Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности ВИЧ-инфекции в культивируемых лимфоцитах больных СПИД и инфицированных лиц

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности ВИЧ-инфекции в культивируемых лимфоцитах больных СПИД и инфицированных лиц"

- 8 О -1 9 1,

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ имени Д. И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи

УДК 578.612-022.6+57.086.835

КУЧЕРОВ Игорь Иванович

ОСОБЕННОСТИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ЛИМФОЦИТАХ БОЛЬНЫХ СПИД И ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ

03.00.06 — Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1990

(

Работа выполнена в лаборатории зирусоЕ лейкозов Института вирусологии .им. Л. И. Ивановского АМН СССР.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук М. И. Парфаноакч

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Л. Д.. Кущ

кандидат медицинских наук Л. .1 Лиознер

Еедукчя организация:

Институт микробиологии АН Дате. ССР км. А. Кирхенштейна

Зэдита диссертации состиш-ся " ^ г.

в Ш час, на заседании специализированного еотета Д 001.20.01 по защите диосертлции при Институте вирусологии им. Л. И. Уна-новсгаго АШ СССР по с-дреоу: 12$09С. Москва, ул. Гамааен, 16.-Институт вирусологии Af.fi! СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии АМН СССР.

Автореферат разослан " ^¿¿¿¿рТЧ 189(^г.

Ученый секретарь специализированного совета

A: U. НУКОВСКИЙ

- ~ -

КТУАЛ1.1iOOTL ПРОВ ЛЕл<Ы

ИНДрОЫ Приобретенного иммунодефицита (СПИЛ) - ОГфТОЛЬ ичфеющонное паболеваяие, • -вызываемое вирусом •л«муг'олефш;и,га челс-Еска (БИЧ), хараитериоувдеесл тяжелым поражен vom иммунной система и получиЫгее широкое распространение во многих стрниах мира. По данным »ЮЗ на 1 февраля 1990 г. в ШЗ отр-чнах было зарегистировано 215 1-14 случая заболевания, а число БИЧ - инфицированных оценивается в 5-10 млн человек.

Г: СССУ на 1 января ЮйО г. вьс.в/кно 89S» ВИЧ-инфицирован • них лиц (иь них 1Й9 советских граждан). Выявлены и больные CISOfc иностранцев 3 (умерло ó), советских граждан 19 (умерли >2). Однако, гарегиотрироьанныи в СССР случаи, дакт неполную |«1!,тину, а истинны* раьмери ВИЧ-инфицированное™ в стране пока т ру дно спре деjiHT ь.

В числй мор профилактического характера важнейшее место занимает рпоработкп надежных методов лабораторной диагностики СПИД и выявления вирусо.чосителей с помощью обнаружения в сыворотках крови антител к WA. Однако, несовершенство отечествен-' них тест -систем, неполное совпадение рерультатов серологических методов исследования в различных тест-системах, влияние сроков обследования подозреваемых на ВИЧ-ивфицированность на результаты анализе в, обратная серокопверсия антител (AT) к Bilk у некоторых пациентов, а также отсутствие совпадения результатов при лабораторном тестировании отдельных компонентов вируса могут приводить к тому, Hi'o, наряду с ложноиоложитедьиши, имеют место случаи я ложноотрицате.лышх результатов, которда moi l'v HOBJvUb собой не*?лаг «лшг поелсдетгия.

Поэтому представлялись аКТучЛЫЦ'М в нчптх условиях изучить дополнительные критерии подтгврлдешм ыимупойюгиФ-сккх данных при постанов!« диагио.".* ШЧ -кяоят«:л* ;йш>."ти ь com'hv-

тельных случаях с использованием культур лимфоцитов от подозреваемых лиц, а также выяснить некоторые особенности ВИЧ-инфекции в таких культурах и определить факторы, оказыг-аицяе на нее слияние.

ЦКЛЬ И ЗЛДЛЧ!' ИССЛЕДОМШ.

Целью настояний работы было изучение дополнительных критериев подтверждения иммунологических данных о ВЙЧ-инфицированное™ методами молокулярно-биодогичкского анздизч <•■ использованием культур лимфоцитов от подозреваемых' лиц с биологической и физической стимуляцией репродукции вируса в них.

В связи о этим суздк.адеь следуйте ь-адачи:

1. ЙССЛеДОЕа'ГЬ сыворотки кропи больных 01Щ и подозреваемых на ЕИЧ-инфицировашюсть в иммунофермектном анализе (МФА) нескольких тест-систем д.пн уточнения диагноза и отбора образцов крови для последующей р.;ооты.

2. Последовать повторно' поло.чэтельнно в ИФЛ сыворотки крови б ишиуношютннге (ИВ) для подч рерл^енкя наличия в них антител к белкам РИЧ и установления их спектра.

А Получить культуры лик-фэцитоь от оольцых СПИД и подозреваем ц> на ШЧ-инфм"иросаиность лиц и отработать оптимаш.ные условия их длительного культивирования.

4. Исследовать полученные культуры лим^онит'ов больные СПИД и подозреьаемых на ЕИЧ-инфицированность «»ц е целью поиска ь них компонентов вируса (антигенов, ГИК-з^ксимой ДНК-«о лимеразы и премируемой ДНК) к различные сроки нося» сокудьти-ькрования с чуьствитедишми лимфоцитами здоровых доноров.

Г.. Уст.-шогяп. дополнительные критерии оцдяки иммунологи ческих дагшнх о ШЧ-юцюцироьанйости в ссмнотельш« случаях.

(3. Определить особенности ВОТ-инфекции в длительно куль тивируемых лим^юцитгл и установить факторы, оказывающие стимулирующее влияние на репродукцию вируса.

ПОЛОЮГИЯ, ВШЮСШЬЕ НЛ ЗАЩИТА.

1. Для подтверждения ЕКЧ-ин^ицированности необходимо комплексное исследование материалов ит подозреваемых лиц с использованием не только иммунологических методов выявления антител к ШЧ в сыворотках крови, но и молекулярно-биологич&ских у^тодов обнаружения компонентов вируса в культивируемых лимфо-.,у пациентов.

Необходимо считать ШЧ- инфицированными тех лиц, в еы~ чгчютках крови которых определяются антитела г. БИЧ в 1:\'>'*ноблотинге и/или в культивируемых лимфоцитах методом п:ДриД(1зг.цпл обнаружена провирусная ДНК ШЧ. г*.. 1,ИЧ-инфекция в длительно культивируемых лимфоцитах БИЧ инфицированных лиц переходит в латентную форму с эпизодическими кратковредеикшм сезонными периодами активации вируса.

4. Гамма- из лучение способствует активации латентного ви-чугп в культивируемых лимфоцитах ВИЧ-инфицировакних лиц.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТА 1. В результате проведенных исследований отработана методика длительного культивирования лимфоцитов ВИЧ-инфицированных ниц. которая мо№т быть использована как для выделения вируса, |'пк и для закреплении его в продуктивной клеточной линии.

?,. Выявлены кратковременные сезонные периоды активации патентного н;1Ч в длителм-ю кульгипируемых лимфоцитах илфициро-••»•'•т^х лиц.

1"'.П£')1ЬМ" lli.KWr.HH4 В(Г ;><.-|УЛи(""Г!. аК'!'1!К'!!'ИИ ГнЧТН'Н О ГИЧ

в культивируемых лимфоцитах инфицированных лиц гамма-излучением, что может иметь значение для выяснения некоторых особенностей как происхождении вируса, так и патогенеза заболевания.

4. Совместно а коллективом авторов впервые в нашей стране изданы "Методические рекомендации по определению антител к гарусному антигену у больных с приобретенным 'иммунодефицитом им-муно'^'рмонтнмм методом" (Москва, 18Я6, 200 экз. , е. ).

АПРОБАЦИИ РАПОТЫ.

Материалы диссертационной работы били доложены й обсуждены на расширении»,-; заседании Ученого еоьета Института ьирусоло-г ии им. Л- И. Ил. «о некого АМН СССР (декабрь 1Н&7 г.) и кон'^рен-нии-конкурсе молодых ученых Института вирусологии им. Л. Л. Ивановского ЛЫН СССР (декабрь 1988 р.).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертационная работа изложена на 13<1 страницах машинописного текста и состоит из введения, обаора литературы, еобс-тььнныу исследований, обсуждения результатов л выводов. Полученные результаты олкстрирумтся J0 таблицами л 14 Рисунками. Список литературы включает 1G5 патриотам;-»"!.

гКЙУЛЬТАТЫ ИСС.ЩОЕ/МШЙ.

Исследование сывороток кропи в теет-систек'ач ИДА.

С декабря 1934 г. по август 1906 г. на исследование полупило 37 ог.раацов сывороток крови от пациентов, 2 из коте pi,ix имели диагноз "СГМД", а остальнн; подозревалась на ВИЧ-пн-фицириыишасть. Ог этих лг лиц била получена и кровь, стояли-

зиреьанная геларлном, для выделения лимфоцитов. У 19 из них при первичном скрининге била обнаружена ВИЧ-ееропоэитивность при использовании МФА тест-системы "Эб0отт"(С1Ш, для осталь ных сывороток такие данные отсутствовали. В качестве контрольном группы г5или исследованы сыворотки крови 65 доноров, проживающих ц г. Москве.

Образцы сывороток повторно исследовались на присутствие АТ к ВИЧ в 1МА-тест-системах "Антиген" (Московский 1Ш вирусных препаратов МЗ СССР. Институт вирусологии АМН СССР, НПО "Антиген"). "Пептоскрин"С Институт иммунологии Ш СССР) и "Ор-гйнон'Ч Голландии).

Г; результате проведенных анализов подтверждающие Результаты о наличии АТ к ВИЧ были получены в 0 сыворотках иностранных ¡'раздан при отрицательных результатах для всех Ой донорских сывороток но ьс-ех использованных тост-системах. Таким обра&ом, повторное подтверждение ВИЧ-серопозитивности получили в КФЛ 472 сывороток (N0. 1, 2, 9, 10, 11, 15, 17, 24 и 26). Из них 4 сьъорптчи имели высокие титры АТ (свыше 1: 10 ООО).- Я получены от больных СПИД (N0.1 и 15) и ?, - от подозреваемых на БИЧ-инфицированность (N0.2 и 10).

Однако, б нескольких случаях не было полного совпадения результатов КТА при постановке анализа в разных тест-системах. Так, сыворотки N0. 1) и 24 'дали негативные результат и в тест-системе "Пентоскрин" в го время, как в других результаты бьии положительными. Сыворотка Мо. 7, при отсу гстгии данных по "Э0ботт"-1Й'Л, оказалась позитивной в "Антигене", но отрича-':".льно1* в системах "Органон" и "Пептсскрин".

Тшиш ооразом, на 1 предварительном этапе исследований, по данным №Л, было выпялено Я ВИЧ-позитивных сывороток 1-4)01-,и, а так;» оонарукечо неполное совпадение результатов в доыычных

тест-системах №А при исследовании сывороток подозреваемых на ВИЧ-инфицированность лиц.

Исследование сывороток крови в иммуноблотинге.

Следующим этапом явилось определение спектра ЛТ к раьлнч-ным белкам ВИЧ в этих 9 ЦОД-позитивных сыворотках. . ИБ-акализ проводился с использованием иммунодиагкостических наборов "Дюпон" (США).

Исследования проводились совместно со ст. н. сотр. Института эпидемиологии и микробиологии. им. R Ф. Гамалея Г. И. Медведевой и 11 В. Яхно.

Б результате ИБ-анализа присутствие AT к различным белкам ВИЧ выявлено в 8 из 9 сывороток (сыворотка No. 9 оказалась негативной). Данные о наличии AT к ВИЧ в исследованных сыворотках крови при использовании ИФА и ИЕ суммированы в табл. Г. ^

И5 данных табл. 1 видно, что спектр выявленных AT оказался не одинаковым. Так, если у 2 больных СПИД (No. t и 15) результаты ИТ; почти полностью совпадают (за исключением отсутствия AT к plV у ЛБГ), 'го у подозреваемых на ШЧ-инфицированиость картина более пестрая. Из них 2 сыворотки (No. 'iû-ЛБД и Nu. 24-.'Шн) содержали AT ко всем белкам ВИЧ и еще S (Ko.lt и 25) - все AT кроме анти-pt? ВИЧ. В сыворотке !.'а Z (ЛБУ) определились ЛТ против белков р55 и рбО ВИЧ, a в сыворотке No. 17 (JîBî.fi - AT против р!31 ВИЧ. По существующим на сегоднишньй д*вь представлениям роаультагы КБ в двух последних случаях расцени-Е.чются гак неопределенные, поэтому в дальнейшим ати гь'вуропда будут рассматриваться как лохнопозигимше, а данные иаииенш как серо!'.егати1-ши «о ВйЧ-инф'КЦИИ. ito получили в №5 подтверж довкя результаты ИФА сипоротки Mo.« ('ЖБ/Лаос/).

Таблица I.

Данные обнаружения антител к БИЧ в сыворотках крови больных СШД и подозреваемых на ВЙЧ-инфекцию..

И? сы-!Источннк! Диагноз воро- 'материа-! ток ! ла !

»Дата пос- И Ф А_'Иммуноблотинг (АТ к белкам ШЧЗ_

!тупления Г'30-ГАнти-!"иргат'^еа-' тлп „т,т9п глч ^т ^¿т „чт «то \сывороток!бот*! ген"!нон" ! то- ¡^Р160 ^Р120 рбб р55 р51 $р41 р31 р24 р17

сурин"!

I. А.Т, (ЛВС) СШД, саркома Капо-ши носитель АТ к ШЧС?) 12.1984 (+) С+) (-0 (+) (+) ы и> (4) с+

10 лвд 20.02.86 (+) (+> Ы (+) (+) (+) (+) (+) (+} ы ы (+) (+

24 ЛБН 04.07.86 (+) н/т (+> (-> (+) {+) (+) (+) (+) (+) (+) ы <+

15 ЛЕГ СШД, лимфа- 26.03.86 (+) н/т (+) (+> (+> Ы (+) (♦> (+) (♦> <-

II

25 ~

17 9

денопатия, лимфогракуло-матоз

ЛБП носитель 04.03.86 (+) (+) (+) (-) (+) АТ к ЕИЧ(?)

ЛЕС 04.07.66 (+) н/т (+) (+) (+)

(+) Ы (+) Ы Ы (+) (+) Ы Ы Ы

.(+> Ы ( (+) Ы (-

М.(ЛВУ) аимфадено- 09.1983 (+) (+) С+) Ы патия

ЛЕМ носитель 28.03.86 (+) н/т (+) (+) АТ к ШЧ(?)

ЛББ(Лаос) 14.02.86 (+) {■>) (+) (+)

(_) (_) (+) (+)■(-) {-) (-) (-) (-

(-> (-) (-) (-) (+> С-) (-) (-) (• '(_) (-) (_) (.) (-) (-) (_) (_) (.

н/т - не тестировалась

Таким образом, из 27 сывороток больных ОВД (2 случая) I подозреваемых на ШЧ-инфицированность 9 дали повторные подол» тельные результаты в ИМ нескольких тест-систем. Из них в сыворотках наличие АТ к белкам ВИЧ было подтверждено в ИВ, а оказались ложнопозитивними.

Таким образом, с одной стороны выявилось неполное «овладение результатов тестирования АТ к БИЧ в различных тест-сж темах ИЛ, а с другой, - отсутствие полного подтверждения с< ропсзитиьности сывороток в ИБ.

Такое несовпадение результатов иммунологических тесто: показало необходимость применения каких-то дополнительных М1 тодов исследования дли-уточнения к сомнительных случаях диы ноза РИЧ -инфициронанности.

Обнаружение компонентов БИЧ в культивируемых лимфоцита инфицированных лиц.

Из образцов крови всех 27 исследуемых пациентов были вы делены мононуклеаряые клетки периферической крови (М!5ШЖ) получены культуры лимфоцитов, о наличии ВИЧ в которых суди по обнаружению его компонентов в различные сроки после сокул тияирования их с МШЖ здоровых доноров.

а) Обнаружение методом непрямой иммунофлуоресценцип ПШ антигенов (АТ) ВКЧ в культивируемых лиНоцич'Ж больных (ЯЗ'Д подрзркшемих на ВИЧ-инфшшрор.анность.

Клетки ье«х полученных культур штоиом НКФ с игнюльз^ья. ишц ШЧ- позитивных псммклошиышх сывороток исследовалж-ь ч роа каждмэ 3 дня, начиная с г-.-х суток после сокультивировав л:им4«-'ЦН'1ч.;-',. Ь результате специфическая иммунофлуоросценда б ¿■л (¿п-лруюиь ь 3 культурах. них 6 были нолученн от ьшда* • с ¡.оЛЕГорлт'чи'-м В Ж, руч-оерот'.ознгпвнос-гьк' (.)1Т-;Х, ЛЬ

ЛБГ, ЛК\ Л!'н и ЛБП.). Вир положительные в 1Ш культуры били подучены от срро!1.;гатиь-ннх в ИП лиц (ЛВУ и ЛББ/Лаое/). Оставь-пи-1 культуры в тесте 1Ш> оказались отрицательннш.

К.7Л',турах лимфоцитов с подтвержденной в КБ серопозитив-ностьп пр''Олежирплась ярно выраженная тенденция снижения % жион'-онисчоннх клеток вплоть до 12-х суток после сокультиииро-I'. 1"ил лимЛокитол с одновременным резки« уьеличением 7. флуоресцирующих клеток, достигавшим своего максимального значения га б 3 сутки после сокультиьирования Затем наблюдалось медленное нарастание числа жизнеспособных клеток, коррелирующее со сни-/■> ином X флусресцирукяцих клеток. Об идя динамика указанных проносов отражена на рис. L.

Приблизительно к концу месячного культивирования лимфоцитов наблюдалось снижение числа флуоресцирующих клеток до 4-5%, т. е. результаты НЖ'-теста становились отрицательными.

б) Обнаружение обратно-транскриптааной активности в куль-гуральнои среде лим|{юцктов больных (ЛШД и подозреваемых на ВОТ - инфицированное?ь.

Обратно-транскриптазная реакция (OTP) проводилась с уль-тоаоепдком (концентрация в '100-500 раз) культуральной среди культивируемых лимфоцитов с использованием экзогенной синтетической матрицы poly(t-A) ol i(jo(dT) и двухвалентных катионов магния. Культуральная среда Оралась на 5-, 8-, iS- и 25-е сутки после сокультивирования лимфоцитов. ОТ-активность оценивалась по включению З-Н-ТТФ в кислотонерастворимую фракции» образца, определяемого в счетчике "Packard Ггicarb-3380" (ОНА), и выражалась индексом OTP (отношением величины включенной мет ки в присутствии матрицы к величине включенной метки бей матрицы). Критериями признания результатов положительными слу.-и-

Число мзнеспо-собныг клеток

( К.Ю5/мл)

% флуоресцирующих киеток

3 6 9 12 15 18 21

Сутки после сокуяьтиэировашя лимфоцитов

Рис. I. Динамика числа жизнеспособных я флуоресцирующих клеток в культурах лимфоцитов большое СПЭД и ВШ-тфгщравашшх на различие сроки после сокультивирования лимфоцитов.

Условные обозначения:

0 .и I <| - число жизнеспособных клеток О I -О - % флуоресцирующих клегок

- LI -

ли': а) нилнкй порог включения метки 3-Н-ТТФ - 10 тмс. имп/мни; Г>] индекс от? но нил",' 2,0. В качестве положительного контроль v.'-!h>j\u:fot\:;mu]b ультраосадки культуральны* сред стандартных ви-руепродуцирумцпх куль"'ур ARV-4 и CV, индекс; OTP которых коле-очлся от г, до 4,70 при величине включения метки в присутствии матрицы от КА?.74 до 70624 имп/мин.

Таблица 2.

Определение ибрнтно-транскриптнзной активности в культу-радьнои среде лимфоцитов лиц, подозреваемых на РИЧ инфициро!;ан:юсть, на различные сроки после сокультивироиа-ния лимфоцитов.

( т ' Индекс OTP 1 i

No. 1 Источник г ¡Величина

I материала I 5-6 8-е 12-е 25-е 1включения

n/lll I сутки сутки сутки сутки 'метки 3-н-

I [ I I 1ТТФ (имп/мин) I

1. А. Г. (ЛБХ) 2,40 6,08 2, 14 1,76 43338-112447

i,. M. (ЛБУ) 3,21 4,02 2,27 1,38 29060-СИ 098

9. ЛББ /Лаос/ 1,14 4,63 1,20 1,51 47085

11. ЖД 1,53 2,40 1,72 1,68 350Я2

14. С. 1,52 2,11 1,12 1,00 J764

25. .ИБС 2,54 2,97 2,10 1,76 13Й83-Т|9Й40

nt-t 1.1. МТВ 1,62 4,55 1,74 1,65 5063

Примечание: результат считало* поломггелышм, если индекс OTP Онл >;Ь!ше 2,00, а ни.+иий порог включения П-П-ТТФ в присутствии матриц».' - Ю ООО vii.it:-'мин.

По данным нроьйдеиаых исследований (табл. ':> и культурах лимофцитов индекс ОХР прениеил 2,0. Однако, в культурах лимфоцитов пациентов No. 14 (С.) и No. ?.7 (КГГО при индексе OTP гимн-2, О ка 8-е сутки (Я, И и 4,55 соответственно) уроьень вкльче нил метки в присутствии матрицы (9764 и 5ÖG3 ими/мин соответственно) оказался чиже порогового значении, что не позволяет '•оворигь о присутствии ретровирусной ГНК-зависим-Rial ноли we разы в даннных культура;:. Поэтому позитивны!»'!! по OTP тесту следует считать 5 лимофцитарных культур.

Во всех случаях пик ОТ-активности приходился на' 3 и сутки после сокультивирования лимфоцитов. В 3 культурах (No. 1-ЛВХ. 2-ЛБУ и 25-ЛЕС) OTP была положительной и нн 5- и 12 -е сутки. Величина включения метки 3-Н-ТТ'Х' для атих культур в присутствии матрицы составила 4ГШ0-112447, 290f>o-f>iOö8 и 13983-59349 имп/мин соответственно.

В культурах лимфоцитов Wo. 9 (ЛББ /Лаос/) и No. 11 (ЛЕШ присутствие ОТ в культурапьной среде определялось только на 3 е сутки после сокультивирования (величина включения метки в присутствии матрицы составила соответственно 47085 и Р50;.й имп /мин).

Таким образом, первые положительные находки РНК-ьнвиоимой ДШйюдимеразы приходились на 5-е сутки после сокультньировавия лимфоцитов. Затем ОТ-активность в культуральной среде нарастала и достигала максимальных значений на В-е сутки, а ¿атем заметно снижалась и к £5 суткам OTP во всех культурах давала отри: täT е л ише рез у ль? ат ы.

Две (ЛГУ и ЛВВ /Лаос/) из 5 положительных в OTP культур лпмфоцитив бьют, получеяи от ВйЧ-серовегативиых по VIE лиц. Все мозитш ■;:.!? в OTP культуры бчли положительными по ошару^нию

метьдом 1ГОФ АГ ВОТ п лимфоцитах. С другой стороны, ОТ-тест оказался отрицательным в 2 культурах лимфоцитов ВИЧ-серологи тиьных пациентов (No. 10-ЛЕД и No. 24-ЛБн), а также и больного С1ШД (No. 15-ЛБГ).

й)Обнаружение непрямым ИФА АГ БИЧ в кульгуральной среде культивируемых лимфоцитов больных СПИД и подозреваемых на ВИЧ-иифицированность.

Работа выполнена при участии ст.н. с. лаб. вирусов лейкозов Института вирусологии АШ ССОР 1L Г. Яросдавцевой.

Определение АГ ЕИЧ в ультраосадке культуральной ср»ди (концентрация в 100-200 раз) методом ИФА проводилось для всех культур не менее G раз: на V-, 11-, 14-, 21- и ЗЬ-е сутки после сокультивироьания лимфоцитов. В качестве положительного контроля тестировались ультраосадки иультуральных сред стан дартних вируспродупирующих культур ARV-4 и CV. Уровни оптической плотности (ОГП материалов определяли при длине водны 492 нм на приборе "Reatfer Microel'isa system" (Organon, Голландия). Положительными на наличие АГ ВИЧ считались образцы, в которых индекс ИФА (отношение ОП материала, обработанного ВИЧ-позитивной сывороткой, к ОП того я® материала, обработанного БИЧ негативной сывороткой) превышая 3,0. Результаты определении АГ ВИЧ в культуральной среде культивируемых лимфоцитов болышх ОГВД и подозреваемых на ВОТ-инфекцию приведены в табл. а

Как-видно из таблицы, и?. 27 полученных культур в 7 ненри мым ИФА были обнаружены АГ РОТ ь культуральной среде. Г> и-| них были получены от ВИЧ-с^ропозитиьиых лиц ( ЛБХ, ЛГС, ЛПГ, JK/1 и ЛБн), а дье другие (ЛВУ и ЛБР /Лаос/) - от В11Ч-eepoHi.-roi иьных лиц.

Таблица 3.

Положительные результаты определения АГ БОТ методом ИФА в культуральной среде лимфоцитов больных СПИД и подозреваемых ца ВИЧ-инфицированкоегь *

!Источник ! Индекс И Ф к !

No. ! материала ' 7-е 11-е 14-е 21-е ЗГ>-е t

п/н ! ! сутки сутки сутки сутки сутки!

■ I I

__1__( _________!

1. А. Т. (ЛБХ) 2,23 3,48 4,72 3,04 2,11

2. М. (ЛБУ) 1,95 2,43 2,79 3,06 1,80

9. ЛБЕ /Лаос/ 1,35 1,52 3,53 1,59 2,95

10. ЛБД 1,50 3,49 1,50 1,80 1,45

15. ЛБГ 1,93 1,44 3,01 2,10 2,44

24. ЛБн 2,16 3,21 2,05 1,98 2,10

25. ЛЕС 4,58 3,31 2.80 1,37 1,26

*) Результат считался положительным, если индекс ИФА превышал 3,0.

В 5 на ? положительных в ИФА культурах максимальные значения индекса КФА приходились на интервал между 11- и 14-ми сутками после еокультивиропания лимфоцитов. В 1 случае (ЛБС) атот пик пришелся на 7-е и еще в 1 (ЛБУ) - на 21-е сутки после сокулы-ивирования. Ке Лмо ни одного случая положительных результатов ИФА на Cf'.-и сутки после сокультивирования.

fce у позитишых г; МЛ культур имели положительные ре-лульгат!.' в mi'i, а $ па iv,:x и ъ OTP. О другой сторг.кы, культура км .-¡'С. и nuvKwrwum тес ж ь 1Ш1 и OTP. окагаяась отри-

цат»лъной в ИФА по обнаружению ЛГ ВИЧ в культуральной среде.

Результаты комплекса иммунологических и г.ирус ^логических методов исследования материалов от пациентов, подозреваемых на ВИЧ-инфициротнность, представлены в табл.4. В ней приьедены результаты исследования материалов 9 пациентов, так как в остальных случаях были получены отрицательные результаты.

Как видно из табн. 4, только у 2 пациентов из 9 (ЛВХ и ЛВС) все исиользованные тесты серологического и иммунологического анализов дали положительные результаты; в остальных случаях полного совпадения результатов не было. Особо необходимо отметить, что встречались случаи (и частности, ЛКУ и ЛББ /Лаос /), когда AT к БОТ в сыворотках крови отсутствовали, а в культивируемых лимфоцитах этих иацыентов обнаруживались маркеры БИЧ.

Подводя итог данному этапу исследований, можно отметить, что положительные результаты обнаружения компонентов ВИЧ различными методами в культивируемых лимфоцитах, выделенных от разных пациентов,.варьируют как по времени появления, так и ло интенсивности.

Метол ШФ даЕал положительные результаты обнаружения АГ ВИЧ в культивируемых лимфоцитах между о- и 30-ми сутками после сскультивирования лимфоцитов с максимальными значениями на 09 -е сутки. OTP давала положительные результаты обнару.-жния ОТ-активности в культуральной среде меэду 5- и 12-ми сутками с максимальными значениями на 8-е сутки после оокультивщювашы лимфоцитов. МЛ в положительных случаях позволил обнаруживать •\Г ТЖЧ в культуральной ср^де тхду 7 и £1-ми сутками с к ¡кои мальными а л'лзателкми Hi И-М-м сутки поело ег^у.глТ'ЛЬ'.'р.и а пил ;;!!!.СРЦ'!Г: on.

"аким образом, при иг.почьзок^нии комчли fc 'Ь'-ч;1'1

Таблица 4.

Результаты комплекса иммунологических и вирусологических методов исследования материалов пациентов, подозреваемых на ШЧ-инфицированность.

JW в I !Диагноз приIОбнаружение AT к ШЧ в сыворотках крови!Обнаружение компонентов поряд- Шсточник 1поступлении1 .. , ... !ЩЧ в культивируемых яим-ке по- 'ыатеи1ала| материала !Тест-системы И$А_[Иммуиобло-! фоцитах___

сттоле-! |Эбботт! "Анти-! "Орга-!"Пепто-i/»п£пт.п\ Г» 1 OTP !

ния \ | , генч , j скрин"! Л)110» ' } !

!

!

!

1

I. А.Т.(ЛБХ) СПИД, саркома Калоши U) (♦) ы <*> Ы <+>

2. М. (ЛБУ) димфадено-пагая U) (+) <♦) .(-)(анти-«рбб и -р55-АТ U) «+)

25. JffiS носитель. AT к ШЧ(?) <+> н/* {+> (+) U) <+) Ы <+>

9. ЛББ(Лаос) - " - (+) <+> W (+) (-> (+) <♦>

15. ЛБГ СПИД, яим-фаденопатия, лимфогранУ-ломатоэ (+) н/* (♦> (to (♦> (+) (-> <♦)

10. ад носитель AT к ШЧ<?) (+) (+) W (+) (+> (+) (-) С*)

И. лш — Я с (+) ы <♦) (-) (+) (+> <♦> (-)

24. _ я _ (+) и/* (-) (+) (+) <-) ы

17. ЛБМ _ и _ ы н/т С-)(антя--р51-АТ) (-)

0> I

Примечание: к/? - образец ие тестировался

ленннх методов исследования установлена ВИЧ инфицированность 8 - ми исследуемых пациентов, двое иь которых имели отрицательно ри 1.ультатн t; ИГ>-ннализе. Пациента No. 17, чья сыворотка была триады положительной в ИФА, но отрицательной в ИБ, следует пригнать нл инфицированным ВИЧ.

Активация латентного БИЧ в кул! тивируемнх лимфоцигах BJi'-f инфицированных лиц.

Как видно по результатам проведенных исследований, по истечении приблизительно месячного срока после еокультивирования лимфоцитов 1;ИЧ-инфицированных лиц с МШПК здоровых доноров все использованные тесты обнаружения ШЧ (ШФ, ОТ? и ИФЛ1 становились отрицательными, т.е. РКЧ-инфекция приобретала латентный характер без возможности обнаружения присутствия вируса в культивируемых лимфоцитах таких пациентов.

а)Бноло1 ичсская активация латентного ROT в культивируемых лимфоцитах инфицированных лиц.

В качестве биологического фактора активации латентного БИЧ был использован регулярный подсев (не реже 1 раза в месяц) свелевыделенных донорских MfIKIIK, предварительно обработанных ФГА. Поскольку в литературе приводятся различные данные как о количестве дооапляемых лимфоцитов, так и дозах и Бремени их обработки «Т'ГЛ, то условия такого культивирования ft или экепери-ме нталь но отработаны.

Дпд предварительной обработки донорских WflfflK были использованы 4 дозы WA (1,0; 5,0; 10,0 и 20,0 мкг/мл) И 3 :жс-позиции его воздействия для каждой дозы (Г:4, 48 и '/?. '¡аса). Результат!! контролировались по обнаружению А1' ВИЧ в культу

рапьной среде иа 14-е сутки после внесения донорских клеток.. В результате проведенных анализов установлено, что оптимальным режимом обработки донорских лимфоцитов являлось воздействие {>ГА в дозе 5 мкг/мл в течение 43 часов (рис.2)

Следующей задачей было установление оптим.1льного соотношения культивируемых и донорских лимфоцитов. Ллн этого активированные ФГА (5 мкг/мл - 48 часов) донорские MHKIIK вносили в культивируемые в соотношениях от 1:1 до 1:10. Об эффективности активации латентного ВИЧ судили по экспрессии вирусных АГ, определяемых в культуральиой среде с помощью ИМ на 7-, 11-, 14 и 21--е сутки.

Б результате проведенных экспериментов установлено, что оптимальным соотношением культивируемых ВИЧ-инфицированных лимфоцитов с чувствительными донорскими являлось соотношение 1:8 -1:10. (В качестве примера приводится культура JIBX -рис.3).

Таким образом, данный этап работы позволил определить условия- активации латентного БИЧ в культивируемых лимфоцитах инфицированных лиц, которые предусматривают' регулярное внесение в культивируемые лимфоциты БИЧ инфицированных лиц сведевыде-ленных донорских МШШК, обраоотанных> ФГА (5 мкг/мл - 48 часов), в соотношении 1:8-1:10.

Такая биологическая .активация латентной ВИЧ-инфекции в культивируемых лимфоцитах позволяла в течение определенного времени вызывать эксгрессию Еируных АГ. Однако, по мере "старения" этих культур, данный прием становился все менее эффективным. Этот процесс выражался во временном сдвиге обнаружения АГ ВИЧ на более поздний срок с одновременным снижением индексов V№A.

Таким образом, с течением времени эффективность биологи-

24 43 Ус часы

Рис. 2. Ллшшие эксиоэши::! и дос:: ¿ГЛ для донорских лшн.огдаов ¡¡а окоирессшо тЧ-аи'лилмоь в культуре льл.

Услошпо ооозианония (доаы ^ГЛ):

1 !.'.Кг/о : ©же*© 1и (.'Кг/'.ш

V ГМГА'.Л 20 ккг/д-л

И ?! ~7 21

Р:?о, У. Дшяше актцьиро^ лшнх ФГЛ донорских.

хдолюпцтов са окев|юсинк ЬкЧ-антцгелов в культуре АЬХ

сутки

1:3

■Условные ооозиачстш (соогпе-аеине 17^-ы:ш:*.р''см!Х л донорских ддгЪонатоз): » а 1:5 <з=—=о О--о 1:и

ыеской стимуляции латентного ВИ'Гв культивируемых лимфоцитах Инфицированных лиц постоянно снижалась и в конце концов все лик-фоцитарные культуры ВИЧ-инфицированных лиц возвращались к состоянию латентности.

б) Сшическая активация латентного ВИЧ в культурах лимфоцитов инфицированных лиц.

Несмотря на наступление латентной ВИЧ-инфекции в культивируемых лимфоцитах, оказалось, однако, что при одинаковой методике их ведения в них иногда наблюдалась спонтанная активация продукции ВИЧ-АГ Oes каких-либо внешне видимых причин. Такие периоды активации приходились на осенне- зимние и особенно эимне-весенние месяцы (рис.4). Из данного графика видно, что экспрессия АГ БИЧ являлась процессом не постоянным, а носила волнообразный характер.

Предполагая взаимосвязь спонтанных сезонных периодов активации латентного ВИЧ, сопровождавшихся экспрессией вирусных АГ, с колебаниями уровней радиационного ({она, была проведена серия экспериментов по изучению влияния ионизирующего излучения на латентную ВИЧ-инфекцию в культивируемых лимфоцитах инфицированных лиц. С этой целью культуры были подвергнуты гамма -облучению на рентгеновской установке с источником излучения кобальтом-60. Мощность излучения варьировала от 19,0 до 21,6 рад/мин, суммарные дозы облучения составили 100 и 150 рентген. 00 активации латентного БИЧ в культивируемых лимфоцитах судили по обнаружению АГ БИЧ r культурадьной среде с помощью непрямого ИФА

Hpi веденные эксперименты показали (рис. 5), что воздействие Д(Х:ы 100 рентген вызывало активацию латентной ВИЧ-инфек-ьик г; культивируемы >{ лимфоцитах. Особенно высокие показатели

Средние показатели И Ф А

6,6 6,2 5.8 5,4 5,0 4.6 4.2 3,8

3,4 3,0

го .

сл

0 N

1

ы о

о го

месятты культивирования лямфоп

3 5 7 9 12 15 18 21 24 27 30

~эцитов

Рис. 4. Спонтанная экспрессия антигенов ВГО в культуре ЛЕХ в течение 30 месяцев наблюдения.

Примечание. Результаты ®А считались положительными, если индекс реакции превышал 3,0.

Средние индексы И Ф А ,

Î7-e 21-е 45-е сутки после

„,_ » облучения

Рис. 5. Активация латентного ВИч в лимфоцитаршх культурнх под

_воздействием гамма-излучения в дозе 100 рентген (по данным ®А)

ВЕЙ- культура А№4 У//1- культура ЛБС ШБ- культура ЛЦЦ

I I- культура СУ 838- культура ЛББ (Даос)Р?^- культура ЛЕГ

ИФЛ наблюдались на ?-е сутки после облучения. На "1-е сутки после облучения часть культур продолжала сохранять ног,пшенные уровни яксироссии ЛГ ВИЧ, однако через М] суток после воздействия ионизирующей радиации показатели Ш>А во всех культурах вернулись к исходному уровню, т.е. к состоянию латентной БИЧ-инфекции.

Подобную активацию латентного БИЧ в культивируемых лимфю цитах удавалось вызывать неоднократно. Однако по мере дальней-иего "старения" культур ВИЧ-антигенный ответ на гамма-излучение постепенно становился все менее выраженным, и на 3-м году . культивирования лимфоцитов эта доза облучения стала неэффективной. Все культуры ВИЧ-инфицированных лиц вновь возвращались к латентному состоянию. -

в) Обннружиме методом дот-гибридизации провируеной ДНК ВИЧ в культивируемых лимфоцитах инфицированных лиц.

1'абота проводилась совместно со ст. н. сотр. лаб. генно -инженерных препаратов Института вирусологии АМН СССР Г.Ф.Денисовой и Л. Ф. Лидеман.

На стадии латентной ВИЧ-инфекции в культивируемых лимфоцитах инфицированных лиц все использованные методы обнаружения в них вируса (ШФ, OTP и Ш>Л) приобрели стойко негативный характер. Поэтому необходимо было выяснить, являлось ли данное состояние клеток действительно фазой латентной ВИЧ-инфекции, либо отрицательные результаты вышеназванных методов тестирования вируса были обусловлены элиминацией провируеной ДНК ВИЧ из культивируемых лимфоцитов. Для уточнения зтого вопроса был ис~ гюльз<-.;-;чн ььтод дот-гибридизации.

Тб<Г! HpoWU.lHú были подвергнуты клетки всех культур, KpOMw JiV.il, ft/,</(<••»» к aTi.'My щиплет в процессе длитеньного культинн-роьзнил бым rioна. В кчЧ'.-стве полохительниго кэнтролн ис

- Е4 -

•пользовалась ДНК, выделенная из вируспродуцирутоцей культуры 0V, а в качестве отрицательного - ДНК из клеток Н9. В работе использовалась рекоыбинантнгш нлазмида рВШО, содержащая кло-кированьый провируе ВИЧ, меченная 32-Р.

В результаге провирусная ДНК ВИЧ была обнаружена в 6 лим-фоцитарных культурах (ЛБХ. ЛБУ, ЛВС, ЛБР, ЛБД и ЛЕВ /Лаос/). Клетки культур No. 17 (ЛБМ) и No. 24. (ЛВн) провирусной Д1ГК в геноме не имели. В случае JffiM дот-гибридизация подтвердила данные ИВ о локнопозитивности сыворотки пациента. В культуре же ЛВн произошла элиминация провиусной ДНК ВИЧ в процессе культивирования.

Таким образом, дот-гибридизация подтвердила ВИЧ-шгфнциро-ванность 6 пациентов, включая двух (ЯЛУ и ЛЕВ /Лаос/), имевших серонегативные результаты ИВ. Также' установлено наличие ВИЧ -инфекции в культивируемых лимфоцитах инфицированных лиц, несмотря на ее стойко латентный характер, наступивший на 3-м году культивирования.

ВЫВОДЫ

1. В культивируемых лимфоцитах больных СПИД и ШЧ- ипфицнро ■ ванных яиц первые положительные результаты обнаружения компонентов ВИЧ (антигенов и .обратной транскрилтагы) методами непрямой пммунофлуоресцекции < НПФ), иммуноферментного анализа (ИФА) и обратно- транс чр.ттазнои реакции (ОТР) варьируют как по времени появления, так и по интенсивности. lía-:, правило, максимально значения ШФ приходились на о-У-э, ОТР - на В-з, а й'1А на 11-14 е сутки поел ; сокульгшлрованил с чувствительными .т;имф)цатами здеровмх доноров. У Длительно«, в т€ч>'ч»ме нескольких месяцев, кудьтивиро! анис

.лимфоцитов ВМЧ-Ш|фииированних и больных CI ¡ИД приводит к рачви-тию латентной инфекции, при которой обнаружить компоненты ВИЧ вышеназванными методами не удается.

а. Регулярное добавление екогевыделеиных активированных ФГ'Л донорских лимитов способствует активации латентного РИМ в культивируемых лимфоцитах.

4. В культивируемых лимфоцитах в стадии латентной ВИЧ инфекции наблюдаются кратковременные сезонные подъемы активации экспрессии вирусных антигенов.

5. Гамма-облучение длительно культивируемых лимфоцитов ь стадии латентной ЮТ-инфекции выаывяот активацию экспрессии антигенов вируса. .

б. Обнаружение компонентов ВИЧ в культивируемых лимонитах серонегативных в иммуноблотинге ( ИБ) лиц свидетельствует о необходимости в сомнительных случаях для подтверждения ЬЙЧ-инфи-цированности использовать не только иммунологические методы обнаружения антител в сыг.ороткч крови, но и комплекс вирусологических и молекулярно-биологических методов обнаружения вируса в культивируемых лимфоцитах исследуемых пациентов.

?. Положительные результаты обнаружен? ировирусиой ДНК ВИЧ методом дот-гибридизации в длительно кудьтвируемых лимфоцитах (, в том чис.гр и г.еронргатиьных в ИБ лиц) при отрицательных ре-иул;татах остальных методов обнаружения вируса позволят считать ВИЧ-инфицированными те/ лиц, у которых в ИБ обнаружены антитола к белкам Г.11Ч и/или методом дот-гибридиаациии обнаружена г.ровирусная ДЦК БИЧ в культивируемых лимфоцитах.

С1ГОС0К РАБОТ, ОПУШКОВЛШШ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ.

1. Методические рекомендации по определению антител к вирусному антигену у больних с приобретенным иммунодефицитом имму-но(}ерментным методом /В. М. Дданов, Е. С. Северин, М. И. Парфанович, Ю. ¡a Венгеров, II. Г. Ярославцева, С. М. Воробьёв, И. И. Кучеров и др. //№ , 19Ь0. - 200 экз.. - 12с.

' 2. Постановка экзогенной обратно-транскриптазной реакции с ретровиоусамк /II Г. Ярославцева, 3. А. Горбунова, О. И. Серегина, И. И. КучероЕ и др. //Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии. ~ М. . 1987. - С. .45-48.

3. Обнаружение вируса иммунодефицита человека в культуре лимфоцитов от больного из Центральной Африки с синдромом приобретенною иммунодефицита и саркомой Капоши /Ь. М. Жданов, М. К. Парфанович, И. Г. Ярославцева. И. И. Кучеров и др. //Вопросы вирусологии. - 1988. 33, Мо.2. - 0. 188-192.

4. Обнаружение Т~лимфотропного вируса человека у больных с Т -клеточной патологией '/М. И. Парфанович, Н. Г. Ярославцева, З.А.Горбунова, Н. Л. Рябова, И. И. Кучеров и др. //Ретровирусы к их роль в патологии человека и животных. - Рига.: "Зинатне", 1989. - С. 20-23.

5. ТЫ search of retroviruses Гго.и patients with different torn» of leukemia and 1 ymplюта /М. I. Parfanovich, N. G. Yaroslavzeva, i. I. Kuchercv et __al. //Abstracts XVI11 Meeting or European Tumor Virus Group.: Dresden. , GDR, 1SS7. -P. 46.