Разработка и использование молекулярных маркеров на основе ПЦР-метода в селекции клевера лугового

Клименко, Ирина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Разработка и использование молекулярных маркеров на основе ПЦР-метода в селекции клевера лугового
ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Разработка и использование молекулярных маркеров на основе ПЦР-метода в селекции клевера лугового"

На правах рукописи

КЛИМЕНКО Ирина Александровна

РАЗРАБОТКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ НА ОСНОВЕ ПЦР-МЕТОДА В СЕЛЕКЦИИ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО (Trifolium pratense L.)

Специальность 06.01,05 - селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Москва 2004

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт кормов имени В.Р. Вильямса» в 1999-2003 гг.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Ивашута Сергей Иванович

Официальные оппоненты:

доктор сельскохозяйственных наук Новоселов Михаил Юрьевич кандидат биологических наук Долгих Юлия Ивановна

Ведущая организация - Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса.

Автореферат разослан 2004 г,

Ученый секретарь диссертационного совета

Трофимова Л.С.

гот

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Клевер луговой, в силу своей биологической природы, является одним из труднейших объектов селекции. Он имеет многолетний цикл развития, высокую гетерогенность внутри вида и в отдельных его популяциях, перекрестный энтомофильный тип опыления и существенную зависимость экспрессии основных признаков и свойств от условий внешней среды. Все это снижает точность оценки исходного материала, эффективность отбора и увеличивает сроки селекционных программ, материальные и финансовые затраты. Поэтому разработка и применение новых методов селекции клевера, позволяющих проводить ускоренный анализ непосредственно на уровне ДНК, в сочетании с огромным опытом селекционной работы с этой культурой (Навалихина, 1977; Новоселова, 1986; Новоселов, 1999), может значительно повысить эффективность селекции, открывает новые возможности для создания высокоурожайных форм и сортов, устойчивых к болезням и вредителям.

В настоящее время широкое распространение приобретает метод использования ДНК-технологий, в частности, PCR-анализ, основанный на амплификации ДНК. Метод достаточно прост, обладает большой чувствительностью и дает быстрые результаты. Молекулярные маркеры, генерируемые с помощью полимеразной цепной реакции (PCR), позволяют оценить генетическое разнообразие исходного материала, классифицировать селекционные формы, маркировать гены хозяйственно важных признаков, картировать геномы.

Однако исследования по разработке молекулярных маркёров и применению их в селекции кормовых культур стали появляться только в последние годы. Они немногочисленны, охватывают не все виды растений, условия ДНК-анализа, в большинстве случаев, нуждаются в оптимизации. К началу нашей работы в отечественных и зарубежных источниках литературы не встречались данные о применении ДНК-маркеров (на основе PCR- и RFLP-методов) для исследований клевера лугового. Поэтому разработка системного подхода к ДНК-анализу этой культуры и применение результатов в селекционных программах является актуальной научной задачей.

Целью настоящей работы являлось определение оптимальных

условий молекулярно-биологических методик исследований для клевера лугового; изучение использования ДНК-маркеров для оценки генетического полиморфизма и маркирования селекционно-ценных признаков, а также выделение новых источников для практической селекции.

В задачи исследований входило:

1. Изучить экспериментальную гибридную популяцию клевера лугового ГП-27 по основным морфобиологическим показателям. 2. Определить возможность и условия использования метода клонального

микроразмножения для обеспечения максимального <

огдавашшонлльНАЯ |

БИБЛИОТЕКА {

---—

исходного генетического материала клевера лугового.

3. Установить оптимальные условия выделения ДНК из растительной ткани клевера и наилучшие параметры амплификации ДНК.

4. Провести сравнительный анализ применения различных систем молекулярного маркирования для оценки ДНК-полиморфизма в популяции клевера ГП-27.

4. Оценить возможность использования полученных ДНК-маркеров в создании генетической карты клевера лугового.

5. Провести анализ косегрегации ДНК-маркеров с фенотипическими характеристиками для выявления локусов генов хозяйственно ценных признаков клевера лугового.

6. Выделить новые селекционные источники.

Научная новизна результатов исследований. Впервые показана принципиальная возможность применения ряда ДНК-технологий для генетического анализа клевера лугового.

Определены оптимальные условия выделения ДНК, параметры амплификации и состав реакционной смеси для полимеразной цепной реакции применительно к культуре клевера лугового. Изучены возможности и перспективы использования различных систем молекулярного маркирования для выявления внутрипопуляционного полиморфизма в экспериментальной клеверной популяции.

Разработан способ повышения надежности RAPD-маркеров, позволяющий улучшить воспроизводимость и стабильность результатов RAPD-анализа.

На основе проведенных исследований, в совместном проекте со специалистами Японии (NARCH), разработана первая генетическая карта клевера лугового; результаты STS- и RAPD- маркирования использованы для насыщения базовой карты дополнительными маркерами.

Практическая ценность работы. Определен способ и условия сохранения и поддержания гетерогенного исходного материала для обеспечения непрерывности и воспроизводимости молекулярно-биологических исследований.

Выделены 8 RAPD и 3 STS-генетических маркеров; показана принципиальная возможность ДНК-маркирования хозяйственно ценных признаков клевера лугового для повышения эффективности и ускорения селекционного процесса.

На основе выявленной связи полученных генетических маркеров с фенотипическими проявлениями устойчивости растений в популяции ГП-27 установлены 7 локусов устойчивости к склеротиниозу и зимостойкости, размещенных на базовой генетической карте клевера лугового.

В результате изучения исходной популяции клевера в различных условиях по основным морфобиологическим показателям выделены новые источники хозяйственно-ценных признаков: зимостойкости, раннеспелости - и устойчивости к склеротиниозу для использования в селекционной практике.

Апробация результатов исследований. Основные положения диссертационной работы были доложены на Международной конференции Functional Genomics and Breeding Strategies for Cold tolerance in Plants (Sapporo, Japan, 2003); на 5 Международном Симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2003); на научной генетической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения А. Р. Жебрака (Московская Сельскохозяйственная Академия им. Тимирязева, 2002), на ежегодных отчетах научно-технического совета селекцентра ВНИИ кормов в 2000-2003 годах.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов и предложений селекционной практике. Содержит 10 таблиц, 22 рисунка и 7 приложений. Список литературы включает 180 наименований, из них 113 — зарубежных изданий.

2. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили в лабораториях геномного анализа и биотехнологии ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса, в лаборатории селекции кормовых бобовых трав Хоккайдского Национального Центра сельскохозяйственных исследований - NARCH (Япония) и на опьнных полях ВНИИ кормов и NARCH в период с 1999 по 2003 годы по общей схеме, представленной на рис. 1.

Основным объектом исследований являлась гибридная популяция клевера лугового ГЛ-27, созданная сотрудниками отдела генофонда ВНИИ кормов, путём скрещивания диплоидной белоцветковой формы WF1680, выделенной из сорта Среднерусский (материнское растение), и гибрида 272 с розовой окраской соцветий, происхождением из дикорастущих клеверов Архангельской области. Популяция включала 167 растений F2.

Полевые опыты проводили на экспериментальных полях ВНИИ кормов в 2002-2003 годах по оценке зимостойкости отдельных генотипов клеверной популяции и устойчивости к склеротиниозу на естественном фоне заражения. На полях Хоккайдского Центра сельскохозяйственных исследований в Саппоро изучены особенности сроков цветения генотипов популяции ГП-27 и показатели зимостойкости в 2001-2002 г.

В селекционно-тепличном комплексе ВНИИ кормов экспериментальные растения выращивали в зимний период при температуре 18оС, фотопериоде 15 часов и освещенности 18 тыс. люкс. В летний период - в условиях открытой вегетационной площадки.

Рис. 1. Схема исследований по применению ДНК-технологий в селекции клевера лугового.

Морфобиологические признаки растений оценивали в соответствии с рекомендациями «Международного классификатора рода Trifolium L.» (Ленинград, 1983) и «Методическими указаниями по селекции и первичному семеноводству клевера» (2002).

Микроразмножение осуществляли для максимального сохранения и поддержания исходных генотипов на весь период исследований в соответствии с «Методическими указаниями по регенерации и размножению клевера лугового в культуре in vitro» (Мезенцев, Любавина, 1983).

Геномную ДНК выделяли из листовой ткани клевера с помощью модифицированных методов: СТАВ-экстракции ДНК (Doyle et al., 1990) и экспресс-метода Эдвардса (Edwards et al., 1991).

Молекулярно-биологические процедуры проводили по стандартным методикам (Маниатис, 1983; Williams et al., 1990; Sambrook and Russel, 2001). Для идентификации ДНК-полиморфизма использовали коммерческие рандомные праймеры фирмы «Operon Technologies» (Alameda, Calif., USA), или специфические праймеры, синтезированные по заказу лаборатории селекции кормовых бобовых трав (NARCH) на основе базы данных GenBank (GenBank/Overview.html). Реактивы получали от фирм «Syntol» и «Helikon» (Россия), «Promega» (Promega Cetus, USA), «Boehringer Mannheim» (Germany), «Pharmacia» (USA).

Инокулюм для лабораторного опыта по оценке устойчивости к склеротиниозу был получен из лаборатории иммунитета ВНИИ кормов. Пораженность раком определяли на основе метода ранней диагностики устойчивости клевера лугового к болезням (Разгуляева, Костенко, Пуца, 1999).

Статистическая обработка экспериментальных данных проведена с помощью компьютерных программ «Statistica v.6», «Excel-7,0»; расчет генетических дистанций и картирование потенциальных локусов количественных признаков (QTLs) выполняли с применением программ JoinMap v. 2.0 и v.3.0 (Stam et al., 1995) и MapQTL (Johan et al., 1993).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Описание и поддержание экспериментальной популяции клевера лугового ГП-27

Оценка фенотипического варьирования признаков. Описание гибридной популяции проводили в условиях селекционно-тепличного комплекса ВНИИ кормов на растениях 1-го и 2-го года развития. Установлена высокая гетерогенность популяции ГП-27 по основным морфобиологическим показателям (рис. 2), что указывало на возможность выявления высокой степени ДНК-полиморфизма и маркирования хозяйственно ценных признаков. В полевых условиях России и Японии (Хоккайдо) в 2001-2003 годах провели учет сроков цветения, зимостойкости, устойчивости к склеротиниозу.

По срокам цветения индивидуальных генотипов наблюдали варьирование признака с разницей, в среднем, в 14 дней. Из 160 генотипов 75 или 46,8% отличались ранними сроками начала цветения (первая декада июля), а для 85 генотипов (53,1%) были характерны более поздние сроки цветения. На основании выявленных различий детектированы потенциальные локусы генов (QTLs), связанные с проявлением особенностей в сроках цветения генотипов популяции ГП-27 (Isobe et al., unpublished.). Два из них ответственны за проявление признака раннего

цветения, а один связан со смещением фазы цветения исследуемых растений на более поздние сроки.

Рис. 2. Гистограмма фенотипического варьирования признаков в экспериментальной популяции клевера лугового ГП-27 (2001г.)

Установленные маркеры помещены в LG1, LG2, LG3, LG5 и LG6 группах сцепления на генетической карте клевера лугового (рис. 5).

Введение генотипов изучаемой популяции в культуру in vitro. С целью обеспечения экспериментальных работ исходным материалом на весь период исследований индивидуальные растения популяции ГП-27 в 1999 году были введены в культуру in vitro и клонально размножены. В результате была создана коллекция клонов из 1000 пробирочных растений-регенерантов, сохранение которых обеспечивали в процессе непрерывного цикла выращивания в условиях камеры искусственного климата «Sherer». В процессе субкультивирования размножаемых эксплантов (пазушные почки растений) установлено, что большинство генотипов обладают достаточно хорошим морфогенетическим потенциалом при условиях, отработанных для культуры ткани клевера. Метод обеспечивал оздоровление от грибной и бактериальной инфекции и сохранение 147 генотипов популяции (88% от изначально введенных в культуру), способствовал экономии площади для содержания опытных образцов и сокращению сроков получения растительного материала, идентичного исходному, при проведении QTL-анализа.

3.2. Молекулярный анализ и создание генетической карты сцепления клевера лугового

Для оценки ДНК-полиморфизма, выявления маркеров и использования их в разработке генетической карты, а также для

маркирования локусов хозяйственно ценных признаков был осуществлен молекулярно-генетический анализ популяции ГП-27.

Оптимизация условий выделения ДНК из растительной ткани клевера. Изначально для PCR-анализа использовали геномную ДНК, изолированную методом СТАВ-экстракции (Doyle et al., 1990). Однако, амплификация образцов ДНК, в большинстве случаев, не проходила. Причиной могло быть присутствие в тканях клевера веществ, способных ингибировать PCR-реакцию. Применили некоторые модификации к основному протоколу. В частности, предварительно выдерживали растения в темноте в течение 2-х суток для снижения содержания полисахаридов, добавляли к буферу меркаптоэтанол для предотвращения окислительных процессов в тканях; очищали образцы ДНК смесью фенол-хлороформ. Модифицированный метод показал высокую эффективность, но для RAPD-анализа, где требовалось минимальное количество генетического материала, и для массового генотипирования он оказался трудоемким и затратным по времени.

При выделении ДНК экономичным и быстрым экспресс-методом Эдвардса (Edwards et al., 1991) обнаружили, что PCR-реакции с клевером проходили только после дополнительной очистки образцов хлороформом и разбавления растворов ДНК до меньших концентраций (1:5; 1:10 и даже 1:50).

Лучший результат был получен при использовании растений клевера, выращенных в культуре in vitro. Отмечено, что практически все образцы ДНК из растений-регенерантов амплифицировались; RAPD-профили были отчетливыми, хорошо выраженными. Вероятно, одной из причин является высокое содержание нуклеиновых кислот в молодых листочках регенерантов, что подтверждается данными литературных источников (Петербургский, 1971). Кроме того, клетки растений, выращиваемых in vitro, более мелкие и активно делящиеся, следовательно, на 1 грамм ткани приходится больше ДНК и меньше примесей. В условиях повышенной влажности in vitro клеточная стенка растений значительно тоньше, что повышает эффективность ДНК-экстракции и уменьшает количество примесей, ассоциируемых с материалом клеточной стенки.

Таким образом, экстракция ДНК из асептически выращенных растений может быть рекомендована в молекулярном анализе клевера лугового для генотипов, которые дают низкий выход ДНК или ДНК неудовлетворительного качества при экстракции традиционными методами.

Сравнительный анализ различных систем молекулярного маркирования. На изучаемой клеверной популяции оценили идентификационные возможности различных типов ДНК-маркеров, основанных на PCR-технологии, и провели исследование ДНК-полиморфизма с помощью RAPD-, STS-, и CAPS-методов. Разработаны ДНК-маркеры для решения следующих селекционно-генетических задач:

1. Оценка внутрипопуляционного ДНК-полиморфизма клевера.

2. Насыщение дополнительными маркерами исходной генетической карты клевера лугового (Isobe et al., 2003).

3. Использование результатов ДНК-анализа для картирования локусов генов селекционно-ценных признаков.

Оптимизация условий и параметров PCR с использованием рандомных праймеров (RAPD-PCR). Выбор этой системы для исследований был обусловлен быстротой, надёжностью методики и возможностью применения крайне малого количества ДНК для анализа (от 10 до 25 нг). RAPD-метод прост в использовании и достаточно дёшев. В наших исследованиях на популяции ГП-27 протестированы 75 рандомных праймеров (10 и 11-мерных). Большинство праймеров (93%) генерировали продукты амплификации различной степени интенсивности. Информативные праймеры продуцировали от 2 до 4 полиморфных полос, сегрегирующих в потомстве, что дает основание использовать праймеры произвольного сиквенса для выявления внутрипопуляционного ДНК-полиморфизма клевера лугового. Праймеры, - 0РВ-03, ОРВ-18, 0РС-02, ОРВ-11 («Operon Technologies»), - генерировали 8 информативных RAPD-маркеров, которые помещены на интегрированной генетической карте клевера лугового в трёх группах сцепления: LG1, LG2, LG7 (рис. 5).

Экспериментальным путем определили оптимальные параметры программы PCR-амплификации для клевера. Снижение температуры гибридизации праймеров с 37,5 до 36°С, уменьшение количества циклов PCR с 40 до 37 и времени промежуточной элонгации цепи ДНК с 2 минут до 1 минуты 30 секунд позволило сократить длительность программы на 35 минут без снижения качества и выхода PCR-продуктов. В результате этих изменений к основному протоколу (Williams et al., 1990) получили отчетливую амплификацию с большинством испытанных праймеров.

На основании проведенных исследований установлено, что для клевера лугового RAPD-метод является достаточно информативной маркерной системой для выявления ДНК-полиморфизма внутри популяции. Предложенные нами параметры PCR-реакции и состав компонентов реакционной смеси можно рекомендовать для анализа генома клевера. Определён набор полиморфных RAPD-праймеров и проведена апробация использования их для маркирования сортов клевера лугового (Козлов и др., 2002).

Использование праймеров с дополнительным селективным нуклеотидом для повышения надежности RAPD-маркеров. Одной из проблем RAPD-анализа является недостаточный уровень воспроизводимости результатов при изменении экспериментальных условий. Для повышения надежности RAPD-маркеров осуществили селективную или избирательную амплификацию элементов RAPD-профиля путем использования новых праймеров, отличающихся от исходного дополнительным нуклеотидом (А, Т, С, или G) у 3'-конца. В качестве образца для экспериментов был выбран 10-мерный праймер OPR-16 (5'-GTCTGCGCGT) («Operon Technologies»). PCR-реакция была

поставлена на образцах геномной ДНК люцерны и клевера со всеми парными комбинациями 11-мерных праймеров (производных от исходного 10-мерного) при модифицированных условиях: а) вместо одиночного RAPD-праймера использовали комбинации из двух праймеров с дополнительным нуклеотидом у 3'-конца; б) увеличивали температуру отжига для повышения специфичности реакции и амплификации только стабильных PCR-продуктов. Результаты PCR на клевере и люцерне показали, что эффективность использования данного метода зависит от индивидуальных комбинаций праймер - образец ДНК таким же образом, как и в обычном RAPD-анализе, но надежность полученных маркеров существенно выше. В каждом из вариантов амплифицировались только определенные фрагменты, RAPD-профили были достаточно интенсивны (рис. 3).

Рис. 3. Сравнение RAPD-профилей геномной ДНК люцерны, полученных двумя разными способами:

а) стандартные условия — * одиночный 10-мерный праймер при 37°С;

б) модифицированные условия — 2 праймера с дополнительным нуклеотидом при 52°С. Лунки:

1, 2 - 15 - анализируемое потомство;

М-маркер молекулярной массы (100 bp Pharmacia).

Полученные маркеры отличались меньшей чувствительностью к изменению условий PCR (температура, вариации времени и числа циклов реакции) в сравнении с исходными RAPD-маркерами, что повышало воспроизводимость результатов без применения повторных экспериментов. Модифицированный метод позволяет создать на основе рандомных праймеров более специфичные праймеры и рекомендуется нами, в первую очередь, при выполнении совместных проектов, когда исследования проводятся в различных условиях.

Исследование ДНК-полиморфизма с использованием сиквенс-специфических праймеров (STS-технология). «Целенаправленная» PCR или PCR сайта известной нуклеотидной последовательности предполагает использование праймеров, гомологичных к заданным специфическим областям, и детектирует уникальный участок генома с определённым сиквенсом. На популяции клевера ГП-27 испытано 45 STS-праймеров,

созданных по сиквенс-гомологии с генами, участвующими во многих функционально важных физиологических процессах в растениях. В составе реакционной смеси была уменьшена концентрация М^СЬ в буфере (до 1,5 тМ) и повышена температура гибридизации праймеров до 45-50°С. Данные по анализу клеверной популяции с некоторыми из 8Т8-праймеров представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты амплификации с сиквенс-специфическими праймерами _(STS-маркирование)_

npaflMep Структура 5'-3' Ген - функция, происхождение t° отжига/ циклов PCR Харахтер амплификации

1 2 3 4 5

MsnatF2/ Msnat R5A GTCAGGCTOGACGGTCG/ GGATTCATACTCGGGTGGAG Неизвестен (холодо- индуцируемый) 45°/37 Четкая амплификация, полиморфизм

MMK4F/ MMK4R TCGTTGTTGAATACGGAG/ GCAATTTGATGCACATGATC МАР-киназа (GenBank) 50732 Чёткая амплификация, нет полиморфизма

Calm F/ CalmR GTCCCTTTTCTGTTCATG/ CCGATCAACTCACCGAC Калмодулин (GenBank) 50732 Чёткая амплификация, нет полиморфизма

Invert F/ Invert R CAGGACACTCCCACATTC/ ACCAATATAACCCTAAAGG Инвертаза (GenBank) 50732 Слабая амплификация

CICF/ CICR ACCCITCACATG AA АСТСТА/ CATTTCTTAACAATGGCTTCC Холодо- идуцируемый протеин 45737 Чёткая амплификация, нет полиморфизма

SucSyn F/ SusSyn R ATTGCCACATTCTTCGAG/ CTCTTCCAAGTCCTTTGAC Сахаросинтаза (GenBank) 50734 Чёткая амплификация, нет полиморфизма

FtSH FI/ FtSHRl ACGACCTGACCTTATCG/ CACTCGTGAAACTTGATG Хлоропласт-FtSH-протеаза 49732 Нет продуктов амплификации

Msnus F/ MsousR GTGGACATGGAAAGTGC/ ATTCCGGACAACCAACC MTA/SAH нуклеосидаза 50732 Слабая амплификация, нет полиморфизма

PhKin F/ PhKinR GAGGAAGTTGAGAAGTTGG/ CCACCAACAATTGCAGCA Фосфоглицерат Киназа (GenBank) 45740 Четкая амплификация, выражен полиморфизм

Ms natS F2/ MsnatR5A TGGCCTGTCTGGAGCGTAG GGATTCATACTCGGGTGGAG Ретротранспозон (холодо- индуцируемый) 50732 Слабая амплификация, необходима оптимизация PCR

MSnatl7Rl/ MSnatl 7F1 GTGCTTAGCTCTTGAATGC/ TGATGACAAGGAGCTTG Ретротранспозон (холодо- индуцируемый) 50732 Чёткая амплификация, нет полиморфизма

PBSMCIRE CCCGGCAACGGCGCCAT Ретротранспозон (холодо- индуцируемый) 45740 Чёткая амплификация, полиморфизм

Cas 18F/ Cas 18R ACAATGTCTCAATATCATGGA/ CATGCATCCATATACACACAA Дегидрин-подобный протеин 50732 Нет продуктов амплификации

Из 39 информативных (одиночных и в парных комбинациях) 5 праймеров детектировали полиморфизм с сегрегацией в потомстве, что составило 12,8%.

Маркеры, генерированные праймерной парой MsnatF2/MsnatR5A, помещены на базовой карте клевера лугового в группах сцепления LG4 и LG5 (рис. 5), а детектированные с помощью праймеров SiCasl7F/SiCasl7R и PBSMCIRE, локализованы в LG6 и LG7 соответственно. Поскольку дизайн этих праймеров осуществлён на основе генов, экспрессирующихся в растении при воздействии холодом (Ivashuta et al., 2002), можно предположить определённую связь выявленных маркеров с локусами признаков холодостойкости.

Предпринята попытка использования STS-маркёров для QTL-анализа экспериментальной клеверной популяции ГТ1-27 по признаку устойчивости к Sclerotinia trifoliorumErikks. (Klimenko et al., 2003).

Полученные результаты позволяют сделать вывод об эффективности STS-маркирования в исследованиях по селекции клевера лугового на устойчивость к воздействию стрессовых факторов. Специфичные фрагменты амплификации, присутствующие в спектрах некоторых генотипов, могут быть использованы в качестве маркеров при QTL-анализе хозяйственно ценных признаков.

Детекция ДНК-полиморфизма с помощью CAPS-маркеров. Полиморфизм ДНК может быть связан не только с длиной амплифицированных фрагментов, но и с различиями в нуклеотидной последовательности продуктов амплификации. Выявить такие различия и установить полиморфные участки ДНК позволяет методика расщепления продуктов амплификации рестрикционными эндонуклеазами (Akopianz et al., 1992), так называемое CAPS-маркирование или полиморфизм амплифицированных сайтов рестрикции. Для генотипирования клевера были использованы шесть пар специфических олигонуклеотидных праймеров. Предварительный PCR-анализ показал, что у родительских форм и потомства присутствуют гены, детектируемые этими праймерами (четкая амплификация с одной мажорной полосой), но ни в одной из реакций полиморфизм ДНК-фрагментов не был обнаружен. Полученные продукты PCR были расщеплены рестрикционными эндонуклеазами EcoRl и Rsal. Из шести вариантов расщепление ДНК с ферментом Rsal произошло в трёх случаях, но только с праймерной парой DhR2/Dh5new получили выраженный полиморфизм (табл.2). Выявлено до 5 полиморфных полос, которые могут быть использованы как информативные генетические маркеры.

CAPS-маркёры, разработанные нами на основе STS-PCR, использовались для изучения ДНК-полиморфизма в популяции клевера лугового ГП-27 (Клименко и др., 2002).

Показана целесообразность применения CAPS-технологии для анализа клевера в качестве дополнительной маркерной системы, если не удалось обнаружить полиморфизм другими методами, или при необходимости детектировать оба родительских аллеля в исследуемом генотипе, т. к. CAPS-маркеры - кодоминантны..

Таблица 2

Расщепление продуктов STS-PCR рестриктазами для детекции __CAPS-маркеров_

Праймеры Ген, функция Рестриктаза Результат

MMK4F/ МАР-киназа Rsal Нет сайта

MMK4R рестрикции

CalmF/ Калмодулин Rsal Рестрикция без

CalmR полиморфизма

CatF/ Каталаза Rsal Нет сайта

CatR рестрикции

S1-3F/ Неизвестен Rsal Нет сайта

S1-3R (холодоиндуцируемый) EcoRl рестрикции

Gal SF/ Галактосидаза Rsal Необходима

Gal SR оптимизация PCR

DhR2/ Дегидрин-подобный Rsal Рестрикция с

Dh 5new EcoRl полиморфизмом

Suc Syn F/ Сахаросинтаза Rsal Нет сайта

Suc Syn R рестрикции

Использование ДНК-маркеров в создании генетической карты клевера лугового (Trifolium pratense L.). В результате совместных исследований по выполнению российско-японского проекта разработана базовая генетическая карта клевера лугового (Isobe S., Klimenko I., Ivashuta S., Gau M, Kozlov N., 2003). Карта состоит из семи групп сцепления, в которых размещены 157 RFLP-маркеров и морфологический маркер белоцветковости. Общая длина карты составляет 535,7 сМ со средней дистанцией между маркерами 3,4 сМ. Изучаемая клеверная популяция была проанализирована со 114 различными праймерами на основе PCR-метода (RAPD-, STS-, CAPS-маркирование) для насыщения исходной карты дополнительными молекулярными маркерами. Выявлены полиморфные фрагменты и детектированы 11 RAPD- и STS-маркеров, которые помещены на интегрированной генетической карте клевера лугового (рис. 5).

3.3. Анализ косегрегации установленных ДНК-маркеров с фенотипическими проявлениями устойчивости растений

Идентификация локусов генов хозяйственно важных признаков (QTLs) основана на оценке фенотипических проявлений признаков, привязывании их к генетическим маркерам, прослеживании наследования в расщепляющейся популяции и локализации генов на карте.

Оценка зимостойкости гибридной ПОПУЛЯЦИИ ГП-27 ДЛЯ QTL-анализа была проведена в полевых условиях Хоккайдского Национального Центра (Саппоро) в апреле 2002 года и на экспериментальном полевом участке ВНИИ кормов. С помощью компьютерной программы MAPQTL установлена связь показателей зимостойкости с выделенными RFLP- и STS-маркерами. Из 6 маркеров 3 обеспечивали высокую зимостойкость

(табл. 3). Локусы признака зимостойкости размещены на интегрированной карте сцепления: whja - в группе сцепления LG1; whjd - в LG6 и whjf - в LG7 (рис.5). Идентифицированы 2 STS-маркера, кодирующие холодоиндуцируемые гены: SICAS, сцепленный с whjc, и MsnatB, сцепленный с whjd.

Оценка устойчивости к склеротиниозу {Sclerotinia trifoliorum Erikss.) Для отбора контрастных по устойчивости к склеротиниозу форм клевера и установления потенциальной связи с генетическими маркерами на базе ВНИИ кормов был проведён лабораторный опьц. Устойчивость отдельных генотипов определяли по индивидуальной реакции листовой ткани растений на воздействие мицелиальной суспензии гриба S. trifoliorum. Балльная оценка показала широкое варьирование в интенсивности развития болезни от бурого единичного пятна в месте нанесения инфекции до полностью сгнившего листа. Результаты статистической обработки данных опыта представлены гистограммой (рис. 4). Маркер с2047Ь, определяющий устойчивость к раку, локализован в LG3 группе сцепления на генетической карте клевера лугового (рис. 5).

Таблица 3

• Характеристика рТЬ-признаков зимостойкости и устойчивости к склеротиниозу в экспериментальной популяции клевера лугового

Локализация 2)направление сегрегации

Маркер 11

Признак QTL Lod

LG cM Тип сегрегации2* ао а- ас

SRL srll C2047b 3 44.2 2.01 оохао +

WHJ whja C1551a 1 64.8 2.36 аохао +

wh}b C1430f 3 104.4 2.35 оохао +

whj с C2426b 6 5.6 2.44 оохао +

whjd C1965a 6 32.6 2.89 аохао -

whje C1961b 6 55.7 4.91 аохоо -

whjf C189b 7 12.1 2.02 aaxbc -

1) маркер, детектирующий наибольшее значение lod в QTL

2) генотипы, определяющие устойчивость или восприимчивость «+»■

показывает устойчивость и «-« восприимчивость_______

ЗйЬ-признак устойчивости к склеротиниозу_

£ О 10 20 30 АО Я 80 70 00 90 100 110

Степень пораженности, %

Рис. 4. Гистограмма частоты распределения степени поражения раком генотипов популяции клевера лугового ГП-27.

В общей сложности детектированы 7 потенциальных рТЬ зимостойкости и устойчивости к склеротиниозу (КИшепко й а1., 2003).

Результаты наших исследований показали принципиальную возможность использования молекулярных маркеров для выявления локусов генов селекционно-ценных признаков в клевере луговом. Накопление информации по рТЬ-анализу ускорит его практическое применение в программах селекции, в частности, по созданию зимостойких и устойчивых к болезням форм и сортов клевера лугового.

3.4. Выделение новых источников хозяйственно ценных признаков для селекции клевера лугового

Наряду с ДНК-анализом, направленным на разработку молекулярных маркеров и локализацию на генетической карте хозяйственно ценных признаков, был проведен отбор перспективного селекционного материала клевера лугового. В результате лабораторных, вегетационных и полевых опытов в разных эколого-географических условиях из состава популяции ГП-27 были выделены генотипы, представляющие определенный интерес для использования в селекции по признакам раннеспелости, зимостойкости и устойчивости к раку.

Полевые исследования в условиях Хоккайдо в 2001-2002 годах позволили выделить в число раннеспелых 4 образца, дата начала цветения которых приходилось на первую декаду июля, в среднем, на 10-14 дней раньше других генотипов популяции, прошедших оценку (табл. 4).

На экспериментальном участке ВНИИ кормов после первой перезимовки из 400 высаженных растений выжило 291 (72,8%); средний показатель уровня зимостойкости для популяции составил 73,7%. Наиболее перспективными проявили себя 34 генотипа гибридной популяции ГП-27 с превышением среднего значения уровня зимостойкости на 10-20%. В условиях Хоккайдо выделены 26 лучших генотипов из 135 высаженных, с показателем зимостойкости выше среднего уровня.

Для селекционной работы заслуживают внимания 11 генотипов с повышенной зимостойкостью как в условиях России, так и Японии (табл.4).

Метод ранней диагностики устойчивости клевера к раку в лабораторных условиях позволил выделить из популяции ГП-27 генотипы, проявившие степень поражения раком ниже, чем у стандарта ВИК-7 (42,6%). Слабо пораженными культуральной жидкостью патогена оказались 13 генотипов из 72, прошедших оценку.

В 2003 году был заложен полевой опыт на естественном фоне заражения (24,2%). Распространенность рака для стандарта (ВИК-7) после первой перезимовки составила 46,3%. Выявлены генотипы, проявившие слабую и среднюю восприимчивость к патогену (ниже стандарта на 1020%) и генотипы без симптомов поражения, которые представляют ценный исходный материал для селекции на устойчивость к склеротиниозу.

По результатам лабораторного и полевого опытов выделены 8 генотипов, проявивших повышенную устойчивость к болезни (табл. 4). Отобранные образцы высажены в сосуды для продолжения исследований. Заложен полевой опыт по оценке устойчивости к склеротиниозу (семенной материал и клонально размноженные генотипы) на родственной клеверной популяции с использованием искусственного фона заражения.

Таблица 4

Генотипы популяции клевера лугового ГП-27 - источники селекционно-ценных признаков

Признак Я49 Я63 Я70 Ш18 Я105

1680 272 Ш6 Ш8 Я43 Я84 И95 Я107 Я76 И.77 Ш44 Я132

Раннеспелость + + +

Зимостойкость + + + + + + + +

Устойчивость к раку + + + + + 4-

Из таблицы 4 следует, что некоторые из выделенных образцов обладали комплексом хозяйственно ценных признаков. Так, генотип Я76 отличался раннеспелостью и устойчивостью к условиям перезимовки и склеротиниозу, в генотипах Я70 и Ш07 сочетались повышенная зимостойкость с раннеспелостью, в Я77 - раннеспелость с устойчивостью к раку; Ш8 - лучший по признакам устойчивости к раку и зимостойкости. Указанные образцы могут служить ценным исходным материалом в селекции на устойчивость к склеротиниозу и по другим хозяйственно важным признакам.

Сочетание традиционных методов селекции и современных ДНК-технологий позволит повысить эффективность и ускорить процесс создания перспективных форм и сортов клевера лугового.

Рис. 5. Интегрированная генетическая карта клевера лугового:

Б01, Б02 - маркеры генов, связанных со сроками цветения экспериментальной популяции в 2001-2002 годах. Линии слева - локусы генов зимостойкости и устойчивости к склеротиниозу.

ВЫВОДЫ

1. Изучена гибридная популяция клевера лугового ГП-27 по основным морфобиологическим показателям для проведения ДНК-анализа и выделения новых селекционных источников.

2. Установлено, что поддержание популяции в культуре in vitro обеспечивает сохранение генетически гетерозиготного материала и воспроизводимость молекулярно-генетических исследований.

3. Определены наилучшие условия выделения ДНК из растительной ткани клевера: предварительное выдерживание растений в темноте (2 суток) для снижения содержания полисахаридов; дополнительная очистка образцов растворами фенола и хлороформа; экстракция ДНК из асептически выращенных растений-регенерантов.

4. Установлены оптимальные параметры амплификации ДНК для клевера лугового. Показано, что снижение температуры отжига с 37,5°С до 36,0°С и уменьшение циклов PCR с 40 до 37 не отражалось на результативности амплификации, но позволяло сократить продолжительность программы PCR на 35 минут.

5. Сравнительный анализ различных систем маркирования на основе PCR-метода показал эффективность использования RAPD-праймеров для оценки ДНК-полиморфизма в популяции клевера лугового. Выделены наиболее информативные праймеры: ОРВ-03; ОРВ-11; ОРВ-13; ОРВ-18; ОРС-02 («Operon Technologies»).

6. Разработан способ повышения надежности RAPD-маркеров с помощью 2-х праймеров с дополнительным нуклеотидом при повышенной температуре отжига. Принцип избирательной амплификации ДНК способствовал повышению специфичности реакции, стабильности PCR-продуктов и получению высоковоспроизводимых маркеров.

7. Установлено, что STS-праймеры результативны для маркирования QTL-признаков в клевере луговом. Высокий уровень сиквенс-гомологии праймеров PhKinF/PhKinR; SiCasl7F/SiCasl7R и PBSMCIRE с холодоиндуцируемыми генами в растениях повышает вероятность идентификации и маркирования признаков, связанных с устойчивостью к неблагоприятным факторам среды.

8. Для повышения эффективности выявления ДНК-полиморфизма при использовании STS-праймеров целесообразно применять расщепление продуктов STS-PCR рестриктирующими эндонуклеазами EcoRl, Rsal и другими. Фрагменты рестрикции с различной молекулярной массой могут быть использованы для генерации CAPS-маркеров.

9. Полученные ДНК-маркеры были использованы для насыщения базовой генетической карты клевера лугового. Интегрированная генетическая карта включает 157 RFLP-, 8 RAPD-, 3 STS-маркера и 1 морфологический маркер белоцветковости. Генетические маркеры, генерированные праймерами 0РВ-02 и 0РС-02, помещены в LG1 и LG7 группах сцепления; 0РВ-03 и ОРВ-18 - в LG2 и LG7 группах

соответственно. STS-маркеры: SICAS; MSnatB; PBSMCIR локализованы в LG6 и LG7 группах сцепления на генетической карте клевера лугового.

10. Установлена связь различий в сроках цветения генотипов исследуемой популяции с RFLP-гибридизационными зондами. Детектированы маркеры, размещенные в LG1, LG2, LG3, LG4, LG5 и LG6 группах сцепления интегрированной карты клевера.

11. На основе RFLP- и STS-маркирования детектированы 7 локусов устойчивости к склеротиниозу и зимостойкости в исследуемой популяции. Из них QTL - srli, детектированный маркером с2047Ь, и расположенный в LG3 группе сцепления, связан с устойчивостью к склеротиниозу. QTLs -whja, whjb, whjc, whjd, whje, whjf, связанные с зимостойкостью популяции, локализованы в LG1, LG6 и LG7 группах сцепления на базовой карте клевера лугового. Идентифицированы 2 STS-маркера, кодирующие холодоиндуцируемые гены, сцепленные с признаком зимостойкости: SICAS, сцепленный с whjc и MSnat В, сцепленный с whjd.

12. Из состава популяции ГП-27 выделены 17 генотипов клевера лугового с повышенной зимостойкостью, раннеспелостью и устойчивостью к склеротиниозу, из них 5 генотипов (R18, R70, R76, R77 и R107), ценных в качестве материала для селекции по 2-3 признакам.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

1. В целях повышения эффективности селекционного процесса целесообразно использовать RAPD- и STS-праймеры для оценки внутрипопуляционного ДНК-полиморфизма, маркирования исходного материала и селекционно-ценных признаков клевера лугового.

2. Рекомендуем использовать разработанную генетическую карту клевера при определении генетических дистанций и для выявления степени сцепления между генами, ответственными за проявление хозяйственно важных признаков, в популяциях клевера лугового.

3. Для отбора перспективного материала при селекции на устойчивость к склеротиниозу следует использовать RFLP-маркер с2047Ь; при селекции на зимостойкость - RFLP-маркеры cl430f; c2426b; cl965a; cl961b; cl89b и STS-маркеры SICAS и MSnat В.

4. Использовать в селекционной практике клевера лугового генотипы популяции ГП-27: WF1680, 272, R18, R43, R49, R70, R76, R84, R107, R118, R144, как источники повышенной зимостойкости. При селекции на устойчивость к раку клевера использовать генотипы: R16, R18, R63, R76, R77, R95, R105, R132. В качестве исходных форм с ранними сроками цветения использовать в селекции генотипы: R70, R76, R77, R107.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. S. Isobe, I. Klimenko, S. Iva-huta, M. Gau, N.N. Kozlov. First RFLP linkage map ofredclover (Trifoliumpra tense Z.^basedoncDNAprobes and its transferability to other red clover gpmpasm// Theor Appl Genet (2003)108:105-112.

2. I. Klimenko, S. Isobe, N. Kozlov, N. Razgulayeva and S. Ivashuta. QTL-Analysis of Sclerotinia Tolerance in Red Clover Mapping Population.// Proceeding of the International Workshop «Functional Genomics and Breeding Strategies for Cold Tolerance in Plants» (2003) Sapporo, Japan.

3. И .А. Клименко, СИ. Ивашута, Н.Н. Козлов. Использование CAPS-маркеров для оценки ДНК-полиморфизма клевера лугового.// Тезисы докладов научной генетической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А. Жебрака в МСХА им. К А Тимирязева. М.,МСХА,2002,с.413.

4. Н.Н. Козлов, Т.Ф. Прибыткова, ИА Клименко, Н.В. Разгуляева. ДНК-маркирование селекционно-ценных признаков клевера лугового.// Материалы 5 Международного Симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», т.2, М, Издательство Российского университета дружбы народов (2003), с.492.

5. S. Isobe, S. Sato, E. Asamizu, I. Klimenko, N.N. Kozlov, K.Okumura and S. Tabata. Construction of a high-density linkage map of red clover based on SSR and RFLP markers.// Proceeding of the 5-th European Conference on Grain Legumes and the 2-nd International Conference of Legume Ge-nomics and Genetics.// 7-11 June, 2004 Dijon, France.

6. Н.Н. Козлов, Т.Ф. Прибыткова, ВА Трухан, СИ. Ивашута, ИА Клименко, Е.Г. Калле, Ю.Н. Малышева. Результаты и перспективы исследований ДНК-полиморфизма кормовых растений.// Сб. Адаптивное кормопроизводство: проблемы и решения. М., ФГНУ Росинформагротех» (2002), с. 522.

Усл. печ. л. 1,16 Зак. 209 Тираж 100 экз.

Издательство МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

РНБ Русский фонд

2005-4 20733

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Клименко, Ирина Александровна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Значение клевера как кормовой культуры; проблемы селекции клевера

1.2. Системы молекулярного маркирования генома

1.3. Использование молекулярных маркеров в современной селекции

1.4. Генетические карты и их использование в селекции растений

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 3.1. Описание и поддержание экспериментальной популяции клевера лугового ГП

3.1.1. Оценка фенотипического варьирования признаков

3.1.2. Введение генотипов изучаемой популяции в культуру in vitro

Глава 3.2. Молекулярный анализ и создание генетической карты сцепления клевера лугового

3.2.1. Оптимизация условий выделения ДНК из растительной ткани клевера

3.2.2. Сравнительный анализ различных систем молекулярного маркирования

3.2.3. Оптимизация условий и параметров PCR с использованием рандомных праймеров (RAPD-PCR)

3.2.4. Использование праймеров с дополнительным селективным нуклеотидом для повышения надёжности RAPD-маркеров

3.2.5. Исследование ДНК-полиморфизма с использованием сиквенс-специфических праймеров (STS-технология)

3.2.6. Детекция ДНК-полиморфизма с помощью CAPS-маркеров

3.2.7. Использование ДНК-маркеров в создании генетической карты клевера лугового (Trifolium pratense L.)

Глава 3.3. Анализ косегрегации полученных ДНК-маркеров с фенотипическими проявлениями устойчивости растений

3.3.1. Оценка зимостойкости гибридной популяции ГПв различных условиях

3.3.2. Оценка устойчивости к склеротиниозу (Sclerotinia trifoliorum Erikss.)

3.3.3. Детекция локусов генов, связанных с признаками устойчивости и локализация их на интегрированной генетической карте

3.3.4. Выделение новых источников хозяйственно ценных признаков для селекции клевера лугового

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Разработка и использование молекулярных маркеров на основе ПЦР-метода в селекции клевера лугового"

Клевер луговой - одна из важнейших кормовых бобовых культур, распространённых в регионах с влажным умеренным климатом. Большинство сортов, используемых сегодня, являются диплоидными (2п=2х=14), перекрёстноопыляющимися видами, с гаметофитной самонесовместимой системой.

Большое народнохозяйственное значение клевера определяется тем, что он является источником дешевого кормового растительного белка и высокоэнергетических кормов, сохраняет почву от водной и ветровой эрозии и повышает плодородие почвы, фиксируя азот.

Однако реализация потенциала клевера как кормовой культуры в; настоящее время ограничена недостатком сортов с улучшенными хозяйственными характеристиками, в частности, раннеспелостью,, зимостойкостью, долголетием и устойчивостью к различным неблагоприятным факторам среды, болезням и вредителям.

Важнейшая роль в создании сортов, отвечающих требованиям современного кормопроизводства, принадлежит селекции. Как правило, для создания новых сортов с улучшенными характеристиками применяется фенотипический отбор с последующей рекомбинацией генетических вариаций. В большинстве случаев селекционер работает со сложными признаками, которые контролируются большим количеством генов, а их фенотипическое проявление существенно варьирует в зависимости от условий внешней среды. В связи с этим суждение о генетической ценности материала, основанное на фенотипическом проявлении его признаков и свойств, в определённой степени ошибочно. Вот почему повышение эффективности оценки исходного материала и > отбора перспективных форм является коренным вопросом селекции (Серебровский, 1970).

Эти задачи особенно актуальны в исследованиях клевера, что обусловлено особенностями его генетической структуры. Сорта и популяции клевера лугового состоят из гетерогенных биотипов, полученных путём массового отбора. Наблюдается высокий уровень внутрипопуляционных и внутрисортовых вариаций (Kongkiathngam et al., 1996). Гетерозиготное состояние особей популяции обеспечивает её приспособительную пластичность и более высокую жизнеспособность, но создаёт определённые трудности в проведении генетического анализа. Выведение новых высокопродуктивных сортов осложняется и тем, что клевер луговой является самонесовместимым облигатным перекрестником, получение гомозиготных Ф линий крайне затруднено. Это, вг свою очередь, усложняет определение характера наследования отдельных признаков.

В этих условиях для успешной селекции особенно важен выбор оптимальных систем, маркирования. Маркерные или сигнальные признаки; как отмечал А.С. Серебровский (1970), позволяют «следить за наследованием того участка хромосом, в котором эти сигналы * расположены». Выявленное таким образом сцепленное наследование признаков в ряде случаев позволит исключить сложные биохимические анализы или другие трудоёмкие методы оценки исходного материала, что упрощает, ускоряет и удешевляет селекционный процесс.

Наиболее широкое распространение в практической селекции получили фенотипические маркеры, имеющие сравнительно простой тип генетического контроля. Однако классические методы маркирования на основе фенотипических признаков имеют ряд существенных ограничений. В частности, число «удобных» фенотипических маркеров, связанных с селектируемыми признаками, весьма ограничено, например, у клевера их насчитывается около 15, а у люцерны - около 20. Кроме того, для фенотипических маркеров зачастую характерно плейотропное действие, и, нередко,, их проявление зависит от условий окружающей среды, стадии; онтогенеза и генетического фона. Селекция, основанная на морфологических признаках, является длительной; трудоёмкой и часто требует большого числа повторных экспериментов при различных условиях.

Ряд недостатков фенотипических маркеров (изменение проявления признака в ходе онтогенеза, органоспецифичность) характерен и для маркёрной. системы, основанной на полиморфизме запасных белков и изоферментов. В этом случае возможности метода ограничиваются ещё и низким уровнем белкового полиморфизма в большинстве популяций.

С развитием современных методов селекции? и созданием широкого сортового разнообразия культур возникли также определённые трудности в методиках достоверной идентификации сортов растений. Используемые для этой цели морфологические характеристики не всегда достаточны для маркирования и паспортизации сортов. Применение белковых маркеров часто не представляется возможным, особенно для растений с низким уровнем межсортового полиморфизма.

Разработка и использование молекулярных маркеров на основе различий в структуре гомологичных последовательностей ДНК гарантирует большую объективность, оценки, т.к. селекционер работает только с генотипом, и ошибки могут возникать лишь в связи с неполным сцеплением молекулярного маркера с признаком. С помощью ДНК-маркёров; можно маркировать любые участки ДНК, в том числе и некодирующие, и использовать для анализа любые ткани и органы, независимо от стадии развития организма. Достоинством новой технологии является также возможность проводить отбор ценных генотипов не по фенотипической оценке взрослого растения, а на основе прямой генетической информации на ранних стадиях развития* растения. Это сокращает время отбора и обеспечивает экономию материальных ресурсов и трудовых затрат.

Молекулярные маркеры, генерируемые с помощью PCR, позволяют оценить генетическое разнообразие исходного материала, классифицировать селекционные формы, маркировать гены хозяйственно важных признаков, картировать геномы. Уже сегодня известен ряд примеров эффективного использования s ДНК-маркёров ? в молекулярно-генетических исследованиях и селекции зерновых, зернобобовых, бобовых и овощных культур.

Однако практическое применение молекулярного маркирования для; создания новых сортов кормовых культур пока ещё сильно отстаёт от потенциальных возможностей* метода. Связано' это с необходимостью* использования > относительно сложных методов молекулярной биологии^ что требует индивидуального подхода к выбору систем и техник маркирования, а также наличия подготовленного персонала.

Исследования по разработке молекулярных маркёров и применению их в селекции кормовых культур стали появляться только в последние годы. Они немногочисленны, охватывают не все виды растений, условия ДНК-анализа, в большинстве случаев, нуждаются в оптимизации. К началу нашей работы, в отечественных и зарубежных источниках литературы не встречались данные о применении различных групп молекулярных маркеров, (на основе PCR- и RFLP-методов): для? исследований клевера лугового. Поэтому разработка системного подхода к ДНК-анализу этой: культуры и применение результатов в селекционных программах является актуальной научной задачей;

Целью настоящей работы являлось определение оптимальных условий молекулярно-биологических методик исследований? для клевера лугового; изучение использования, ДНК-маркеров для; оценки генетического полиморфизма и маркирования селекционно-ценных признаков, а также выделение новых источников для практической селекции.

В задачи исследований входило:

1. Изучить экспериментальную гибридную популяцию клевера лугового ГП-27 по основным морфобиологическим показателям.

2. Определить возможность и условия использования метода клонального микроразмножения для обеспечения максимального сохранения исходного генетического материала клевера лугового.

5. Оценить возможность использования полученных ДНК-маркеров в создании генетической карты клевера лугового.

6. Провести анализ косегрегации ДНК-маркеров с фенотипическими характеристиками для выявления локусов генов хозяйственно ценных признаков клевера лугового.

7. Выделить новые селекционные источники.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Селекция и семеноводство", Клименко, Ирина Александровна

выводы

3. Определены наилучшие условия выделения ДНК из растительной ткани; клевера: предварительное выдерживание растений в темноте (2 суток) для снижения содержания полисахаридов; дополнительная очистка образцов -растворами фенола и хлороформа; экстракция ^ ДНК из асептически, выращенных растений-регенерантов.

4: Установлены оптимальные параметры амплификации ДНК для клевера лугового. Показано, что снижение температуры отжига с 37,5°С до 36,0°С и уменьшение циклов PGR с 40 до 37 не отражалось на результативности амплификации, но» позволяло сократить продолжительность программы PCR на 35 минут.

5. Сравнительный анализ различных систем маркирования на основе PCR-метода показал эффективность использования RAPD-праймеров для оценки ДНК-полиморфизма в популяции клевера лугового^ Выделены наиболее информативные праймеры: ОРВ-ОЗ; ОРВ-11; ОРВ-13; ОРВ-18; ОРС-02 («Орегоп Technologies»).

7. Установлено, что STS-праймеры результативны для маркирования QTL-признаков в клевере луговом. Высокий уровень сиквенс-гомологии праймеров PhKinF/PhKinR; SiCasl7F/SiCasl7R; и PBSMCIRE с холодоиндуцируемыми генами в растениях повышает вероятность идентификации и маркирования; признаков, связанных с устойчивостью к неблагоприятным факторам среды.

9. Полученные ДНК-маркеры были использованы для насыщения базовой; генетической карты; клевера; лугового. Интегрированная генетическая карта включает 157 RFLP-, 8 RAPD-, 3 STS-маркера и 1 морфологический маркер бе л оцветковости.

Генетические маркеры, генерированные праймерами ОРВ-02 и ОРС-02, помещены в LG1 и LG7 группах сцепления; ОРВ-ОЗ и ОРВ-18 — в LG2 и LG7 группах соответственно. STS-маркеры: SICAS; MSnatB; PBSMCIR локализованы в LG6 и LG7 группах сцепления на генетической карте клевера лугового.

10. Установлена связь различий в сроках цветения генотипов исследуемой популяции с RFLP-гибридизационными зондами. Детектированы маркеры, размещенные в LG1, LG2, LG3, LG4; LG5 и LG6 группах сцепления интегрированной карты клевера.

11. На основе RFLP- и STS-маркирования детектированы; 7 локусов устойчивости к склеротиниозу и зимостойкости в исследуемой популяции. Из них QTL-srli, детектированный маркером с2047Ь, и расположенный в LG3 группе сцепления, связан с устойчивостью к склеротиниозу. QTLs-whj a, whjb, whjc, whjd, whje, whjf, связанные с зимостойкостью популяции, локализованы в LG1, LG6 и LG7 группах сцепления на базовой карте клевера лугового. Идентифицированы 2 STS-маркера, кодирующие холодоиндуцируемые гены, сцепленные с признаком зимостойкости: SICAS, сцепленный с whjc и Msnat В, сцепленный с whjd.

-108

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

3. Для отбора перспективного материала при селекции на устойчивость к склеротиниозу следует использовать RFLP-маркер с2047Ь; при селекции на зимостойкость - RFLP-маркеры cl430f; c2426b; с1965а; cl961b; cl89b; и STS-маркеры SICAS и Msnat В.

4. Использовать в селекционной практике клевера лугового генотипы популяции ГП-27: WF1680, 272, R18, R43, R49, R70, R76, R84, R107, R118. R144, как источники повышенной зимостойкости. При селекции на устойчивость к раку клевера использовать генотипы: R16, R18, R63, R76, R77, R95, R105, R132. В качестве исходных форм с ранними сроками цветения использовать в селекции генотипы: R70, R76, R77, R107.

- 109

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата сельскохозяйственных наук, Клименко, Ирина Александровна, Москва

1. Айала Ф., Кайгер. Дж. Современная генетика. Москва "Мир" 1987,с. 293

2. Бороевич С. Принципы и методы селекции растений. — М., Колос, 1984. с. 9-11.

3. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. Москва "Агропромиздат", 1990. с. 382.

4. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция. -Молекулярная биология. М., Наука - 1991 - т. 25, - вып. 46 -с. 926-936.

5. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.Н. Большой практикум по физиологии растений. -М., Высшая школа, 1975. с. 135.

6. Глазко В.И., Дунин И.М., Глазко Г.В., Калашникова А.А. Введение в ДНК-технологии М., ФГНУ "Росинформагротех" 2001, с. 179-376.

7. Ю. Дорохов Д.Б., Лаптева М.Н. Быстрая технология RAPD-анализа генотипов луков. — Сельскохозяйственная биология, 1997, №5, с. 22-31.

8. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. Агропромиздат, 1985. с. 351.

9. Ефимова Г.К. Методы определения устойчивости клевера лугового к раку. — Селекция и семеноводство, 1981, № 10, с. 1819.

10. Журавлёв Ю.Н., Козыренко Е.В., Артюкова Г.Д., Реунова М.В., Илюшко K.JI. ДНК-типирование дальневосточных видов рода Iris L. с помощью метода RAPD-PCR. Генетика, т. 34, № 3, с. 368-379.

11. Н.Жученко А.А. Экологическая генетика культурных растений. Кишинев, 1980.

12. Захаров И.А. Генная инженерия, секвенирование геномов или генетическое картирование? В сб. Материалы научной генетической конференции. М., МСХА, 2002, М., МСХА, 2002, с. 120-121.

13. Зайцев B.C., Хавкин Э.Е. ДНК-маркёры устойчивости к болезням растений на основе генов рецептор-подобных киназ. В сб. Материалы научной генетической конференции. М., МСХА, 2002, с. 119-120.

14. Козлов Н.Н., Михайличенко Б.П., Ивашута С.И., Шаденков А.А. Перспективы использования молекулярных маркёров в селекции кормовых культур. Сельскохозяйственная биология, 1997, № 3, 68-73.

15. Козлов Н.Н., Прибыткова Т.Ф., Клименко И.А., Разгуляева Н.В. ДНК-маркирование селекционно-ценных признаков клевера лугового. В сб. Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования. М., 2003, т. 2, с. 326-328.

16. Клименко И.А., Ивашута С.И., Козлов Н.Н. Использование CAPS-маркёров для оценки ДНК-полиморфизма клевера лугового. В сб. Материалы научной генетической конференции. М., МСХА, 2002, с. 148-150.

17. Кокаева З.Г., Боброва В.К., Петрова Т.В., Гостимский С.А*, Троицкий А.В; Генетический полиморфизм сортов, линий и мутантов гороха по данным RAPD-анализа. Генетика 1998, т. 34, №6. с. 771-777.

18. Конарев В. Г. Белки растений как генетические маркёры. М., Колос, 1983, 320 с.

19. Конарев А.В. Использование молекулярных маркёров в работе с генетическими ресурсами растений. Сельскохозяйственная биология 1998, № 5, с. 3-25.

20. Кочиева Е.З. Использование методов на основе полимеразной цепной реакции для анализа и маркирования растительного генома. Сельскохозяйственная биология, 1999, № 3, с. 3-13.

21. Кочиева Е.З., Рыжова Н.Н. Использование PCR-амплификации на основе сателлитных последовательностей для маркирования генома различных видов перца. Сельскохозяйственная биология, 2001, № 1, с. 94-97.

22. Куренина JI.В. Разработка системы регенерации in vitro для генетической трансформации клевера лугового (Trifolium pretense L.) Автореф. дисс. к. б. н., М., 2003, с. 25.

23. Мазин В.В., Лапотышкина Л.И., Соложенцев П.Д., Шарапов Н.В. Биотехнологические приёмы получения ценных форм клевера и люцерны. Селекция кормовых культур, М:, 1989, с. 66-75.

24. Малышев С.В., Корзун В.Н., Бёрнер А., Войлоков А.В:, Картель Н.А. Использование молекулярных маркёров в генетическом картировании генома ржи (Secale cereale L.). В сб. Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. М., 2000, с. 221-222.

25. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., Мир 1984., 480 с.

26. Мезенцев А.В., Любавина Л.А. Методические указания по регенерации клевера лугового в культуре in vitro. М., ВАСХННИЛ, 1983.

27. Международный классификатор СЭВ рода Trifolium. М., Ленинград, 1983, 12 с.-11334. Методические указания по селекции и первичному семеноводству клевера. М., 2002, 66 с.

28. Методические рекомендации. Современные методы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. М., МСХА, 1998.

29. Мироненко Н.В., Гусева Н.Н. Использование молекулярно-биологических методов для решения проблем иммунитета растений. Сельскохозяйственная биология, 1998, № 1.

30. Мухина Ж.М., Харитонов Е.М., Супрун ИИ. Полиморфизм микросателлитных маркёров применительно к российским сортам риса. В сб. Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования. М., 2003, т. 2, с. 376-378.

31. Мухина Н.А. Клевер красный. — Л., Колос, 1971, 88 с.

32. Навалихина Н.К. Генетические основы селекции тетраплоидного клевера красного. Киев "Наукова думка, 1977. с. 132.

33. Новосёлова А.С. Селекция и семеноводство клевера. М., Агропромиздат 1986, 196 с.

34. Новосёлова А.С. Повышение устойчивости клевера к болезням и вредителям. В сб. Клевер в России. М., 2002, с. 126-130.

35. Новосёлов М.Ю. Создание исходного селекционного материала клевера лугового при использовании химического мутагенеза. Автореф. дисс. к. с-х. наук.-.М., 1984. с 114.

36. Новосёлов М.Ю. Селекция клевера лугового (Trifolium pretense L.) М., 1999, 183 с.

37. Новосёлов М.Ю. Состояние, задачи и методы селекции. В сб. Клевер в России. М., 2002, с. 29-40.

38. Оганесян А.С., Кочиева Е.З., Рысков А.Р. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD PCR. Генетика, 1996:448-451.

39. Петербургский С.М. Агрохимия и физиология питания растений. Россельхозиздат, Москва, 1971, с. 330.

40. Поветкина А.Г., Сиволап Ю.М. Использование SSRP-анализа для определения "гибридности" простых гибридов. В сб. Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии. М., 2000, с. 81.

41. Прибыткова Т.Ф. Селекция на повышенное содержание сырого протеина клевера лугового. Методические указания по селекции и первичному семеноводству клевера. М., 2002, с. 4143.

42. Пуца Н.М., Разгуляева Н.В. Селекция на устойчивость к патогенам корневой системы. Методические указания по селекции и первичному семеноводству клевера. М., 2002, с. 5257.

43. Разгуляева Н.В., Костенко Н.Ю., Пуца Н.М. Методы ранней диагностики устойчивости клевера лугового и костреца безостого к болезням. В сб. Теоретические и прикладные основы ресурсосбережения в сельском хозяйстве. Тюмень, 1999, с. 115-116.

44. Рокотянская JI.C. Селекция растений на устойчивость к болезням. В сб. Материалы научной генетической конференции. М., МСХА, 2002, с. 281-283.

45. Серебровский А.С. Генетический анализ. М., 1970.

46. Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. М., Наука, 1985, 272 с.

47. Солодкая Л.А., Агафодорова М.Н., Лапотышкина Л.И., Куренина Л.В., Покрышкина О.Л. Методы биотехнологии в селекции клевера лугового. Методические указания по селекции и первичному семеноводству клевера. М., 2002, с. 3033.

48. Солодкая Л.А., Новосёлова Е.Ю. Методы создания форм клевера лугового с повышенной устойчивостью к раку. В сб. Селекция кормовых культур, вып. 42, М., 1989, с. 57-65.

49. Солодкая Л.А. Генетические особенности соматических клеток клевера лугового (Trifolium pratense L.) в культуре и их использование в селекции. Автореф. дисс. к. б. н.-Минск, 1987.20 с.

50. Сорокатая Е.И. Тестирование в лабораторных условиях устойчивых к возбудителям корневой гнили растений-регенерантов ячменя. В сб. Материалы научной генетической конференции. М., МСХА, 2002, с. 306-308.

51. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. М., Мир т .2. 1998., с. 370.

52. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н. Генетический полиморфизм ячменя, детектируемый ПЦР с произвольными праймерами. Генетика, 1995, т. 31, №10, с. 1358-1364.

53. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Нецветаев Н.Ю. Использование продуктов полимеразной цепной реакции для картирования генома ячменя. Генетика растений, 1997, т. 33. № 1, с. 53-60.

54. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркёры в растениеводстве. Сельскохозяйственная биология, 1997, № 5, с. 3-20.

55. Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур. Сельскохозяйственная биология, 2003, № 3, с. 26-41.

56. Шевелуха Е.А., Калашникова С.В., Дегтяров С.В. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. М., Высш. шк., 1998, 416 с.

57. Шпаков А.С., Новосёлова А.С., Кутузова А.А., Георгиади Н.И. Клевер в России. М., 2002, 297 с.

58. Akkaya, M.S., Bhagwat, A.A., Cregan, Р.В. 1992. Length polymorphisms of simple sequence repeat DNA in soybean. Genetics 132: 1131-1139;

59. Akopyanz, N., Bukanov N.O., Westblom T.U., and Berg, D.E. 1992. PCR-based RFLP analysis of DNA sequence diversity in the gastric pathogen Helicobacter pilori. Nucleic Acids Res. 20: 6221-6225.

60. Anderson, J.A., Stack, R.W., Liu S.,Warldon, A.D. et al. DNA markers for Fusarium head blight resistance QTLs in two wheat populations. 2001. Theor Appl Genet, 102: 1164-1168.

61. Barcaccia, G. 1994. Development, comparability and potential application, of RAPD marker in the genus Medicago. Jornal of Genetic and Breeding 48: 161-168.

62. Beckman, J.S., and Soller, M. 1990. Toward a unified approach to the genetic mapping of eukaryotes based on sequence-tagged microsatellite sites. Bio/Tecchnology, 8: 930-932.

63. Blake, Т.К., Kadryshanova, D. STS-PCR markers appropriate for wheat-barley introgression. Theor. Appl. Genet., 1996, 5-6: 826-832.

64. Blair, M.W., Panaud, O., McCouch, S.R. 1999. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellitemotif frequency and'finge^rinting-in rice (Oriza sativa L.). Theor Appl Genet 98: 780-792.

65. Bonierbale, M.W., Plaisted, R.L., Pineda, O., Tanksley, S.D. 1994. QTL analysis of trichome-mediated insect resistance in potato. Theor Appl Genet 87: 973-987.

66. Botstein, D., White, R., Skolnick, M. 1980. Construction of a genetic map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J.Hum. Genet., 32: 314-331.

67. Briggs, S.P. 1998. Plant genomics: more then food for thought. Proc Natl Acad Sci USA 95:1986-1988.

68. Broun, P., Tankley, S.D. Characterization and genetic mapping of simple repeat seguences in tomato genome. Mol. Gen. Genet., 1996, 250: 39-49.

69. Brouwer, D.J.,& Osborn, T.C. A molecular marker linkage map of tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Theor Appl Genet 1999, 99: 1194-1200.

70. Chen, C., Sleper, D.A., Jonal, G.S., West, C.P. 1998. Comparative RFLP mapping of meadow and tall fescue. Theor Appl Genet 97: 255-260.'

71. Clements, R.J., Hay ward, M.D., Byth, D.E. 1983. Genetic adaptation in pasture plants. In: Mclvor J.G., Bray, R.A. (eds.) Genetic Resources of Forage Plants. CSIRO, Australia 101-106.

72. Dalbo, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., Steinkellner, H., Sefc, K.M., and Reisch, B.I. 2000. A gene controlling sex in grapevines placed on a molecular marker-based genetic map. Genome v.43, № 2.

73. Devey, M.E., Bell, J.C., Smith, D.N., Neale, D.V., and Morgan, G.F. 1996. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers. Theor. Appl. Genet. 92: 673-679.

74. Devos, K.M., and Gale, M.D. 1997. Comparative genetics in the grasses. Plant molecular Biology 35,3-15.

75. Diwan, N., Bhagwat, A.A., Bauchan, G.B., Cregan, P.B. 1997. Simple sequence repeat DNA markers in alfalfa and perennial and annual Medicago species. Genome 40: 887-895.

76. Doyle, J.J., Doyle, J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue.

77. Echt, C.S., May-Marquardt, P., Hseih, M., and Zahorchak,R. 1996. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome, 39: 1102-1108.

78. Echt, C.S., ErDahl, L.A., and McCoy, T.J. 1991. Genetic segregation of random amplified polymorphic DNA in diploid cultivated alfalfa. Genome, 35: 84-87.

79. Echt, C.S., Kidwell, K.K., Knapp, S.L., Osborn, T.C., &McCoy, T.J. Linkage mapping in diploid alfalfa (Medicago sativa). Genome 1994,37:61-71.

80. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. 1991. A simple and rapid method for preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucl Acids Res 19(6): 1349.

81. Edwards, M.D., Helentjaris, Т., Wright, S., Stuber, C.W. 1992. Molecular-marker-facilitated investigations of quantitative trait loci in maize. Theor Appl Genet 83: 765-774.

82. Ganal, M.W., Czihal, R., Hannappel, U., Kloos, D.U., Polley, A. Ling, H.Q. 1998; Sequencing of cDNA clones from the genetic map of tomato (Lycopersicon esculentum). Genom Res 8: 842-847.

83. Guevara-Garcia, A., Herrera-Estrella, L., and Olmedo-Alvares, G. Use of PCRs in Plant Molecular Biology.

84. Halward, Т., Stalker, Т., LaRue, E., Kocchert, G. 1992. Use of single-primer DNA amplifications in genetic studies of peanut (Arachis hypogaeva L.). Plant Mol Biol 18: 315-325.

85. Hayward; M.D., McAdam, N.J., Jones, J.G., Evans, G.M., Forster, J.W., et al. 1994. Genetic markers and the selection of quantitative traits in forage grasses. Euphytica, 77: 269-275.

86. Hearn, C., Ghosh, S., and Todd, J. 1992. Microsatellite for linkage analysis of genetic traits. Trends genet. 8: 288-2941

87. Heun M., Kennedy A.E., Anderson J.A., Lapitan N.L., Sorrells M.E., Tanskley S.D. 1991. Construction of a restriction fragment length polymorphism map for barley (Hordeum vulgare). Genome 34: 437-447.

88. Hirochika, H. 1997. Retrotransposons of rice: their regulation and use for genome analysis. Plant. Mol. Biol. 35, 231-240.

89. Hughes M.A. Dunn M.A. 1996. The molecular biology of plant acclimation to low temperature. Journal of Experimental Botany 47, 291-305.

90. Ivashuta, S., Naumkina, M., Gau, M., et al. 2002. Genotype-development transcriptional5 activation of novel repetitive elements during cold acclimation of alfalfa {Medicago sativa). The Plant Journal, 31(5), 615-627.

91. Isobe, S., Klimenko, I., Ivashuta, S., Gau, Mi, Kozlov, N.N. First RFLP linkage map of red clover {Trifolium pratense L.) based on cDNA probes and its transferability to other red clover germplasm. Theor Appl Genet (2003) 108: 105-112.

92. Jansen R.C. A general Monte Carlo method for mapping multiple quantitative trait loci. Genetics 142: 305-311.

93. Jarvis, P., Lister, C., Szabo, V., Dean, C. Integration of CAPS markers into lines of Arabidopsis thaliana. Pit mol Biol 1994, 24: 685687.

94. Johan, W., van Ooijen, Chric Maliepaard 1993, MapQTL ver.4.0.

95. Jung, G. Molecular markers associated with plant architecture and resistance to common blight in common beans. J. Amer. Soc. Hort. Sci., 1996,121, 5: 794-803.

96. Kalo, P., Endre, G., Zimany, L., Csanadi, G., and Kiss, G.B. 2000. Construction of an improved linkage map of diploid alfalfa (Medicago sativa L.). Theor Appl Genet 100: 641-657.

97. Kangfu, Yu and Pauls, K.P. 1992. Optimization of the PCR program for RAPD analysis. Nucleic Acids Research, Vol. 20, № 10.

98. Karp, A. On the current understanding of clonal, variation. Oxford Surweys of Plant Molecular and Cell Biology/ Ed. B.J. Miflin. 1991. V.7.P. 1-58.

99. Karp, A., Seberg, O., Buiatti, M. 1996. Molecular techniquesbin the assessment of botanical diversity. Annals of Botany 78: 143-149.

100. Keim, P., Schupp, J.M., Travis, S.E., Clayton, K., et al. 1997. A high-density soybean genetic map based upon AFLP markers. Crop Sci. 37: 537-543.

101. Kidwell, K.K., Bingham, E.T., Woodfield, D.R., Osborn, T.C. 1994. Relationships among genetic distance forage yield and heterozygosity in isogenic diploid and tetraploid alfalfa populations. Theor Appl Genet 89: 323-328.

102. Kiss G.B., Csanadi, G., Kalman, K., Kalo, P., Okresz, L. 1993. Construction of a basic genetic map for alfalfa using RFLP, RAPD, isozyme and morphological markers. Mol Gen Genet 238: 129-127.

103. Lander, E.S., Green, P., Abrahamson, J., Barlow, A., et al., 1987. MAPMAKER. Mcintosh version 2,0, Genomics 1: 174-181.

104. Landry, B.S. and Michelmore, R.W. Methods and applications of restriction fragment length polymorphism analysis to plants, in Tailoring Genes for Crop Improvement. Brueing. Ed., 25.1985.

105. Landry B.S., Kesseli R.V., Farrara В., Michelmore R.W. 1987. A genetic map for lettuce (Lactuca sativa L.) with restriction fragment length polymorphism, isozyme, disease resistance and morphological markers. Genetics 116: 331-337.

106. Lodhi, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., and Reisch, B.I. 1994 A. simple and efficient method for DNA extraction from grape vine cultivars and Vitis species. Plant Mol. Biol. Rep. 12: 6-13.

107. Maniatis, Т., Fritsch, E.F., Sambrook, J. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring laboratory Press, New York.

108. Markert, C.L., and Moller, F. Multiple forms of enzymes: tissue, ontogenetic, and species-specific patterns. Proc Natl Acad Sci USA 1959,45:753-763.

109. McCouch, S.R., Kochert, G., Yu, Z.H., Khush, G.S., Coffman, W.R., and Tanksley, S.D. 1988. Molecular mapping of the rice chromosome. Theor Appl Genet. 76: 815-829.

110. Mershall, P., Marchand, M.C., Lisieezko, G. A simple method to estimate the percentage of hybridity in canola (Brassica napus. L.) F1 hybrids. Theor Appl Genet, 1994, 89, 7/8: 853-858.

111. McGregor, C.E., Lambert, C.A., Greyling, M.M., Louw, J.H., Warnich. 2000. A comparative assessment of DNA fingerprintingtechniques (RAPD, ISSR, AFLP and SSR) in tetraploid potato (Solanum tuberosum L.) germplasm. Euphtica 113: 135-144.

112. Michelmore, R. Molecular approaches to manipulation of disease resistance genes. Annu. Rev. Phytopathol., 1995, 33: 393427.

113. Morgan, Т.Н. Sex-linked inheritance in Drosophila. Science 1910,32:120-122.

114. Mori, N., Liu, Y.G., Tsunewaki, K. Wheat phylogeny determined by RFLP analysis of nuclear DNA. Theor Appl Genet, 1995,90, 1: 129-134.

115. Mullis, R.B., Fallona, F.A., Scharf, S. Specific synthesis of DNA in vitro: the Polymerase Chain Reaction. Cold Spring Harbor Simposia on Quantitative Biology, 1986, 51: 263-273.

116. Nakagawa, H., and Ebina, M. Development of Molecular Markers for the Analysis of Apomixis. 2001. In Spangenberg (ed), Molecular Breeding of Forage Crops, 161 -173.

117. Mullis, K.B. and Faloona, F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Meth. Enzymol., 155,335.1987.

118. Paterson, A.H. Making Genetic Maps. 1996. In Genome mapping in Plants, ch. 3, R.G. Landes Company.

119. Paterson, A.H. Mapping Genes Responsible for Differences in Phenotype. 1996. In Genome mapping in Plants, ch. 4, R.G. Landes Company.

120. Paterson, A.H., Tanksley, S.D., Sorrels, M.E. DNA markers in plant improvement. Adv. Agron., 1991, 46: 39-90.

121. Paran, I., Michelmore, R.W. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theor Appl Genet, 1993, 85: 985-993.

122. Powell, W., Morgante, M., Andre, C., Hanafey, M., Vogrl, J., Tingey, S. and Rafalski, A. 1996. The comparison of RFLP, RAPD, AFLP and SSR (microsatellite) markers fpr germplasm analysis. Mol Bred 2: 225-238.

123. Quesenberry, K.H., Smith, N.L., Taylor, D.D., Baltensberg, and parrott, W.A. 1991. Genetic nomenclature in clovers and special-purpose legumes. Crop Sci. 31: 861-867.

124. Rafalski, A., Tingey, S., Williams, J.G.K. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Plant Molecular Biologi Manual. Klubedr Acad. Publ., c.8: 1-9.

125. Rajora,. O.P., Rahman, M.H., Buchert, G.P., and Dancik, B.P:, 2000. Microsatellite DNA analysis of genetic effects of harvesting in old-growth eastern white pine (Pinus strobus) in Ontario. Mol. Ecol. 9: 339-348.

126. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

127. Sambrook, J., and Russel F. 2001. "Quantitation of Nucleic Acids", in Molecular cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y).

128. Sanchez-Escribano, E.M., Martin, J.P., Carreno, J;, and Cenis, J.L. 1999. Use of sequence-tagged microsatellite site markers for characterizing table grape cultivars. Genome, 42: 87-93.

129. Smith, J.S.C., Smith, O.S. Fingerprinting crop varieties. Adv. Agron., 1992, 47: 85-140.

130. Spangenberg, G., Molecular Breeding of Forage Crops. Proc. of the 2nd International Symposium, Molecular Breeding of Forage Crops, Lome and Hamilton, Victoria, Australia, November 19-24, 2000. Kluwer Academic Publishers (Dordrecht/Boston/London).

131. Spangenberg, G., Wang, Z.Y., Potrykus (1998) Biotechnology in forage and turf grass improvement. In: Frankel R. et al. (eds) Monographs on Theor Appl Genet, v. 23, 10 ch., Spring Verlag, Heidelberg, 192.

132. Stam, P., Ooijen, J.W. 1995. JoinMap vers 2,0: Software for the calculation of genetic linkage maps. CPRO-DLO, Wageningen.

133. Sweeney, P.M:, & Danneberger, Т.К. 1994. Random amplified polymorphic DNA in perennial ryegrass: A comparison of bulk samples vs. individuals. HortSci. 29: 624-626.

134. Taramino, G., Tingley, S. Simple sequence repeats for germplasm analysis and mapping in maize. Genome, 1996, 39, 2: 277-287.

135. Tauts, D. 1989. Hypervariability of simple sequences as a general source of polymorphic markers. Nucleic Acids Res. 17: 6463-6471.

136. Taylor, N.L. 1982. Registration of gene marker germplasm for red clover. (Reg. CP 1 for CP). Crop Sci.: 1226-1269.

137. Teutonico, R., Yandell, В., Satadopan,J.M. e.a. Genetic analysis and mapping of genes controlling freezing tolerance in oilseed Brassica. Molecular Breeding, 1995, 1, 4: 329-339.

138. Thomas, M.R., and Scott, N.S. 1993. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphisms when analyzed as sequence-tagged sites (STSs). Theor Appl Genet 86: 985-990.

139. Warren, J.M., Raybould, A.F., Ball, Т., Gray, A.J., Hayward, M.D. (1998). Genetic structure in the perennial grasses Lolium perenne and Agrostis curtisii. Heredity 81: 556-562.

140. Wang, Z., Weber, J.L., Zhong, G., and Tanksley, S.D. 1994. Survey of plant short tandem repeats. Theor Appl Genet 88: 1-6.

141. Weber, J.L. (1990) Human DNA polymorphism based on length varations in simple-sequence tandem repeats. In: Davies K.E., Tilghman S.M. (eds) Genetic and physical mapping. V I genome analysis. Cold Spring Harbour laboratory Press, Plainview, New York.

142. Welsh, J., and McClelland, M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18: 72137218.

143. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J;, Rafalski, J.A., and Tigney, S.V. 1990. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful genetic markers. Nucleic Acids Res. 18: 65316535.

144. Wing, R.A., Zhang, H.B., Tanksley, S.D. 1994. Map-based cloning in crop plants. Tomato as a model system. Genetic and physical mapping of jointless. Mol. Gen. Genet., 242: 681-688.

145. Wolfraim L.A., Langis R., Tyson H., Dhindsa RS.1993. cDNA sequence, expression and transcript stability of a cold acclimation-specific gene of alfalfa (Medicago falcata ) cells. Plant Physiology 101, 1275-1282.

146. Yamada, Т., Fukuoka, H., Wakamatsu, T. (1989a). Recurrent selection programs for white clover (Trifolium repence L.) using self-compatible plants. Euphytica 44: 167-172.

147. Yu, K.F., and Pauls, K.P. 1993. Segregation of random amplified polymorphic DNA markers and strategies for molecular mapping in tetraploid alfalfa. Genome 36: 844-851.

148. Yu, K.F., and Pauls, K.P. 1993. Rapid estimation of genetic relatedness among heterogenous populations of alfalfa by random amplification of bulked genomic DNA samples. Theor Appl Genet 86, 788-794.

149. Список основных аббревиатур и сокращений, используемых вдиссертационной работе

150. NARCH-National Agricultural Research Center for Hokkaido region -Национальный Центр сельскохозяйственных исследований для Хоккайдского региона.

151. PCR-polymerase chain reaction полимеразная цепная реакция (ПЦР).

152. MAS-marker-assisted selection селекция с помощью маркеров.

153. QTL-quantitative trait loci локусы количественных признаков.

154. RFLP-restriction fragment length polymorphism —полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.

155. RAPD-randomly amplified polymorphic DNA полиморфизм рандомно амплифицированной ДНК.

156. STS-sequence-tagged site полиморфизм длины фрагментов определенных сайтов.

157. CAPS-cleaved amplified polymorphism site полиморфизм сайтов расщепленной (расколотой) ДНК.

158. AFLP-amplified restriction length polymorphismполиморфизм длины амплифицированных последовательностей нуклеотидов

159. SSR-simple sequence repeats простые повторяющиеся последовательности

160. DAF-DNA amplification fingerprinting фингерпринтинг, (отпечаток) амплифицированной ДНК.

161. DDRT-differential display RNA technique техника дифференциального дисплея для РНК.

162. DD-AFLP-differential display AFLP дифференциальный дисплей для AFLP-метода.

163. Map-based-cloning клонирование генов на основе генетических карт.-130 1.d-skore логарифм частной вероятности.

164. RNasel РНКаза, фермент для удаления РНК из растворов.bp-base pear — пары оснований (нуклеотидов).ng нанограмм.

165. DMPLC денатурирующая жидкостная хроматография.

166. Fingerprint высокоспецифичная картина спектров амплификации оцениваемого генотипа.

167. ВС популяция типа беккрос.

168. Comparative mapping «сравнительное картирование» родственных видоводной таксономической группы. Tag DNA Polymerase термостабильная ДНК-ролимераза.

169. ТАЕ трис-ацетатный буфер для проведения электрофореза.Ф

170. СТАВ-буферы для экстракции ДНК (Doyle et al., 1990)1,5Х СТАВ-буфер (1л) 10% СТАВ-буфер (1л) СТАВ-осаждающий буфер (1л)

171. СТАВ 15 г СТАВ - 100 г СТАВ - Юг1М Tris-HCl 75 мл NaCl -40,95 г 1М Tris-HCl-50 мл0,5М EDTA 30 мл 0,5М EDTA - 20 мл1. NaCl 61,43 г

172. Буфер для выделения ДНК методом Эдвардса (Edwards et al., 1991)

173. Компоненты Объем (1мл) Конечная концентрация

174. Tris-HCl (рН 7,5) 200 мкл 200 шМ1. EDTA (о,5 М) 50 мкл 25 шМ1. NaCl (5М) 50 мкл 250 шМ1. SDS (10%) 50 мкл 0,5 %1. Н20 (рН 7,0) 650 мкл

175. Состав рабочих растворов для проведения электрофореза:

176. ТАЕ (трис-ацетатный)-буфер 5 ОХ раствор (1л)

177. Рабочий раствор: 0,04М Трис-ацетат (50Х): 0,002М ЭДТА Концентрированный раствор (1л)1. Трис-НС1 242 г0,5М ЭДТА (рН 8,0) 100 мл

178. Ледяная уксусная кислота 57 мл2. ТЕ-буфер (рН 7,4)1. ЮмМTris-HCl (рН 7,4)1.M EDTA (рН 8,0)

179. Загрузочный буфер для нанесения проб (6Х) с продуктами PCR0,25% бромфеноловый синий0,25% ксилолцианол30% глицерин2+

180. Состав буфера для приготовления смеси для PCR (XI0), Mg добавляли вреакционную смесь1. Tris-HCl, рН 8,8 670 mM1. NH)2S04 166 mM1. Tween 20 0,01%

181. Оценка экспериментальной популяции ГП-27 по основнымморфобиологическим показателям

182. Условные обозначения к значениям признака (Международный классификатор рода Trifolium», Ленинград, 1983).

183. Оценка сроков цветения популяции клевера ГП-27 в полевых условиях (Хоккайдо, июль 2001-2002г.,* генотипы, не прошедшие оценку)

184. Результаты RAPD-анализа популяции клевера лугового ГП-27

185. Праймер Нуклеотидная Наличие продуктов Полиморфизмпоследовательность амплификации фрагментов1 2 3 41. KIT А code)

186. ОРА-01 5'-CAGGCCCTTC-3' — —

187. ОРА-02 5'-TGCCGAGCTG-3' + — ■

188. ОРА-ОЗ 5AGTC AGCC АС-3 + —1. ОРА-04 5-AATCGGGCTG-3 + —1. ОРА-05 5-AGGGGTCTTG-3 + —

189. ОРА-О6 S'-GGTCCCTGAC-S1 + —

190. ОРА-07 S'-GAAACGGGTGS' — —1. ОРА-08 5-GTGACGTAGG-3 + —

191. ОРА-09 5'-GGGTAACGCC-3 — —

192. ОРА-Ю 5 '-GTG ATCGC AG-3 + —

193. ОРА-11 5'-CAATCGCCGT-3' + —1. ОРА-12 5-TCGGCGATAG31 + —

194. ОРА-13 5'-CAGCACCCAC3' + —

195. ОРА-14 5'-TCTGTGCTGG-3' + —

196. ОРА-15 5'-TTCCGAACCC-3* + —1. ОРА-16 S-AGCCAGCGAAS' + —

197. ОРА-17 5-GACCGCTTGT-3' + —1. ОРА-18 5-AGGTGACCGT-3 + —1. ОРА-19 5-CAAACGTCGG31 + —

198. ОРА-20 5'-GTTGCGATCC-3' + +Ф

Информация о работе

Клименко, Ирина Александровна
кандидата сельскохозяйственных наук
Москва, 2004
ВАК 06.01.05

Диссертация

Разработка и использование молекулярных маркеров на основе ПЦР-метода в селекции клевера лугового - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы