Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности взаимодействия монометиновых бензтиазоловых цианиновых красителей с ДНК: исследования спектрально-люминесцентными методами

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности взаимодействия монометиновых бензтиазоловых цианиновых красителей с ДНК: исследования спектрально-люминесцентными методами"

НЛДЮНЛЛЬНА АКАДЕМЫ НАУК УКРАШИ 1НСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНО! БЮЛОГПI ГЕНЕТИКИ

' "" КОВАЛЬСЬКА ВЛАДИСЛАВА БОРИСШНА

~ I I.... - '

УДК 577.336+577.113.7

ОСОБЛИВ ОСТ1 вздемодй МОНОМЕТИНОВИХ БЕНЗТ1АЗОЛОВИХ

Ц1АНШОВИХ БАРВШЮВ 3 ДНК: ДОСЛ1ДЖЕННЯ СПЕКГРАЛЬНО-ЛЮМШЕСЦЕНТНИМИ МЕТОДАМИ

03.00.03 - молекулярна бioлoriя

АВТОРЕФЕРАТ дисертавд на здобутгя наукового ступеня кандидата бюлопчпих наук

КИ1В-2000

Диссртацгсю срукопис.

Роботу виконано у вщдш структури i функцп нуклешових кислот 1нстшугу молекулярно! бю: i генетики МАИ Украши, м. Ки\'в.

HayKOßi кер1вники: доктор бюлопчних наук, професор, академш HAH Украши МацукаГеннгшй Харламлшович, 1нститут молекулярно! бюлоп! i генетики HAH Украши, директор шституту, заладувач яцщщу структури i функцш нуклешових кислот;

кандидат х1М1чних наук Ярмолюк Серпй Миколайович, Ьютагут молекулярно! 6kwiorii i генетики HAH Украши, старший науковий сшвроб1тинк вцщшу структури i функщй нуклешових кислот

Офщшш опоненти: доктор бюлопчиих наук, ст. irayкопий ствроб1тник Говорун Дмитро Миколайович

1нститут молекулярно! 6ioJiorii i генетики HAH Украши, заыдувач В1ддшу молекулярно! бшф1зикк;

кандидат бюлоп'чних наук, ст. науковий сшвробгтик Федоряк Дшггро Михайлович

1нститут бюоргашчно! xiMii та нафтохшП HAH Украши, м. Кшв, заш'дувач лабораторй xiMii нуклешових кислот

Провщна установа: Ки!вський нацюнзлышй ушперситст ¿меш Тараса Шевченка, бюлопчний факультет.

Захист дисертацд вадбудеться 18 квпня 2000 р. о 10 годин! на заыданш спещалазовано! вчено! ради Д 26.237.01 1нсттуту молекулярно! бюлогй i генетики HAH Укранш, за адресом: 03143 м. Кшв, вул. акадешка Заболотного, 150 (конференц-зала).

3 дисертащею можна ознакомились у 6i6nioTeoi 1нституту молекулярно! бioлoгií i генетики Н Укра!Ш1.

Автореферат роздано 17 березня 2000 року.

Вчений секретар спс1щл1зовано! вчено! ради, доктор бюлогтчних наук, ст. науковий ствроб!тник ^ "V Лукаш JUL

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ.

Актуалыпсть теми. За остатп роки значио зросло використання флуоресцентних барвнша'в для Ki;ibKicnoï та яккно! детеыш нуклешових кислот (НК). Завдяки cnoîM угакалъним спектральпим властивостям монометшкда щашшда барвники с найчутливттми з iciiyютах на сьогодшшшй дет флуоресцентних зонд1в, яю вшюристовуються з шею метою. LJi барвники практично не флуоресщюють у т'лыгому стат, але при утворенш комплекс™ з ПК, штенсивтстъ ïx випромпловашн зростас на деталька порядив. Таким чином фоновий надлишок вшьного барвника у cyviiini не запажае детекци НК. Щипни застосовуються як конкурептш замшники широковживаного бромистого етид|'ю для визначення ПК в розчинах та агарозних гелях, як флуоресцентш Minai в сиквенЫ нуклеотидних послщовностей, а також як барвники для в1зуагпзацп в кашлярному електрофорез! та флуоресценции микроскопа'. Чутлив1сть вданшових барвниюв на порядки перевшцуе чупидасть бромистого етид)ю OKpiM того, щагани пе каннерогенш. Тому синтез новях шашнових барвниюв, яю за cboïmh властивостями перевищугать ¡сиуюч! ниш барвники, с актуальним.

BiflOMOCTi про особливосп зв'язування т'аш'гов з НК гакож е корисною шформащею при конструюванш нових високочутливих щаншових барвниив для визначення ДНК та РНК. Поряд з ним, дослщження Mexaui3MÎB взаемоди щашнових барвниыв з НК ыоже розширити кнуючи уявлення про молекулярга мехатзми взаемоди малих молекул з ДНК та РНК, а В1дтак - i про струкгурно-динам1чну орган! защю НК та ïxhto поведшку, хцо може бути використано при створент нових лкарських прспарапв.

Загально прийнято юнування трьох основт« титв нековалеитшн взаемоди малих молекул з нуклешовою кислотою: зовннинс зв'язування молекул 3i сшраллю, борозенкова фпесашя, при якш молекула розташовуеться у велимй чи маленькш борозенш та штсркалящя плоских чи майже плоских ароматичних систем мгж сусщшми по лшпцогу парами основ НК.

Вщомо, що при свплоиому збуджетя монометшювих барвниюв легко вщбувасться транс- цис- фотспзомеризащя, що i с основним каналом дезактивацп enepriï електронного збудження. Зросташгя ¡нтенсивносп флуоресцепцй' монометинових щаншових барвниив, яке спостер^аетъся в присутносп ДНК, спричинеяо там, що молекули барвника утворюхиъ комгшекси з ДНК, в яких жорстко фшсусться тшьки одна конформащя щаншу.

На час постановки завдання в ттсратур) описано демлька моделей взаемоди щаншових барвниюв з НК. Зпдно з моделлто, запрононованою Jacobsen et al. (1995 р),

гомодимерний щанш TOTO взаемод!е з ДНК з перевагою до (5'-CTAG-3')2 miciü, зв'язуваипя. Хромофори цього барвинка ловшстю штеркалюють в м1жпарний проепр ДНК, розташовуючись так, що бедапазоловий запшнок знаходиться мш шримщинами, а хшошновий - Miac сус!дн1ми пуринами. Поряд з тнм, для щашнових барвнимв запропоновано реал1защю послщовно штеркаляцшного, а по-пм борозенкового мехашзмш фжсацп па ДНК (Norden et al. 1994 р). Але наведет в лиератур! модет взаемодп монометанових uiamnia з НК не можуть несуперечливо пояснити ¡снуют! експсримснтальш даш.

Зв'язок робота з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у вцщовщносп з планом иауково-дослших poöiT IMBiT HAH Украйш. держ. бюджетою темою "Синтез та вивчення механпму взаемодп щаншових флуоресцентних зонд|'в з нуклешовими кислотами"№ 2.2.4.16 за 1997-99 р. (№ держ. ресстраци: 0197U004292).

Мета i завдання достдження. Мета робота полагала у вивчснт за допомогою спеклрал ьио-л ю м mcci ichihux метод1в особливостей взаемодп монометшювих бензпазолових щаншовмх барвштв з дволанцюговою лшшною ДНК; у дослщженш впливу агрегаци щашн1В на Гхню взасмодпо з НК; у пошуку швих високо ефсктивних щашнових барвниюв - зонд1в для детекци НК.

Для виршення itici мети було поставлено таи завдання:

- дослвдгщ спектрально-люмшесцентш характеристики низки монометшювих щашнових барвнимв, як! мютять бензлазоловий фрагмент, вшышх та в комплексах з НК;

- вивчити особливоеп агрегагацц монометанових щашшв, яка супроводжуе утворсння комплекс!» барвнимв з ДНК, та залежтсть спсктрально-люмшесценпшх характеристик цих комплекав вщ сшввдаошення барвник/ пара основ;

- встановити особливосп поведшки монометиновнх щашнових барвшшв та i'xHix комплека'в з ДНК при додавакш домшпси оргашчного розчинника;

- охарактеризувати геометрпо взаемодп монометшювих бентазолових ц1аншових барвнимв з ДНК методом спектроскопа лшйного дихройму;

- дошидити специф^чшсть взаемодц щашнових барвнимв з сшггетичними полшуклеотидами poly(dA)poly(dT) та poly (dGC/dGC);

- вивчити вплив pH середовища на спектрально-люмшесцентш характеристики комплексов структурно шдабнкх щатнсвих барвнимв з ДНК;

- провести комп'ютерне моделювання геометри'шо'1 структури комплексов олнонуклеотиду GCTA:TAGC з щаншовими барвинками.

Наукова новнзиа одсржатгих результата. 1з застосуванням спектралыю-люмшесцентних метод!в вивчено особливосп взаемодн монометанових щаншових

бензттазолових барвниив з ДНК. Запропоновано i екснериментально обгрунтовано модель "натвштеркалящГ монометшювих шаншових барвниюв в дволанцгогову ДИК, зпдно з якою моделлго бензот^азоловий гетероникл "класично" штеркалгос шж сусщшми парами основ, TOfli як другой гетероцнкл просторово фжсуеться » маленькш борозенщ НК. Bnepine вивпено вплив агрегацй щаншових барвниыв на структуру та фпико-хшрпп властивосп" ixiiix комплексов з ДНК. Встаповлено зв'язок м)ж особливостями будовн мопометинових niariihíb та ixhímh властивостями як флуоресцентних барвниюв для ефективно!" детекци НК. Доведено, що метилещшокЫбентпазоловий фрагмент с перспективним для розробки високофлуоресцептпих зондт для дстекцп НК.

Практичне значения одержаних результат. Наявшсть шформаци про взасмод^ю щатнових барвниюв зокрема з ДНК, е важливою для конструювання нових, бщьш чутливих зоид1в для детекци НК. Результата дослщжень особливостей взасмодп монометинових щатптв з ДНК доповншш 1снукта знания про мехашзми зворотноГ взаемодн малих молекул з НК, що с корисним для розробки пропшрусних та протипухлинних препаратхв. Продемонстровано що монометтюв1 бентпазолоы' tuaiiúioBi барвники Cyan 13 та Cyan 40 е високочутливими флуоресцентними зондами для детекци НК.

Особистий виесок здобувача. Основний об'ем експерименталыкп робота, обробка i анал1з отриманих результат! в, формулювашм висновмв диссртащйно! роботи виконаш пошуковачем. Частину експериментальних дослщжень проведено у ствпращ з ствробтшками игддЬу структур» i функци нуклешових кислот 1МБil" НЛН Укршни -Юнменко I.B., Живолупом О.М. та асшрантом ф1зичного факультету КДУ ím. Шевченка Лосицьким М.Ю. Постановка задач! i обговорення результата проведет з науковими KepiBinncaMH.

Апробащ'я результатов дисертацп. Матер^али робота допов^далися на М1жнародщй конференцй з оргашчшн xímü (Харюв, 1995) на 8 Свропейсыай Конференци з Спектроскопа бюлопчпих молекул (Holland, Enschede 1999), a також на наукових семшарах вщдщу структури i функцй нуклешових кислот.

Публ|'каш"1. Основний зм!ст роботи вщображено у 6 статтях в наукових фахових журналах та 2 тезах доповщей на наукових конференщях.

Структура та обсяг роботи. .. Дисертаадю викладено на 110 сторшках друкованого тексту. Вона míститъ вступ, огляд Л1тератури, матер1али i методи, експериментальну частину, обговорешш результата та висновки. Список лпсрагури охоплгое 94 найменування. Дисертацпо прошюстровано 31 рисунком та 11 таблицами.

ОСНОВНИЙ 3MICT РОБОТИ Матср1али та мсггоди дослщжешш

1ндивщуальшсть та чистоту щашшв, що використовувалися у роботс (монометинов) uiaiiiHOBi барвники люб'язно палаш Ю.П. Ковтуном та Ю.Л. Сломшським (1нститу1 оргашчно! xiMii HAH Украши)) контролювали сукуптстю ф13ико-мм1чних методов, а саме ПМР- спектроскопа! та даними CHN анализу. Використовували ДНК з тимусу бика, тотальну дршджову РНК та синтетичш полшуклеощди poly(dA)po!y(dT), poly(dGC/dGC) (Sigma" (США)). Oprairi4Hi розчшпики ("Merck" (ФРН)) та iiuui реактиви (Aldrich" (США)) використовувалися без попереднього очищения.

Ctokobi розчини барвниив (210"3 М) готували шляхом розчинення барвншав в ДМФА, а стоков! розчини НК - шляхом розчинення наважки бшпол1мер1в в буфер! Tpic-HCl, (50mM, pH 7,5); ixiii концентрат становили 6 хЮ"3 М пар основ для ДНК та синтетичних полшуклеотид1в i 1,2х10 2 М основ для РНК. Величину коицентраци бюиошмерт встановлювали спекгроскошчно. Po6o4i розчини барвниив та ixHix комшгагав з НК готували безпосередньо перед вим^рюваиням шляхом розведення стокових розчишв барвника та НК в Tpic-HCl (50mM, рН7,5) буфер!. Похибка концентрацш становила 4.7 %.

Для вивчення спектрально-люмшесцентних характеристик шашнових барвниив та ix комплексов з НК використано метода спектроскопн електронного поглинання, лшшного дихройму та флуоресцентно! спекгроскош"!. Отримаш снектри електрошюго поглинання записували на модершзованому спектрофотометр] «Specord» М-40 (НДР). Похибка визначення довжшш хвюп при 185 ни становила 0,03 нм, а при 900 нм - 0,1 ни. Для реестрацй cneiapie флуорссценцц та cnewpie збуджешш флуоресцснцн використовували флуоресцентний спектрофотометр Hitachi Model 850 (Япошя). Похибка визначення довжияи хвил! становила 0,2 нм. Довжину хвшн збудження флуоресценцн брали ршною довжит хвия1 максимуму смути поглинання MOHOMepiB барвника у ш'дгешдному розчит. Bei вим1ри проводили при юмнатнш температур! у кварцових кюветах товщиною 10 мм. Снскггри лнийного дихро!зму отримано на снсктрополяриметр! Jasko J500, реестращя ¡зотрошчнид cneicipiB поглинання проведено за допомогою спектрофотометра Сагу 2300.

Комп'ютерне моделтовання проводили в наближенш молекулярно! мехашки (методи MMf та AMBER, верен 5.01), використовували пакет програм Hyperchem 5.01. I сомстрш барвника оггшм1зували в наближенш ММ+. Розрахунки геометрн комплексп ол!гонуклеотиду GCTA:TAGC з барвинками проводили в наближенш молекулярно! мехашки AMBER.

'Натвйггеркаляцшна" модель зв'язування монометинових nianiiim з дволанцгоговими НК

На осшда отриманих результата спектрально-люмшесцентних дослщжень взаемодй монометинових бсизопазолових шаниювих баршшюв з НК, спрямованих на визначення особливостей та мехат'зму щс! взасмодп, запроионоваио модель "нашвиггеркаляцц" монометинових цiaнiнoвиx барвниюв в ДНК, що посднуе штеркалящйкий та борозенковоий мехашзми. Зпдно з шио моделлю гетероцикл з бшьшою осноншстю фксуеться в нукпеофшьшй борозенщ, тод1 як бензо-пазоловий гетерошпш з меншою основшспо "класично" ¿нтеркалюе в електрофшьний можпарний просп'р (рис. 1). На нашу думку, електронна асиметр!я щаншового барвника спричиняе ттльки корекзну оркигацпо барвшка в процес! зближення з НК. Зв'язування основтшого гетероцтелу ввдбуваеться за рахунок електростатично! взаемодй з фосфатними групами НК. Першою стадкю формування комплешв для монометинових щаштв, як 1 для "класичних" ¡нтеркалятор1в с електпостатична взаемол!» бапвиика з молекулою 1ГК

Рис. 1. Розрахований комплекс барвшпеа Суап 40 з олшэнуклеотидом GCTA: TAGC. (1-бензпазоловий гстероиикл, який класично ¡итеркашос мЬк парами основ; 2- гетероцикл, що фксуеться у борозенщ за рахунок електростатично! взаемодй з фосфатними групами.)

Отримано низку доказав, як! евщчать, по-перше, на користь злачно! доступное™ молекули барвника, бшьшо! шж у виладку "класично!" ттеркаляцм, а по-друге, що мехашзм фжеацц мае штеркаляцгйшш характер, а не борозеиковий.

Спектроскотчт дослцжсння низки монометинових щашнових барвшиав, що мктять бештазоловий фрагмент, як флуоресцентен* зонд1в для детекцп НК

3 метою пошуку иових високоефективних зонд1в для детекцп НК вперше дослщжено спектралыю-лтомшесцентш властивосл низки монометинових бензттазолових щашнових барвниюв та ixuix комплексов з ДНК та РНК. Bei доелдакегп щашни е катюшшми i мають бензтсазоловий фрагмент. Ixui спектральт властивосл подано в Таблищ 1, БарвникТО,

игляд з боку цукрово-фосфатного кютяка

вигляд з боку мало! борозенки

вигляд зверху

спектральш характеристики якого досконапо вивчеш, наводиться як еталон пор^вняння. Нами продемонстровано, що збшыпення довжини N-алкшьного замюника нризводить до 31шже1шя штенсивносп флуоресцентного випром1нювання барвниюв у комплексах з НК. Введения до складу молекули барвника анюшшх груп (SO3", СОО") призводить до суттевого попршення флуоресцентних властивостей барвниюв (Cyan 1, Cyan 4, Cyan 5) як зощцв для детекци НК. Це явите, на нашу думку, можна пояснити негативним впливом цих груп на здатшеть барвника утворювата стабшьш комплекси з НК.

Ана1из отриманих результата заевщчуе перспектившсть метшхеноксибеншазолового фрагмента для конструювання на його ocuoBi високосфективних зоцд»в для детекци НК. Встановлено, що барвники Cyan 13 та Cyan 40 можуть використовуватись як флуоресцентщ зонди для детекци НК (таблиця 1).

Вивчення cepii' метилендюксибензт1азолових барвниюв (Cyan 3, Cyan 13 - Cyan 45, таблиця 1) продемонструвало, що для барвника Cyan 15 ciгостср1гаеться сутгеве нщвищення штенсивносп люмшесцешш при утворенш комплексе з НК. Але в склад! цього барвника знаходиться об'емний замгашк, який спричиняс значш стеричш утруднення, через яю цей барвник не в 3M03i повистю проштеркалювати, осиль ки розм1ри барвника значно перевшцують роз\«ри Уотсон-Кригавсыеих пар основ. В той же час результата спектрально-люмшесцентних дослцркень евщчать, що Cyan 15 взаемодце з ДНК за мехашзмом, подабним до механ1зм1в шших барвниив та ж cepii. Таи дащ не узгоджуютъея з «класичноюх моделлю повлого штеркаляф'йного входження барвника у внутршанш шжпарний npoerip Лопчно припустити, що деяка частина барвника знаходиться поза парами основ розташовуючись в борозешц НК.

Таблиця 1.

Спектральш характеристики комплекив монометинових беизлазолових щаншових

барвшшв з НК в буфер! Tpic.

Барвник Структурна формула ДНК РНК

Лабе, нм Х.ем, нм I, в.о. Лабе, нм Лем, нм I, во.

Cyan 1 HN(C3H,)S 417 435 503 0,66 417 437 492 1,05

Cyan 2 454 520 534 0,30 «480 0,08

СуапЗ 429 444 496 32,32 427 450 494 71,01

Cyan 4 370 481 635 0,40 I 370 I 495 625 0,48

Cyan 5 °3S ^COOH 485 508 543 1,69 485 508 541 0,96

Cyan 6 COOH 492 515 536 24,02 492 515 536 46,50

Cyanl3 OToe' Ccc^XJ 423 442 486 49,90 430 443 489 62,45

Cyan 14 z:xxrpo 397 484 16,52 403 446 487 29,90

Cyan 15 _ .ото»; Ljxxrpo 416 458 487 22,85 424 444 485 40,80

Cyan22 co^ro 423 442 485 35,70 431 453 489 41,30

Cyan23 co^o 423 442 486 22,90 431 453 491 25,60

Cyan 45 Crjp^O 407 427 472 ¡6,49 410 431 470 37,50

Cyan 37 442 485 12,32 442 483 11,28

Cyan 39 J¿Сцр 435 457 505 0,47 436 457 535 2,15

Cyan 40 ^¿cip 437 482 17,50 440 480 49,05

Cyan 41 476 496 530 12,64 477 496 528 12,40

Cyan 42 476 495 528 10,80 476 494 528 8,60

TO 485 508 532 16,78 485 508 537 19,54

Тут i нижчс: X абс- довжина хиил! максимуму попшнання; >.см- довжина хвши максимуму випромшюванпя; I - ¡птенсившстъ флуоресценци; в.о,- вщгост одшшщ.

Проведено також дослщження, яю спрямоваш на визначення способу фшсацп бщьш основного гетероциклу в борозешц НК. 3 гцею метою вивчено поведшку щаншових барвниюв (Cyan 41, Cyan 42 та ТО) (таблица 1.), то е структурними аналогами, але в)дргшшоться розподшом електрошю1 густинм, в комплексах з ДНК при змии рН середовшца (рН= 6, 5 та 9). Для цього використовували дв! процедури приготування розчину. В першому випадку необхвдне значения рН досягалося додаванням лугу чи кислоти до розчину комплекав барвник- ДНК. За другою процедурою комплекси барвник: ДНК готувалися безпосередньо у кислому чи лужному середовина.

Продемонстровано, що дослщжеш барвники взаемодноть з ДНК за подШними мехашзмашг. Змша спектрально-люмшесце1гших характеристик комплексов барвник- ДНК, що спосгериалася, при змпп рН, практично не залежить вщ процедури приготування розчин!в. В лужному середовшщ (рН= 9) eci барвники мають низький pieenb агрегацп та високий ршень винромшювання, для кислого середовшца(рН= 5) спостерп'аеться зворотня картина. Анагаз результата свщчить, що вщсутшсть електростатичноТ фшсацн позитивно зарядженого гетероциклу в борозенщ призводить до значного зниження штенсивностз випромшювання та зростання ступеню агрегацп барвника.

Агрегацт вшьних шапшових барвтннв та в ирисутност! НК

Важливим аспектом взаемодн барвник- ДНК та одним з доказ1в на користь запропоновашн модел1 ми вважаемо arperauiwii процеси, що супроводжують взасмодш щаншових барвниив з НК. 1снування процест агрегатоутворення у водних розчинах вшьних щашшв добре вадомо. Bono найчаспше супроводжуеться появою додаткових смут у спектрах поглинання. Для бшыпост! дослщжених барвнюав характерним е формува!Шя так званих Н- агрегал'в (асощ'аги сендв1чево1 структури), що проявляются у спектрах поглинання у виглядг смут, зсунузих у короткохвильовий бис вщносно мономерно! смути (рис. 2., А) Цей тип асощапв (рис. 2., Б, В) е нсфлуорссцентним тому збшьшення юлькосп таких агрегапв призводить до втрати барвшжаш! здатносп флуоресцшвати.

У спектрах поглинання комплексу барвника Cyan 13 з ДНК при стввшюшешл барвник/ пари основ ДНК 1:1 спостернаеться поява додатково! корюгкохвильово! смути близько 390 им, яка вщсутня у розчинах вшыюго барвника при таких же концентращях. У водному розчиш вольного Cyan 13 шостеркасться мономерна смуга поглинання близько 440 нм, та смута димерного Н- агрегату в обласп 420 нм (рис. 2, А, Б.).

А,%

<00 410 Я, КМ

Рис. 2. Спектри поглинання вхльного барвника Cyan 13-(1) i в присутносп ДНК при С1лввшношеннях:(2) - 1 :7 ( молекули барвника/ пари основ ДНК); (3) - 1 :2; (4> 2 :1; Л) смута мономерного барвника; Б) /химерного агрегату; В) Н- агрегату вищого порядку.

Ми вважаемо, що поява короткохвильово{ смути поглипання бшя 390 им спричинена формуванням агрегата високого порядку (юльюсть молекул барвника в структур! асошату три або бйыпе). Вони утворюготься безпосередпьо на ДНК в результат! стекшг- взасмодн вшьних молекул шатну з молекулою барвника, що вжв зафксована на НК. Утворення под1бних агрегата високого порядку в водних розчинах для вшьного барвника при таких саме концентращях не спостср1галося.

Наведен} результата вказують па непридатнюгь модел! полно! ттеркаляцп для дослцркених барвнигав у випадку реал1зацц давно! штеркаляпн зв'язана з ДНК молекула барвника повшепо знаходиться м!ж парами основ 1 не може утворювати агрегат з вшьною молекулою барвника,

тод1 як на ¡снування таких агрегаттв вказують отримаш результата. Щ даш вказують на нашвштеркалящю, коли деяка частина молекули барвника знаходиться поза основами 1 доступна для утворення агрегату.

Дослвдження вплнву домшнеи оргашчних розчииннюв на сиектралыго-люмшесцентм характеристики комплекав барвннк- ДНК

Для ДОСЛШЖСШ1К впливу присутносп домипки р1зномаштних оргашчних розчиннимв на спектрально-люш'несцентш характеристики комплекмв барвншав з ДНК використано монометишш бензттазолов! iliairnioBi барвники ТО та Cyan 13. Для нортнягпш брали класичний штеркалятор барвник бромистой етидш, який не належить до класу монометинових тианнпв Додавання 15 % домшгки оргашчних розчиннию'в до водного буферу практично усувало агрегащйш процеси у розчинах щашнових барвниюв. Для розчишв В1льних ТО та Cyan 13 зменшення илькоетт агрегатов при пониженш полярносп

середовища супроводжувалося ш'двищсошям нггеоосивности флуоресценци в деколька paiin. Навпаки, для комплексов барвник - ДИК, для яких теж спостерцалося зменшення штенсивносп агрегацшпоо смуги, штенсившсть флуоресцеонцо зменшувалася (таблиця 2.).

Таблидя 2.

Характеристики cneocrpie флуоресценци барвинков Cyan 13 i ТО та охнох комплекЫв з ДНК в присутносто домошки розних оргамчних розчинниюв.

Барвник Cyan 13 ТО

вшыпой ДНК волышй ДНК

Розчшшик А,ем, нм 1о. в.о. Хем, нм I, в.о Хсм, нм 1о. в.о. Хсм, нм I, в.о

Буфер 520 0,23 492 28,20 — 0,04 538 12,10

Метанол 515 0,19 495 11,00 — 0,05 538 9,34

Етанол 515 0,27 495 15,35 570 0,10 540 8,30

1зопропанол 515 0,31 490 17,94 570 0,08 540 10,50

Гло'церин 515 0,29 493 23,80 565 0,06 540 9,86

Ацетон 510 0,38 490 7,06 560 0,21 540 6,37

Дооксан 505 0,60 490 6,45 557 0,28 540 5,13

ДМФА 505 0,32 490 8,75 560 0,06 540 5,85

ДМСО 510 0,22 485 11,00 560 0,07 540 10,23

Огримаооо результата вказують на те що для бромистого етидою зменшення imeucHBiiocTi флуоресценци" комплексов барвник -ДНК при додаванш оргашчких розчинниюв невелике (22-28%) i до того ж мало залежить вод природи домипки. Це можна поясните, спираючись на доведений штеркалящйний мехашзм взаемодоо бромистого етидою з ДНК. Оскшьки молекула барвника штеркалюс мiж сусодоими по ланцюгу парами основ ДНК, куди внасладок пдрофобних взаемодш не потрашшоть молекули середовшца, то можна зробити припущення про те, що за таких умов П контакт з молекулами оргашчного розчшшика значною юрою обмежений.

Навпаки, для оцашшв спостсргаеться велика залежность зменшення штенсшшосто флуоресценци комплексов барвник -ДНК вод природа домшпеи при додаванш оргашчних розчинншав (16-77 % для Cyan 13 та 13-58% для ТО, Таблиця. 2). На наш погляд, чисто нггеркаляцшна модель взаемодп оцаганових барвниюв з ДНК не може цього поясните. Цей ефект пояснюеться механозмом часпсовоо онтеркаляцц барвника в ДНК, оскшьки лише у оц>ому випадку молекула щашну е быьш "вщкритою" для взаемоди з зовнппном оточенням.

Але наведет у представлетй робел фактч, яга сш'дчать на користь "вщкритоетт" молекули щаншового барвинка у комплеюл з ДНК також могли б добре пояснюватись ¡снуванням борозенкового, а не штеркаляцмного мехашзму взаемодп з ДНК. Доказами того, 1до взагмод!я них барвнимв з ДНК мае ¡нтеркалящйний характер ми вважаемо:

по-перше, наведет в лператур! даш стосовно структури комплексу барвника TOTO (гомодимеру Ъ'азолового оранжевого) з олпонуклеотидом d(CGCTAGCG)j, отримаш за допомогою дво!шм1рного ЯМР (Jacobsen etal. 1995 р). Також шзеркалящйний характер було шдтверджено спектрами лпшшого дихро'ому, отримшшми для барвника YO, що с оксазоловим аналогом ТО (Norden etal. 1994 р).

гго-друге, проведет нами додатшй дослщження сиециф1чносп взаемодп монометинових щаннпв з синтетичними шшнуклеотидами та отримаш спектри лтйного дихровму комплексу барвника Cyan 40 з ДНК.

Дослдакеиня, що евщчать на користь нгтеркаляцшного типу взаемодп: спсциф^чшсть взаемодп шаншових барвникш з гкыпнуклеотидами та спсктри лшшною

днхроТзму

Вщомо, що специфггтсть зв'язування молекул, що взаемодпоть з ДНК за штеркалящйним та борозенковим механЬмами суттево вщр1зняеться. Молекули, що взасмодпоть за борозенковим мехашзмом демонструють значну перевагу при зв'язуванш з AT- послщовностями, тод1 як для штеркалюючих молекул спостер1гаеться незначна переважт'сть до GC- дшяпок ДНК. Таким чином, вивчення загадано! специф;чносп зв'язування дослщжуваних щаштв е корисним для шдтвердження того чи imuoi o мехашзму взаемодп барвштв. Для цих дослшкень були внбрат структурно pi3Hi щаншов1 барвники-мономегинов! iiiaiiiiiu ТО, Cyan 40 та Cyan 13.

У Таблиц! 3 наведено спектральт властивост!' щ'аншових барвниюв в комплексах з гаотнуклеотидами poly(dA)poly(dT) та poly(dGC/dGC). Для Bcix дослщжешсх барвштв положения максимум1в смуг поглинанпя комплектов практично не залежало вщ типу використаних полшуклеотидт та практично збиалося з розтатуванням вщповдашх максимум1в в комплексах з ДНК. Форми спектр1в випромшюванпя та положениям максимум!» для дос.'пджепих барвшдав у вадповщних комплексах з ол!гонуклеотидами та ДНК практично не ш'дрппялися. Тнтенсииш'стг, нинромипования для комплексе барвника Cyan 40 з poly(dGC/dGC) практично втрич; перевищус його флуоресцешцю комшгекеш цього щашну з poly(dA)poly(dT). Флуоресценция барвника Cyan 13 в комплект з poly(dGC/dGC) бигыпе щж в чотири рази перевшцуе флуоресценцпо з poly(dA)poly(dT), штенсивюсть випромшювання иього щашну з нативною ДНК перевищуе штенсивтсть комплекав з

полшуклеотидами. Для барвника ТО штенсившсть випромшювання комплекив для нолшуклеотвдв та наткано! ДНК мало вщрпняються (таблиця 3).

Таблиця 3.

Спектрапьно-люмшесцентш характеристики комплекав щаншових барвншав з полшуклеотидами poly(dA)poly(dT) та poly (dGC/dGC).

poly(dA)poly(dT) poly (dGC/dGC) ДНК

Барвник Хабс им Хал нм I в.о. Хабс нм А.ем нм I в.о. Хем нм I в.о.

Cyan 13 442 495 9,70 442 491 40,02 492 45,05

Cyan 40 439 480 15,61 439 480 48,11 480 60,11

ТО 508 537 14,22 508 537 14.30 535 16,15

Очевидно, що ми не можемо зробити значних узагальнень щодо переважнос-ri зв'язування для доыцджених uiaiiiiuB, проте жоден з барвнимв не продемонстрував суттсво1

спегшф|чност1 при взаемодн з полшуклеотидом poly(dA)poly(dT). Ми розукиемо цей факт як додаткове свщчення на користь штеркаляцшного типу взаемодн монометинових щашшв з ДНК.

1итеркаляцшний характер фжсацп молекул монометинового бензпазолового барвника Cyan 40 на ДНК гадтверджено також за допомогою спекгроскопп лшшного дихройму (рис. 3). Лшшний дихройм (LD) визначасться як р1зниця поглиианпя свила, поляризованого паралельно та перпендикулярно макроскошчнш oci opif inauii комплексщ ДНК. Зведений лшшний дихройм (LDr)e нормована величина, яка не залежить вщ концентрацп га довжини оптичного шляху.

Отримаш результата засвщчують, що

Рис. 3. - Спектри лпптгаго дихроУзму т . . ,.г . , , -ч тг

величини LD i LD с вщ емиими (рис. 3). Це

барвника Cyan 40 в комплекс з ДНК. LD- лшшний

дихройм, А- Ьотрошчна адсорбци, LD'- зведений однозначно вказуе на те, що молекули лшшний дихро!зм. барвника ор!ентуються перпендикулярно

довгм oci ДНК (яка у даному випадку грае роль макроскошчно! oci оркнтанп), це сш'дтпъ про наявшеть под]бного до ¿теркалящ'йною мехашзму фкеацн барвинка в ДНК. Тод1 як при реал1защ1 борозенкового типу взасмоди барвника Cyan 40 з ДНК молекули niaiiiny розташовувалися б паралельно довпй oci ДНК i, таким чином, величини LD та LD' були б додатними.

На нашу думку запропонована в представленш робой модель "натвштеркаляцп" монометинових щаншових барвниюв в ДНК добре узгоджуеться з результатами спектрально-люмшесцентних дослщжень та може бути використана для опису взасмоди цього типу барвниив з ДНК. Але, безперечно, реал1зутоться також imni мехашзми зв'язуватшя, як) ¡стотио залежать вщ структурных особливостсй самих барвниив.

висновки

1. Вперше запропоновано та експериментально обгрунтовано модель нашвщтеркаляцйного зв'язування монометинових бензиазолових шаншових барвниюв у дволанцюгову ДНК, яка поеднуе борозешовий та игтеркаляцшшш мехашзмн взаемодн. Зп'дно з нею, основшшнй бензолазоловий гетероцикл шатну класично вбудовуеться мгж сусщшми парами основ, а гетероцикл з метлою основшстю фжсусться в борозенц! НК за рахуаок електростатично! взасмоди з позитивно заряджешгми фосфатними групами.

2. Вперше отримано снектрально-люмшесцентт характеристики вгамнадцяти монометинових щаншових барвниив, що мктять бензолазоловий фрагмент та ixirix комплекс) r з НК. Вперше встановлено, що барвники Cyan 13 та Cyan 40 е перспективними флуоресцентними зондами для детещи НК.

3. Спектрально-люмшесцентними методами вперше дослшжено arperaniro щаншових барвншав у водних розчинах, що супроводжують ¡'хню взаемодда з НК. Вперше показано, що у присутносп' надлишку барвника ш процеси спричиняють формування на НК асошата високого порядку, ski мають севдвмеву структуру.

4. Вперше вивчено вплив присутносп домшюк оргашчних розчинншяв на снектрально-люмшесцентш характеристики комллекеш монометиновий щашновий барвник- ДНК та встановлено, що молекула барвника за таких умов с набагато достуишшою для зовшшнього впливу, шж молекула класичного шгеркалятора - бромистого етщцю.

ПЕРЕЛВС ОСПОВ1ШХ НАУКОВИХ ЦРАЦЬ, ОЯУБЛЖОВАНИХ НА ТЕМУ

ДИСЕРТАЦЙ.

1. Yarmoluk S.M., Zhyvoloup A.N., Kovalska V.B., Klimenko J.V., Kukharenko A.P, Kovtun Yu.P., Slominsky Yu.L. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. I. Studies on monomethync as possible fluorescent probes for the nucleic acids // Биополимеры и клетка, - 1996. - 12, №1 .-С.69-74.

2. Yarmoluk S.M., Kovalska V.B., Smirnova T.V., Shandura M.P., Kovtun Yu.P. and Matsuka G.Kh. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. II. Spectroscopic properties of methyleneoxy analogues of Thiazolc Orange // Биополимеры и клетка. - 1996. - 12, №6. - C.74-81.

3. Yarmoluk S.M., Kovalska V.B., Kovtun Yu.P. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. V. Towards model of "half intercalation" of monomethyne cyanine dyes into double-stranded nucleic acids //Биополимеры и клетка. - 1999. - 15, №1. - C.75-83.

4. Yarmoluk S.M., Kovalska V.B., Lukashov S.S., Slominsky Yu.L. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids. ХП. P-substituted carbocyanines as possible fluorescent probes for nucleic acids detection // Bioorganical & Medicinal Chemistry Letters - 1999 - V.9. - P. 1677-1678.

5. Кочешев I.O., Ковальська В.Б., Ярмолюк. C.M., Акерман Б. та Мацука Г.Х. Взаемодгя щатнових барвниюв з нукле'шовими кислотами. 15. Спсктрально-люмшссцентш властивосп нових бензиазолме1Шен-2,5-диметилшридишсвих гомодимерних та гомотримерних щаншових барвниюв та охнох комплексов з нуклешовими кислотами //Биополимеры и клетка - 1999. - 15, №6. - C.S57-567.

6. Лосицький М.Ю., Ковальська В.Б., Ярмолюк С.М. Взаемоддя ц1аншових барвников з нуклешовими кислотами. 9. Вивчеши спектральиих властивостей комплексе щаншових барвниюв з ДНК в присутаосп оргатчних розчинниюв И Биополимеры и клетка - 2000. - 16, №1. - С.75-81.

7. Ярмолюк С.М., Кухаренко О.П., Ковальська В.Б., Шандура М.П., Ковтул Ю.П. ДocлiджeнIlя асиметричних цоаншових барвниюв як зондов для вивчення нуклешових кислот //17 Укр. конф. з оргатчноо хоми (Харюв, жовтень 1995): тези доп. - Харюв, 1995-1, - С. 262.

8. Lossytsky M.Yu., Kovalska V.B., Yarmoluk S.M. The spectral properties of cyanine dyes-DNA complexes in prcscncc of orgaroic solvent.// в"3 Europ. Conf. Spectroscop. Biolog. Molec.(29 Aug.-2 Sept. 1999, Enschede, Netherlands): post-deadline papers -Enschede, 1999.,-P. 15-16.

АНОТАЦЦ

Ковальська В.Б. Особливоси' взаемоди мономепшових бснз-пазолових щашнових барвниюв з ДНК: дослдакенпя спектрально-люмшеспептггами методами. - Рукопис.

Дисертащя на здобутгя паукового ступеня кандидата бюлопчних наук за спешалыпстю 03.00.03- молекуляриа бюлопя. - Incmryr молекулярно! бюлогп i генетики НАНУкраши, Кшв, 2000.

За допомогою спеетрально-люмшесцеитиих методов дослщжено особливост! взаемоди мономепшових бентпазолових шаннгошх 6apBHinciB з ДНК. Вперше запропоновано модель "нашвштеркаляци" мономепшових щ'аннпв в ДНК, зпдно з якою гетероцикл з бшыдаю основшстю фжсуеться в бороздвд ДНК, тод1 як менш основний бензопазоловий гетероцикл "класично" ¡нтеркалгое в елекгрофшьний м1жосновний npocrip. Зв'язуваютя бшын основного гетероциклу вщбувасться за рахунок елсктростатичноТ взаемоди з фосфатшши групами ДНК. Вивчено вплив агрегащйних процемв, що юнують у водних розчинах щашшв, на структуру та спектрально-люмшесцентт властивосп комплекив барвник- НК. Дослщжепо спектрально-люмшесцентт властивоста cepil з вшмнадцяти мономепшових щаншових барвниив та ix комплекте з ДНК та РНК. Вперше продемонстровано, що барвники 2-[(3-метил-2(ЗН)-бензо'пазолш1ден)-мета)1]-5,6-диоксиметилен-3-метил- бензопачолш п-толуолеульфонат (Cyan 13) та 4-[(1-метил-бензот1азолипден-2)метил]-1,2,6-триметилшридитум перхлорат (Cyan 40) е перспективними флуоресцентштаи зондами для детекци НК.

Клюнет слова: флуоресцентш зонди, монометинов1 nianiiiOBi барвинки, ДНК, РНК, нековалентнз взаемод1я.

Ковальськая В.Б. Особенности взаимодействия монометиновых бензтиазоловых цианиновых красителей с ДНК: исследования спектрально-люминесцентными методами. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.Q0.03- молекулярная^ бцология. Институт молекулярной, биологии.. и генетики НАН Украины, Киев, 2000.

С помощью спектралыю-люмипесценгаых методов изучено особенности взаимодействия монометиновых бензтиазоловых 1[ианинокых красителей с ДНК. Впервые предложено гипотетическую модель "полуинтеркаляции" монометиновых цианинов в ДНК. Согласно с предложенной моделью, гетероцикл большей основности фиксируется в бороздке ДНК, а бензтиазоловый гетероцикл, меньшей основности, "классически" интеркалирует в електрофильное межосновное пространство. Фиксация гетероцикла с большей основностью происходит за счет электростатического взаимодействия с фосфатными группами ДНК. Исследовано влияние агрсгационных процессов, существующих в водных растворах цианинов, на структуру и спектрально-люминесцентные свойства комплексов краситель-

НК. Изучено спектрально-люминесцентные свойства серии из восемнадцати мономстиновых цианиновых красителей и их комплексов с ДНК и РНК. Впервые показано, что красители 2-[(З-метил^ЗЩ-бензотиазолилиденуметил^З^-диоксиметилен-З-мегилбензо-гаазолий н-толуолсульфонат (Cyan 13) и 4-[(1-мет1ш-бензотиазолилиден-2)метил]-1,2,6-триметилпиридиниум перхлорат (Cyan 40) являются перспективными флуоресцентными зондами для детекции НК.

Ключевые слова: флуоресцентные зонды, монометиновые цианиновые красители, ДНК, РНК, нековалентиое взаимодействие.

Kovalska V.B. Peculiarities of interaction of monomethyne benzothiazole cyanine dyes with DNA: study by spectral-luminescent methods.-Manuscript.

Thesis for a degree of Doctor of Philosophy (Ph.D.) in Biology, speciality 03.00.03 -molecular biology- The Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences ofUkraine, Kyiv, 2000.

Features of monomethyne benzothiazole cyaninc dye interactions with DNA were studied using-various spcctral-Juminescent methods. Based on experimental results "half-intercalation" model of monomethyne cyanincs - DNA interaction was proposed. The model is based on a combination of groove and intercalation mechanisms. According to the model, DNA base pairs overlap with the central part of the dye molecule and the heterocycle with the lower electron-donor ability. The template with the higher electron-donor ability is attracted to the negatively charged phosphate ions of the DNA backbone and is placed in the DNA groove.

The influence of organic solvent on spectral-luminescent properties of the dye - DNA complexes was studied for the first time. It was shown that the cyanine molecule in the complex is considerably more exposed to the external environment than a "classical" intcrcalator. The influence of aggregation processes in water solutions of cyanines on structure and spectral-luminescent properties of dye-DNA complexes were investigated. Behavior of such aggregates in the presence of DNA and formation of other types of aggregation structures in the presence of this biopolymer confirm considerable "openness" of the dye molecules in complexes with double stranded DNA. At the same time, linear dichroism spectroscopy and studies of binding specificity suggest that cyanine dyes interact with DNA by intercalation.

Spectral-luminescent properties of a series of eighteen monomethyne cyanines and their complexes with DNA and RNA were investigated. It was shown that the dyes 2-[(3-methyl-2(3H)-benzothiazolyliden)-methylJ-5,64lioxymethylene-3-methylbenzothiazolium p-toluenesulfonate (Cyan 13) and 4-[(l-methyl- benzothiazolilydene-2)methyl]-l,2,6-trimethylpyridinium perchloratc (Cyan 40) can serve as fluorescent probes for nucleic acids detection.

Key words: fluorescent probes, monomethyne cyanine dyes, DNA, RNA, non-covalcnt interaction.