Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Отолитовая мембрана

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Лычаков, Дмитрий Витальевич

1. Общая характеристика работы.

1.1. Введение.

1.2. Цель и задачи исследования.

1.3. Основные результаты и положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна и теоретическая значимость работы.

1.5. Практическое значение.

2. Материал и методика.

2.1. Объекты исследования.

2.2. Общая характеристика методов исследования.

3. Проблема вариабельности отолитовой мембраны.

3.1. Исследование структурной организации отолитовой мембраны.

3.1.1. Отолитовая мембрана круглоротых.

3.1.1.1. Введение.

3.1.1.2. Материал и методика.

3.1.1.3. Результаты.

3.1.1.5. Выводы.

3.1.2. Отолитовая мембрана пластиножаберных рыб.

3.1.2.1. Введение.

3.1.2.2. Материал и методика.

3.1.2.3. Результаты.

3.1.2.4. Обсуждение.

3.1.2.5. Выводы.

3.1.3. Отолитовая мембрана осетрообразных рыб.

3 1.3.1. Введение.

3.1.3.2. Материал и методика.

3.1.3.3. Результаты.

3.1.3.4. Обсуждение.

3.1.3.5. Выводы.

3.1.4. Отолитовая мембрана настоящих костистых рыб.

3.1.4.1. Введение.

3.1.4.2. Материал и методика.

3.1.4.3. Результаты.

3.1.4.3.1. Световая и сканирующая электронная микроскопия.

3.1.4.3.2. Морфометрические исследования.

3.1.4.3.3. Математическое моделирование.

3.1.4.4. Обсуждение.

3.1.4.4.1. Световая и сканирующая электронная микроскопия.

3.1.4.4.2. Морфометрические исследования.

3.1.4.4.3. Математическое моделирование.

3.1.4.5. Выводы.

3.1.5. Отолитовая мембрана тетрапод.

3.1.5.1. Введение.

3.1.5.2. Материал и методика.

3.1.5.3. Результаты.

3.1.5.3.1. Амфибии.

3.1.5.3.2. Рептилии.

3.1.5.3.3. Птицы.ЮЗ

3.1.5.3.4. Млекопитающие.

3.1.5.4. Обсуждение.

3.1.5.4.1. Амфибии.

3.1.5.4.2. Рептилии.

3.1.5.4.3. Птицы.

3.1.5.4.4. Млекопитающие.

3.1.5.5. Выводы.

3.2. Исследование химической организации отолитовой мембраны.

3.2.1. Введение.

3.2.2. Материал и методика.

3.2.3. Результаты.

3.2.4. Обсуждение.

3.2.5. Выводы.

3.3. Обсуждение результатов по проблеме вариабельности отолитовой мембраны.

3.3.1. Эволюция отолитовой мембраны.

3.3.1.1. Структурная организация и эволюция отолитовой мембраны низших позвоночных (нететрапод).

3.3.1.2. Функциональная организация отолитовой мембраны низших позвоночных (нететрапод).

3.3.1.3. Структурная организация и эволюция отолитовой мембраны тетрапод.

3.3.1.4. Функциональная организация отолитовой мембраны тетрапод.

3.3.2. Экоморфологическая пластичность отолитовой мембраны.

3.3.3. Индивидуальные отклонения.

3.3.4. Химическая организация отолитовой мембраны.

3.3.5. Форма и кристаллическая структура отоконий.

3.4. Основные положения и выводы по проблеме вариабельности отолитовой мембраны.

4. Проблема структурной устойчивости отолитовой мембраны.

4.1. Введение.

4.2. Материал и методика.

4.3. Результаты.

4.4. Обсуждение.

4.5. Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Отолитовая мембрана"

1.1. Введение

Между раздражителем, действующим на рецепторные клетки, и самими ре-цепторными клетками располагаются, как правило, структуры, изменяющие в той или иной степени характер действия раздражителя (Гершуни, 1972; Ильинский, 1972; Орлов, 1998). К числу таких структур относится отолитовая мембрана отолитовых органов вестибулярного аппарата. Под термином "отолитовая мембрана" подразумевается целый комплекс взаимосвязанных структур (рис. 1а-в) (Лычаков, 1988а; Орлов, 1998; Шипов и др., 1997; Fermín et al., 1998; Lim, 1973, 1974; Lindeman, 1969). Это, во-первых, отолитовый аппарат, представленный обычно множеством мелких кристаллических отоконий или одним крупным кристаллическим отолитом. Во-вторых, это желеобразный желатиновый слой, на котором лежит отолитовый аппарат и который связывает между собой отоконии и покрывает их со стороны эндолимфатического пространства. В-третьих, это субкупулярная сеть (которую правильнее было бы назвать субото-литовой сетью), основным компонентом которой являются тонкие нити, связывающие желеобразный слой с поверхностью макулы.

Благодаря отолитовой мембране отолитовые органы способны реагировать на различные движения головы и определять их интенсивность и направление (Винников и др., 1970; Орлов, 1998; Шипов и др., 1997; Gresty et al., 1992). Принцип преобразования механических стимулов в нервные сигналы состоит в следующем. Отолитовая мембрана не жестко связана с поверхностью макулы, а отолитовый аппарат имеет плотность примерно в три раза большую, чем омывающая его эндолимфа. Поэтому при движении и наклонах головы отолитовая мембрана за счет сил инерции или за счет силы тяжести способна легко смещаться относительно поверхности макулы (рис.2). Сдвиг отолитовой мембраны вызывает наклон пучков чувствительных волосков рецепторных клеток макулы, которые своими вершинами связаны с желеобразным слоем отолитовой мембраны. В свою очередь, наклон волосков рецепторных клеток вызывает возбуждение или торможение самих рецепторных клеток (Орлов, 1998; Hudspeth, Corey, 1977; Hudspeth, Jacobs, 1979). Таким образом, отолитовая мембрана, и в первую очередь ее отолитовый аппарат как пробная инерциальная масса, преобразует линейные ускорения и ускорение силы тяжести в возбуждение рецептор-ных клеток. Эта информация используется организмом для пространственной ориентации, поддержания равновесия, организации моторного поведения, для координации движений головы и глаз (Орлов, 1998; Gresty et al., 1992). Кроме того, у низших позвоночных отолитовые органы используются для восприятия звуковых колебаний (Platt С., 1983; Popper, Carlson, 1998). Таким образом, совершенно очевидно, что отолитовая мембрана играет важнейшую роль в процессе преобразования механических стимулов (линейных ускорений) в доступную для организма форму. Именно отолитовая мембрана обеспечивает высокую избирательную чувствительность отолитовых органов к действию линейных ускорений (Ильинский, 1972; Гершуни, 1972). Нарушение структуры отолитового аппарата приводит к резкому изменению двигательной активности животного, его способности ориентироваться в пространстве (Лычаков, 19966; Магнус, 1962; Gresty et al., 1992; Lim, 1980).

Несмотря на сходную функцию, отолитовые мембраны у разных позвоночных, а также у одного животного, но в разных отолитовых органах, т.е. в утри-кулюсе, саккулюсе и лагене, могут сильно различаться по организации отолитового аппарата. Отолитовый аппарат варьирует по форме, размерам, массе, способности к росту, химическому составу, кристаллической структуре и т. д. (Лычаков, 1988а; Лычаков, Лаврова, 1994; Carlström, 1963; Fermín et al., 1998; Lim, 1974; Platt, Popper, 1981; Pote, Ross, 1991). Неясно, в чем причины такого разнообразия. Каков функциональный смысл морфологической вариабельности отолитового аппарата? Как отражается эта вариабельность на вестибулярной функции, а также на слуховой функции у низших позвоночных?

Помимо вопросов, связанных с выяснением причин и смысла структурной вариабельности отолитовой мембраны, имеется целый комплекс вопросов, связанных, во-первых, с изучением устойчивости отолитовой мембраны к действию различных неблагоприятных факторов и, во-вторых, ее функции в необычных условиях. Большинство этих вопросов носит медицинский характер и обязано своим происхождением широкому применению различных машин и механизмов, появлению новых, необычных по силе и длительности механических воздействий, таких как микрогравитация (невесомость), укачивание, перегрузка, вибрация и т. д. (Горгиладзе, Шипов, 1994; Лычаков, 1988в; 19966, 1998; Пащи-нин, 1990; Gresty et al., 1992; Ross, 1987). Особый интерес представляют исследования, посвященные изучению действия невесомости на вестибулярный аппарат и выяснению роли отолитовой мембраны в генезе укачивания.

Действительно, на протяжении миллионов лет все живое развивалось в неизменных гравитационных условиях. С другой стороны, во время космического полета сила тяжести практически "отсутствует", поэтому отолитовые органы должны функционировать в совершенно необычных условиях. Как отолитовая мембрана реагирует на изменение величины силы тяжести? Способны ли отолитовые органы нормально развиваться в условиях измененной силы тяжести? Является ли сила тяжести одним из факторов, детерминирующих рост отолитового аппарата? Эти и другие вопросы до сих пор остаются нерешенными.

С укачиванием человечество столкнулось уже много сотен лет назад, однако, только в последние десятилетия эта проблема стала интенсивно изучаться в связи с обнаружением особой, космической формы болезни движения (см. например, Бенсон А., 1987; Егоров, Юганов, 1985; Лычаков, 1992в). Так, считается, что вариации в структуре отолитового аппарата, а именно межлабиринтная отолитовая асимметрия, могут быть одной из причин возникновения этого недуга (Горгиладзе и др., 1986; Егоров, Самарин, 1970; Лычаков, 19966, 19926; 1998; Пащинин, 1990; Самарин, 1992; Diamond, Markham, 1991; Markham, Diamond, 1992). В связи с этим исследования индивидуальной вариабельности отолитовой мембраны, выяснение роли отолитовой асимметрии и ее возможных пертурбаций в условиях измененной гравитации представляются весьма актуальными для решения проблемы укачивания.

Помимо чисто биологических и медицинских аспектов изучения отолитового аппарата, его исследования имеют также самостоятельный интерес в рамках формирующейся в последние годы новой науки - биоминералогии (Кораго, 1991, 1992). Объектами биоминералогии являются различные виды так называемых органоминеральных агрегатов, которые состоят из минерального и органического вещества и образуются в организме или специально (кости, зубы, отолитовый аппарат, экзоскелет и т. д.), или возникают в результате различных патологических процессов (почечные камни, желчные камни и т. д.). Механизмы формирования и поддержания органоминеральных агрегатов до сих пор остаются во многом не выясненными (Кораго, 1991, 1992; Addadi, Weiner, 1992; Belcher et al., 1996; Degens et al., 1969; Williams, 1984). Очевидно, что новые данные о структуре, росте и составе отолитов и отоконий представляют несомненный интерес для изучения этих процессов.

Таким образом, при изучении отолитового аппарата, этой вспомогательной с функциональной точки зрения структуры, перед исследователями встает целый ряд вопросов, ответы на которые могут иметь принципиальное значение для решения целого ряда проблем в различных областях биологии, медицины и биоминералогии.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Лычаков, Дмитрий Витальевич

Результаты исследования эволюции отолитового аппарата тетрапод показаны на схеме (рис.70). Диаграмма показывает взаимоотношения ныне живущих тетрапод друг с другом и лопастеперыми рыбами и структуру их отолитовых аппаратов.

4) Таким образом, резюмируя, можно утверждать, что в эволюции позвоночных развитие отолитовой мембраны шло по двум направлениям. В филогенетическом ряду низших водных позвоночных (от круглоротых до костистых рыб) прослеживается тенденция к интеграции отолитового аппарата, созданию крупного, цельного постоянно растущего поликристаллического отолита. В филогенетическом ряду тетрапод (от амфибий до млекопитающих) прослеживается тенденция к структурной дифференцировке отолитовой мембраны, формирующейся на ранних этапах онтогенеза. Возникает вопрос, почему развитие структуры отолитовой мембраны шло по двум направлениям? Для того чтобы ответить на этот вопрос, мы оценили морфометрические (микромеханические) характеристики отолитовой мембраны рыб, разработали математическую модель движения отолита при действии вестибулярных и звуковых стимулов, провели принципиальную качественную оценку поведения структурно дифференцированной отолитовой мембраны при действии линейных ускорений.

5) Проведенное нами математическое моделирование показало, что отоли-товая мембрана, содержащая отолит определенной массы, обеспечивает настройку отолитового органа на работу только в определенном режиме ускорений, с определенной чувствительностью и быстродействием. Для охвата всего диапазона встречающихся ускорений рыбы должны использовать совместную работу всех трех отолитовых органов, содержащих отолиты разной массы. Аналогичным образом используются отолитовые органы у рыб и для восприятия звуковых колебаний. Масса отолита фактически определяет частотный диапазон и пик чувствительности данного отолитового органа, а использование двух, а возможно всех трех, по-разному настроенных отолитовых органов, обеспечивает необходимую настройку и звукоразличение. С ростом массы отолита чувствительность и разрешающая способность отолитового органа к линейным ускорениям повышаются. Одновременно с этим повышается и чувствительность отолитового органа к звуковым колебаниям, при этом максимум чувствительности сдвигается в низкочастотную область. Учитывая эти результаты, а также литературные данные о функциональной роли внешнего строения рыб и особенностях их поведения, мы пришли к выводу, что появление в процессе эволюции у низших водных животных массивного, постоянно растущего отолита связано с необходимостью постоянно повышать чувствительность каждого отолитового органа. Потребность в повышении чувствительности возникает в связи с тем, что, во-первых, чем крупнее рыба, тем точнее она должна определять ускорения, и, во-вторых, чем крупнее рыба, тем лучше она должна воспринимать более низкие звуки.

6) В отличие от отолитовой мембраны рыб, содержащей один отолит, структурно дифференцированную отолитовую мембрану тетрапод можно уподобить набору отдельных взаимосвязанных инерциальных анализаторов. Каждый такой анализатор настроен на работу в определенном режиме ускорений. В целом же вся структурно дифференцированная отолитовая мембрана способна охватить весь диапазон встречающихся ускорений, обеспечивая при этом высокую чувствительность, быстродействие и разрешающую способность отолитового органа.

Развитие у тетрапод структурно дифференцированной отолитовой мембраны, являющейся более универсальной и вместе с тем более совершенной и точной системой анализа ускорений, связано с переходом тетрапод в воздушную среду обитания и необходимостью уже с первых дней жизни иметь высокочувствительный, быстродействующий преобразователь ускорений, охватывающий при этом широкий диапазон ускорений. Структурно дифференцированная отолитовая мембрана не используется для восприятия звука. В процессе эволюции во внутреннем ухе тетрапод возникает целый ряд специализированных слуховых органов. Только у низших тетрапод постоянно растущий композиционный отолит саккулюса сохраняет структурно-функциональные характеристики, свойственные рыбам.

7) Помимо структурных различий в организации отолитовой мембраны, наблюдающихся на уровне достаточно крупных таксономических групп (эволюционная вариабельность), в процессе работы были обнаружены межвидовые различия в пределах одного класса и более мелких подразделений. При этом межвидовые различия не перекрывали отличий, связанных с уровнем филогенетического развитая.

8) Для того чтобы понять, может ли межвидовая вариабельность отолитовой мембраны носить адаптивный, экоморфологический характер было проведено специальное исследование отолитов черноморских рыб.

В ходе работы было найдено, что независимо от того, какой образ жизни ведет та или иная рыба, рост и развитие отолитовых органов подчиняются четырем отолитовым закономерностям. Эти закономерности можно сформулировать следующим образом: а) масса отолита постоянно увеличивается с ростом рыбы; б) соотношения между массами отолитов саккулюса/лагены и саккулю-са/утрикулюса не меняются с ростом рыбы; в) соотношение между площадью проекции отолита и его массой описывается степенным уравнением 5 = ат2/3; г) соотношение между площадью проекции отолита и площадью макулы существенно не меняется с ростом рыбы.

Таким образом, в процессе роста или приспособления к определенным внешним условиям изменение важнейших структурных параметров отолитов происходит в рамках определенных правил. Расчеты показывают, что это не только не мешает успешной адаптации отолитовых органов, но и обеспечивает постоянство их относительных функциональных характеристик.

На основании полученных морфометрических данных, литературных данных и, используя описанные выше отолитовые закономерности, была построена математическая модель движения отолита при действии звуковых и вестибулярных стимулов. Модель описывает движение отолита как демпфированного маятника с колеблющейся точкой подвеса. Уравнения движения отолита были представлены в явном виде, причем, оказалось, что при заданной величине стимула смещение отолита может быть определено только через одну переменную величину, а именно через его массу.

9) Проведенный морфометрический анализ показал, что у донных и прибрежных рыб по сравнению с пелагическими рыбами саккулярные отолиты имеют большую скорость роста и большую массу. Кроме того, величина соотношения между массами отолитов саккулюса и лагены или саккулюса и утрику-люса у донных и прибрежных рыб также заметно больше, чем у пелагических рыб. Результаты математического моделирования показали, что благодаря этим различиям отолитовые органы донных и прибрежных рыб, с одной стороны, и отолитовые органы пелагических рыб, с другой стороны, должны обладать разными свойствами при анализе вестибулярных и звуковых стимулов.

Отолитовые органы донных и прибрежных рыб настроены на работу в широком диапазоне ускорений. В целом они способны совмещать высокую чувствительность с быстродействием и со способностью работать с ускорениями, сильно различающимися по величине. У пелагических рыб отолитовые органы настроены на работу в более однородном диапазоне ускорений и не должны достигать максимальных значений чувствительности, характерных для донных рыб. При анализе звуковых колебаний донные и прибрежные рыбы должны иметь лучшее звукоразличение и более высокую чувствительность в низкочастотном диапазоне, чем отолитовые органы пелагических рыб.

10) Результаты математического моделирования показали также, что вариабельность формы отолитов у рыб имеет приспособительное значение и вызвана необходимостью дополнительной настройки отолитовых органов на преимущественное распознавание определенных относительно головы рыбы направлений звука.

И)Внутривидовая вариабельность отолитовой мембраны характерна для всех исследованных видов позвоночных. Так, отолиты разных особей одного вида и размера могут различаться по массе, форме, структуре образующих их кристаллов. Слой отоконий в одних и тех же областях отолитовой мембраны может иметь разную толщину, массы левых и правых одноименных отолитов отолитовых мембран) могут заметно отличаться друг от друга и т. д. Как правило, вариабельность тех или иных параметров отолитовой мембраны носит характер небольших колебаний относительно среднего уровня и в качественном отношении находится в пределах нормы. Однако у некоторых особей обнаруживаются сильные качественные отклонения, которые имеют характер нарушений, недоразвития или патологии. В природе такие отклонения встречаются достаточно редко. Большинство из них имеет искусственное происхождение. Очевидно, что небольшие структурные вариации в отолитовой мембране в том случае, когда они наследуются, могут послужить основой для последующих экоморфологических и эволюционных перестроек.

12) Проведенное исследование обнаружило, с одной стороны, заметную вариабельность элементного состава отолитов и отоконий, а с другой - позволило выявить некоторые общие черты, свойственные отолитам и отокониям животных разных систематических групп. Так, у всех позвоночных для создания пробной массы в качестве основного неорганического компонента используется Са. № находится в отолитовом аппарате в связанном состоянии и используется, по-видимому, в качестве электролита, прерывающего отложение карбоната кальция. Концентрация М^ в отокониях заметно выше, чем в крупных постоянно растущих цельных отолитах являясь ингибитором роста кристаллов кальциевых солей, может использоваться как один из ограничителей роста отоконий). К является примесным элементом в отолитовом аппарате челюстноро-тых и не играет существенной роли в процессе его роста.

13)Различия в содержании тех или иных элементов обусловлены, по-видимому, тремя причинами. Во-первых, как и в случае структурной вариабельности, некоторые различия в составе отолитов и отоконий могут быть объяснены с эволюционных позиций. Так, обнаруженные нами различия в элементном составе отолитового аппарата между бесчелюстными и челюстноротыми соответствуют прогрессивному эволюционному переходу от одного минерального вещества к другому (от аморфного фосфата кальция к кристаллическому карбонату кальция). Во-вторых, ряд различий в составе отолитов и отоконий связан с приспособлением данного вида или данной группы животных к определенным внешним условиям, с необходимостью создания отолитового аппарата с опре

181 деленными параметрами. Так, варьирование концентраций в отолитах рыб Ыа и М§ обеспечивает, по-видимому, разную скорость роста отолитов, разную степень их кальцификации и т. д. В-третьих, одной из причин вариабельности элементного состава отолитов и отоконий является естественный разброс, обусловленный как внутренними причинами, так и внешними воздействиями различного характера.

14) Внешняя форма отоконий и отолитов, тип кристаллической модификации СаСОз детерминируются генетически. Выбор арагонита или кальцита определяется тем, какие из свойств этих двух минералов являются оптимальными для данного вида отолитовой мембраны. В том случае, когда отолитовый аппарат должен обладать максимальной устойчивостью, что важно для работы структурно дифференцированной отолитовой мембраны, используется кальцит. В том случае, когда имеется необходимость в постоянном увеличении массы отолитового аппарата, что имеет место в отолитовых органах, содержащих отолиты (цельные и композиционные), используется арагонит. Форма и размеры отоконий могут влиять на уровень обмена и, соответственно, на устойчивость к растворению отоконий. Однако наиболее оптимальный подбор этих параметров прослеживается только у ряда нететрапод. У высших позвоночных роль формы, как фактора, способствующего обеспечению максимальной устойчивости, снижена. Устойчивость отоконий, т. е. их способность не растворяться в ненасыщенной эндолимфе, обеспечивается с помощью других физико-химических механизмов. вует на вестибулярный аппарат не секунды, а часы, месяцы, оставалось не выясненным.

Помимо изучения влияния факторов космического полета на дефинитивные отолитовые органы представлялось важным выяснить, как действуют условия космического полета на формирующийся эмбриональный лабиринт. Исследование этого вопроса особенно важно для понимания роли силы тяжести как фактора, определяющего рост массы отолитового аппарата.

Особый интерес представляет изучение межлабиринтной отолитовой асимметрии у животных, подвергшихся воздействию факторов космического полета. Межлабиринтная отолитовая асимметрия рассматривается целым рядом авторов как фактор, способствующий возникновению различных вестибулярных расстройств, как одна из главнейших причин возникновения космической болезни движения (Горгиладзе и др., 1986; Егоров, Самарин, 1970; Кисляков, Столбков, 1982; Самарин, 1992; Baumgarten et al., 1982; Diamond, Markham, 1991; Markham, Diamond, 1992; Lackner et al., 1987). Согласно гипотезе отолитовой асимметрии левые и правые отолитовые органы морфологически и функционально не идентичны, в частности, они содержат отолиты, различающиеся по массе (Горгиладзе и др., 1986; Егоров, Самарин, 1970; Самарин, 1992). На земле в привычных условиях эта асимметрия учитывается и компенсируется в ЦНС. В условиях невесомости эта компенсация становится неадекватной новым условиям, что в конечном итоге приводит к возникновению болезни движения. Постепенно организм адаптируется, и в ЦНС возникает новая схема компенсации. После окончания полета возникают новые вестибулярные расстройства (Горгиладзе и др., 1986; Яковлева и др., 1981), связанные с реадаптацией к земным условиям и возвращением к первоначальной схеме компенсации отолитовой асимметрии.

Учитывая вышесказанное, было решено провести исследование дефинитивных и эмбриональных отолитовых органов у животных, пребывавших в условиях космического полета; провести лабораторные модельные эксперименты с целью выяснения устойчивости отолитовых органов к действию перегрузки, вибрации и гипокинезии, оценить степень отолитовой асимметрии у животных разных классов в норме и после пребывания в условиях невесомости или длительной перегрузки.

Приводимые в работе данные о структуре отолитовой мембраны и рецептор-ных клеток были в основном опубликованы ранее (Винников и др., 1980, 1982, 1983; Лычаков, 1984, 1988в, 19926, 19966, 1998; Лычаков и др., 1983, 1988, 1989, 1993; Лычаков, Лаврова, 1985; Лычаков, Пащинин, 1991; Lychakov, 1991; Lycha-kov et al., 1993; Vinnikov et al., 1983).

4.2. Материал и методика Рыбы

1) Для исследования влияния факторов космического полета на формирование отолитовых органов рыб были использованы личинки рыбки данио-рерио Brachidanio rerio (Винников и др., 1982). Зародыши рыбок находились в момент старта на стадии средней гаструлы. Развитие зародышей шло в специальных биоконтейнерах ЭМКОН-Т (рис.73) на борту корабля "Союз-22" в течение 8 суток при 25°. На 2 сутки после посадки мальки замораживались целиком в пропане, охлажденном жидким азотом до -160°. Контрольные зародыши развивались в лаборатории в аналогичных контейнерах и при той же температуре в течение 10 суток. Материал обезвоживался в течение 7 суток в пропане при -150°, помещался в вакуумную камеру, где температура поднималась постепенно до комнатной, и удалялся пропан, затем материал заливался в эпон-812. Трансвер-сальные срезы головы толщиной 5 и 10 мкм, сделанные сухим стеклянным ножом, помещались на кварцевые подложки, напылялись углеродом и анализировались на рентгеновском микроанализаторе JSM-U3. Исследовалось распределение в отолитовых органах и глазу Na, К, Са, Р и S. Для того чтобы проверить, в каком состоянии находится Na, часть срезов до напыления углеродом инкубировалась в течение 1 часа в ванночке с дистиллированной водой, затем эти срезы высушивались на воздухе и обрабатывались по описанной выше схеме.

2) Для исследования влияния факторов космического полета на структуру отолитов взрослых рыб были использованы 2 взрослые самки гуппи Poecilia reticulata (Лычаков, 1988в). Рыбки находились в герметично закрытой полиэтиленовой емкости на борту биоспутника "Космос-1514" в течение 5 суток. Контрольные рыбки находились в лаборатории в сходных условиях. Саккулярные и утрикулярные отолиты извлекали, промывали дистиллированной водой и взвешивали на ультрааналитических весах фирмы БаЛопш. Шлифы саккулярных отолитов исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа. Материал подготавливали по методике, описанной ранее (см. раздел 3.1.4.2).

3) Для исследования влияния повышенной силы тяжести на отолитовый аппарат гуппи была изготовлена центрифуга, которая обеспечивала вращение двух аквариумов со скоростью 0,71 об/сек (Лычаков и др., 1988). Аквариумы свободно висели на подвесках, расположенных на концах вращающейся рамы, свободно отклоняясь с началом вращения. Из-за небольшого размера рамы центрифуги в пределах аквариумов существовал градиент ускорения от 1,8 до 2,2 д.

Для уборки аквариумов и кормления рыб центрифугу останавливали на 1520 мин 5-6 раз в неделю. Мальков в каждом эксперименте получали от двух беременных самок, подобранных таким образом, чтобы роды происходили в один день (гуппи являются живородящими рыбами). Мальков без предварительного отбора на 8-10 день после рождения помещали в опытные и контрольные аквариумы. В контроле, как и в опыте, было использовано по два одинаковых аквариума (№1 и №2). Условия содержания в них были такими же, как и в опытных аквариумах. При кормлении малькам в опыте и контроле давали одинаковое количество сухого корма. Было поставлено три 4-х месячных эксперимента. В первом и во втором экспериментах в каждый аквариум помещали по 6 мальков, в третьем эксперименте в оба опытных аквариума было посажено по 10 мальков, а в контрольные аквариумы было посажено 8 и 10 и мальков. Световой режим 12 часов ночь - 12 часов день регулировался с помощью реле времени 2РВМ. В первом эксперименте и в опыте, и в контроле аквариумы были прикрыты пенопластовыми крышками, что создавало равномерное сумеречное освещение. Во втором и третьем экспериментах крышки были прозрачными. Температура в аквариумах поддерживалась автоматически с помощью двух термореле, совмещенных с нагревателями. В качестве виварного контроля и для отбора беременных самок использовали стадо гуппи, свободно жившее в 200 л аквариуме.

После окончания экспериментов рыбок усыпляли, измеряли стандартную длину тела (от конца головы до начала хвостового плавника) и взвешивали на весах ВЛР-200. Отолиты извлекали, промывали дистиллированной водой и высушивали на воздухе в течение нескольких дней. В первом эксперименте отолиты измеряли дважды. При первом измерении отолиты взвешивали по одному, затем их помещали на столик светового микроскопа и фотографировали, по фотографиям определяли площади их проекций (площади отолитов). Были измерены отолиты у 12 опытных и 12 контрольных мальков. При втором измерении отолиты взвешивали попарно, но не у всех рыб, были перевзвешены отолиты у 10 опытных и 11 контрольных рыб. Во втором и третьем экспериментах отолиты взвешивали только попарно. Взвешивание отолитов производили на ультрааналитических весах фирмы Эайогшз.

Амфибии

Для исследования развития вестибулярного аппарата амфибий в условиях невесомости были использованы эмбрионы шпорцевой лягушки Хепорт \aevis. В настоящей работе представлен материал четырех полетных экспериментов на космических комплексах "Салют-6 - Союз-26", "Салют-6 - Союз-36", "Салют-6 - Союз-39" и "Салют-6 - Союз-40" (Винников и др., 1980, 1983; Лычаков, 1984; Лычаков, Лаврова, 1985; Утш'коу а1., 1983). В каждом эксперименте оплодотворенные за несколько часов до старта космического корабля "Союз" икринки помещались в три миниаквариума прибора ЭМКОН-Т по 5 икринок в каждый аквариум (рис.73). После стыковки космического корабля "Союз" с орбитальной станцией "Салют-6" космонавты переносили прибор ЭМКОН-Т в термоэлектрический термостат БИОТЕРМ-4, который поддерживал температуру 15°С. Развитие головастиков в условиях невесомости начиналось до начала формирования отолитовой мембраны и продолжалось на борту станции 8-9 суток (20 суток в эксперименте на "Салют-6 - Союз-26"). Живой материал доставлялся в лабораторию на 2 день после посадки и исследовался с помощью микроскопических и морфометрических методов (в эксперименте на "Салют-6 - Союз-26" материал был зафиксирован на борту станции). Контрольные эмбрионы развивались в аналогичных миниаквариумах и в том же температурном режиме и обрабатывались теми же способами, что и полетные эмбрионы.

Для исследования отолитовой мембраны с помощью светового, просвечивающего электронного и сканирующего электронного микроскопов было использовано 31 опытных и 45 контрольных головастиков. Материал просматривался под бинокулярным поляризационным микроскопом, фиксировался 4% глютаральдегидом на 0,1 М коллидиновом буфере или 2% глютаральдегидом на 0,1 М какодилатном буфере (рН 7,3), фотографировался в поляризованном и обычном свете и дофиксировался 1% СЮд на соответствующем буфере. Образцы обезвоживались в спиртах. Часть материала заливалась в эпон-812. С блоков изготовлялись серии трансверсальных (поперечных) срезов головы личинок толщиной 10 мкм. Срезы фотографировались под световым микроскопом, часть срезов переклеивалась и использовалась для изготовления ультратонких срезов. Изучение ультратонких срезов проводилось с помощью просвечивающего электронного микроскопа ШМ-100В. Материал для сканирующей микроскопии после обезвоживания в спиртах помещался в амилацетат и высушивался при критической точке в СО2. Высушенные образцы монтировались на металлических подложках, покрывались путем напыления в вакууме углеродом и золотом и просматривались в сканирующем электронном микроскопе 18М-35.

Морфометрическое исследование отолитовой мембраны было выполнено на 10 опытных и 14 контрольных головастиках. Материал без предварительной фиксации замораживался целиком в жидком пропане, охлажденном жидким азотом до -160°, высушивался в вакууме при -40° в течение 3 суток и заливался в эпон-812. С блоков изготовлялись серии трансверсальных (поперечных) срезов головы так, чтобы срезы с одного животного включали полностью оба лабиринта. По фотографиям вычислялась общая площадь, занимаемая отолитами на всех срезах, которая после перемножения на толщину среза (10 мкм) давала объем отолита.

Млекопитающие

1) Для исследования влияния факторов космического полета на лабиринт млекопитающих был использован материал двух экспериментов.

В эксперименте на биоспутнике "Космос-936" взрослые самцы крыс линии Вистар-СПФ весом 200-250 г находились на борту спутника в течение 18,5 суток (Винников и др., 1980). У 5 особей выделение материала было начато через 4 часа после приземления спутника, 5 особей после приземления проходили период реадаптации в наземных условиях в течение 25 суток. Контролем служили 5 крыс, находившихся в лаборатории в условиях, имитирующих большинство факторов космического полета, кроме невесомости, и 5 крыс из вивария. При взятии материала обращали внимание на наличие воспалительных процессов в среднем ухе и кровоизлияний в области преддверия, т. к. подобные дефекты могли бы помешать правильной оценке возможных изменений. Фиксацию лабиринта производили до его выделения из височной кости, для лучшего проникновения фиксатора в преддверие верхушку улитки обламывали. С момента декапитации животных до погружения препаратов в фиксатор проходило 15-20 мин. В качестве фиксатора использовали 5% глютаральдегид на 0,1 М какоди-латном буфере. В растворе глютаральдегида препараты хранились в течение 1 месяца. Перепончатый лабиринт, извлеченный из кости, дофиксировался 1% 0s04 на 0,1 М какодилатном буфере. После обезвоживания весь материал заливался в эпон-812. Срезы утрикулюса и саккулюса просматривали в световом и поляризационном микроскопах, ультратонкие срезы изучали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-100В. Срезы толщиной 1 мкм наклеивались на медные сеточки, напылялись углеродом и анализировались с помощью рентгеновского микроанализатора JSM-U3.

В эксперименте на биоспутнике "Космос-1667" было использовано 7 взрослых самцов крыс в возрасте около 13 месяцев весом 200-250 г, находившихся на борту спутника в течение 7 суток (Лычаков и др., 1989). Контролем служили 7 крыс того же возраста и той же линии, взятых из вивария. Масса крыс после полета составляла 332±9 г, контрольных - 333±15 г (М±о). Выделение материала было начато через 4 часа 22 минуты после приземления спутника. При взятии материала обращали внимание на наличие воспалительных процессов в среднем ухе и кровоизлияний в области преддверия, т. к. подобные дефекты могли бы помешать правильной оценке возможных изменений. Височные кости с вскрытыми лабиринтами хранились в фиксирующем растворе 2% глютаральдегида на 0,1 М какодилатном буфере в течение 16 суток, затем дофиксировались 1% 0э04 и хранились в 70° спирте. Отолитовые мембраны выделялись на 4-5 сутки хранения, переносились на медные сеточки, покрытые формваровой пленкой, высушивались на воздухе. Образцы монтировались на металлических подложках, покрывались путем напыления в вакууме углеродом и золотом и просматривались в сканирующем микроскопе ^М-35. Для исследования отолитовой мембраны и рецепторных элементов вестибулярного аппарата выделенные из костного лабиринта утрикулюс, саккулюс, а также ампулы полукружных каналов заливались в эпон-812, с блоков изготовлялись серии срезов толщиной 5 и 10 мкм. Срезы исследовались под световым микроскопом и фотографировались. Всего было исследовано 29 рецепторных органов в опыте и 21 - в контроле. Для количественной оценки степени структурной неоднородности рецепторных отделов по фотографиям осуществляли реконструкцию макул и крист, в опыте было реконструировано 7 органов, в контроле - 9. Для оценки степени отечности нервных окончаний в области стриолы утрикулюса вычисляли долю чашевидного нервного окончания в процентах по отношению к комплексу "рецеп-торная клетка-чашевидное нервное окончание". Для этого с помощью рисовального аппарата под световым микроскопом по серийным срезам вычисляли площадь всего комплекса и площадь чаши отдельно.

2) Для исследования влияния повышенной силы тяжести на отолитовую мембрану млекопитающих были использованы взрослые самцы крыс (Лычаков и др., 1988). Эксперимент был проведен И.Б.Красновым (Краснов и др., 1986). В опыте 6 крыс находилось на центрифуге в течение 30 суток при перегрузке 2g. Каждый день центрифуга останавливалась для ухода за животными. Для контроля было использовано 6 крыс такого же возраста и пола. В процессе эксперимента поддерживался световой режим 12 часов день - 12 часов ночь. При взятии материала обращали внимание на наличие воспалительных процессов в среднем ухе и кровоизлияний в области преддверия, т. к. подобные дефекты могли бы помешать правильной оценке возможных изменений. Фиксацию лабиринта производили до его выделения из височной кости, для лучшего проникновения фиксатора в преддверие верхушку улитки обламывали. С момента декапитации животных до погружения препаратов в фиксатор проходило 15-20 мин. В качестве фиксатора использовали 5% глютаральдегид на 0,1 М какоди-латном буфере. Перепончатый лабиринт, извлеченный из кости, дофиксировал-ся 1% 0&0А на 0,1 М какодилатном буфере и помещался в 70° спирт. Ото лотовые мембраны утрикулюса и саккулюса переносились на предметное стекло, покрывались покровным стеклом и исследовались под световым микроскопом в обычном и поляризованном свете. Для оценки формы и размеров отоконий ото-литовые мембраны утрикулюса разрушались, отоконии перемешивались, часть отоконий в капле 70° спирта переносилась на медную сеточку, покрытую форм-варовой пленкой. Препараты высушивались на воздухе, покрывались путем напыления в вакууме углеродом и золотом и просматривались и фотографировались в просвечивающем электронном микроскопе ШМ-100В. По фотографиям измерялись размеры отдельных отоконий. Для исследования рецепторных и опорных клеток утрикулюса фиксированный материал обезвоживался, заливался в эпон-812, с блоков изготовлялись последовательные серии срезов толщиной 10 мкм, которые исследовались под световым микроскопом.

3) Для исследования влияния на вестибулярный аппарат низкочастотной вибрации было использовано 16 крыс линии Вистар в возрасте 1 месяц (Лыча-ков, Пащинин, 1991). Крысы предварительно и по окончании опытов проверялись на наличие отитов и других ушных заболеваний. Было проведено два эксперимента. В первом эксперименте крысы в период с 20 мая по 2 июня (кроме 21, 22, 28 и 29 мая) подвергались действию общей вибрации частотой 18 Гц с максимальным виброускорением 2,4 % в среднем по 5,8 часа в день общей продолжительностью около 58 часов. Во втором эксперименте крысы в период с 14 по 28 марта (кроме 16, 17, 23 и 24 марта) подвергались действию общей вибрации частотой 30 Гц с максимальным виброускорением 9,6 % в среднем по 5,1 часа в день общей продолжительностью около 56 часов. Вибрационное воздействие имело вертикальное направление и создавалось с помощью прибора ПВ-1. Крысы во время опытов находились в свободном состоянии, каждая в отдельном отсеке клетки. Контрольные крысы находились в сходных условиях. Крысы взвешивались до начала эксперимента и сразу после его окончания.

Для оценки состояния вестибулярной системы у крыс был исследован рефлекс переворачивания, для оценки общего состояния животных была исследована статическая выносливость, для обнаружения сдвигов в структуре вестибулярного аппарата было проведено морфологическое исследование.

Для оценки рефлекса переворачивания была изготовлена специальная установка и использована стробоскопическая фотосъемка (Lim et al., 1978). Каждую крысу помещали на горизонтально закрепленный стержень, при этом животное удерживалось на стержне передними и задними лапами и висело спиной вниз. При выдергивании стержня крыса свободно падала вниз. Одновременно с выдергиванием стержня включалась лампа-вспышка с частотой мельканий 15 Гц и открывался затвор фотоаппарата. Таким образом, на одном кадре фиксировались фазы падения животного и его положение в пространстве. По фотографиям измерялись углы наклона головы и туловища к линии горизонта в соответствующих фазах падения. У всех животных рефлекс переворачивания оценивался по 5 попыткам до, после и у некоторых крыс в ходе эксперимента.

Статическая выносливость определялась по предельному времени удерживания на шесте, свисавшем вниз от платформы, которая закреплялась с помощью кронштейна к стойке на высоте 1,2 м (Шипов, Маркин, 1977). Шест имел диаметр 2 см, длину 29 см и был покрыт поролоном толщиной 1 см. Крыса вцеплялась в поролон, чтобы не упасть вниз. Она старалась удержаться на шесте как можно дольше, лезть вверх ей мешала платформа. Статическую выносливость оценивали по бальной системе: до 5 мин удержания на шесте - 1 балл, от 5 до 10 мин - 2 балла, от 10 до 15 мин - 3 балла, от 15 до 20 мин - 4 балла, больше 20 мин - 5 баллов. Перед определением статической выносливости животных взвешивали, поскольку статическая выносливость зависит от массы тела (Котовская и др., 1979).

В обоих поведенческих тестах крысы падали на натянутую эластичную ткань, что исключало возможность получения травмы.

Материал для морфологических исследований брался на следующий день после окончания опытов (через 21-22 часа) с тем, чтобы надежнее выявить возможные патологические нарушения или стойкие функциональные сдвиги. Препаровку и фиксацию отолитовых мембран проводили по той же методике, что и в опыте с крысами на центрифуге (см. предыдущий раздел). Состояние выделенных отолитовых мембран оценивали под световым микроскопом во время препаровки. Размеры отоконий измеряли под электронным просвечивающим микроскопом JEM-100B по той же методике, что и в опыте с крысами на центрифуге (см. предыдущий раздел). Для исследования рецепторных областей зафиксированные макулы утрикулюса и саккулюса и кристы заднего полукружного канала заливались в эпон-812, с блоков изготовлялись серийные срезы толщиной 5 и 10 мкм, которые исследовались под световым микроскопом.

4) Для исследования влияния условий клиностатической и антиортостати-ческой гипокинезии на структуру отолитовой мембраны было использовано 7 самцов обезьян Macaca mulatta возрастом 3-3,5 года, массой 2,8-3,8 кг (Лычаков и др., 1983). Эксперимент был проведен сотрудниками ИМБП, Москва, и ИЭПТ, Сухуми. Для имитации условий космического полета три особи в течение 7 суток с помощью специального костюма фиксировались в горизонтальном положении (клиностатическая гипокинезия), а затем весь ложемент наклонялся на 6°, и голова оказывалась ниже ног (антиортостатическая гипокинезия). В этом опыте моделировался постепенный переход к невесомости - постепенное перераспределение жидкостей в организме. В условиях антиортостатической гипокинезии (6°) животные находились 12 суток. В другом опыте одна особь находилась 2 суток в сидячем положении в специальном кресле, а затем была переведена в антиортостатическое положение (наклон к голове 6°) на 7 суток. В этом опыте прилив жидкости к голове происходил резко, т. е. имитировался переход к невесомости, происходящий в реальных полетах. Голова во время проведения опытов не фиксировалась. Три особи служили контролем. Фиксацию лабиринта производили до его выделения из височной кости, для лучшего проникновения фиксатора верхушка улитки обламывалась. В качестве фиксатора использовали 2,5% глютаральдегид на 0,1 М какодилатном буфере. Материал сохранялся в фиксаторе 1, 5 месяца. Перепончатый лабиринт, извлеченный из кости, исследовался под световым микроскопом, дофиксировался 1% 0з04 на 0,1 М какоди-латном буфере, обезвоживался в спиртах, помещался в амилацетат и высушивался при критической точке в С02. Высушенные образцы монтировались на металлических подложках, покрывались путем напыления в вакууме углеродом и золотом и просматривались в сканирующем микроскопе Д8М-35.

Отолитовая асимметрия

При вычислении межлабиринтной отолитовой асимметрии измеряли массы или объемы отолитовых мембран утрикулюса, саккулюса и лагены в левом и правом лабиринтах, затем вычисляли отношение массы (объема) меньшей отолитовой мембраны к массе (объему) большей отолитовой мембраны (Лычаков, 1992в). Эту величину, выраженную в процентах, принимали равной величине межлабиринтной отолитовой асимметрии. Для оценки межлабиринтной отолитовой асимметрии, встречающейся в природе, был использован материал, полученный в ходе исследования нормальной структуры отолитовой мембраны у пластиножаберных рыб (скаты морская лисица и морской кот, раздел 3.1.2), настоящих костистых рыб (14 видов черноморских рыб, гуппи и беломорская камбала, раздел 3.1.4) и голубя (раздел 3.1.5). Для оценки влияния измененной гравитации, т. е. невесомости или перегрузки, на величину межлабиринтной отолитовой асимметрии были использованы данные, полученные в ходе исследования отолитового аппарата головастиков шпорцевой лягушки, развивавшихся в условиях невесомости (см. выше), и рыбок гуппи, росших в условиях перегрузки на центрифуге (см. выше). Для количественной оценки характера раздражения лабиринтов при изменении величины отолитовой асимметрии и в зависимости от массы отолитовых мембран была использована математическая модель, разработанная нами и описанная выше (раздел 3.1.4.3.3).

4.3. Результаты Рыбы

1) При сравнении мальков рыбки Вгаскуёато гепо, развивавшихся в условиях невесомости на борту корабля "Союз-22" в течение 8 суток со стадии средней гаструлы, и мальков, развивавшихся в лабораторных условиях, между ними не было найдено заметных качественных соматических различий.

На рис.65 и рис.66 представлены контрольные и опытные препараты срезов головы мальков на уровне внутреннего уха. Препараты сняты в характеристических лучах исследуемых элементов и во вторичных электронах. Большая плотность белых точек соответствует более высокой концентрации элемента. При сопоставлении опытного и контрольного материалов не было выявлено существенных качественных различий, которые можно было бы отнести за счет воздействия факторов космического полета. Описание распределения Иа, К, Са, Р и Э в отолитовых органах рыбки Вгаскуёато гепо было дано нами ранее (см. раздел 3.2.3).

2) При исследовании отолитов взрослых гуппи, находившихся на борту биоспутника "Космос-1514" в течение 5 суток, была обнаружена значительная асимметрия по массе в утрикулюсе как в опыте, так и в контроле (табл.10). Исследование шлифов саккулярных отолитов не выявило существенных качественных различий по структуре внутренних слоев между опытом и контролем.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Лычаков, Дмитрий Витальевич, Санкт-Петербург

1. Невесомость 7 Крыса суток1. Невесомость 7 Крыса суток

2. Невесомость 18,5 Крыса суток

3. Перегрузка 4,15 Крыса 48 суток1. Перегрузка 2 Крыса30 суток

4. Распределение отоконий, форма отоконий (СЭМ)

5. Распределение отоконий, форма отоконий (СЭМ)

6. Структура макулы и отолитовой мембраны (СМ, ПМ), распределение Са в отокониях (РА)

7. Объем отолитовой мембраны (СМ)

8. Вибрация 18 или Крыса 30 Гц, 2 недели по 5-6 часов в день

9. Распределение отоконий, размеры и форма отоконий (СЭМ), содержание Са и других элементов в отокониях (РА)

10. Распределение отоконий, размеры и форма отоконий (СЭМ), содержание Са и других элементов в отокониях (РА)

11. Антиортостати- Макака Распределение Качественная оценка Лычаков и др., 1983ческая гипокине- отоконий, формазия, 2 недели отоконий (СМ, ПЭМ)

12. Исследование структурной устойчивости эмбриональной отолитовоймембраны и отолитов рыб