пикунова, Анна Викторовна

Выводы

Использование RAPD анализа для изучения генетического разнообразия рода Rib es L. выявило высокий уровень полиморфизма (в среднем на праймер 98,5%), позволяющий различать даже близкородственные сорта. При этом коэффициенты генетических различий у группы образцов секции Ribesia выше, по сравнению с образцами секции Eucoreosma.

2.Идентифицированы RAPD фрагменты .специфичные для отдель- »/ f / ных сортообразцов и таксономических групп рода Ribes L. Полученные данные позволяют рассматривать RAPD анализ как перспективный метод изучения гибридов и различения генотипов в селекционной работе с крыжовниками и смородинами.

3.Установлено, что анализ процента полиморфных фрагментов, рассчитанные коэффициенты генетических различий и топология дендро-граммы поддерживают классификации, выделяющие красную смородину, чёрную смородину и крыжовник в отдельные подроды. Вместе с тем смо-родино-крыжовниковые гибриды генетически ближе к представителям чёрной смородины, чем к крыжовникам.

4.По данным топологии филогенетического дерева, исследованные образцы крыжовников генетически ближе к образцам секции чёрных смородин, нежели к образцам красных смородин; смородина кроваво красная ближе к кластеру смородин и крыжовников, нежели к образцам красных смородин; а смородина золотистая является наиболее генетически отдалённой от всех исследованных представителей рода. При этом данные кластерного анализа не всегда отражают данные родословных на уровне сортов.

7.SDS-IIAAr спектры запасных белков семян чёрной смородины состоят из 4 зон. Для большинства сортообразцов (за исключением формы 3122-47-29) выявлен значительный полиморфизм генотипов семенного потомства, что свидетельствует о высокой степени гетерозиготности ло-кусов кодирующих белки семян. Выборки семян, полученных от самоопыления образцов, характеризуются определенными сочетаниями типов спектров зоны 3. По наличию очевидных визуальных различий спектров зоны 2 исследованные сортообразцы делятся на две группы.

8.8СА11 маркёр, амплифицируемый парой праймеров вМгеза, был обнаружен у сортообразцов крыжовника, смородинно-крыжовниковых гибридов и смородины (Кипиана, Грация, В1613/17, 1448-14-24), имеющих, по данным селекционных наблюдений, ген Се. Данный маркёр может быть использован для отбора генотипов устойчивых к почковому клещу.

9.На хромосоме 6(1 картирован один из главных генов (Яр/1) устойчивости к фитофторозному увяданию земляники садовой {P.fragariae) и обнаружены фланкирующие этот ген молекулярные ДНК маркёры.

Рекомендации для ботаники, биохимической генетики, по-пуляционной генетики, молекулярной генетики, маркер-вспомогательной селекции.

1 .Использовать RAPD анализ для изучения полиморфизма и филогении представителей рода Ribes L. в связи с высоким уровнем выявленного полиморфизма. Продолжить исследования по использованию RAPD маркеров для идентификации сортов.

2.SDS-nAAT электрофорез белков семян^полученных от самоопыления , выявляет меж- и внутрисортовой полиморфизм локусов запасных белков семян чёрной смородины и может быть использован в качестве дополнительного метода для генетической характеристики данной культуры.

3.Использовать SCAR маркёр, амплифицируемый парой праймеров GMresa, для отбора иммунных к почковому клещу генотипов чёрной смородины.

4.SCAR-MapKep Ria и микросателлитный маркер Rh50 могут быть использованы в качестве фланкирующих маркеров для маркер-вспомогательного отбора генотипов, несущих ген Rpfl, контролирующий устойчивость к (P.fragariae).

Заключение

В нашей работе методы молекулярного маркирования были использо

I ваны для первичной оченки исходного и селекционного материала смородиj ны чёрной и земляники садовой.

На основании полиморфизма молекулы ДНК, выявляемого RAPD ана

1 лизом, было охарактеризовано генетическое разнообразие и филогенетические связи представителей рода Ribes L. Установлено, что из проанализиро2 ванных сортообразцов] наиболее генетически отдалёнными являются сморо

I 1

4 «w дина золотистая и смородина кроваво красная; крыжовники генетически ближе к чёрной смороде, чем к красной; смородинно-крыжовниковые гибриI

I ды ближе к чёрной смородине, чем к крыжовникам; группа красных сморор дин Наиболее генетически полиморфна, чем группа чёрных смородин. Полуt ^ ченные данные поддерживают классификации^ выделяющие крыжовники,

1 красные смородины и чёрные смородины как таксоны одного уровня. Кроме

Iii

Жу того, для отдельных сортообразцов и групп сортообразцов были обнаружены

Ш > ' I и 1 »

Iii специфичные RAPD фрагменты. SDS-ПААГ электрофорез запасных белков семян чёрной смородины выявил меж- и внутрисортовой полиморфизм локу-сов запасных белков семян чёрной смородины. SCAR маркер гена Се устойчивости чёрной смородины к почковому клещу протестирован на разнообразном селекционном материале. Полученные молекулярные данные совпа-t—■ даюст с данными о присутствии гена, базирующимися на анализе родословных и наблюдениями за порожаемостью. Данный маркёр может быть использован для отбора генотипов несущих ген Се. Была составлена молекулярно генетическая карта сцепления ДНК-маркёров и гена Rpfl—одного из главных генов, отвечающих за устойчивость земляники к фитофторозному увяданию. Были обнаружены фланкирующие маркёры, которые могут быть использованы при отборе генотипов несущих ген.

Полученные результаты могут быть использованы в ботанике, биохи

I/ мическои генетике, популяционнои генетике, молекулярной генетике^ селекции. /Л

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Пикунова, Анна Викторовна, Орел

1. Анисимова, И. Н. Идентификация сортов, линий и гибридов подсолнечника по составу полипептидов гелиантина. Текст. Текст./ И. Н. Анисимова // Сб. науч. тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции. 1987. -Т. 114.-С. 114-126.

2. Арсеньева, Т.В. О возможности применения метода электрофореза запасных белков семян в сортоведении смородины красной Текст. / Т. В. Арсеньева // Молодые учёные садоводству России: сборник статей. - М., 1995. - С.61-64.

3. Барсуков В. Всё о землянике. © V. Vesjolij. Рига, 2009. 54с.

4. Баянова, JI.B. Оценка исходных форм черной смородины по устойчивости к почковому клещу Текст. / Л. В. Баянова // Прогрессивные приемы возделывания сортимента плодовых и ягодных растений: сб.ст.- Тула, 1984.-С. 60-65.

5. Бурмистров, А.Д. Ягодные культуры Текст. / А. Д. Бурмистров.- 2-е изд.- Л.: Агропромиздат, 1985.- 272 с.

6. Вавилов, Н.И. Теоретические основы селекции. Текст. / Н. И. Вавилов.-М.: Наука, 1987. -511 с.

7. Введенская, И.О. Полиморфизм белков семян в изучении внутривидовой дифференциации смородины малоцветковой (Ribes Pauciflorum Turcz.) Текст. / И.О. Введенская, А.Ш. Сабитов// Генофонд растений Дал. Востока России. Владивосток, 1999. - с. 114-116.

8. Власова, Э.А. Защита ягодных культур Текст. / Э.А. Власова, Э.И. Ларина. Ленинград: Лениздат, 1974 - 72с.

9. Войлокова, В. Н. Систематика и филогения рода Polygonum L. : моле-кулярно-генетический подход : диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук : 03.00.05 Москва, 2007 181 с.

10. Володин, В.И. Электрофоретический состав альбуминов семян гибридов гороха и вики в F2 Текст. / В.И. Володин, О.И.Гуринович, А.И. Костромичева, В.И. Измалкова//Бюллетень научно-технической информации ВНИ-ИЗБК, Орёл, 1978 с.31-36.

11. Высоцкий, В.А. Современные подходы к идентификации косточковых культур Текст. / В.А. Высоцкий, О.В. Арклис, И.Л. Цветков // Садоводство и виноградарство. 2007. - № 2. - С. 19-21.

12. Гаврилюк, И. П. Идентификация, анализ и регистрация сортов, линий и гибридов подсолнечника методом электрофореза гелиантини-на.//Методические указания Текст. / Под ред. И.П.Гаврилюк.; Ленинград, ВИР., 1988. 23с.

13. Гаврилюк, И.П. Электрофорез белков семян в сортовой идентификации овощных культур Текст. / И.П. Гаврилюк, Н.К. Губарева, Е.В. Смирнова, В.И. Пыженков//Аграрная Россия. 2005. -№2. С. 13-16.

14. Говоров, В.Н. Основные грибные болезни земляники садовой и устойчивость к ним новых сортов и гибридов Текст. / В.Н. Говоров //Arpo XXI, 2008.-№7-9.-С.13.

15. Головнина, К.А. Использование молекулярных маркеров для установления филогенетических взаимоотношений видов в родах Triticum 1. и Iris 1: автореф. дис. канд. биол. наук : 03.00.15. М, 2010. - 19с.

16. Горюнова, C.B. RAPD-анализ внутривидовой изменчивости и филогенетических связей видов Aegilops L. с D- геномом, содержащих D-геном Текст. / C.B. Горюнова, Е.З. Кочиева, H.H. Чикида, В.А. Пухальский // Генетика 2004. Т. 40, №5. С. 642-651.

17. Горюнова, С. В. Молекулярно-генетический анализ полиморфизма рода Aegilops L. : диссертация на соискание кандидата биологических наук : 03.00.15 Москва, 2005. 225 с.

18. Гостимский, С.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров Текст. / С.А. Гостимский, З.Г. Ко-каева, Ф.А. Коновалов.// Генетика. 2005. - т. 41. - №4. - С. 480-492.

19. Гречко, B.B. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики Текст. / В.В. Гречко //Генетика. 2002. - том 38. - №8. - С. 1013-1033.

20. Гриб, О.М. Наследование компонентного сотава гордеина у гибридов ячменя при различных типах скрещивания Текст. / О.М. Гриб//Сельскохозяйственная биология. 1984. - № 12. - С.29-32.

21. Еленевский, А. Г. Ботаника высших, или наземных растений: Учеб. для студ. высш. пед. учеб. заведений/ А.Г. Еленевский, М.П. Соловьёва, В.Н. Тихомиров. -М.: Издательский центр «Академия», 2000. 432с.

22. Ерёмин, Г.В. Общая и частная селекция и сортоведение плодовых и ягодных культур: учебник для вузов Текст. / Г.В. Ерёмин и [др].- М.: Мир, 2004. 422с.

23. Жученко, А. А. Адаптивная система селекции растений (экологические основы) / А. А. Жученко. М.: Изд-во РУДН, 2001. - Т. 1. - 780 с.

24. Зарубин, А.Н. Наличие вредителей на сортах черной смородины разного географического происхождения Текст. /А.Н. Зарубин, С.О. Некрасова // Состояние и перспективы селекции плодовых культур. Минск, 2001.-С .178181.

25. Зубов, A.A. Земляника Текст. /A.A. Зубов//Достижения селекции плодовых культур и винограда.-М.: Колос, 1983.- С.284-268.

26. Ивлев, В.А. Вирусная болезнь ягодников,- «Махровость» черной смородины Текст. /В.А. Ивлев // Садоводство, 1939. №7.- С. 34-39.

27. Ильин, B.C. Наследование признака устойчивости смородины черной к почковому клещу Текст. /B.C. Ильин // Вестник РАСХН, 2000.- № 2.- С.20-22.

28. Казаков, И.В. Ягодные культуры в Центральном регионе России Текст. /И.В. Казаков [и др.].- Брянск: Изд-во Брянской ГСХА, 2009.- 208 с.

29. Карлов, Г.И., Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами. Автореферат диссертации на соискание степени д.б.н., Москва, 2009, 24с.

30. Князев, С. Д. Достижения в селекции и основные направления совершенствования сортимента смородины чёрной во ВНИИСПК Текст. / С.Д. Князев, А.Ю. Андрианова// Достижения науки и техники АПК. 2010. - № 4. -С. И -13.

31. Князев, С.Д. 2004. Селекция смородины черной на современном этапе Текст. / С.Д. Князев, Т.П. Огольцова. Орел: Изд-во Всероссийского научно-исследовательского института селекции плодовых культур, 2004. - 238 с.

32. Князев, С.Д. Использование доноров олигогенной устойчивости к болезням и вредителям в селекции черной смородины Текст. / С.Д. Князев // Селекц.-генет.пробл.развития садоводства в сред.полосе европ.части России. Мичуринск, 1995. - С. 83-87.

33. Князев, С.Д. Устойчивость к почковому клещу актуальная проблема селекции смородины черной Текст. / С.Д. Князев// Молодые ученые - садоводству России. - М., 1995. - С. 56-59.

34. Конарев, A.B. Адаптивный характер молекулярного полиморфизма и его использование в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции Текст. /A.B. Конарев //Аграрная Россия. 2002. - №3. - С.4-11.

35. Конарев, В. Г. Белки растений как генетические маркеры Текст. /В.Г. Конарев / -М.: Колос, 1983. 320с.

36. Конарев, В.Г. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян Текст. / Под ред. Конарева В.Г.; ВИР СПб., 2000.- 186 с.

37. Кощеев, В.Г. Идентификация сортов и регистрация генофонда кульо белкам семян Текст. / Под ред. Конарева В.Г.; ВИР

38. Конарев, В.Г. Молекулярно-биологические исследования генофонда культурных растений в ВИРе, 1967-1997 гг. Текст. / В.Г. Конарев СПб, ВИР, 1998.-99с.

39. Конарев, В.Г. Молекулярно-биологические исследования генофонда растений в ВИРе (1967-2007гг.). Текст. / В.Г. Конарев. Издание 2-е дополненное (составители: Сидорова В.В., Конарев A.B.) - СПб.: ВИР, 2007. - 134с.

40. Копань, В.П. Адаптивная селекция черной смородины Текст. /В.П. Копань, И.М. Копань, Л.Д. Болдичева, О.М. Ярещенко.- Садовництво, 1998. -Вып. 47.- С. 64-69.

41. Корниенко, H.H. Идентификация сортообразцов гороха морфотипа ха-мелион и опредление степени внутрисортового полиморфизма по запасным белкам семян.: Автореферат. Канд.дис.Воронеж, 2006, 23с.

42. Кочиева, Е. 3. Геномный полиморфизм представителей сем. Solanaceae (род Solanum, род Lycopersicon, род Capsicum) : диссертация на соискание учёной степени доктора биологических наук : 03.00.15, 03.00.03 Москва, 2004

43. Кудрявцев, A.M. Маркер-опосредованная селекция растений Текст. / A.M. Кудрявцев// Молекулярная и прикладная генетика, сборник науч. трудов том 9, Минск-2009. С.28-33.

44. Лесневич, Л.А. Полипептиды US-глобулина в анализе подлинности сортов сахарной свёклы Текст. / Л.А. Лесневич, В.А. Борисюк// Физиология и биохимия культурных растений. 1993. т.25.- №2. - С.175-180

45. Малаева, Е. В. Молекулярный RAPD анализ геномного полиморфизма видов рода Actinidia Lindley, (сем. Actinidiaceae), произрастающих на территории России Текст. / Е.В. Малаева // Экологическая генетика. 2008.- т. VI. - №3. - С.11-17.

46. Мартиросян, Е.В. RAPD-анализ геномного полиморфизма у представителей семейства Lemnaceae (Рясковые) Текст. / Е.В. Мартиросян, H.H., Рыжова, К.Г. Скрябин, Е.З. Кочиева //Генетика. 2008. том 44. - №3. - С.1-5.

47. Назарюк, Н.И. Оценка новых алтайских сортов черной смородины в лесостепной зоне Алтайского края. Автореф. дис.канд. с.-х. наук.- Барнаул, 2000.- 16 с.

48. Общая биотехнология : учебник / сост.: Н. Е. Павловская и др. Орел: Изд-во ОрелГАУ, 2007. - 331 с.

49. Огольцова, Т.П. Селекция чёрной смородины прошлое, настоящее, будущее Текст. /Т.П. Огольцова. - Тула: Приок. кн. изд-во, 1992. - 384 с.

50. Павловская, Н.Е. Белковый комплекс зернобобовых культур и пути повышения его качества Текст. / Н.Е. Павловская [и др.] Орёл: Издательство1. ОрёлГАУ, 2003. 216с.

51. Павловская, Н.Е. Влияние сроков хранения на содержание запасных белков в семенах гречихи / Н.Е. Павловская, И.В. Горькова, Т.Н. Лазарева // Хранение и переработка сельхозсырья 2006. - № 3. - С. 12-15.

52. Павловская, Н.Е. Формирование полипептидного состава белков семянгороха и фасоли в процессе созревания Текст. / Н.Е. Павловская [и др.] //

53. Вестн. РАСХН, 2007; N 3. С. 39-41. \ О

54. Планк, Ван дер, Я. Устойчивость растений к болезням / Я. Ван дер Планк. М.: Колос, 1972. 254 с.

55. Плохинский H.A. Алгоритмы биометрии Текст. / H.A. Плохинский -М., 1980.- 150 с.

56. Поморцев, A.A. Полиморфизм гордеинов ячменя северной Африки Текст. / A.A. Поморцев, Б.А. Калабушкин, И.А. Терентьева //Генетика, 2002. том 38. - №11 - С.1498-1510.

57. Потокина, Е.К. Современные методы геномного анализа в исследованиях генетики количественных признаков у растений Текст. /Е.К. Потокина, Ю.В. Чесноков //Сельскохозяйственная биология.-2005.-№ 3.-C.3-18.

58. Пояркова, А.И. Род Ribes L. Текст./ А.И. Пояркова ////Флора СССР. /Сем. Камнеломковые Saxifragaceae. [Текст]/ Под ред. В.Л. Комарова.- М.-Л., изд-во АН СССР, 1939 - т. IX, стр. 244.

59. Приказ Минсельхоза РФ от 26 декабря 2007г. № 673 «Об утверждении перечня карантинных объектов».

60. Равкин, А. Черная смородина. Исходный материал, селекция, сорта. Текст. / А.Равкин. Московское общество испытателей природы: - М. Изд-во Московского университета, 1987. - 213 с.

61. Равкин, A.C. Селекция черной смородины на невосприимчивость и высокую устойчивость к почковому клещу и махровости Текст. / A.C. Равкин // Селекция и сортоизучение черной смородины.- Мичуринск, 1988.- С. 63-68.

62. Романова, О.В. Идентификация сортов косточковых культур с помощью ПНР -анализа : диссертация на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук : 06.01.07 Москва, 2007. 179с.

63. Романова, Ю.А. Исследование коллекции вида пшеницы Triticum spelta L. по полиморфизму глиадинов Текст. / Ю.А. Романова [и др.] // Генетика, 2001. т. 37. - №9. - С.1258-1265.

64. Сабитов, А.Ш. Полиморфизм и селекционное значение Ribes Pauciflo-rum Turcz. (смородина малоцветковая) в условиях дальнего востока России.: Автореферат. Канд.дис. С.-П., 1994, 21с.

65. Самигуллина, Н.С. 2006. Практикум по селекции и сортоведению плодовых и ягодных культур Текст./ Н.С. Самигуллина: Учебное издание,- Мичуринск: Издательство Мичуринского государственного университета, 2006. 197с.

66. Седов E.H. Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур Текст. / Под ред. Седова E.H.; Орел: Изд-во ВНИ-ИСПК, 1995.-502 с. у7

67. Сидорова, В.В. Идентификация эндоспермальных мутантов кукурузы по компонентному составу зеина Текст./ В.В. Сидорова, А.П. Подольская, Г.Е. Шмараев, В.Г. Конарев //Доклады ВАСХНИЛ. 1989. - №7. - С.5-8.

68. Созинов, A.A. генетические маркеры растений Текст./ A.A. Созинов // Цитология и генетика. 1993. - т.27. - №5. - С.3-11.

69. Сулимова, Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и область применения Текст./ Г.Е. Сулимова // электронный журнал лаборатории сравнительной генетики животных ИОГЕН им. Н.И.Вавилова, РАН, 2004. http://www.labsgj.by.ru

70. Супрун, И.И. Цитолого-генетическое изучение особенностей опыления иммунных и устойчивых к парше сортов яблони Текст./ И.И. Супрун, Е.В. Ульяновская, Я.В. Ушакова //Arpo XXI. 2010. №1-3. - С.27-28.

71. Урбанович, О.Ю. Молекулярные методы паспортизации сортов груши Текст./ О.Ю. Урбанович, A.A. Хацкевич, З.А. Козловская, H.A. Картель// Молекулярная и прикладная генетика, сборник науч. трудов, том 9, Минск-2009.-С.160-166.

72. Фадеева, Т.С. Генетика земляники Текст./ Т.С. Фадеева // Л.: Наука. -1975. 184 с.

73. Фарбер, С.П. Идентификация овощных крестоцветных по запасным белкам семян Текст./ С.П. Фарбер //Аграрная Россия. 2002. - №3. - С.59-62.

74. Фортэ, А. В. Технология RAPD анализа генотипов яблони Текст./ A.B. Фортэ, Д.Б. Дорохов, Н.И. Савельев. методические указания. - Мичуринск, 2002.-26с.

75. Фортэ, A.B. Применение ДНК маркеров для оценки генетического полиморфизма яблони Текст./ A.B. Фортэ, Н.И. Савельев, Д.Б. Дорохов Мичуринск, 2004. - 112с.

76. Хавкин, Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных сортов Текст./ Э. Е. Хавкин //Сельскохозяйственная биология. 2003. - № 3. - С.26-41.

77. Хемлебен, В. Сателлитные ДНК Текст./ В. Хемлебен //Успехи биологической химии. т.43. - 2003. - С.267 —306.

78. Чесноков, Ю. В. ДНК фингерпринтинг и анализ генетического разнообразия у растений Текст./ Ю.В. Чесноков // С.-х. биол. - 2005. - № 1. - С.20-40.

79. Шаманская, Л.Д. Особенности биоэкологии и вредоносности смородинного клеща в Алтайском крае Текст./ Л.Д. Шаманская // Новейшие достижения с.-х. энтомологии.- Вильнюс, 1981.- С.200-202.

80. Эфрон, Б. Нетрадиционные методы многомерного статистического анализа. Текст./ Б. Эфрон М.: Финансы и статистика, 1988.- 263 с.

81. Afimiana, М. R. Linkage of Vfa4 in Malus x domestica and Malus floribunda with Vf resistance to the apple scab pathogen Venturia inaequalis Текст./ M.R. Afuniana, P. H. Goodwina and D. M. Hunter.// Plant Pathology. 2004. -V.53. -P.461-467.

82. Anderson, M.M. Resistance to gall mite (Phytoptus ribes Nal.) in the Eucor-cosma section of Ribes Текст./ M.M. Anderson // Euphytica. 1971. - V.20. -P.422-426. , .

83. Aranzana, M.J. A set of simple-sequence repeat (SSR) markers covering the Prunus genome Текст./ M.J. Aranzana, A. Pineda et al.// Theor Appl Genet. -2003. -V.106. P.819-825.

84. Arús P. High Marker Density around the Peach Nematode Resistance Genes Текст./ P. Arus, M. Mnejja et al.//Acta Hort. 2004. - V.658. - P.567-571.

85. Ashley, M. V. High subsp.iability and disomic segregation of microsatellites in the octoploid Fragaria virginiana Mill. (Rosaceae) Текст./ M.V. Ashley, J. A. Wilk et al.// Theor Appl Genet. 2003. - V.107. P.1201-1207.

86. Bagga, H. S. Genes in Venturia inaequalis controlling pathogenicity to с rabapples Текст./ H.S. Bagga, D.M. Boone //Phytopathology. 1968. - V.58. -P.l 176-1182.

87. Baldi, P. Cloning and linkage mapping of resistance gene homologues in apple Текст./ P. Baldi, A. Patocchi et al. // Theor Appl Genet. 2004. - V.109. -P.231-239.

88. Belfanti, E. The HcrVf2 gene from a wild apple confers scab resistance to a transgenic cultivated subsp.iety Текст./ E. Belfanti, E. Silfverberg et ah II PNAS.- 2004. V. 101.- N. 3. - P. 886-890.

89. Bellini, E. Genetic relationships in Japanese plum cultisubsp.s by molecular markers Текст./Е. Bellini, E. Giordani, V. Nencetti, D. Paffetti // Acta Hort. -1998. V.478. - P.53-59.

90. Berger, A. A taxonomic review of currants and gooseberries Текст./ A. Berger // NewYork Agric. Exp. Sta. Techn. Bull. 1924. - V. 109. - C. 1-118.

91. Boone, D. M. Venturia inaequalis (Cke.) Wint. XII. Genes controlling pathogenicity of wild-type lines Текст./ D.M. Boone, G.W. Keitt //Phytopathology.- 1957. V.47. - P.403-409.

92. Botstein, D. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms Текст./ D. Botstein, R.L. White, M. Skolnick, R. V. Davis // Amer. J. Hum. Genet. 1980. - V.32. - P.314-331.

93. Bremer, B. An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III Текст./ В. Bremer, К. Bremer et al. // Botanical Journal of the Linnean Society. 2009. - V.161. - P.105-121.

94. Brennan, R. The development of a ПЦР-based marker linked to resistance to the blackcurrant gall mite ( Cecidophyopsis ribis Acari: Eriophyidae) Текст./ R. Brennan, L. Jorgensen et al. // Teoretical and Applied Genetics. 2009. - V. 118.-P. 205-211.

95. Brennan, R.M., 2008. Currants and Gooseberries Текст./ R. M. Brennan // Temperate Fruit Crop Breeding/ Ed. Hancock J.F., Springer Science+Business Media.-P.177-196.

96. Brennan, R. Future perspectives in blackcurrant breeding Текст./ R. Brennan, L. Jorgensen, M. Woodhead and J. Russell // Acta Hortic. 2002. -V.585. -P.39-45.

97. Bringhurst, R. S. Cytogenetics and evolution in American FragariaTeKCT./ R. S. Bringhurst // Hortscience. 1990. - V.25. - P.879-881.

98. Burnes, T.D. Black Currant Clonal Identity and White Pine Blister Rust Resistance Текст./ T.D. Burnes and R. A. Blanchette // Hortscience. 2008. - V. 43. -N.l.-P. 200-202.

99. Bus,V. G. M. Genome mapping of three major resistance genes to woolly apple aphid (Eriosoma lanigerum Hausm.) Текст./ V. G. M. Bus et al. // Tree Genetics & Genomes. 2008. - V.4. - P.233-236.

100. Bus, V. An Update on Apple Scab Resistance Breeding in New Zealand Текст./ Bus, V. Allan White et al.// Proc. IS on Apple Scab Eds. A. Bergamini et al. Acta Hort. - 2002. - V.595.- P.43-47.

101. Cevik, V. High-resolution genetic analysis of the Sd-1 aphid resistance locus in Malusspp Текст./ V. Cevik, G.J. King // Theor Appl Genet. 2002,- V.105. -P.346-354.

102. Cipriani, G. A new set of microsatellite markers for Fragaria species and their application in linkage analysis Текст./ G. Cipriani, F. Pinosa //Journal of Horticultural Science & Biotechnology. 2006. - V. 81. - N. 4. - P. 668-675.

103. Cipriani, G. Isolation and characterization of microsatellite loci in Fragaria Текст./ G. Cipriani and R. Testolin // Molecular Ecology Notes. 2004. - V.4. -P.366-368.

104. Colton, L. M. Marker-Assisted Selection for the Broad-Spectrum Potato Late Blight ResistanceConferred by Gene RB Derived from a Wild Potato Species Текст./ L. M Colton, H.I. Groza, S. M.Wielgus and J. Jiming // Crop Sci. 2006. - V.46. - P.589-594.

105. Coville, F.V. Grossulariaceae Текст./ F.V. Coville and N.L. Britton // North American Flora. 1908. - V.22. - P. 193-225.

106. Cronquist, A. The Evolution and Classification of Flowering Plants Текст./ A. Cronquist New York.: The New York Botanical Garden, - 1988. - 555p.

107. Dayanandan, S. Conservation of microsatellites among tropical trees (Le-guminosae) Текст./ S. Dayanandan, K. Bawa, R. Kesseli //American Journal of Botany. 1997.- V.84-P.1658-1663.

108. Dirlewanger, E. Comparative mapping and marker assisted selection in Ro-saceae fruit cropsTeKCT./ E. Dirlewanger, E. Graziano et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - V.l01 - P.9891 -9896.

109. Doyle, J. J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Текст./ J.J. Doyle and J. L. Doyle // Phytochemical bulletin. 1987. V.19 -P.l 1-15. http://irc.igd.cornell.edu/Protocols/DoyleProtocol.pdf

110. Dunemann, F. Identification of molecular markers for the major mildew resistance gene Pl2 in apple Текст./ F. Dunemann, G. Bracker, T.Markussen, P. Roche // Acta Hort. 1999. V.484 - P.411-416.

111. Edwards, R. Glutathione and elicitation of the phytoalexin response in legume cell cultures Текст./ R. Edwards, J.W. Blount, R.A. Dixon // Planta. 1991.- V.l84. P.403-409.

112. Ellis, M.A. Using fungicides to control strawberry fruit rots in matted row production in Ohio Текст./ M.A. Ellis // Massachusetts Berry Notes. 2008. - V. 20 - N.8 -P.2-5.

113. Esmenjauda, D. Resistance to Root Knot Nematodes in Prunus: Characterization of Sources, Marker-Assisted Selection and Cloning Strategy for the Ma Gene from Myrobalan Plum Текст./0. Esmenjauda // Acta Hort. 2009. - V.814- P.707-714.

114. Flor, H.H. Current status of the gene-for-gene concept Текст./ H.H. Flor //Annu. Rev. Phytopathol. 1971. - V.9 - P.275-296.

115. Francia, E. Marker assisted selection in crop plants Текст./ E. Francia, G. Tacconi et al.// Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2005. - V.82. - P.317-342.

116. Fresh strawberry/World production and market/USA market report/19942003 A publication by Today's market prices.-2004. 21p. http://www.todaymarket.com/samples/rpte.pdf

117. Genomics-Assisted Crop Improvement. Vol 2: Genomics Applications in Crops. Текст./ Subsp.shney, Rajeev K.; Tuberosa, Roberto (Eds.) 2007. - 509p.

118. Grodzicker, T. Physical mapping of temperature-sensitive mutations of adenoviruses Текст./ Т. Grodzicker, J. Williams, P. Sharp, J.Sambrook // Cold Spring

119. Harb Symp Quant Biol. 1975. - V.39 - P.439-446.buerin, G. Development of a1

120. SCAR marker linked to dominant gene conferring resistance to ColletotRich.um acutatum in strawberry (Fragaria x ananassa) Текст./ G. Guerin, F. Laigret //Acta Hort. 2003. - V.636 - P.85-90.

121. Guilford, P.S. Microsatellites in Malus X domestica (apple): abundance, polymorphism and cultisubsp. identification Текст./ P.S. Guilford, J. M. Prakash et al. //Theor Appl Genet. 1997. - V.94 - P.249-254.

122. Gygax, M. L. A PatocchiMolecular markers linked to the apple scab resistance gene Vbj derived from Malus baccata jackii Текст./ M. L. Gygax, R. Gian-franceschi et al. // Theor Appl Genet. 2004. - V.109 - P. 1702-1709.

123. Hadonou, M. Characterisation of Fragaria vesca Single Sequence Repeats (SSR) Markers Текст./ M. Hadonou, D. Sargent, R. Walden and D. Simpson // Molecular Ecology Notes. 2003. - V.3 - P.171-173.

124. Hadonou M. 2004. Development of microsatellite markers in Fragaria, their use in genetic diversity analysis, and their potential for genetic linkage mapping Текст./ M. Hadonou, D. Sargent, R. Walden and D. Simpson // Genome. V.47. -P.429-438.

125. Hash, C.T. Opportunities for marker-assisted selection (MAS) to improve the feed quality of crop residues in pearl millet and sorghum Текст./ C.T. Hash, A.G. Bhasker et al. // Field Crops Research. 2003 - V.84. P.79-88.

126. Hash, C.T. Pearl Millet Molecular Marker Research Текст./ C.T. Hash, R. S. Yadav // PSP Annual Report 2003. Section 1: Introduction and General Overview. Research Outcomes. Edited by Dr C. Stirling, 2004 - P.35-41.

127. Haymes, K.M. Identification of RAPD markers linked to a Phytophthora fragariae resistance gene (Rpfl) in the cultivated strawberry Текст./ K.M. Haymes, B. Henken, T.M. Davis and W.E. Van de Weg // Theor. Appl. Genet. -1997.-V.94-P.097-1101.

128. Hemmat, M. Identification and Mapping of Markers for Resistance to Apple Scab from 'Antonovka' and 'Hansen's baccata Текст./ M. Hemmat, K. Susan et al. // Acta Hort. 2003. - V.622 - P. 153-161.

129. Henry, R.J. Plant genotyping: the DNA fingerprinting of plants. Текст./ edited by R.J. Henry CABI publishing, - T.l. - 2001. - P.325.

130. Hummer, К. E. Currants: Comprehensive Crop Report Текст./ К. E. Hummer and D. Barney // HortTechnology. 2002. - V.12. - N.3 - P.377-387.

131. James, C.M. Identification of Molecular Markers Linked to the Mildew Resistance Genes Pl-d and Pl-w in Apple Текст./ C.M. James and K.M. Evans // ISHS Acta Horticulturae, XI Eucarpia Symposium on Fruit Breeding and Genetics. -2004.-V.663 -P.123-128.

132. Jancz^ewski, E. Monograph of the currants Ribes L. E. Текст./ Jancz.ewski //Mem. Soc. Phys. Hist. Nat. Geneve. 1907. V.35 - P. 199-517.

133. Jena, К. K. Molecular Markers and Their Use in Marker-Assisted Selection in Rice Текст./ К. К. Jena and D. J. Mackill // CROP SCIENCE. 2008. - V.48 -P.1266-1276.

134. Jones, C.J. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories Текст./ C.J., Jones, K.J. Edwards et al. // Molecular Breeding. 1997. - V.3 - N.5 - P. 381-390.

135. Jones, J.D, G. The plant immune system Текст./ J.D. Jones & J.L. Dangl //Nature. 2006. - V.444. - P.323-329.

136. Joshi, S. P. Molecular markers in plant genome analysis Текст./ S. P. Joshi, K. R. Prabhakar and S. G. Vidya // Plant Molecular Biology. 1999. - V.77 - P. 230-240.

137. Keep, E. Interspecific hybridization in Ribes Текст./ E. Keep // Genetica. -1962.-V. 33 №1 - P.l-23.

138. Keller-Przybylkowicz, S. RAPD and ISSR markers of black and green colour of blackcurrant (Ribes nigrum) fruits Текст./ S. Keller-Przybylkowicz, M. Korbin and J. Gwozdec // Journal of Fruit and Ornamental Plant Research. 2006. - V.14 - P.45-52.

139. Keniry, A. Identification and characterization of simple sequence repeat (SSR) markers from Fragariaxananassa expressed sequences Текст./ A. Keniry, J. Clare // Molecular Ecology Notes. 2006. - V.6 -1.2 - P.319-322.

140. King, G.J. Introgression of the Vf source of scab resistance and distribution of linked marker alleles within the Malus gene pool Текст./ G.J. King, S. Tartari-ni et al. // Theor Appl Genet. 1999. - V.99 -P. 1039-1046.

141. Knight, R.L. Transference of resistance to black currant gall mite Cecidophyopsis ribis from gooseberry to black currant Текст./ R.L. Knight, E. Keep, J.B. Briggs, J. Parker // Ann. Appl. Biol. -1974. -V.76 P.123-130.

142. Komarov, V. L. Flora of the (former) USSR Текст./ V. L. Komarov / In: Ribesioideae Engl. (Translated from the Russian by the Israel Program for Scientific Translation, Jerusalem). Keter, London, -1971. V.IX - P. 175-208.

143. Korban, S. S. Apple Structural Genomics Текст./ S. S. Korban and S. Tar-tarini //Genetics and Genomics of Rosaceae Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. 2009. - V.6 - P.I - P.85-119.

144. Lanham, P. RAPD fingerprinting of blackcurrant (Ribes nigrum L.) culti-subsp. Текст./ P. G. Lanham, R. M. Brennan et al. // Theor Appl genet. 1995. -V. 90. - P.166-172.

145. Lanham, P. Genetic diversity within a secondary gene pool for Ribes nigrum L. revealed by RAPD and ISSR markers Текст./ P. Lanham, A. Korycinska and R. Brennan // Journal of horticultural Science & Biotechnology. 2000. - V. 75. -N.4. - P.371-375.

146. Lanham, P.G. Genetic diversity in Ribes Текст./ P. G. Lanham, R. M. Brennan //Acta Hort. 2001. - V.546. - P. 135-137.

147. Lanham, P.G. Genetic characterization of gooseberry (Ribes grossularia subgenus Grossularia) germplasm using RAPD, ISSR and AFLP markers Текст./ P. G. Lanham, R. M. Brennan // J. hortic. Sci. and Biotechnol. -1999. V.74 -P.361-366.

148. Lecouls, A. C. RAPD and SCAR markers linked to the Mai root-knot nematode resistance gene in Myrobalan plum (Prunus cerasifera Ehr.) Текст./ A.C. Lecouls, M. J. Rubio-Cabetas et al. // Theor Appl Genet. 1999. Y.99 - P.328-335.

149. Liebhard, R. Mapping Quantitative Field Resistance against Apple Scab in a 'Fiesta' x 'Discovery' Progeny Текст./ R. Liebhard, B. Roller et al. // The American Phytopathological Society. 2003. V. 93 - N.4 - P.493-501.

150. Linden, C. G. Efficient targeting of plant disease resistance loci using NBS profiling Текст./ С. G. Linden, D.C. Wouters et al.// Theor Appl Genet. 2004. -V.109 - P.384-393.

151. Maas, J.L. Resistance in strawberry to races of Phytophthora fragariae and to isolates of Verticillium from North America Текст./ J.L. Maas, G.J. Galletta and A.D. Draper //Acta Hort. 1989. - V.265 - P.521-526.

152. Mackill, D. J. Molecular mapping and marker assisted selection for majorgene traits in rice Текст./ D. J. Mackill & J. Ni // In Proc.Fourth Int. Rice Genetics Symp. (eds G. S. Khush, D. S. Brar& B. Hardy), 2000. - P.l37-151.

153. Marker-assisted selection: current status and future perspectives in crops, livestock, forestry and Fisch // Food and Agriculture Organization of the United Nations. Edited by Elcio P. Guimaraes. 2007.- 471p.

154. McDermott, J.M. Genetic subsp.iation in powdery mildew of barley: development of RAPD, SCAR, and VNTR markers Текст./ J.M. McDermott, U. Brandie et al. // Phytopathology. 1994. - V.84 - N. 11 - P.1316-1321.

155. Messinger, W. Ribes phylogeny as indicated by restriction-site polymorphisms of PCR-amplified chloroplast DNA Текст./ W. Messinger, A: Listón and K. Hummer // Plant Systematics and Evolution. 1999. - V.217 - P. 185-195.

156. Mitre, I. Genotypic Subsp.iability of he Main pple Cultisubsp.s Grown in Transylvania, omania, valuated by eans of APD nalysis Текст./1. Mitre, L. Lu-kacs et al. // Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca. 2009. - V.37 -N.1-P.261-264.

157. Moseman, J. G. Host-parasite interactions between culture 12A1 of the powdery mildew fungus and the MIt and Mig genes in barley Текст./ J. G. Moseman // Phytopathology. 1957. - V.47 - P.453 (Abstr.).

158. Nourse, S.M. Development of simple sequence repeat (SSR) molecular markers in strawberry Текст./ S.M. Nourse, E.W. Fickus, P.B. Cregan and S.C.

159. Parikka, P. Tracing latent infection of ColletotRich.um acutatum on strawberry by PCR Текст./ P. Parikka, A. Lemmetty // Eur J Plant Pathology. 2004. -V.110-P.393-398.

160. Patocchi, A. Vr2: a new apple scab resistance gene Текст./ A. Patocchi, B. Bigler et al. // Theor Appl Genet. 2004. - V. 109 - P. 1087-1092.

161. Patocchi, A. Identification by genome scanning approach (GSA) of a microsatellite tightly associated with the apple scab resistance gene Vm Текст./ A. Patocchi, M. Walser et al. // Genome. 2005. - V.48 - P.630-636.

162. Peer, Van de Y. TREECON for Windows: A software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment Текст./ Van de Y. Peer,R.D. Wachter // Comput. Appl. Biosci. 1994. -V. 10. - P.569-570.

163. Plant biotechnology: the genetic manipulation of plants/ A. Slater, N. Scott & M. Fowler.-2nd ed.Oxford University Press Inc., New York. 2008. Pp.376.

164. Puchooa D., 2004. A simple, rapid and efficient method for the extraction of genomic DNA from lychee (Litchinensis Sonn) Текст./ //African Jornal of Biotechnology .April. Vol. 3. N. 4. P. 253-255.

165. Rehder A., 1954. Manual of cultivated trees and shrubs. Toronto.: MacMil-lan and Co. 999pp.

166. Ribaut Jean-Marcel and Michel Ragot. Marker-assisted selection to improve drought adaptation in maize: the backcross approach, perspectives, limitations, and alternatives Текст./ // Journal of Experimental Botany, Vol. 58, No. 2, pp. 351— 360, 2007.

167. Sahasrabudhe, A. and M. Deodhar, 2010. Standardization of DNA etraction and otimization of RAPD-PCR cnditions in cinia indicaTeKCT./ // Int. J. Bot., 6: 293-298.

168. SARGENT D .J ., HADONOU A .M. and D.W.SIMPSON Development and characterization of polymorphic microsatellite markers from Fragaria viridis , a wild diploid strawberry Текст./ //Molecular Ecology Notes (2003)3 ,550 -552

169. Sargent D. J., Т. M. Davis, K. R. Tobutt, M. J. Wilkinson, N. H. Battey, D. W. Simpson. A genetic linkage map of microsatellite, gene-specific and morphological markers in diploid Fragaria Текст./ // Theor Appl Genet (2004) 109: 1385-1391.

170. Schuelke Markus An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments Текст./ // NATURE BIOTECHNOLOGY VOL 18 FEBRUARY 2000 p.233-234 , • „ „

171. Schultheis L.M., Donoghue M.J., 2004. Molecular phylogeny and biogeo-graphy of Ribes (Grossularia) with an emphasis of gooseberry (subg. Grossularia) Текст./ // Systematic Botany. Vol. 29. N. 1. P. 77-96.

172. Scott, D.H., J.L. Maas, and A.D. Draper. 1975. Screening strawberries for resistance to Phytophthora fragariae with single versus a composite of races of the fungus Текст./ // Plant Dis. Rpt. 59:207-209.

173. Senters A. E. and Soltis D.E., 2003. Phylogenetic relationships in Ribes (Grossulariaceae) inferred from ITS sequence data// TAXON. Vol. 52. P. 51-66.

174. Senthilkumaran, R., I. S. Bisht, К. V. Bhat, J. C. Rana. Diversity in buckwheat (Fagopyrum spp.) landrace populations from north-western Indian Himalayas Текст./ // Genet Resour Crop Evol. 2008. V.55. p.287-302.

175. Sinnott Q.P., 1985. A revision of Ribes L. subg. Grossularia (Mill.) per. Sect. Grossularia (Mill.) Nutt. (Grossulariaceae) in North America Текст./ // Rho-dora. Vol.87. P. 189-286.

176. Spigler RB, KS Lewers, DS Main and T-L Ashman. Genetic mapping of sex determination in a wild strawberry, Fragaria virginiana, reveals earliest form of sex chromosome Текст.///Heredity (2008), 101(6):507-17.

177. Strawberry situation and outlook for selected countries Текст./ //World horticultural trade & U.S. export opportunities. 2006. P.l-8.

178. Sureeporn Kate-ngam and Padcharee Lakote. 2008. A comparative study of different RAPD-PCR protocols for genetic diversity analysis of Doritis germplasm Текст.///Agricultural Sci. J. V.39.N.3.P.203-206.

179. Tartarini S. Marker-assisted selection in pome fruit breeding Текст./ // ISHS Acta Horticulturae 622: XXVI International Horticultural Congress: Genetics and Breeding of Tree Fruits and Nuts p.23-28 1999.

180. Thomas T.A. and Tanksley S.D. A rapid and inexpensive method for isolation of total DNA from dehydrated plant tissue Текст./ //Plant molecular biology report 8, p.297-303.

181. Treuren R van, Kuittinen H, Karkkainen K, Baena-Gonzalez E, Savolainen О (1997) Evolution of microsatellites in Arabis petraea and Arabis lyrata, outcrossing relatives of Arabidopsis thalianaTeKCT./ // Mol Biol Evol 14:220-229

182. Urbanovich Oksana, Zoya Kazlovskaya. Identification of scab resistance genes in apple trees by molecular markers Текст./ // Scientific works of the LI

183. THUANIAN INSTITUTE OF HORTICULTURE and LITHUANIAN UNIVERSITY OF AGRICULTURE. SODININKYSTE in DARZININKYSTE. 2008. 27(2).pp.347-357.

184. Van de Weg, W.E. 1997. A gene-for-gene model to explain interactions between cultisubsp.s of strawberry and races of Phytophthora fragariae subsp. fraga-riae Текст./ // Theor. Appl. Genet. 94:445-451.

185. VIRUEL M. ANGELES, Daniel Sánchez, Pere Arús. AN SSR AND RFLP LINKAGE MAP FOR THE OCTOPLOID STRAWBERRY (Fragaria x ananassa) Текст./ // Plant, Animal & Microbe Genomes X Conference, 2002. http://www.intl-pag.org/10/abstracts/PAGXP660.html

186. Weg, W.E. van de, 1997a. A gene-for-gene model to explain interactions between cultisubsp.s of strawberry and races of Phytophtora fragariae subsp. fraga-riae Текст.///Theoretical and Applied Genetics 94:445-451.

187. Weg, W.E. van de. Genes for and molecular markers linked with resistance to Phytophtora fragariae in strawberry Текст./ W.E. van de Weg, B. Henken et al. // Acta Hort. 1997. - V.2 - P.839-843. (c)

188. Weigend, M. Grossulariaceae Текст./ M. Weigend // In Kubitzki K., Bayer C., Stevens (Eds) The Families and Genera of Vascular Plants: IX Flowering plants. Eudiocots. -2007. P.168-176.

189. Werner, H. Comparative mapping and marker-assisted selection in Rosaceae fruit crops Текст./ H. Werner and P. Arus // PNAS, 2004. - V. 101 - N. 26. -P.9891-9896.

190. Whitton, J. Microsatellite loci are not conserved across the Asteraceae Текст./ J. Whitton, L.H. Rieseberg and M.C. Ungerer // Mol Biol Evol. -1997. V.14 -P.204-209. v ,

191. Witcombe, J.R. Resistance gene deployment strategies in cereal hybrids using marker-assisted selection: Gene pyramiding, three-way hybrids, and synthetic parent populations Текст./ J.R. Witcombe & C.T. Hash // Euphytica. 2000. V.l 12 -P.175-186.

192. Xu, Y. Marker-Assisted Selection in Plant Breeding: From Publications to Practice Текст./ Y. Xu and J. H. Crouch // CROP SCIENCE. 2008. - V.48 -V.391 - P.391-407.

193. Yan, Z. Construction of an integrated map of rose with AFLP, SSR, PK, RGA, RFLP, SCAR and morphological markers Текст./ Z. Yan, C. Denneboom et al. // Theor Appl Genet. 2005. - V.l 10 P.766-777.

194. You, M. A PCR-based molecular marker applicable for marker-assisted selection for anthracnose disease resistance in lupin breeding Текст./ M. You, J. G. Boersma et al. // Cellular & Molecular Biology Letters. 2005. V.10 - P. 123 -134.

195. Young, N.D., Tanksley, S.D. Restriction Fragment Length Polymorphism. Maps and the Concept of Graphical Genotypes. // TheorAppl Genet. 1989. V.77 -P.95-101.

196. Zeinalabedini, M. Comparison of the use of morphological, protein and DNA markers in the genetic characterization of Iranian wild Prunus species Текст./ M. Zeinalabedini, K. Majourhat et al. //Scientia Horticulturae. 2008. -V.116-P.80-88.

197. Zhang, H. Genetic relationships among 17 bramble cultisubsp.s and 11 wild excellent Rubus germplasms from china revealed be RAPD Текст./ H. Zhang, X. Wang et al.//Agricultural Journal. 2009. - V.4 -N.4. - P. 179-183.

198. Zhang, X. Development of SCAR markers linked to self-incompatibility in Brassica napus L. Текст./ X. Zhang, M. Chaozhi et al. // Mol Breeding. 2008. -V.21 -P.305-315.

199. Zharkikh, A. Statistical properties of boot-strap estimation of phylogenetic subsp.iability from nucleotide sequences. I. Four taxa with a molecular clock Текст./ A. Zharkikh and W. H. Li // Mol. Biol.Evol. 1992. V.9 - P. 1119-1147.