Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности циркуляции вирусов гриппа А и В в эпидемический период с 2000 по 2004 г. (молекулярно-биологические свойства, серодиагностика, популяционный иммунитет)

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности циркуляции вирусов гриппа А и В в эпидемический период с 2000 по 2004 г. (молекулярно-биологические свойства, серодиагностика, популяционный иммунитет)"

На правах рукописи

ЗАГОРСКАЯ ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА

ОСОБЕННОСТИ ЦИРКУЛЯЦИИ ВИРУСОВ ГРИППА А И В

В ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ ПЕРИОД С 2000 ПО 2004 ГОД

(МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, СЕРОДИАГНОСТИКА, ПОПУЛЯЦИОННЫЙ ИММУНИТЕТ).

(03.00.06. - вирусология; 14.00.30. - эпидемиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2005

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Доктор медицинских наук, Заслуженный деятель науки РФ, профессор Слепушкин Анатолий Николаевич Доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Иванова Валерия Тимофеевна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор медицинских наук, профессор Русакова Екатерина Владимировна Доктор медицинских наук, профессор Стаханова Вера Михайловна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Государственный институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича МЗ РФ, г. Москва.

Защита состоится « 80 » ¿/ЮМ Я 2005 года в 00 часов на заседании диссертационного Совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан « » мая 2005г.

Ученый секретарь диссертационного Совета Н.П. Косякова

Доктор медицинских наук

¿/¿-/•/¿У

7496

i

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Грипп является массовой и неуправляемой инфекцией, ежегодно регистрируемой в

различных частях земного шара. Несмотря на значительные усилия, предпринимаемые отечественными и зарубежными учеными, проблема гриппа еще далека от своего решения. Основная причина этого связана с естественной изменчивостью возбудителей, которая выражается в вариабельности первичных структур и соответственно свойств вирионных белков (Львов и др., 2004; Webster et al., 1994; Hay, 2001).

К возникающим новым антигенным вариантам вирусов практически отсутствует иммунитет населения, поэтому они быстро распространяются, вызывая вспышки заболеваний и эпидемии. В случаях появления нового антигенного варианта вируса гриппа типа А, человечество вовлекалось в пандемии гриппа, отличием которых являлось быстрое распространение, высокие показатели заболеваемости и летальности. Во время "обычной" эпидемии заболевает от 5 до 15 % населения, при пандемии - до 40-60%. По числу сезонной смертности в развитых странах грипп занимает первое место (Reichert, Sharma, 2001).

Особенностью настоящего периода является распространение новых антигенных вариантов циркулирующих вирусов гриппа A/H1N1, A/H3N2, и В, возникновение новых эволюционных линий, а также реассортантов среди вирусов гриппа А и В (Lin et al., 2004). Широкая циркуляция вирусов гриппа среди животных и птиц привела к интродукции вирусов гриппа птиц в человеческую популяцию, что может свидетельствовать о возникновении потенциальных кандидатов в новые пандемические штаммы (WER, 2004).

В связи с вышеизложенным, крайне важным является функционирование системы эпидемиологического надзора за гриппом, включающей надзор за распространением инфекции, своевременную этиологическую диагностику заболевания, характеристику биологических особенностей возбудителя. Изучение циркуляции вирусов гриппа в таком огромном регионе земного шара, каким является Россия, имеет большое значение для медицинской науки и практики. Определение свойств возбудителя включает вирусологические исследования: выделение и типирование штаммов вирусов гриппа, и серологическую диагностику, основанную на выявлении в крови человека специфических антител к вирусам гриппа и увеличении их количества в динамике заболевания, обеспечивая точное определение этиологических агентов, вызывающих эпидемии. Изучение иммуноструктуры у здорового населения к вирусам гриппа в различных географических зонах в течение разных эпидемических периодов позволяет определить степень защиты людей от циркулирующих в мире эпидемических штаммов. Углубленное изучение свойств этих штаммов позволяет определять основные тенш^^^МШАЬЧШов гриппа А

} БИБЛИОТЕКА \

и В, эволюционные связи между вирусами гриппа, циркулировавшими ранее и возникающими вновь в различных регионах земного шара. Данные об эпидемически актуальных штаммах необходимы как для расшифровки причин текущих и для прогнозирования грядущих эпидемий, так и для проведения профилактических и противоэпидемических мероприятий, в том числе - разработки новых вакцинных и диагностических препаратов.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлся этиологический надзор над распространением вирусов

гриппа А и В и определение уровня популяционного иммунитета в России на протяжении 4 лет (2000-2004гг.). Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить антигенные свойства гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (КА) современных эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В; определить их эволюционные связи с эталонными и эпидемическими штаммами, циркулировавшими в России и в мире в разные годы.

2. Провести серологические исследования парных сывороток от больных с диагнозом грипп и ОРВИ из разных регионов России для определения возбудителей эпидемий гриппа в эпидсезоны 2000-2004 гг.

3. Изучить популяционный иммунитет населения к эпидемическим штаммам вирусов гриппа А и В в зависимости от периода эпидемического сезона и географического положения обследуемых регионов.

4. Определить чувствительность современных штаммов вирусов гриппа А и В к различным изоляционным системам (клеткам культуры тканей МБСК и куриным эмбрионам - КЭ);

5. Определить чувствительность НА эпидемических штаммов вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗ№) и В к протеолитической обработке современными препаратами фермента бромелаина.

Научная новизна работы:

-На основании результатов вирусологических и серологических исследований установлена этиология эпидемий в России за период с 2000 по 2004 год.

-Выявлено, что эпидемия гриппа, вызванная циркуляцией нового дрейф варианта А/Фуцзянь/411/02(НЗ№) в 2003-2004гг., развивалась на фоне низкого уровня защитного иммунитета у населения к этому вирусу.

-Определены основные направления эволюции вирусов гриппа А и В, циркулировавших в России.

-Впервые установлен возврат в 2003году в циркуляцию вирусов гриппа В эволюционной ветви В/Виктория/2/87, после 10 летнего отсутствия в России.

-Впервые в России в эпидсезоне 2002-2003гг. выявлена циркуляция реассортантов вируса гриппа В: В/Москва/3/03, В/Ярославль/16/03, В/Липецк/17/03. У реассортантных штаммов НА принадлежал к ветви В/Вшггория/2/87, а КА - к ветви В/Ямагата/16/88. -Впервые установлены различия в чувствительности НА современных штаммов вирусов гриппа А и В к протеолитической обработке современным препаратом В5144 фермента бромелаина. Наиболее чувствительным оказался вирус гриппа В/Сичуаль/379/99 из эволюционной ветви В/Ямагата/16/88-подобных, по сравнению с вирусами гриппа А(НШ1) и А(НЗШ), которые были менее чувствительными к этому препарату.

Практическая значимость работы.

Полученные данные по идентификации и изучению особенностей вирусов гриппа,

циркулировавших на территории России и за рубежом, а также по определению основных направлений эволюции вирионных белков этих вирусов могут быть учтены при прогнозировании эпидемий и отборе кандидатов в вакцинные штаммы.

Результаты анализа антигенной структуры и биологических свойств циркулировавших штаммов вирусов гриппа включались в информационные материалы, посылавшиеся в ВОЗ, в департамент Госсанэпиднадзора Минздрава РФ, в базовые областные и городские центры Госсанэпиднадзора.

В рамках сотрудничества с ВОЗ в штаб - квартиру ВОЗ в Женеве (Швейцария) и Всемирные справочные центры по гриппу в Лондоне (Англия) и Атланте (США) высылались ежегодные отчеты и наиболее актуальные отечественные штаммы, которые затем входили в состав коллекций вирусов этих центров. В Государственную коллекцию вирусов депонировано 2 оригинальных штамма: А/Москва/34/03(НЭШ) и В/Москва/3/03, которые определили новые этапы в распространении и изменчивости вирусов гриппа. Коллекция вирусов Научно-практического центра экологии и эпидемиологии гриппа пополнена изученными штаммами (174), наиболее характерными для вирусных популяций ежегодных эпидемий гриппа (в течение 3 лет).

Вирусы могут быть использованы, в качестве кандидатов в вакцинные штаммы, а также для приготовления диагностикумов. Данные по чувствительности современных штаммов вирусов гриппа А и В к КЭ необходимо учитывать при получении современных штаммов в больших количествах, для производства диагностических тест-систем. Результаты по чувствительности НА вирусов гриппа к протеолизу следует принимать во внимание для получения очищенных препаратов внутренних белков (М и ОТ) вирусов гриппа, для их исследования, а также при производстве диагностических тест-систем, содержащих эти белки.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Этиология эпидемий гриппа в разных регионах России в период с 2000 по 2004 год

была обусловлена циркуляцией и социркуляцией вирусов гриппа человека A(H1N1), A(H3N2) и В, родственных эталонным штаммам, рекомендованным ВОЗ для производства гриппозных вакцин. Активность циркуляции вирусов гриппа А и В зависела как от возбудителей, так и от уровня популяционного иммунитета населения к эпидемическим штаммам.

2. Установлено, что в период 2000-2004гг. антигенный дрейф поверхностных белков эпидемических штаммов имел свои особенности для вирусов гриппа человека А и В. Для вирусов гриппа А был характерен последовательный дрейф; для вирусов гриппа В - циркуляция вирусов с поверхностными белками разных эволюционных линий и реассортантных штаммов.

3. Современные штаммы вирусов гриппа человека A(H1N1), A(H3N2) и В обладали разной степенью тропизма к традиционной системе культивирования вирусов гриппа - куриным эмбрионам (КЭ). Наиболее чувствительными к КЭ являлись современные вирусы гриппа A(H1N1), которые сохраняли способность к изоляции на КЭ из носоглоточных смывов от больных, а также к адаптации к КЭ после их изоляции на клетках культуры тканей MDCK.

4. Чувствительность НА современных штаммов вирусов гриппа А и В к протеолитической обработке ферментом бромелаином зависела от возбудителей и активности препаратов фермента бромелаина. Наиболее чувствительным к ним, из изученных штаммов, был вирус гриппа В эволюционной ветви В/Ямагата/16/88.

Апробация работы.

Результаты работ были представлены на международных симпозиумах и

конференциях: VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, М., 2002г.; Всероссийской конференции «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций», С.-П., 2002г.; The first European Influenza Conference, St.-Julians, Malta, 2002г.; Симпозиуме «Повышение готовности к пандемии гриппа на основе военно-гражданского сотрудничества», Санкт-Петербург, 9-11 мая 2003г.; Int. Conf. "Options for the Control of Influenza V", Nago City, Okinawa, Japan, October 7-11, 2003; Межрегиональной научно-практической конференции Федерального научного центра гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана «Факторы риска и здоровье населения в регионах России», 2223 апреля 2004г., Липецк; Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией», 1-2 декабря 2004г., Санкт-Петербург; The First International Conference on Influenza Vaccines for the World, 24-26 May 2004, Lisbon, Portugal. VI International

Symposium on respiratory viral infections, 18-21 March 2004, Sanibel Harbor Resort& Spa, Fort Myers, USA; Международной конференции «Актуальные вирусные инфекции -теоретические и практические аспекты», 2-5 ноября 2004г., Санкт-Петербург; Международной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты», 25 ноября 2004г., Санкт-Петербург; 5ft Louis Pasteur Conference on Infectious Diseases, 17-20 November 2004, Institute Pasteur, Paris, France.

В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела вирусологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 12 мая 2005 года.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 3 статьи в реферируемых российских научных журналах и 2 статьи в зарубежных изданиях (книгах), посвященных материалам международных конференций, а также тезисы докладов в сборниках российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Работа состоит из

введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения собственных исследований, их обсуждения, заключения и выводов. Содержит 22 таблицы, 21 рисунок, 4 электронные микрофотографии. Список литературы включает^З&отечественных и зарубежных источников.

Ключевые слова: эпидемические штаммы, вирусы гриппа А и В, сыворотки, популяционный иммунитет, куриные эмбрионы, клетки культуры тканей MDCK, протеолитический фермент бромелаин.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

«

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Вирусы и антитела. Эталонные штаммы: использовано 15 штаммов вирусов гриппа А и В: A(H1N1) -3, A(H3N2) -3, В - 9. Штаммы были получены из справочных центров ВОЗ и коллекции Центра экологии и этиологии гриппа ГУ НИИ вирусологии РАМН. Носоглоточные смывы: исследовали 147 смывов от больных с диагнозом грипп и ОРВИ из 9 регионов России. Эпидемические штаммы: в работе всего исследовано 245 штаммов вируса гриппа человека типа А и В. Они являлись изолятами, выделенными от больных с диагнозом грипп и ОРВИ, возрастного диапазона от <1 до 80 лет, в разные эпидемические сезоны. Из них вирусов гриппа A(H1N1) - 46 штаммов, A(H3N2) - 125 штаммов, В - 74 штамма. Вирусы изолированы от больных на территории России из 16 городов. Парные сыворотки:

исследовано 520 пар сывороток, полученных от больных в возрасте <1-80 с диагнозом грипп и ОРВИ из 7 регионов России. Донорские сыворотки: исследовано 477 сывороток, полученных от доноров города Москвы, Липецка и Приморского края.

Выделение и культивирование вирусов на системе изоляции - куриные эмбрионы (КЭ) и клетках культуры тканей MDCK. Выделение вирусов гриппа из носоглоточных смывов, полученных от больных с диагнозом грипп и ОРВИ, а также из виру (¡содержащей культуры клеток MDCK, проводили на 10-11 дневных развивающихся куриных эмбрионах (КЭ). Заражение осуществлялось в амниотическую полость КЭ. Вирусы культивировали на клетках культуры тканей MDCK по методу Davies et al., 1978г. Гемагглютинирующую активность вирусов определяли, методом РГА по общепринятой методике, рекомендованной ВОЗ, с использованием 0,75% эритроцитов 0(1) группы крови человека.

Определение антигенной активности гемагтлютинина вирусов гриппа А и В, методом РТГА. Изучение антигенной структуры гемагглютинирующих изолятов проводили в реакции торможения гемагтлютинации (РТГА) с использованием референс-пгтаммов, а также приготовленных к ним сывороток и стандартных сывороток из диагностических наборов ВОЗ. Реакцию ставили по общепринятому методу, рекомендованному ВОЗ. Исследования сывороток переболевших и доноров проводили в РТГА с набором эталонных штаммов, циркулировавших в этот период в мире. Иммунные сыворотки (человеческие и крысиные, полученные к цельным вирионам) обрабатывали нейраминидазой нехолерного вибриона (РДЭ, производство ГНИИЭМ), инкубировали 18 час при 37°С. Для удаления остаточной активности РДЭ сыворотл! прогревали 1 час при 56°С.

Определение антигенной активности и специфичности нейрамннндазы вирусов гриппа АнВ:

Тиобарбитуровый метод. Исследование проводили по методу Aminoff (1961), в качестве субстрата использовали фетуин (Calbiochem). Реакцию подавления нейраминидазной активности (РПНА) ставили по методу Aymard-Henry (1970).

Пектин-тест. Метод основан на феномене демаскировки нейраминидазой остатков галактозы на рецепторах эритроцитов морской свинки, специфически связывающихся с пектином. За основу был использован метод, разработанный Luther at al. (1979) и модифицирован Любовцевой, Закстельской (1984).

Термочувствительность поверхностных белков. Определяли гемагглютинирующую активность гемагтлютинина (НА) вирусов в РГА, а также нейраминидазную (NA) активность - в лектин-тесте до и после прогрева.

Получение и очистку вируса гриппа проводили метолом центрифугирования в

центрифуге L5-50, ротор Ti-35, v=25 000об./мин., t=l4ac; очищали в градиенте концентрации сахарозы 10-50%, v=22 ООО об./мин, (ротор SW 27.1), t=l4ac. Вирус ресуспензировали в буфере STE (0,01М Tris - HCl, 0,1М NaCl, 0,001М ЭДТА; рН=7,4).

Получение субвирусных частиц методом протеолнча. Субвирусные частицы получали путем протеолитической обработки вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В двумя препаратами фермента бромелаина фирмы Sigma (каталожные №№ В5144, В2252). За основу был взят метод, разработанный Brand, Skehel (1972).

Электрофорез вирионных белков в полиакриламидном геле. Препараты вирионных белков анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (ПААП. Электрофорез в 12 или 15% ПААГ в не восстанавливающих условиях при длительности 5060 мин проводили по методу Laemmli (1976).

Иммуноферментный анализ (ИФА) использовали для определения антител и антигенов в сыворотках переболевших и доноров. Проводили непрямым методом Voller et al. (1976) с коньюгатом содержащим пероксидазу, которую обнаруживали по изменению окраски субстрата (ортофенилдиамина) при длине волны Х=492 нм.

Электронная микроскопия. Электронную микроскопию выполняли совместно с д.б.н. Маныкиным A.A. (ГУ НИИ вирусологии РАМН). Негативное контрастирование проводили с помощью 2% водорастворимой фосфорно-вольфрамовой кислоты, рН=6,0 (ФВК) и 2% водного раствора уранилацетата (УА).

Секвеиирование генов НА и NA было проведено в Центрах ВОЗ, сотрудничающих по гриппу: СДС в США, (Атланта) и в Медицинском исследовательском институте Англия (Лондон) по методу, описанному Hemphill et al. (1993).

Статистическая обработка результатов. Определение средних геометрических титров антител, среднего квадратичного отклонения, коэффициентов вариации и корреляции проводили по методу Стьюдента (Беляков и др., 1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ. Этиологическая структура заболеваний гриппом в период 2000 —2004гг.

Материалы были получены из 17 вирусологических лабораторий «Центров гигиены и эпидемиологии» ФГУ здравоохранения разных регионов России (таблица 1). Следует отметить, что период циркуляции вирусов и появление больных с диагностическим

приростом антител в сыворотках больных к эталонам этих штаммов, приходился на осенне-зимний период (с ноября по март). Эти данные варьировали в зависимости от эпидемического сезона. Так, например, по вирусологическим данным, эпидсезоны: 20002001, 2001-2002, 2002-2003 начинались в декабре и заканчивались в марте, однако эпидсезон 2003-2004гт. в ряде регионов России начинался с ноября 2003 года.

При этом заболевания регистрировали и позже, по серологическим данным диапазон времени расширялся. Так, эпидсезон 2000-2001гг. длился с декабря по февраль, 2001 -2002гг. с января по апрель, а 2002-2003гг. и 2003-2004гг. с декабря по март. Это может быть объяснено более активным выделением вируса в середине эпидемии.

В каждом эпидсезоне, по вирусологическим данным, мы наблюдали циркуляцию и (»циркуляцию вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗ№) и В, в различных сочетаниях. При этом в зависимости от эпидсезона в вирусной популяции доминировали разные вирусы. На пример, доля эпидемических штаммов вирусов гриппа А(НЗК2) в вирусной популяции варьировала от 0 до 100% в 2001 и 2004гг., соответственно. Вирусы гриппа А(НШ1) доминировали в сезоне 2000-2001гт. и отсутствовали в 2003-2004гг. Вирусы гриппа В были изолированы в наибольшем количестве в эпидсезоне 2001-2002гг., не были изолированы в эпидсезоне 20032004гг. При рассмотрении этиологии возбудителей, вызывавших подъем заболеваемости в каждом эпидсезоне, по данным серологических исследований, диагностический прирост титров антител к вирусам А и В наблюдался во всех энидсезонах. Однако, доля их значительно варьировала, в зависимости от сезона. Наибольшее показатели регистрировались у вирусов гриппа А(НЗ№) (54%) в эпидсезон 2003-2004гг. Наибольший диагностический прирост тигров антител к вирусам гриппа А(НШ1) имел место в эпидсезон 2000-2001гг. - 35%. Диагностический прирост антител к вирусам гриппа В наблюдался ежегодно и варьировал от 1%, в эпидсезон 2003-2004гг., и до 13%, в эпидсезон 2002-2003гг.

Таким образом, при сопоставлении серологических данных с вирусологическими, мы видим сходную картину. В периоды, когда наблюдалось большее число сероконверсий в парных сыворотках от больных к данному возбудителю, регистрировали наибольшее число изолированных штаммов вируса гриппа. По серологическим данным были выявлены случаи заболеваний с неясной этиологией, клинические проявления которых имели сходство с гриппом. Отмечен также процент заболеваний, вызванный другими острыми респираторными вирусами, он изменялся от 24 до 56%, в то время как, для микст-ифекции вирусов гриппа А и В - находился в диапазоне от 5 до 17%.

Таблица 1.

Циркуляция вирусов гриппа А и В в разных регионах России, в эпидемических сезонах с 2000 по 2004гг._

Эпидсезон Вирусологические исследования Серологические исследования** Города

Тип вируса Период взятия материала % детей* Штаммы %сероконверсий к Ым % ИоРВИ К сывороток

Д №

2000-2001 А(НШ1) 12.00-02.01 38,3 38 25-63 35 10 45 134 Калининград В. Новгород ♦ Петрозаводск Москва Мое. область* Липецк♦ Рязань Владимир ♦ Ярославль ♦ Н. Новгород ♦ Киров Пермь Челябинск Омск Томск Улан-Удэ Хабаровск*

А(НЗИ2) 12.00-02.01 нв 9 5

В 03.01-03.01 9 0-28 5

2001-2002 А(НШ1) 03.02-3.02 69,4 4 0-18 8 5 52 83

А(НЗШ) 02.02-04.02 17 26-100 24

В 12.01-03.02 41 0-33 11

2002-2003 А(НШ1) 01.03-03.03 41 41 7-24 6 11 56 188

А(НЗШ) 12.02-03.03 116 9-24 14

В 01.03-03.03 21 0-20 13

2003-2004 А(НШ1) 12.03-03.04 52,5 нв 0-19 4 17 24 115

А(НЗ№) 11.03-03.04 101 40100 54

В 12.03-03.04 нв 0-15 1

Примечание: ♦ - города из которых были получены сыворотки от переболевших, кроме вирусологического материала,; * - % детей до 14 лет, от которых был получен вирусологический материал; "Серологические исследования: Л - диапазон сероконверсий ( % ) к вирусам гриппа в сыворотках переболевших, в зависимости от региона; № - общий % сероконверсий; Км - % переболевших микст-инфекцией вирусов гриппа А и В; Йорви - % сывороток от больных с диагнозом грипп и ОРВИ, не имевших прироста антител к вирусам гриппа; N сывороток - общее число пар исследованных сывороток от больных с диагнозом грипп и ОРВИ;

Особый интерес представлял возрастной состав больных. По нашим данным процент детей до 14 лет, от которых были изолированы вирусы гриппа, варьировал от 38,3% до 69,4%, а у взрослого населения от 30,6 % до 61,7 %, в зависимости от эпидсезона.

В результате проведенных исследований была установлена этиология эпидемий, в период с 2000г. по 2004г. В целом за этот период в вирусной популяции, как по вирусологическим, так и по серологическим данным, доминировали вирусы гриппа А(НЗК2). Они составляли по вирусологическим данным 60%, по серологическим 22%, для вируса гриппа А(НШ1) - 21% и 14%; а для вируса гриппа В - 19% и 8%, соответственно. Таким образом, соотношение возбудителей по вирусологическим и серологическим данным оказалось сходным, за весь исследуемый период.

Распространение и характеристика штаммов (антигенные свойства) вируса гриппа А(НШ1).

После возвращения в человеческую популяцию в 1977 году вирусов гриппа А(НШ1), они стали регулярно циркулировать с различной активностью в разные эпидемические сезоны. Они были подобны эталонным штаммам соответствующих эпидсезонов, при этом антигенный дрейф гемагглктшина имел поступательный характер. В рассматриваемый период вирусы гриппа А(НШ1) доминировали в эпидсезон 2000-2001гг. и активно циркулировали в эпидсезон 2002-2003гг., в сезон 2003-2004гг. вирусы гриппа А(НШ1) не были изолированы. В 2001-2002гг. эпидсезон они вызывали подъемы заболеваемости в пограничных регионах России - на востоке, в Хабаровском крае и на западе - в Калининградской области (1 штамм передан нам из Федерального Центра по гриппу в Санкт-Петербурге). В эпидсезоне 2002-2003гт. их географическое распространение значительно расширилось, они циркулировали в Центрально-Европейской части России Вирусы гриппа А(НШ1), циркулировавшие в России с 2000г. и принадлежали к эволюционной ветви, первым представителем которой был штамм А/Пекин/262/95 (таблица 2). Ранее вирусы этой ветви были изолированы в спорадических случаях в двух городах Москвы и Улан-Удэ только в 1998г. (Литвинова и др., 1998, Иванова др., 2003).

Эпидемические штаммы, активно циркулировавшие в России, начиная с 2000г. являлись антигенными вариантами эталона А/Новая Каледония/20/99. Вирусные популяции эпидсезона 2000-2001гг. содержали много штаммов, реагировавших с сывороткой , приготовленной к штамму А/Новая Каледония/20/99 до 1 - 1/2 титра. Однако в последующие сезоны вирусные популяции содержали штаммы, взаимодействие которых с сывороткой к штамму А/Новая Каледония/20/99 было слабее.

Таблица 2.

Антигенный дрейф гемагглютинина и нейраминидазы эпидемических штаммов вируса гриппа A(H1N1), 1995 -2001гг. изоляции (PITA, лектин-тест).

Эпндсезоны Штаммы Титры сывороток к эталонам вирусов гриппа

эволюционных лилий A(H1N1) A(H3N2)

А/Техас/36/91; А/Иоганнесбург /82/96 А/Пекин /262/95;* А/Н.Каледония /20/99* А/Иоганнесбург /33/93; А/Панама /2007/99

НА NA НА NA НА NA

1995-1996 8 1-1/2 1/4 1/32 1/64 <1/32 НС

1997-1998 21 1-1/8 1/4 1/16 1/16 <1/32 НС

1* 1/32 1/2 1/2 1/2

2000-2001 38* 1/32 1/16 1-1/4 1 <1/32 НС

2002-2003 34* 1/32 не 1-1/8 1-1/8 <1/32 <1/16

Примечание: * - штаммы, относящиеся к эволюционной линии А/Пекин /262/95-подобные;

Сравнительный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательности гемагглютинина эпидемических штаммов A(H1N1), изолированных в 2000-2001 году с эталонами этой ветви показал наибольшее число отличий (12-13) в гемагглютинине эпидемических штаммов при сравнении с НА1 «основателя» группы эталона А/Пекин/262/95, в то время как с НА1 эталона А/Новая Каледония/20/99 найдено 3-4 замены. Они были зарегистрированы в антигенном сайте CAI, согласно картированию гемагглютинина (Cafen et al., 1982). Таким образом, генный анализ подтвердил вирусологические данные. Кроме того, внутри вирусной популяции у НА1 эпидемических штаммов были выявлены различия в позициях аминокислот, регистрируемые по всей длине НА1 (Иванова и др., 2003). Исследования парных сывороток от больных в целом за период с 2000-2004гт. выявили приросты антител к эталону А/Новая Каледония/20/99 в 14% случаях, они варьировали от 0 до 63%, в зависимости от эпидсезона и региона. Наибольший процент случаев сероконверсий был выявлен в эпидсезоне 2000-2001гг. и составил 35%. Это подтверждало циркуляцию этого вируса за указанный период (таблица 1). В сезон 20032004гг., когда вирусы гриппа A(H1N1) не были изолированы, но было зарегистрировано 2 случая с диагностическим приростом титров антител (1:640), что указывало на их не активную циркуляцию в данный эпидсезон.

Социркуляция вирусов гриппа A(H1N1) и A(H3N2) в мире, привела к возникновению в период с 2001 по 2003 год в некоторых странах реассортантных штаммов A(H1N2) (Ellis, 2002; WER, 2003). В связи с этим нами были проведены исследованиях нейраминидазы эпидемических штаммов вирусов гриппа в лектин-тесте с сыворотками, приготовленными к эталонным штаммам А/Новая Каледония/20/99(Н1Ш) и A/MocKBa/10/99(H3N2). Эпидемические штаммы 2002-2003гг. реагировали только с сывороткой А/Новая Каледония/20/99 до 1 - 1/8 гомологичного титра и не реагировали (<1/16 гомологичного титра) с сывороткой A/MocKBa/10/99(H3N2) (таблица 2). Полученные данные указывают на то, что в вирусной популяции среди исследованных штаммов отсутствовали реассортантные штаммы A(H1N2).

Таким образом, после появления представителей новой ветви А/Пекин/262/95, вирусы относящиеся к ней постепенно приобрели эпидемический потенциал и практически вытеснили из циркуляции в мире представителей прежней эволюционной ветви A(H1N1), эталоном которой являлся А/Иоганесбург/82/96. Анализ эпидемических штаммов A(H1N1), выделенных в России с 2000г. (Таблица 2), показал, что у нас наблюдалась аналогичная ситуация.

Циркуляция и свойства вирусов гриппа A(H3N2). Сравнительные исследования популяционного иммунитета к вирусам гриппа A(H3N2), A(H1N1) и В населения разных регионов России, в эпидемический сезон 2003-2004ГГ.

Как показали исследования, вирусы гриппа A(H3N2) вызывали эпидемический подьбм заболеваемости гриппом в эпидсезонах 2001-2002гг., 2002-2003гг., 2003-2004гг. в России. Они были изолированы во все эпидсезоны за период исследования, кроме сезона 2000-2001гг. (таблица 1). В сезоне 2001-2002гг. вирусы гриппа A(H3N2) вызывали подъемы заболеваемости в некоторых регионах России, а в эпидсезоне 2003-2004гг. они циркулировали в большинстве регионов. В эпидсезоне 2001-2002, 2002-2003гг. основная масса вирусов была подобна эталонному штамму А/Москва/10/99 или А/Панама/2007/99, варианты которых циркулировали и в других странах света, только несколько штаммов были подобны эталону А/Фуцзянь/411/02(НЗГО). В последующий эпидсезон 2003-2004гг. все изолированные штаммы A(H3N2) (115) были подобны эталону А/Фуцзянь/411/02(H3N2).

Рисунок 1. Суммарные показатели защищенности населения трех районов Приморского края к эталонным штаммам вируса гриппа А и В в октябре 2003г. (с титрами 21:40).

98

эталонные штаммы вируса гриппа

Рисунок 2. Средние геометрические титры (СГТ) антител к эталонным штаммам вирусов гриппа А и В в сыворотках населения различных регионов Приморского края в октябре 2003г. СГГ(10Я2) д

эталонные штаммы вируса гриппа

Таким образом, антигенная изменчивость вирусов гриппа А(НЗ№) за указанный период шла в направлении дрейфа эталонных штаммов А/Москва/10/99—»А/Фуцзянь/411/02. Циркуляция вирусов гриппа А(НЗ№) в указанный период была подтверждена серологическими исследованиями: анализом парных сывороток от переболевших с диагнозом грипп и ОРВИ. Диагностический прирост антител к вирусу гриппа А(НЗ№) наблюдался в сыворотках больных во всех зпидсезонах, когда были выделены штаммы вирусов гриппа А(НЗ№). В эпидсезоне 2003-2004гг. диагностический прирост титров антител в сыворотках переболевших достигал 100%, в некоторых регионах России. В среднем процент сероконверсий за этот эпидсезон составлял 54%.

Активная циркуляция вирусов А(НЗИ2) была обусловлена не только изменением антигенной структуры вируса, но и низким уровнем антител к этим вирусам, что было показано при исследовании донорских сывороток, полученных из Центрально-Европейского региона и Приморского края до начала эпидемического сезона 2003-2004гг. Так процент лиц с защитными титрами антител (>1:40) к эталонному штамму А/Кумамото/102/02 -аналог эталона А/Фуцзянь/411/02, выделенный на КЭ, находился в диапазоне от 7 до 36%. СГТ варьировал от 3 до 4,2 в зависимости от района (Рисунок 1,2). Для других штаммов вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗ№) и В эти показатели были значительно выше. Низкий уровень антител в сыворотках крови был также зафиксирован у доноров г. Москвы и Московской области к вирусу гриппа А(НЗК2), который равнялся 4,22 1о& в декабре 2003 г. до начала эпидемии. После окончания эпидсезона был выявлен прирост СГТ в сыворотках крови, достигший 5,6 1о§2 весной (апрель-май). Таким образом, за период 2000-2004гг. в России, как и в мире на смену вирусам, подобным эталону А/Москва/10/99 пришли вирусы подобные новому эталону А/Фуцзянь/411/02, которые и вызывали эпидемию в России 20032004гг. Их широкое распространение было обусловлено низким уровнем защитных титров антител у населения к данному эталону.

Эпидемические штаммы вируса гриппа типа В, вызывавшие подъёмы заболеваемости в России.

В результате проведенных вирусологических и серологических исследований установлено, что вирусы гриппа В являлись возбудителями эпидемии 2001-2002гг., и вызывали подъемы заболеваемости в некоторых регионах России в 2002-2003гг. и значительно меньше в 2000-2001гг. Во всех сезонах вирусы гриппа типа В циркулировали в разных сочетаниях с вирусами гриппа А(НШ1) и А(НЗК2) (Таблица 1). Эпидемические штаммы вируса гриппа типа В в период с 2000 по 2003 год включали вирусы гриппа

эволюционной ветви В/Ямагата/16/88 (эталоны В/Яманаши/166/98 и В/Сичуань/379/99) и, возвратившиеся в циркуляцию, вирусы гриппа эволюционной ветви В/Виктория/2/87, через 10 лет после их отсутствия в России (таблица 3).

Таблица 3.

Антигенные свойства НА и КА эпидемических штаммов вирусов гриппа В двух эволюционных линий: В/Ямагата/16/88 и В/Виктория/2/87 в период 2000-2003гг.

Эпидемические Тип эволюцион- Титр сывороток к эталонам В/Ямагата/16/88 - группа (Я) Титр сывороток к эталонам В/Викторня/2/87 - группа (В)

сезоны ных линий НА Эталоны НА КА Эталоны

1990-1991* 74 1-1/16 1-1/4 В/Ямагата /16/88 1-1/16 1/81/16

2000-2001 я 9 1-1/4 1-1/2 В/Яманаши /166/98 1/128 1/64 В/Гонконг /22/01

2001-2002 я 41 1-1/8 1-1/4 В/Сичуань /379/99 1/321/128 1/64 В/Гонконг /22/01

2002-2003 н 21 1/321/128 1/21/16 В/Сичуань /379/99 1/21/16 1/21/64

Примечание: * - данные эпидемического сезона 1990-1991гг. были использованы по литературным данным (Иванова и др., 1993); НА - гемагглютинин исследовался в РТГА; 1<А - иейраминидаза исследовалась в лектин-тесте; N ** - число выделенных штаммов.

Возврат в Россию вирусов гриппа В с НА, подобным НА вирусов ветви В/Виктория/2/87 был зафиксирован в сезоне 2002-2003гг. Эпидемические штаммы взаимодействовали с сывороткой к эталону В/Гонконг/22/01 этой ветви в диапазоне от 1/2 до 1/16, в то время как взаимодействие с сывороткой к эталону В/Сичуань/379/99 (ветвь В/Ямагата/16/88) практически отсутствовало, титр был меньше 1/32. Вирусы эволюционной ветви В/Ямагата/16/88 начали циркулировать в России с эпидсезона 1990-1991гт. и продолжали циркулировать во всех сезонах до 2002-2003гг.(Иванова и др., 1993, Гринбаум и др., 1994) Следует отметить, что ранее в эпидсезоне 2001 -2002гг. в сыворотках от больных был выявлен прирост антител к вирусам гриппа В, в двух случаях к В/Гонконг/22/01, однако максимальный титр сывороток к этому эталону не превышал 1:40, что указывало на возможную и осуществившуюся в следующем эпидсезоне циркуляцию вирусов гриппа эволюционной ветви В/Виктория/2/87. Что касается антигенных свойств ЫА эпидемических штаммов вирусов гриппа В, эпидсезона 2002-2003гг., то ее родство с NA эталонов обеих эволюционных ветвей, зависело от штамма. Была зафиксирована циркуляция реассортантов,

у которых НА соответствовал НА вирусов эволюционной ветви В/Виктория/2/87, а 1ЧА -ветви В/Ямагата/16/88. Определение нуклеотвдной и аминокислотной последовательности НА и ЫА этих реассортантов подтвердило, что их НА был наиболее близок к эталону В/Гонконг/330/2001 (4-5 аминокислотные замены), а ИА к - В/Сичуань/379/99 (6-7 аминокислотных замен) (таблица 4).

Таблица 4.

Различия в аминокислотной последовательности поверхностных белков (НА и ОД) эталонных штаммов двух эволюционных линий и реассортантных эпидемических штаммов вируса гриппа В, изолированных в 2003 году.

Эталон | Реассортанты |

Эталон Белки В/Сичуань /379/99 В/Москва /3/03 ы В/Ярославль /16/03 В/Липецк /17/03

В/Гонконг ■г-- и, - <ч>£& < упг

/330/01 МА Г 21 I 1 .26 27 26

В/Сичуань /379/99 НА ИЯ—1 ЙВВ^^Я

Примечание: * - число замен, выявленных в аминокислотной последовательности гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (ЫА) у реассортантных эпидемических штаммов вируса гриппа В, относительно эталонных штаммов;

Таким образом, вирусы гриппа циркулировавшие в России в 2000-2004гг. характеризовались большим разнообразием антигенных свойств поверхностных белков и принадлежали двум эволюционным ветвям. В предыдущие эпидсезоны, в течении 10 лет в России, наблюдалась циркуляция вирусов гриппа В только одной эволюционной ветви В/Ямагата/16/88.

Определение чувствительности современных штаммов вирусов гриппа А и В к различным изоляционным системам (клеткам культуры тканей МШЖ и куриным эмбрионам - КЭ).

В процессе эволюции произошли изменения у вирионных белков вирусов гриппа, затронувшие области, как определяющие антигенные свойства возбудителя, так и другие

Таблица 5.

Выделение из носоглоточных смывов и адаптация к тканям КЭ эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, изолированных на М1)СК в период с 1999г. по 2004 г.

Тип вируса Эпидемические сезоны >1* Эталоны NмDCK-KЭ* Города*

2000-2001 38 н/д н/д н/д

2001-2002 4 3 А/Н.Каледония/20/99 н/д 1

А(НШ1) 2002-2003 41 14 2 11 Москва А ■

2003-2004 Вирус не был изолирован Липецк ▲ ■

Итого: 83 17 2 (12%) 12 (71%) Новгород ▲

1999-2000 59 44 8 32

2001-2002 17 17 А/Москва/10/99 0 7 Н.Новгород ■

А(НЗЫ2) 2002-2003 116 15 0 0 Ярославль ■

2003-2004 101 49 А/Фуджиан/411/02 0 0 Челябинск

Итого: 293 125 8 (6%) 39 (31%) Киров ■

2000-2001 9 5 В/Сичуань/379/99 4 1 Хабаровск ■

В 2001-2002 41 30 0 20

2002-2003 21 8 В/Гонконг/330/01 0 0 Пермь ■

2003-2004 Вирус не был изолирован

Итого: 71 43 4 (9%) 21 (49%)

^Примечание: N - Общее число типированных штаммов; Ми - число исследованных штаммов; N Кэ - число штаммов, изолированных на КЭ из смывов; N моек - кэ - число штаммов, изолированных на Ш)СК и адаптированных к тканям КЭ; Города, предоставившие смывы, из которых удалось изолировать вирусы гриппа на КЭ - А; вирусы, изолированные на МОСК, которые удалось адаптировать к тканям КЭ, -

части бежов, в частности рецепторные участки, определяющие чувствительность вируса к данной системе. Это привело к трудностям в изоляции эпидемических штаммов на КЭ.

Для выяснения вопроса на сколько эти изменения в тропизме зависели от типа вируса, мы провели изоляцию вирусов гриппа А и В из носоглоточных смывов на КЭ, а также адаптацию вирусов к тканям КЭ, после их изоляции на клетках культуры тканей MDCK. В работе были исследованы только те смывы, из которых были выделены штаммы на MDCK.

Исследовано 185 эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В, изолированных на MDCK в период с 1999 по 2004 год, на чувствительность к традиционной системе изоляции (КЭ) и культивирование их на куриных эмбрионах. Для этого была проведена изоляция штаммов из носоглоточных смывов и адаптация вирусов, изолированных на MDCK, в течении 1-2 пассажей. Всего было изолированно на КЭ 14 штаммов, что составило - 7,6% и адаптировалось к тканям КЭ - 72 вируса, изолированных на MDCK - 39% (таблица 5). Для вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В соотношение числа штаммов, изолированных на КЭ / к числу штаммов, изолированных на MDCK - составило 2/17 (12%), 8/125 (6%), 4/43 (9%), соответственно. Соотношение числа штаммов, адаптированных к КЭ для этих вирусов составило 12/17 (71%), 39/125 (31%), 21/43 (49%), соответственно. Носоглоточные смывы и изоляты поступали из разных регионов России, из 9 городов. Только из трех городов (Москва, Липецк и Нижний Новгород) мы смогли изолировать штаммы на куриных эмбрионах из смывов. Удалось адаптировать вирусы, изолированные на MDCK, к КЭ, поступившие из 7 городов, то есть в этих исследованиях географический охват оказался шире.

Полученные результаты могут быть объяснены длительной циркуляцией вирусов гриппа А и В в человеческой популяции и особенностью эволюционного процесса у каждого вируса. Совокупность этих причин, по видимому, и привела к увеличению тропизма к клеткам млекопитающих и его снижению к традиционной системе изоляции и культивирования - КЭ.

Особенности протеолитической обработки современных вирусов гриппа А и В. Получение субвирусных частиц с использованием фермента бромелаина.

В работе исследовались эталонные штаммы вирусов гриппа: А/Новая Каледония/20/99(НШ1), A/MocKBa/10/99(H3N2), высоко репродуктивный реассортант A/X-31(H3N2) и В/Сичуань/379/99. Как показали исследования, при получении субвирусных частиц из этих штаммов вирусов гриппа с использованием двух препаратов бромелаина фирмы Sigma (каталожные №№ В2252 и В5144) была выявлена избирательная способность

Рисунок 3. Электрофорез в 8Б8-полиакриламидном геле полипептидов вирусов гриппа А(НШ1) и В, обработанных препаратами фермента бромелаина.

a be

Подписи к рисунку 3. Электрофорез в SDS-полиакриламидного геля (ПААГе) полипептидов вирусов гриппа, бритых частиц и препаратов бромелаина а: А/Новая Каледония/20/99 (A/H1N1); Ь В/Сичуань/379/99; с препараты бромелаина. Дорожки: 1,4-вирусы; 2,5- субвирусные частицы, полученные с помощью бромелаина В5144; 3-субвирусные частицы были полученны бромелаином В2252; 6-7 препараты бромелаина - В5144, В2252. Маркированы основные вирионные белки: НА (гемагглютинин), NP (нуклеопротеин) and Ml (матриксный белок). Концентрация SDS-ПААГ была 15% (а) или 12% (Ь,с), электрофорез проводился в невосстанавливающих условиях. Окраска белков в геле проводилась с помощью раствора Кумасси бриллиантового голубого G-250.

Рисунок 4. Электронно-микроскопическое исследование вируса гриппа

В/Сичуань/379/99, обработанного препаратом В5144 фермента бромелаина.

♦В/Сичуань/379/99 + бромелаин В5144= субвирусные частицы (вирус) (фермент)

Подписи к рисунку 4. а - интактный вирус гриппа В/Сичуань/379/99; б - субвирусные частицы (вирионы, лишенные поверхностных белков); * - схема реакции.

бромелаина В5144 к протеолитическому раицепленшо гемагтлютинина вирусов гршша А и В. При электрофорезе в ПААГ-е и электронно-микроскопическом исследовании вирусов и субвирусных частиц бьио установлено, что обработка ферментом бромлайном В5144 вирусов гриппа В приводила к удалению наружных белков с поверхности вириона и появлению субвирусных частиц. На вирус гршша А(НШ1) данный фермент не действовал, в аналогичных условиях эксперимента (Рисунки 3,4). После обработки ферментом бромлайном В5144 на электрофореграмме субвирусных частиц вируса гриппа В отсутствовала полоса НА (Рисунок 3, дорожки 4,5). У вируса гриппа А(НШ1) этот белок регистрировался (дорожка 2). После обработки ферментом бромлайном В2252 вируса гриппа А(НШ1) белок НА отсутствовал на электрофореграмме (Рисунок 3, дорожка 3). Для вируса гршша А(НЗ№) регистрировалось неполное воздействие, и в реакционной смеси оставались частицы с ненарушенной наружной оболочкой. Фермент В2252 был эффективен в отношении всех вирусов, взятых для исследования. Однако, наибольший эффект наблюдался у вирусов гриппа А(НШ1) и В. Избирательный эффект воздействия фермента бромлайна В5144 на вирусы гриппа А и В может объясняться отсутствием белковых примесей в препарате В5144, в отличие от препарата фермента бромлайна В2252 (Рисунок 3, дорожки 6,7). Возможно, сателлитные примеси участвуют в отщеплении наружных доменов гемагтлютинина и нейраминидазы, проводя некую «предварительную обработку» вириона, например, удаляя углеводные остатки, предоставляя ферменту бромелаину больше возможностей добраться до мишени (Харитоненков, 1981).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Рассматривая в целом картину распространения вирусов гриппа в России в период с 2000 по 2004г., по вирусологическим и серологическим данным, следует отметить, что эпидемические подъемы были вызваны циркуляцией и социркуляцией вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗ№) и В. Вирусы гриппа А(НШ1) были представлены антигенными вариантами эталонов А/Новая Капедония/20/99, А(НЗ№) - А/Москва/10/99 и А/Фуцзянь/411/02 и вирусами гриппа В двух эволюционных ветвей В/Ямагата/1б/88-подобных (В/Сичуань/379/99) и В /Виктория /2/87-подобных (В/Гонконг/22/01) н их реассортантами.

Наибольшее разнообразие вирусов было зарегистрировано в сезон 2002-2003гг., во время которого циркулировали все типы вирусов гриппа, а также их реассортанты. Заболеваемость населения гриппом в 2003 год, по данным Минздрава РФ, составляла около 3,5 млн. человек, что превышало этот показатель в 1,5 - 2 раза по сравнению с 2001,2002 годом. Антигенное и структурное родство отечественных штаммов с эталонными, изолированными в разных точках земного шара, а также реассортанты вирусов гриппа В с одной стороны, и отсутствие

некоторых реассортантных штаммов вирусов гриппа А - с другой стороны, свидетельствует как об общности явлений происходящих в мире, так и о важности и специфичности процессов, наблюдаемых в отдельных регионах. Для уточнения характера возбудителя эпидемий особую важность приобретает расширение географии исследований, т.е. включение в них восточных и западных регионов России.

Выявленное увеличение тропизма современных штаммов вирусов гриппа А и В к клеткам млекопитающих - МЛСК, изменение чувствительности к протеолитической обработке гемагтлютинина современным препаратом фермента бромелаина, в зависимости от типа вируса, свидетельствовали о том, что в процессе эволюции изменения затронули не только области определяющие антигенные свойства гемагтлютинина, но и рецепторные, а также зоны расположенные вблизи легкой цепи гемагглютинина (НА2). Формирование новых антигенных вариантов вирусов гриппа, возможно, косвенным образом свидетельствует о возможном приближении новой пандемии гриппа.

ВЫВОДЫ.

1. Анализ результатов вирусологических и серологических исследований показал, что эпидемии, и подъемы заболеваемости гриппом в России в период с 2000 по 2004 год были вызваны циркуляцией и социркуляцией вирусов гриппа А(НШ1), А(НЗЫ2) и В. Диагностический прирост титров антител к этим вирусам в парных сыворотках от переболевших варьировал в диапазонах: 7-63%, 9-100% и 2-33% случаев, соответственно.

2. Показано, что антигенный дрейф гемагглютинина (НА) эпидемических штаммов имел свои особенности для вирусов гриппа А и В и был подобен этому дрейфу эталонных штаммов. У штаммов гриппа А(НЗ№) изменения НА соответствовали дрейфу в направлении НА эталонов А/Москва/10/99 - А/Фуцзянь/411/02. Все эпидемические штаммы вируса гриппа А(НШ1) являлись вариантами эталона А/Новая Каледония/20/99. Эпидемические штаммы вируса гриппа В принадлежали к двум эволюционным ветвям: В/Виктория/2/87 и В/Ямагата/16/88, в зависимости от сезона.

3. Выявлена активная циркуляция вирусов гриппа, подобных новому дрейф варианту А(НЗ№) (эталону А/Фуцзянь/411/02) в эпидемическом сезоне 2003-2004гг. Показано, что это было обусловлено низким уровнем титров антител к данному вирусу у населения перед началом эпидемического сезона в различных регионах страны. Выявлена положительная динамика роста уровня антител к эталону А/Фуцзянь/411/02 в конце эпидемического сезона.

4. Подтвержден возврат в 2003г. в циркуляцию в России, после 10 летнего отсутствия, вирусов гриппа В эволюционной ветви В/Виктория/2/87 - подобных.

5. Впервые в России в эпидсезоне 2002-2003гг. выявлена циркуляция реассортантов вируса гриппа В: В/Москва/3/03, В/Ярославль/16/03 и В/Липецк/17/03. У реассортантных штаммов НА принадлежал к ветви В/Виктория/2/87, a NA к ветви В/Ямагата/16/88-подобных.

6. Установлено снижение тропизма современных эпидемических штаммов вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В к традиционной системе изоляции - куриным эмбрионам (КЭ). Для вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В соотношение числа штаммов, изолированных на КЭ / к числу штаммов, изолированных на MDCK -составило 2/17 (12%), 8/125 (6%), 4/43 (9%), соответственно. Соотношение числа штаммов, адаптированных к КЭ для этих вирусов составило 12/17 (71%), 39/125 (31%), 21/43 (49%), соответственно.

i«

7. Впервые установлены различия в чувствительности НА современных штаммов вирусов гриппа типов А и В к протеолитической обработке современным препаратом В5144 фермента бромелаина. Наиболее чувствительным к нему оказался вирус гриппа В/Сичуань/379/99 из эволюционной ветви В/Ямагата/16/88, по сравнению с вирусами гриппа A(H1N1) и A(H3N2), которые были менее чувствительными к этому препарату бромелаина.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Иванова В.Т., Слепушкин А.Н., Бурцева Е.И., Беляев А.Л., Оскерко Т.А., Загорская Ю.В. Вирусы гриппа на рубеже веков (распространение и свойства возбудителей) Матер. VIII съезда Всерос. общества эпидем., микроб, и паразит., М., 2002, с.47-48.

2. Бурцева Е.И., Иванова В.Т., Оскерко Т.А., Загорская Ю.В., Слепушкин А.Н. Использование культуры клеток МДСК для определения этиологии эпидемий гриппа в

России в 2001-2002 гг. Тез. доклада на Всероссийской, конф. «Новые препараты в проф., ^

терапии и диагн. вирусных инф.», C.-IL, 2002, с.80-82.

3. Ivanova V.T., Bourtseva E.I., Slepushkin A.N., Oskerko T.A, Zagorskaya Yu.V. Influenza at the beginning of XXI age in Russia. The first European Influenza Conference, St.-Julians, Malta, 2002,

C.6.

4. Иванова B.T., Бурцева Е.И., Слепушкин A.H., Оскерко T.A, Беляев А.Л, Шевченко Е.С, Загорская Ю.В., Феодоритова Е.Л. Работа службы штаммов центра экологии и эпидемиологии гриппа по изучению эпидемических вирусов в России. Материалы симпозиума «Повышение готовности к пандемии гриппа на основе военно-гражданского сотрудничества», Санкт-Петербург, 9-11.05.2003, с.43.

5. Ivanova V.T., Bourtseva E.I., Slepushkin A.N., Kordyukova L.V., Oskerko T.A., Shevchenko E.S., Kiylov S.V., Zagorskaya Yu.V. Influenza surveillance by Influenza Ecology and

Epidemiology Center. Studies, results, achievements. In Abstracts Book of Int. Conf. "Options for the Control of Influenza V", Nago City, Okinawa, Japan, October 7-11,2003, p.66.

6. Иванова B.T., Бурцева Е.И., Слепушкин A.H., Оскерко Т.А, Загорская Ю.В, Колобухина JI.B., Феодоритова Е.Л. Распространение и свойства эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В, вызвавших подъёмы заболеваемости в России в 1999-2002гг. Вопр. вирусол., 2003, №4,с.11-15.

7. Иванова В.Т., Кордкжова Л.В., Маныкин А.А., Бурцева Е.И., Загорская Ю.В., Оскерко Т.А., Слепушкин А.Н. Особенности протеолитической обработки современных вирусов гриппа А и В. Получение субвирусных частиц с использованием двух препаратов фермента бромелаина. Вопр. вирусол., 2003, №5, с.14-18.

8. Загорская Ю.В., Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Оскерко Т.А., Ходякова И.А, Мельник Е.Л., Ракутина P.O., Слепушкин А.Н. Значение серологического обследования больных гриппом и острыми респираторными инфекциями. Научные труды Федер. научн. центра гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана «Факторы риска и здоровье населения в регионах России», Липецк, 2004, Выпуск 13, с.390-394.

9. Загорская Ю.В., Иванова В.Т., Щелканов М.Ю., Бурцева Е.И., Черкасов Е.Г., Феодоритова Е.Л., Ракутина P.O., Шевченко Е.С., Слепушкин А.Н. Циркуляция вирусов гриппа в России в эпидсезон 2003-2004гт. Тезисы Российской научно-практич. конф. «Узловые вопросы борьбы с инфекцией», 1-2 декабря 2004г., Санкт-Петербург, с.98-99.

10. Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Слепушкин А.Н., Оскерко Т.А., Загорская Ю.В., Шевченко Е.С., Машкова С.А., Феодоритова ЕЛ. Особенности вирусов гриппа, обусловивших эпидемический подъём заболеваемости в России в 2002-2003гт. Возврат в циркуляцию вирусов гриппа, подобных В/Виктория/2/87. Вопросы вирусологии, 2004, №3, с.12.

11. Ivanova V.T., Burtseva E.I., Zagorskaya Yu.V., Oskerko T.A., Shevchenko E.S., Rakutina R.O., Kordyukova L.V., Feodoritova E.L., Slepushkin A.N. Influenza viruses in Russia during the 2003-2004 epidemic seasons. In Abstract Book " The First International Conference on Influenza Vaccines for the World", 24-26 May 2004, Lisbon, Portugal.

12. Zagorskaya Yu.V., Ivanova V.T, Bourtseva E.I, Kordyukova L.V, Oskerko T.A., Rakutina R.O., Slepushkin A.N. Influenza viruses: properties and sérodiagnostics. In poster presentations of VI International Symposium on respiratory viral infections, 18-21 March 2004, Sanibel Harbour Resort& Spa, Fort Myers, USA p. 19.

13. Иванова B.T., Бурцева Е.И., Слепушкин A.H., Кордюкова Л.В., Федорова Е.Л., Черкасов Е.Г., Оскерко Т.А., Загорская Ю.В., Шевченко Е.С., Машкова С.А., Феодоритова Е.Л., Ракутина P.O. Изменчивость вирусов гриппа, циркулировавших в России в последние годы.

Тезисы на Международную конференцию «Актуальные вирусн. инфекции-теоретические и практические аспекты», 2-5 ноября 2004г., Санкт-Петербург, с.25.

14. Слепушкин А.Н., Иванова В.Т., Бурцева Е.И., Беляев АЛ., Оскерко Т.А., Загорская Ю.В., Феодоритова Е.Л., Шевченко Е.С., Ракутина P.O., Львов Д.К. Результаты исследований Центра экологии и эпидемиологии гриппа в 1994-2004 гг. Тезисы на Междун.конферен. ((Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практич. аспекты», 2-5 нояб. 2004г., Санкт-Петербург, с. 19.

15. Ivanova, V.T., Burtseva E.I., Slepushkin A.N., Kordyukova Л.В., Oskerko T.A., Shevchenko E.S., Fillipova I.Yu., Zagorskaya Yu.V. Influenza surveillance in Russia conducted by Center of Influenza Ecology and Epidemiology. Options for the Control of Influenza V. Proceedings of the International Conference on Options for the Control of Influenza V (Edited by Y. Kawaoka), Elsevier 2004p.284-287.

16. Ivanova V.T., Burtseva E.I., Slepushkin A. N„ Kordyukova L.V., Fedorova N.V, Oskerko T. A., Zagorskaya J. V., Rakutina R.O., Shevchenko E.S.Evolution of human influenza viruses at the boundary of XX and XXI centuiy in Russia, In Abstract book of 5Л Louis Pasteur Conference on Infectious Diseases, 17-20 November 2004, Institute Pasteur, Paris, France, p.22.

17. Ivanova V.T., Bourtseva E.I., Slepushkin A.N, Belyaev A.L., Oskerko ТА., Shevchenco E.S., Zagorskaya J. V., Feodoritova E.L. Strain Surveillance in Influenza etiology and Epidemiology Center for Epidemic Viruses Circulation in Russia. Strengthening Influenza Pandemic Preparedness through Civil-Military Cooperation Ed. J.Neville and O.I.Kisilev, IOS Press 2005 Amsterdam, Berlin, Oxford, Tokio,Washington, DC, P.131-138.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям доктору медицинских наук, Заслуженному деятелю науки РФ, профессору Слепушкину Анатолию Николаевичу и доктору биологических наук, ведущему научному сотруднику Ивановой Валерии Тимофеевне за научное руководство.

Основные результаты, получены в соавторстве с к.м.н. Е.И. Бурцевой, с.н.с. Т.А. Оскерко, д.б.н. АА. Маныкиным, (НИИ вирусологии РАМН), к.б.н Л.В. Кордюковой (МГУ им. М.В. Ломоносова). Автор глубоко признателен и благодарен своим соавторам.

За консультативную помощь, автор выражает глубокую благодарность к.б.н. Е.И. Исаевой и к.б.н. И.Т Федякиной (НИИ вирусологии РАМН).

Типография ООО «Телер» 127299 Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД № 00595

Подписано в печать 23.05.2005 г. Формат 60x90 1/16. Тираж 100 экз. Бумага «Снегурочка» 1,5 печ.л. Заказ № П 501

»12279

РНБ Русский фонд

2006-4 7496

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Загорская, Юлия Владимировна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Рисунок 6. Процент сывороток от переболевших с диагнозо! грипп и ОРВИ, не вызванный вирусами гриппа, в разные эпидемические сезоны поданным серодиагностики.

60 52 JjL

(III

2000-2001 2001-2002 2002-2003 2003-2004 эпидемические сезоны

Рисунок 9. Этиология эпидемий гриппа по данным серодиагностики в период с 2000 по 2004 год.

IP s 1 » i i •

1 ■ M к S3 II II II If

Jit 1 1 t * II

H «1 • - » i

к iU IIIM f! ninl \

in ml

H ffj 1 fifij \

1 I 58 |i

Ц fs

J j |

I 1 I Is

f 3 i I IS

i I li !!

*

li л

г SI I'M ! II I'll1 ijljillj!

iif Hfli M I::.,.' ..; 'I.ri

! : ! 1 { i I 1 1 i I 1 ! 1 1 1 i 5 t

! , ■■ i Ml !)iil|!i|| >Ujll|

I I HI « i 5

1 » 3 s

I ;: Ill 5 1 | e ii

i 1 i j

а If м -1 "I = 1

J?I

lif i's -i =1 -!

M 2? =s 2i

"If S3

Б if *

-III i

N 5?

2 я s a

i 3 .1 5 3 a s 1 'S

i - =

i I

I I

га

1 и

Рисунок 19. Спектр прироста антител к эталонным штаммам

вируса гриппа типа В в сыворотках переболевших Владимирской области в эпидемический сезон 2002-2003гг.

В/Сичуань/379/99

• 9

,, Jit Iji-llliilillll

— НИ В/Сичуяиь/379/99.

шП.—

ffTM •-—

■Ill

не ферментом B22S2,