Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности структуры продуктов деградации стабилизированного фибрина, содержащих D домен, и их влияние на полимеризацию фибрина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности структуры продуктов деградации стабилизированного фибрина, содержащих D домен, и их влияние на полимеризацию фибрина"

РГ6 од - 8 ОКТ 1996

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О.В. Палладіпа

На правах рукопису

ЛУКІНОВА Ніна Іванівна

ОСОБЛИВОСТІ СТРУКТУРИ ПРОДУКТІВ ДЕГРАДАЦІЇ СТАБІЛІЗОВАНОГО ФІБРИНУ, ЩО МІСТЯТЬ О-ДОМЕН, ТА IX ВГІЛИВ НА ПОЛІМЕРИЗАЦІЮ ФІБРИНУ

03.00.04 - біохімія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ 1996

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі структури та функцій білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна Національної академії наук України.

Науковий керівник Офіційні оповити:

Провідна організація

кандидат біологічних наук Платонова Тетяна Миколаївна

доктор біологічних наук, професор Кібірєв Володимир Константинович

кандидат біологічних наук Вєрьовка Сергій Вікторович

Національний університет ім. Тараса Шевченка

Захист відбудеться «^3 1996 р0Ку 0 14-00 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д 01.84.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Пал-ладіна НАН України за адресою: 252601, Кнїв-30. вул. Леонговича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. .

Автореферат розісланий ^ схугли-і р0Ку

Вчений секретар спеціалізованої ради

О.В.Кірсєнко

з

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТІ!

АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ. Гемостатичний баланс можна розцінювати як рівновагу між двома протилежними процесами - зсіданням крові та фібринолізом. Система зсідання кропі являє собою каскад біохімічних реакцій, спрямованих на утворення фібринопого згустка з його неактивного попередника фібриногену під дією протеолітичного ферменту тромбі ну. Точність і ефектипмість самоскляданпя фібрину зумовлена наявністю специфічних центрів полімеризації, частина яких активна в молекулі фібриногену, а комплементарні їм центри експонуються в молекулі моїюмерного фібрину після відщеплення фібринопептидіп від фібриногену. За рахунок неповного набору активних цеіпрів фібриноген та продукти його ферментативного розщеплення виступають інгібіторами полімеризації фібрину. Взаємодія продуктів ферментативного розщеплення фібрин(огсн)у з фібрином під час полімеризації є зручною моделлю вивчення механізмів утворення надмолекулярних біологічних структур.

Раніше нами було показано, що у присутності Са2* під дією фібринолітичпої протеази плазміну в Иц-фрагменті відбувається розщеплення міждоменпого пептндиого зв'язку в С-кіїщепіП ділянці вр-лапцюга. Це розщеплення призводить до появи о^д-фрагмента, який має підвищену аіггнполімсризаційпу активність. Як відомо, О-димер е фактично двома Оц-фрагмептамн з двох різних молекул фібрину, що стабілізовані за у-лапцюгамн. Було важливо дослідити можливість аналогічного механізму підвищення антиполімеризаційної активності у О-димеру. Крім того, раніше було доведено, що О-димер та О-фрагмент гальмують процес полімеризації фібрину за різними механізмами. Цю різницю з точки зору як їх структурних особливостей, так і функціонування центрів полімеризації у вищеназваних специфічних інгібіторів було необхідно дослідити детальніше.

Водночас, наявність продуктів деградації фібриногену/фібрину (ПДФ) у плазмі крові є показником порушення гемостатичного балансу. Підвищений рівень цих продуктів супроводжує тромбоз глибоких вен, синдром днееміпованого внутрішньосудшіпого зсідання, травми, хірургічні віручанпя, інфекції, розпиток пухлин, серповидно-кліпишу анемію. Таким чином, рівень ПДФ у плазмі крові є дуже важливим показником для підтвердження діагнозу хвороб, пов'язаних з активацією чи пригніченням зсідиючої та

проти зсідаючої систем. Спостереження за зміною ріки я ГІДФ піл час терапії тромболітмкамн може показувати ефективність лікування. Тому розробка нових підходів ло виявлення ПДФ у плазмі крові людніш має в-дике значення лля лабораторно! клінічної діагностики.

МЕТА РОБОТИ ТА ЗАВДАННЯ ДОСЛІДЖЕННЯ. Метою роботи Суло вивчення структурних і функціоналі іих особливостей продуктів ферментативного розщеплення стабілізованого фібрину, що містять О-домепн, та порівняльне /’''слідження процесу гальмування полімеризації фібрину різними формами О-фрагментів фібриногену та О-димерів стабілізованої о фібрину. Виходячи з ц'.ого, було визначено такі завдання експериментальних досліджень:

1. Вивчити проце- ферментативного розщеплення димерного фрагмента О зі стабілізованого фібрину та дослідити структуру продуктів розщеплення.

2. Провести дослідження антиполімеризаціПних властивостей різних

форм О-димеру. . .

3. Вилучити та дослідити структурні та функціональні особливості С-

кінцеиої ділянки р-ланцюга Б-димеру. .

. 4. Вивчити вплив специфічних інгібіторів, які містять О-домени, на різні

стадії полімеризації фібрину - стадію утворення протофібрил (лаг-фаза) та стадію латеральної асоціації протофібрил та фібрил.

5. Дослідити чутливість скринінг-тесту "анцистроновий час" до різних концентрацій продуктів деградації стабілізованог о фібрину.

НАУКОВА НОВИЗНА. В результаті проведених досліджень вперше показано, що коровий димерний фрагмент О стабілізованого фібрину бика може гідролізуватися плазміном до більш низькомолекулярних форм з підвищеною антиполімеризаційною активністю. Вивчення структури очищених форм О-димеру та вилученої С-кіпцевої ділянки Р-ланцюга показало, що підвищення антиполімеризаційної активності відбувається в результаті збільшення доступності центру полімеризації (12 за рахунок розщеплення поліпептидпого зв'язку Ьузз93'ТЬгз94 у С-кіпцевої ділянки р-лаїщюга. Також показано, що Од и мер проявляє свої антнполімернзаційні властивості більше на сталії латеральної агрегації протофібрил і фібрил, на підміну від О-фрагмеїпа. який є ефективним інгібітором обох стадій полімеризації фібрину. Крім того, під час дослідження гальмування процесу самоскладання фібрину вихідними та

активованими фрагментами D та DD энаПлсно, що розщеплення зв'язку Lys393-Thr394 у С-кіпцевіІІ ділянці р-лапцюга не призводить до зміни механізму гальмуючої дії специфичного інгібпора. Для D-днмсру знайдено повні! термодинамічний перехід у зоні 60-70°С, який відсутній у D-фрагмента, що вказує на можливість пояпн попої структури, утвореної під час взаємодії двох D-доменіп, яка може визначати різницю меха; ізмів гальмування самоскладання фібрилу D-фрагментом і D-днмером.Також показано, що скриііінг-тест "анцистроновий час" може використовуватися для визначення продуктів деградації стабілізованого фібрину п плазмі кропі людини.

ПРАКТИЧНА ЗНАЧИМІСТЬ РОБОТИ. Одержані результати дозволяють глибше зрозуміти механізм гальмування процесу полімеризації фібрину специфічними інюібігорами, які є меркерамн багатьох патологічних процесів в організмі. Запропоновано та опрацьовано новий метод виявлення продуктів деградації фібрину в плазмі крові людини.

АПРОБАЦІЯ РОБОТИ. Матеріали дисертації доповідалися на XII Міжнародній школі з фібриногену (Wrlghtsvllle Beach, USA 1993), па V Науковій конференції "Наука і виробництво - охороні здоров’я", Київ, 1993), на II Міжнародному симпозіумі з фібриногену при серцево-судинних захворюваннях (Edinburgh, UK, 1994), на симпозіумі "Біологічні механізми старіння", (Харків, 1994), на Міжнародній конференції з фібриногену та фібринолізу (Ялта, 1995), на наукових семінарах Лабораторії біологічних досліджень в Оксфорді (Oxford Bioresearch. UK) та відділу структури і функцій білка Інституту біохімії ім. О.В. Палладіпа НАН України.

СТРУКТУРА ДИСЕРТАЦІЇ. Дисертаційну роботу викладено на 120 сторінках машинописного тексту. Робота складається зі вступу, чотирьох глав, списку літератури, з 175 посилань на роботи вітчизняних та зарубіжних авторів, 35 , малюнків, 2-х таблиць.

КОНКРЕТНИЙ ОСОБИСТИЙ ВНЕСОК ДИСЕРТАНТА. Експериментальна частина роботи виконана дисертантом особисто.

МЕТОДОЛОГІЯ, МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Фібриноген вилучали з плазми велико! рогатої худоби методом висолюваная сульфати натрію (Варсцька та іи., I960).

Фібрин-мономер лезААВП одержували активацією фібриногену тромбіном з наступним розчиненням згусткг в 20мМ оцтовій кислоті при 0°С (Бсліцср та іи., 1968).

• Фібрнн-мономер л^АА одержували після обробки фібриногену Аіщнстроном-Н з ііиступішми стадіхми, аналогічними отриманню фібрин-•моиомеру дезЛАВВ.

D-дниер одержували гідролізом зіусгка плазміном за концентрацією останнього 0,4 к.е./мл , :сля стабілізації фібрину протягом 16 годин при 22°С (Платонова Т.И. та іи., 1980). •

д-фрагмеити одержували з фібриногену бика нлазміповим гідролізом у присутності Ca2t (Prlvaluv and Medved', 1982: Medved', 1088).

Вилий спсціфічннх ііпібіїорів на річні стадії полімеризації фібрину досліджувапи турбідиметричннм мсюдом за допомогою Specord-M40 (Німеччина) при довжнні хвилі 350 нм.

Калориметричні______дослідження проводили на скануючому

мікрокалориметрі ДАСМ-4, при швидкості нроірівання 1 градус за хвилину в діапазоні від 10 до 120С. Обробку температурних переходів проводили за допомогою прої рам ''Coplot’' та "KMK Software 1985" па І13М XT.

Визначення ан піполімсризаційноі активності проводили при 37°С в 0,0.5 М ТРИСхІІСІ буфері, pH 7.5, + 0,15 М NaCI + 1x10■'М СаСІ2 за кінцевої концентрації фібрии-мопомеру 0,3 мі/мл. Гальмуючий ефект представляли у вигляді одиниць гальмування (t-t0)/t0, де t0 * час зсідання моиомерного фібрину у контролі, t - час зсідання мономсрного фібрину в пробі у присутності різної кількості іпгібітора. За одиницю активності приймали кількість іпгібітора, яка у даних умовах експерименту подовжували час зсідання фібрину в 10 разів.

N-кіицеві послідовності амінокислотних залишків визначили в лабораторії Д-ра А.Хеншеп Каліфорнійського університету (г.Ервайн, США) на газо-рідиіпіому амінокислотному сиквенаторі "Applied Blosy»tein-777“ (США).

Молекулярні маси отриманих фрагментів внзначали за допомогою ДСН-електрофорезу в поліакриламідному гелі за білками-маркерами (\Veber К.. ОзЬот М., 1469).

Концентрації білків визначали за поглинанням при 280 нм у нейтральному середовищі на спектрофотометрі СФ-46. Коефіцієнт екстинції для фібриногену -15,06, для всіх форм О-лммеру та О-ф, агмента - 20,00.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ

1. ВИВЧЕННЯ ХОДУ ПЛАЗМІНОВОГО ПДРОЛІЗУ О-ДИМЕРУ У ПРИСУТНОСТІ Са2+

На першому етапі було проведепо дослідження ходу плазмінового гідролізу О-днме^у в присутності фізіологічних концентрацій Са2+.при концентрації плазміну 0,4 к.е./мл. На Мал. 1 представлені електрофореграми вихідного О-димеру, І6-, 24- та 48-годиішого гідролізатів, з яких видно, що вихідний ЭЭ з молекулярною масою 195 к Да розщеплюється плазміном до двох більш низькомолекулярних форм, які відрізняються від вихідної на 12 та 24 кДа відповідно. Через 48 годин гідролізат вміщував загалом третю форму О-димеру з молекулярною масою 171 кДа. Дослідженії* антиполімеризаційних властивостей гідролізатів у порівнянні з шіхідною формою показало, що активність форм димеру із зниженням молекулярної маси підвищується з 3,0 до 7,6 од. питомої активності (Мал. 2).

Для розділення трьох форм Б-димеру ми використали афінну хроматографію па фібріш-сефарозі, яка також дала нам змогу оцінити спорідненість різних форм днмеру До імобілізованого фібрину. 48-годинний гідролізат О-димеру, заінгібований РМЭГ, наносили на колонку 2,8x19 см з фібрнн-сефарозою, врівноважену буфером 0,05М ТШЗхНзР04, pH 7,0, + 0,1М ЫаС1 + ІхІО'^М СаСІ2 + 0.025М е-амінокапронової кислоти. Для елюції зв'язаних з фібрнн-сефарозою білків використовували буфери, описані в (ВеІШзег \ЛА, еі аі., 1980). На Мал. З представлена відповідна хроматограма, стрілками вказані буферні розчини. За даними ДСН-електрофорезу (Мал. 4), другий пік елюїіії мав вихідну форму О-димеру фО) у висхідній та проміжну форму (Ьт>) у ннсхідній частині піка. Третя форьа димеру (О'О') так сильно зв'язувалася з імобілізованим фібрином, що елюювати її було можливо тільки буфером з ЗМ сечовиною (третій пік).

оо-«

В К!»

»-^-12кДа в г

Мал. 1; Елсктрофореграмн

вихідного О-димеру (а), 16, 24,48-ГОДИШІОГО гідролізатів (6, в, г відповідно).

Мал. 2. Гальмуючий ефект вихідного Б-димеру, 16, 24,48-годиішого гідролізатів та третьої форми днмеру (О'О).

ПО СБ ШУ

Мал. 3. Афінна хроматографія 48-го-дишіого гідроліза ту О-димеру на фібрин-сефарозі.

. -12 кДа

Мал. 4. Електрофореграми трьох очищених форм димеру (ОБ, Б О та О’О').

З Мал. 2 видно, що третя форма днмеру мала в 3,5 рази вищу антиполімеризаційну активність у порівнянні з вихідним О-димером. З цього випливає, що коровнй днмерний фрагмент ОБ стабілізованого фібрину може розщеплюватися нлазміном у присушості Са2+ до більш низькомолекулярних форм, що супроводжується підвищенням антиполімеризаційної активності.

2. ДОСЛІДЖЕННЯ СТРУКТУРИ ПРОДУКТІВ ПЛАЗМІНОВОГО ГІДРОЛІЗУ О-ДИМЕРУ Наступним етапом наших досліджень було вивчення структурних особливостей вихідної та активованої форм днмеру в порівнянні з Du- та Dla-фрагменгамн методом диференціальної скануючої мікр калориметрії, який дозволяє вимірювати кількість тепла, яка витрачається па денатурацію білка. Денатурація окремих доменів супроводжується поглинанням тепла, яке може бути зареєстроване як пік або піки теплопоглипаиня. Положення піку (температура середини переходу) дозволяє оцінити стабільність структур, що денатурують у даному діапазоні температур: На Мал. 5 представлені температурні залежності молярних теплоємносте!) фрагментів Dh. Dla. DD та D'D'. З малюнка видно, що високотемпературний перехід (ВТ), який відповідає, як було показано раніше, плавленню термостабільного домену (Prlvalov and Medved', 1982), зберігає свій максимум у всіх чотирьох фрагментів. Низькотемпературний перехід (НТ), який відповідає температурній денатурації термолабільних С-кінцепих ділянок р- та у-ланцюгів (LUvlnovich et ah, 1995), у випадку активованих форм (Dla та D'D') зміщений у напрямку більш низьких температур на 5°С. Як було показано нами раніше для ОьА-фРаі'мента (Medved' et al., 1988), це зв'язано з дестабілізацією термолабільних ділянок молекули фрагмента без втрати компактної структури в результаті розщеплення поліпептидного зв'язку Lys393-Thr394 У С-кінцевій ділянці р-ланцюга. Таким чином, ми можемо зробити висновок, що перетворення вихідного и-димеру в активовану форму D'D' також супроводжується дестабілізацією термолабільних доменів, які формуються С-кінцевими ділянками р- та у-ланцюгів. Але в порівнянні з Du та DLA-фрагментами криві плавлення димерних фрагментів мають ще один температурний перехід в зоні 60-70°С. Дегонволюція функції надлишкової теплоємності відповідно алгоритма, розробленого для аналізу кривих плавлення мультндомешіих білків (Філімонов та ін., 1982) показала, що цей температурний перехід описується двома майже однаковими за площиною переходами з максимумами 60,7 та 66,3°С, тобто відібражає денатурацію двох взаємодіючих структур (Мал. 6). Наявність додаткового у порівнянні з D-фрагмеггтом температурного переходу можна пояснити виникненням нової компактної структури у D-димера, яка, можливо, формується при взаємодії двох D-доменів сусідніх молекул фібрину.

(ккм-К*1. ИОЛ!

Мал. 5. Температурна залежність Мал. 6. Деконволюція додаткового молярних теплоємностей . температурного переходу

Оц. Оцд. ОО та О'О' у 0,05 М (НТ2) у О-димера.

гліциновому буфері, pH 3.5. . .

Як видно з Мал. 1, при протеолітичному розщепленні О-димеру на елекгрофореграмах гідролізатів з'являється низькомолекулярна компопеїгга з масою 12 к Да, яка накопичується паралельно підвищенню ашиполімеризаціПиої активності. Ця компонента присутня також і ла елекірофорег рамах очищених фрагментів О'О та О'О' (див. Мал. 3). Раніше нами було показано, що у Оь\-фрагмента аналогічна 12 кДа частина молекули відокремлюється від високомолекулярноі частини фрагмента тільки в денатуруючих умовах. Ми вилучили цю компоненту з фрагмеїгга О'О’ гель-фільтрацією на Сефадексі 0-75 у буфері 0,05М ТШБхНСІ, pH 7,4, який вміщував 0.15М N301 та 6М сечопнни (Мал. 7). У цих умовах ми розділили внеокомолекуляриу частину О'С-фрагмента та низькомолекулярну компоненту (електрофореграмн очищених препаратів представлені). Щоб дізнатися, з якого ноліпептидпого ланцюга походить ця компонента, ми дослідили всі три форми димеру електрофоретично у відновлених умовах. На Мал. 8 представлені відповідні електрофореграмн, з яких видно, що У7іа а-ланцюги мають однакову елек грофорстичму рухливість у всіх трьох форм, а Р-л'шщюг зменшується на 12 к Да у треп.ої форми порівняло з вихідною. У

проміжної форми р-ланцюг представлений двома зонами - 45 та 33 кДа. Виходячи з них даних, ми можемо зроиити висновок, що низькомолекулярна компонента, присутня на електрофореграмах проміжпої та третьої форм димеру у невідновлених умовах представляє собою 12 к Да фрагмент р-лапцюга. Відповідно до уявлень про порядок відщ< плення доменів у периферичних фрагмеїггах фібриногену та зі аналогією до Оцд-фрагмента ми можемо віднести низькомолекулярну компоненту О'О'-фрагмента, що відщеплюється у денатуруючих умовах, до С-кінцевої ділянки р-ланцюга.

а- ■

ОБ Э'Ь ІзЬ1

Мал. 7. Гель-фільтрація О'П'-фрагмепта Мал. о. Електрофореграми трьох на сефадексі С-75 у присутності форм димеру РЭ. О'О, О'О')

б М сечовини. у відновлених умовах.

3. ВИВЧЕННЯ СТРУКТУРНИХ ТА ФУНКЦІОНАЛЬНИХ ОСОБЛИВОСТЕЙ С-КІНЦЕВОЇ ДІЛЯНКИ Р-ЛАНЦЮГ А Структура ізольованої гель-фільтрацією в присутності 6М сечовини компоненти, яку ми відповідно назвали рС-пептидом, була вивчена різними методами. Мікрокалориметричні досліди довели, що рС-пептид має певну компактну структуру, бо на кривій його плавлення знайдений один температурний перехід з максимумом 35,5°С. Для пеп тида була встановлена Гі-кінцева послідовність амінокислот ТЬг-ТЬг-Азр-Рго, за допомогою якої можна точно локалізувати місце розщеплення р-ланцюга - Ьуззэз-ТЬгзд^ Ы-

К*К>ша

кііщепа амінокислота ТЬг була раніше знайдена для рС-пептиду з фрагмента Оьа- Відповідно до поведінки рС-петнду у розчині ми можемо сказати, що він проявляє гідрофобні властивості, тобто не тримається у розчині без солюбілізатора. Цс ускладнило наші функціональні дослідження за допомогою методу турбіднметрії, бо ссчопина гальмує самоскладашія фібрину. В кювету в по*. :ліі фібриноген, Са2+, відповідну кількість інгібітора* (у даному випадку рС-пентиду), потім тромбін, запускаючи при цьому вимірювання мутності розчину в часі. З експериментальних кривих полімеризації отримували два важливих параметр - довжину фази утворення протофібрил, або ак званої лаг-фази (зона майже незмінної мутності) та швидкість латеральної асоціації протофібрил та фібрил (зона різкого збільшення мутності). Для кожної концентрації пептиду, що використовувалася в дослідах, у контроль вносили відпопідну кількість діалізного буферу з ечовішою. З Мал. 9, па якому представлені усереднені криві впливу рС-пептиду на довжину лаг-фази (А) та швидкість латеральної асоціації протофібрил та фібрил (Б), видио, що пептид помітно збільшує довжину лаг-фази та гальмує латеральну асоціацію, починаючи з молярного співвідношення рС-пептид/фібриноген 1:1. 11ей факт свідчить про те, що рС-пепгид маї • своєму складі структуру, втягнену в функціонування центру полімеризації, за рахунок якої рС-пептид виступає специфічним інгібітором полімеризації фібрину.

Відповідно до гіпотези Д-ра Дуліттла про місцезнаходження центру полімеризації с12, комплементарного центру Е.2, експонованому після відщеплення фібрипопептидів В, яка спирається, по-перше, на експериментальні дані, що свідчать про місцезнаходження центру полімеризації сі 1 у С-кінцевій ділянці у-ланцюга, а, по-друге, на високу ступінь гомології р- та у-ланцюгів, ми можемо припустити, що рС-пептид або його -іасіина входить до структури центру полімеризації (12. Раніше нами було показано, що Б^-фрагмент з розщепленим поліпептидним зв'язком рЬувзэз-ТЬгзэ4 ефективно накопичує мічений дапенлом тетрапентид С1у-Ніз-Лг£-Рго, який моделює центр с!2. що свідчить про активність цього центру у фрагмеїпа Иид- Для того, щоб підтвердити специфічну акшвність рС-пептнду, ми вилучили ранній Е-фрагмент з ОБ-Е комплекса та використали його як конкурента за рС-пеппід у дослідах з гальмування полімеризації фібрину. На Мал. 9 (Б) пунктиром представлені криві ефекту суміші рС-пепгиду та Е-фрагмеїпу у двох концен траціях (0,2М та 4М) ка'стадію латеральної асоціації

латеральної асоціації прогофібрнл та фібрил (Б).'

протофібрпл та фібрил. За низької концентрації Е-фрагмепі не впливав на гальмуючу активність рС-пептиду. За співвідношенням П-і|>раі мспі/рС-гіепгнд 4:1 інгібуюча дія рС-псгпиду маПже повністю знімалася Е-фраї мспгом. Отже , рС-пептид мав специфічну антинолімеризаціПну ак і инністі., яка пригнічувалась активним Е-фратмеиіом, що свідчи іь за учасіь С-кіїщевої ділянки р-ла.нцюга у функціонуванні центру полімеризації і!2.

4. ПОРІВНЯЛЬНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ АНТИПОЛІМІІРІГЗЛШИНОІ Дії РІЗНИХ СПЕЦИФІЧНИХ ІНГІБІТОРІ», ЩО МІСТЯ ТЬ О ДОМЕНИ

Для тою, щоб зрозумі іи різницю механізмів аніиполімеризацілиої дії О-димеру та О-фрагмеїгга, ми вивчали іінібіїорні власіивосгі вищеназваних продуктів дсірадації фібриноіену та фібрину за допомоюю меюду іурбіднмеїрії. На Мал. 10, А представлениП ірафік залежмосгі довжини лаі-фази від концентрації іигібітора, з якою видно, то Ц-фрагненг проявляє' свою активність уже на початку полімеризації на відміну від О-димеру, лкиП на стадії утворення лроіофібрнл е малоефективним інгібітором. Стадію латеральної асоціації прогофібрнл та фібрил обидва інгібітори гальмують ефективно (Мал. 10, Б), димер навіїь ефективніше за ІУфраї ме/іт.

Поясниш ці дані можна з точки зору швидк'':іі комплексоутворювання

О та ОН з фібрином. Відомо (Платопова Т.М. та ін., 1983), що обидва інтібі гора можуть утворювати комплекси з фібрином, але з різною кінетикою. Т-фрагмент швидше входить в комплекс, але ос і аішіп е досить нестабільним. Навпаки, О-димер повільніше взаємодіє з фібрином, але Лою

СЄК

Мал. 10. Вплив Э-фрагмеита (О) та Б-димсру (ОБ) на допжішу лаг-фази (А) та швидкість латеральної асоціації протофібрил та фібрил (Б).

комплекс значно стабільніший, ніж у О-фраї мента. Виходячи з цього, можна пояснити розбіжність у дії інгібіторів па різні стадії полімеризації фібрину: менший за розміром Б-фрагмепт швидко взаємодіє з молекулами фібрин-мономеру, гальмуючи вже стадію утворення протофібрил, тоді як О-димер зв'язується повільніше, але значно міцніше, тому його ангиполімеризаційна активність проявляється на пізніших стадіях полімеризації фібрину.

У подальших експериментах ми використовували фібрин-мономери дезААББ та дезАА в оцтовій кислоті та ініціювали полімеризацію шляхом переведения мономерів у нейтральне середовище. Ми досліджували вплив вихідної та активованої форм Э-димеру па різні стадії полімеризації двох форм мономеру (Мал. 11). Як очікувалося, О-димер ефективніше гальмує полімеризацію нормального фібриіі-мопомеру з експонованими центрами полімеризації Еі та Ег, ніж полімеризацію фібрину дезАА, у якого експоновані тільки центри Еі. Це додаткове свідчення важливості обох центрів полімеризації при вазасмодії як фібрин-мономерів між собою, так і у випадку взаємодії фібрину зі спеціфічиим інгібітором. Але коли в модельних експериментах з фібрин-мономером дезАА використовувався як спеціфічний інгібітор Р'О'-фрагмент, ми спостерігали збільшення аіггиполімеризаційного ефекту на обох стадіях полімеризації (Мал. 11 А, Б).

Отже димер з додатково активованим центром полімеризації <12 ефективно взаємодіє з фібрин-мопомером, у якого комплементарний центр Е2 не експонований зовсім. Цей цікавий експериментальний факт можна

поясішти з точки зору уявлень про можливість перехресної взаємодії центрів полімеризації, тобто E|-d2, Ег-dl (Doolittle and Laudano. 1980, llaeverll at at. 1992). Ми вважаємо, що в даному випадку ми маємо справу зі взаємодією ІЗ)-d2, яка, мабуть, стала ефективною та помітною за рахунок додаткової активації центру d2 при розщепленні зв'язку |)І.увз0і-ТИтзщ. Додатковим підтвердженням цього також можуть бути дамі про іалімуючиП е<|)ект рС-пептиду на стадію утворення проюфібрил та латеральну асоціацію, які були представлені вище. -

. мг/ил

Мал. 11. Вплив вихідної (ОО та активованої (ОХ» ) с}юрм П-димеру їй довжину лат-фази (А) та швидкість лаіеральної асоціації прогофібрил та фібрил (Б).

Щодо механізму антинолімеризаціїїмоі дії О-фраї мета та О-димеру, то, як було пожізано раніше при дослідженні впливу сумішей інгібіторі» на час утвореній зі устка (Беліцер В.А. та ін,, 1986), додавання О-димеру за низької концентрації Пн-фраіменіа не приводить до збільшення іальмуючото ефекту, але.за більших концентрації) фраї мента додавання навіть невеликої кількосіі О-димеру різко збільшує антиполімеризаціПну дію суміші. На відміну від днмеру всі інші специфічні іні ібі тори полімеризації фібрину мають адитивну дію. Виникає питання, чи не змінює механісту гальмуючою ефекту розщеплення зв'язку рьуазиз-іїігзо*? Ми перевірили дів; фраї мента ГШ' ня і|юні О^д-фрагмснга. З Мал. 12 видно, іцо механізм антиполімеризаціПиої діі О-димеру і..сля йото активації до О'О'-фратменіа не змінює і ься, Тобю характер кривих залишається тим же, але у випадку акіивоваиих форм для

досягнення відповідного гальмуючого ефекту інгібіторе погрібно значно менше. Таким чином, ми можемо зроби ги висновок, що розщеплення зв'язку риувзвз-ТІїгзд.і приводить тільки до збільшення аіітиполімеризаційпоі активності фрагментів, але не до зміни механізму їхнього гальмуючого ефекту. Тому можна припустити, що центр полімеризації <12 не зумовлює різницю механізмів гальмування полімеризації фібрину О-днмером та О-фрагментом.

Концентрація Інгібіторе, мг/мл

Мал. 12. Гальмуючий ефект специфічних інгібіторів на полімеризацію фібрину.

5. ЧУТЛИВІСТЬ ТЕСТУ "АНЦИСТРОНОВИЙ ЧАС" ДО РІВНЯ ПДФ У ПЛАЗМІ КРОВІ ЛЮДИНИ

Відомо, що ПДФ накопичуються In vivo за різних патологій і с маркерами цілого ряду тяжких захворювань. Тому своєчасне виявлення ПДФ у плазмі крові е важливою задачею клінічної лабораторної діагностики.

Раніше у нашому відділі був вилучений та охарактеризований тромбіноподібний фермент Анцистрон-Н з отрута Щитомордника звичайного (Agktstrodon ha/ys halys). На основі цього ферменту було розроблено та опрацьовано на плазмах хворих за різних патологій скринінг-тест "анцистроновий час", за допомогою якого можна охарактеризувати останній етгп зсідання крові - перетворення фібриногену на фібрин і полімеризацію останнього в плазмі. Час зсідання плазми в анцистроновому тесті залежить від концентрації фібриногену: нормальний час зсідання плазми в умовах теста

Аіщистроном-Н (ЗО сск) спосіерігасті^ся за нормальної концентрації фібриногену 2.5-3,5 г/л (Мал. ІЗ). У випадку зниженим або підвищення концентрації фібриногену анцисіроновий час збільшується. Але ми спостерігали підвищений аіщистронояий час і за нормальної концентрації фібриногену. Це могло бути результатом вплину ПДФ на полімеризацію фібрину в плазмі. Ми створили модельну систему, долавши різні кількості О-димеру до донорської плазми, та дослідили змінсння часу зсідання такої плазми в анцистроновому тесті. З Таблиці 1 можна побачити, що

' Кониентріиіі фІВринотіу. г/а Мал. ІЗ. Залежність часу хідания плазми Анцнсіропом-11 від копнеміраці! фібриногену.

Таблиця І. Залежність часу зсідання плазми Анцистроном-Н від

концентрації продуктів деградації стабілізованого фібрину

1 чькість Ліщистроііовий Тромбіновий

ПЛФ (мкг/мл)_______________час (сек)__________________

-10 ^ 30 И

40 32 14

60 33 Н

80 35 15

160 36 15

200 38 15

300 45 15

апцисіроновіїй час, на підміну віл розповсюдженого у клінічних лабораторіях іромбінового, с чутливим до наявності продуктів деградації стабілізованого фібрину в плазмі. Тому .подовження часу зсідання плазми анцистропом за наявності нормального рівня фібриногену корелює з рівнем ПДФ в плазмі. Таким чином, ми вважаємо, що скринінг-тест "анцистроііовий час" може бути внкористованим для визначення ПДФ у плазмі крові людини. '

ВИСНОВКИ

1. Молекула димерного фрагмента О зі стабілізованого фібрину (О-димеру), аналогічно Оц-фрагмента фібриногену, може розщеплюватися плазміном Ьо більш низькомолекулярних форм з підвищеною «мимполімеризаціПною активністю, яка обумовлена додатковим експонуванням центру полімеризації <12 за рахунок розщеплення зв'язку Ьунзо;гТ1ігв94 У С-кінцевій ділянці р-ланцюга.

2. Розщеплення зв'язку рЬувзэз-ТЬгзд* у О-фрагмеїпа та О-димеру не змінює механізму аитиполімернзаціПної дії інгібіторів, що вказує на те, що центр полімеризації <12 не зумовлює різницю механізмів гальмування полімеризації фібрину Р-димером та О-фрагментом.

3. Експериментально показана участь С-кінцевої ділянки р-ланцюга а роботі цеп іру полімеризації А2.

4. о-димер є більш ефективним інгібітором сталії латеральної асоціації, на відміну від О-фрагмеита, який ефективно гальмує як лаг-фазу полімеризації фібрину, так і латеральну асоціацію протофібрил та фібрил.

3. Для Б-димеру знайдено новий температурний перехід у зоні 60-70°С, відсутній у Р-фрагмента, який можна віднести до денатурації ново! структури, що утворюється при взаємодії двох И-доменів, і яка, можливо, зумовлює різницю механізмів антиполімеризаційної дії О-димеру та Б-фрагмеїгга.

6. Скріїїіиг-тест "анцистроиовий час” може використовуватися для визначення продуктів деградації стабілізованого фібрину в плазмі крові.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Платонова Т.Н., Лукинова Н.Н., Медведь Л.В. Выделение и анализ активированных форм димерного Д-фрагменга молекули фибрина // ДАН Украины. - 1993. - сер.Б. №6. - С.І34-І38.

2. Платонова Т.М., Сушко О.О., Лукіном Н.1., Соловйов Д.О. Спосіб експрес-тестування стану системи гемокоагуляції за допомогою тесту "анцікпропоїшй час" // Фізіол.жури. • 1994. * N*3, - С.21-25.

3. Лукинова //.//., Платонова Т.Н., Жесткова Н.Н., Петров А.В., Сушко ЕЛ. Комплексная лабораторная диагностика синдрома внутрисосуднстог о свертывания крови при поздних гестозах // Укр.биохим.журн. • 1995, • Т.67, N"4. -С. 99-103.

4. Токар А.В., Иакоюненко Є.М., Платонова Т.М., Сушко О.О,, Лукінова II.І. та Ін. Сучасні методи лабораторної діагностики внутрішньосудшшого мікро зсідання крові Ц Меіоднч/іі рекомендації МОЗ України. - 1994. - 22 с.

5. Платонова Т.Н., Лукшюва II.И., Сушко ЕЛ., Соловыв ПЛ., Уіаррла Т.П. Способ экспресс-тестирования состояния системы гемокоагуляции пучем определения времени свертывания плазми // Приоритетна* справка №93020162. - 1994. - Заявка на явочный патент №ВЗВ07530 or 25.01,1995.

0. Lttvlnoulch S., Platonova Т., Lttklnova N.. Ifenschen A., Medved' f„ Preparation and characterization of the fibrinogen PD-fragmenl with Increased antic-lotting activity // Blood Coagulation and Flbrlnnlynlf. ■ 1003. • N4. - P.832 433.

7. Сушко E.A., Платонова Т.Н., Лукинола П.П., Белая И.И. Маркеры старения системы свертывания крови // Тезисы докл., Симпозиум "Биологические механизмы сшрения". - Харьков. • 1994. - С.144.

8. t.uklnoua N.. Sitshko //.. Platonova Т. Investigation of РІавпіа

Flbilnogen Level by Aneystrtm-ll // Blood Coagul. Flbrlnolyel». - 1004. - Vol.fl, •uppl.2 (Materials of 2nd International Sympoalum on Plbrlnotfen end Cardiovascular Disease). - P.23. '

0. Platonono Т., iMuklnova N. Inhibitory Effect uf Г) and DD Fragment* on Fibrin J'olymerU.ition // Укр.біо*ім.журп. - 1996. • №4, C.17-18.

10. Vakulenko V.. Loiildnwia N., Platonova T. C-termlnHl Effect of Dp-chain of riljiinogen on Fibrin Ро1утег1/аиоп//Укр.біохіи,жури. • 1996. • №4.

- C.18 19.

Лукинова И.И. Особеїшосш структуры продуктов деі радацин стабилизированного фнПрнна, содержащих D домен, н их влияние на полимеризацию фибрина.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по сне і пильное ги 03.00.W - биохимия. Институт биохимии им. А.В.Палладина ИАН Укрпипы, Киев, 1996.

Представленная работа содержит результаты исследования структуры и аигшюлимериэациопных своПсін димерного фрагмента D из стабилизированного фибрина быка. Показано, что к«|мвый D-димер может гидролизоваться плазмииом до более иизкомолекулярных форм с повышенной апгинолимеричационной активностью в результате увеличения доступности центра полимеризации d2 за счет расщепления пептидной СВЯЗИ Ly83B3‘Thr3B4 * С-концевой области р-цепн. При этом растепление данной связи не приподит к изменению механизма тормозящего действия фрагментов. Для D-димера обнаружен новый температурный переход ■ зоне 60-70°С, отсутствующий у D-фрагмента, что, возможно, указывает на появляпие попой структуры при взаимодействии днух D-ломенов соседних молекул фибрина. Установлено, что скрининг-тест "анцистроповое время" может использоваться для выявления продуктов деградации фибрина в плазме человека.

Louklnova N.I. Structure of D-domaln containing degradation products of crose-llnkcd ftbrln and their effect on fibrin polymerization.

The Dissertation Thesis for Obtaining a Scientific Degree of Philosophy Doctor (Biology) In the Speciality 03.00.04 - Biochemistry. A.V.Palladln Institute of Biochemistry of National Ukrainian Academy of Sciences, Kiev, 1996.

This work contains study results on structure and anticlotting properties of D-dymer from cross-linked fibrin. It was shown that bovine D-dymer can be hydrolyzed to lower-weight forms with higher anticlotting activity which Is a result of additional activation of d2 polymerization site because of Internal cleavage of peptide bond Ьузздз-Пігзд* in C-termlnal part of [5-chaln. Moreover this cleavage doesn't change the mechanism of anticlotting effect. New thcrmodynamlc transition in 60-70°C zone was found for D-dymer. It Is absent on melting curves of D-fragment so It could be be the result of new structure oppeare after D-D interaction. Besides It was shown that diagnostic kit “Ancystion time" can be used for FDP determination In blood plasma.

Ключові слова: фібриноген, фібрин, цеігтри полімеризації, D-димер, D-фрагмент

Руконнск.