Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности распознавания аллооантигена и условия дифференцировки в популяциях CD8+ Т-лимфоцитов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности распознавания аллооантигена и условия дифференцировки в популяциях CD8+ Т-лимфоцитов"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В. ЛОМОНОСОВА

РГБ од

'} Г* л-и

• •• LLJ

На правах рукописи УДК 612.112.94.017.1

АНОСОВА НАТАЛЬЯ ГЕННАДЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ РАСПОЗНАВАНИЯ ШОАНТИГЕНА И УСЛОВИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В ПОПУЛЯЦИЯХ CD84" Т-ЛИМФОЦИТОВ

(специальность 03.00.06 - вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ •диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1994

Работа выполнена в лаборатории механизмов регуляции иммунитета (руководитель - д.н.н., проф. Б.Д. Брондз) НИИ канцерогенеза ОНЦ РАМН и на кафедре вирусологии (заведующая -академик РАН, проф. И.Г. АтаСеков) Московского Государственного Университета им. Ы.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Б.Д. БРОВДЗ, кандидат медицинских наук И.А. ПОПОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.Г. ГАЛАКТИОНОВ, доктор медицинских наук Е.Г. СЛАВИНА

Ведущая организация: Иедико-генетический научный центр РАШ

Защита состоится " щ ¿¿РтЛ^/л? 1994 г. в ^ ~час. на заседании Специализированного Ученого Совета Д.053.05.70 Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова по адресу 119899, Москва, Воробьева гора, Биологический факультет ИГУ, молекулярный корпус "А"

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. Ы.В. Ломоносова

Автореферат разослан \ 994 года

Ученый секретарь Специализированного Ученого Совета»

х|андадат химических наук С, В.Н. КАГРАМАКСВ

t

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Актуальным вопросом современной иммунологии продолжает оставаться клеточный и молекулярный механизм распознавания чужеродных антигенов Т-лимфоцитами. В рамках этого вопроса не первый план выходит проблема развития иммунного ответа в аллогвнной системе. Понимание закономерностей этого процесса откроет новые перспективы для решения важных вопросов современной медицины и прежде всего проблемы отторжения трансплантируемых органов и тканей. Молекулярные механизмы вллораспознавания также, как и структура аллогенных мишеней, распознаваемых аллореактивными Т-клеткамк, остаются до конца не выясненными. Крайне мало изучены процессы дифференцкровки аштоантиген-специфичэских Г-лимфоцигов, приводящие к появлению, у клеток-предшественников функций эффекторных клеток. Немаловажным является вопрос о том, через одни и те же втапы или нет проходит дафференцировка клеток, впервые встречающихся с антигеном, и клеток памяти (КП).

Актуальность темы исследования обусловливается тага» ■теоретической и практической значимостью изучения роли ко-рвцвпторов и адгезивных молекул в Т-клеточном распознавании. Данные исследования предоставляют дополнительные возможности селективной регуляции иммунных реакций отторжения трансплантата.

Цель работы. Целью диссертационной работы явилось изучение особенностей распознавания вллоантигена популяциями CD8+ цитотоксическях Т-лимфоцитов (ЦГЛ) в зависимости от разли'шой аффинности Т-рецептора (TcR) и от участия в распознавании CD8 и LPA-t ко-рецепторных молекул, а также сравнение природа аллогенных »питонов. распознаваемых супрессорным и

цитотоксичэ ским подклассами CD8+ Т-.тамофоцитов. Вторая проблема исследования заключалась в выяснении условие дифференцировки предшественников вффекторных первичных ЦТЛ и КП в' аллогенной системе.

Задачи исследования. 1. В аллогенной системе сравнить

условия и скорость дифференцировки предыственннков первичных ИГЛ и КП, являющихся предшественниками вторичных еффекторных ЦТЛ.

2. Изучить влияние ко-рецепторной моле- 1 кулы CD8 (Ly2) на функцию аллоантиген-специфических эффекторных ЦТЛ а КП в зависимости от аффинитета TcR.

3. Исследовать роль р-цеш адгезивной молекулы LFA-1 в процессе аллоанти-ген-специфяческой активации Т-лимфо-цитов.

"4. Выяснить возможные различия в распознавании антигенных эштопсв Cd9+ аллорвахтишшми Т-лимфоцитами, опосредующими специфические супрес-сорную и цитотоксичесую активности в одних и тех же условиях иммунизации.

Научная новизна. В представленной работе получены экспериментальные . - данные, свидетельствупцие в пользу существования различных условий дийеренцировки предшественников первичных эффекторных ЦТЛ и КП. Впервые показано, что для созревания первичных ЦТЛ из пре-ЦТЛ на заключительном этапе

антиген-завр"!имой дифференцировки синтезы РНК и белка являются . необходимыми. Напротив, формирование вторичных ЦТЛ из КП происходит в условиях ингабирования указанных синтезов.

В оригинальной экспериментальной системе с использованием адсорбции-элюции иммунных лимфоцитов на монослоях макрофагов (Мф) выяснен вопрос о необходимости Сов молекулы яри взаимодействии низкоаффпшых TcR с аллоантигеном. Для р-цвпи адгезивной молекулы LFA-1 выявлены новые возможности в ко-стимуляции аллогенного иммунного ответа.

Показана возможность генерации Г-клеток, опосредующих как специфическую супрессорную, так и специфическую цитотоксическую активности при одних и тех же условиях иммунизации. Получешше данные свидетельствуют о том, что одна и та ке популяция Ср8+ Т-лимфоцитов может проявлять различные функциональные активности, а распознавание аллоангагенного эпитопа функционально различными субпопуляциями происходят сходным образом, по-видимому, в контексте собственных молекул МНС классе I.

Практическая значимость работы. Диссертационная работа •вносит определенный вклад в развитие фундаментальных представлений о- механизмах функционирования и дифференцировке специфических эффекторных ЦГЛ, важных для развития, в первую очередь противоопухолего и противовирусного иммунитета.

Результаты работы, свидетельствующие о том, что ЦТЛ и специфические Т-супрессоры (СТО) могут иметь сходный характер распознавания антигена In vivo, могут быть полезны при разработке подходов иммунотерапевтического воздействия на популяцию Т-лимфоцитов, опосредующих супрессорный эффект.. Поскольку стратегия иммунотерапии зависит как от выяснения эпитопов, распознаваемых

СТО, <гак в такой хе мере в от решения вопроса о существовании СТО как отдельное линии дафферекцировки Г-клеток.

Результаты работы внедрены в учебный процесс и используются в курсах лекций по фундаментальной иммунологии для студентов биологического факультета МГУ им. W.B. Ломоносова и факультета физико-химической биологии Крымского медицинского института.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на отечественных и зарубежных конференциях и симпозиумах: на I съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), I съезде аллергологов и иммунологов Азербайджана (Баку, 1992), VIII Международном конгрессе по иммунологии (Будапешт, Венгрия, 1992). Междурародном симпозиуме "Структура и функции регуляторных полипептидов" (Москва-Ярославль, 1992), XI республиканской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск,1992), III съезде гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Респ. Молдова (Кишенев, 1992). Международной конференции по механизмам киллдага (Израиль, 1993). Республиканской конференции по иммунологии (Луганск, 1993).

Полученные экспериментальные данные докладывались на лабораторных и межлабораторных - конференциях, а также на совместной конференции лабораторий механизмов регуляции иммунитета, противоопухолевого иммунитета и иммунохимии опухолей НИИ канцерогенеза ОШ РАМН и кафедры вирусологии биологического факультета МГУ*

Материалы диссертации отражены в 17 научных публикациях.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. Ко-рецепторная . молекула CD8 оказывает существенное влияние на проявление цитолитического потенциала ЦТЛ, несущих низкоаффинные рецепторы.

'2. Адгезивная молекула LFA-1 способна передавать индуктивный ко-стимуляторны§ сигнал через свою ß-субъединицу.

3. Аллореактивнне CD8+ Т-лимфоциты со специфическими супрессоркой и цитотоксической активностями, индуцированные в одних и тех яга услошях иммунизации, способны распознавать узкую аллоантигенную детерминанту в измененном (отличном от донорского) контексте.

4. Условия и пути антиген-зависимой дифференцировки предшественников первичных ЦТЛ и КП в зффекторные- ЦТЛ различны.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на

страницах машинописного текста. Она состоит из введения, пяти глав обзора литературы, раздала материалов и методов исследования, четырех глав собственных результатов, главы обсуздения результатов, выводов и списка используемой литературы, содержащего 154 источника. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 6 таблицами.'

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и метода исследования

1. Лабораторные животные.

Мышей линий С57В1/б(В6) <H-2b), BtO.BR(BR) (H-2k), В10.М <H-2f), B10.D2 (H-2d), • B10.D2(R101) (KdIdDb), B10.A(4R) (KkI-AkI-EpKI-EabDb), Вб.С-Н-г1™12«^^') (H-2bm12), БВА/2 (H-2d), BDF1 (B6XDBA/2) (Н-г1®4), CBA (H-2k), BCP, (ВбзГ^А) (Н-г0**) получали из разведения ОНЦ РАМН. Крыс линии Lewis для получения

асцитов также получали из разведения ОНЦ РАМН.

2. Моноклональные антителе.

Анти-СМ антитела, продуцируемые гвбридомой Н3517.2, использовались либо в виде суперна тантз от гибридомы, либо в виде асцита крыс Lewis; анти-СИ4 - в виде, супернатанта от- гибридомы 3.168; авти-Thy-l.2 - в виде супернатанта от гибридомы G4. Гибридому G4 любезно предоставил А. Червонский. Гибридомы, продуцирующие антитела к ß-цэпи и ко всей молекуле ЬУА-1, были любезно предоставлены нашей лаборатории профессором " М. Pleress, Дчниые антитела использовались в виде супернатантов от гибридом.

3. Индукция эффекторных первичных ЦТЛ в In vivo-In vitro

системе.

Облученные 2000 рад аллогенные клетки селезенки вводили в

7

подушки лап (п/л) мышей-реципиентов по 2x10 клеток в объеме 40 мкл в кавдую лапу. Через 4 суток у иммунных реципиентов забирали клетки регионарных лимфоузлов, отмывали и инкубировали в трехсуточной монокультуре в СК^-инкубаторе (5% COg) в полной ростовой среде (RPMI-1640 (?1ои laboratories, США) с 7-10» ембриональной телячьей сыворотки, 2 ты ь-глутамина (Mow, Англия), 100 ед/мл гентамицина, 10 шМ HEPES (Miorobiologioal Aeeosiatee, США)), содержащей 2 mM 2-меркаптоэтанола (Calblochero, США). Клетки инкубировали в 24-луночных плашках (Llnbro, Англия) в концентрации 5x106 в 2 мл среды на лунку.

4. Индукция эффекторных первичных ЦТЛ In гIvo.

ЦТЛ индуцировали путем введения мышам 25 млн клеток тимомы EL-4 (гаплопп Н-2Ъ) в объеме 0,5 мл внутрибршинно (в/бр). Через 11 суток спленоциты иммунных реципиентов тестировали в цитотоксическом тесте (ЦТТ).

5. Индукция эффекторных вторичных ЦТЛ in vivo.

ЦГЛ поучали из селезенок мышей спустя б суток после повторной в/бр иммунизации клетками EL-4 (по 25 млн на мышь). Первичная в/бр иммунизация реципиентов EL-4 проводилась за 1 ,5-2 месяца до вторичной.

6. Индукция КП (предшественников вторичных ЦГЛ) In vivo.

После в/бр введения реципиентам 25 млн EL-4 со 2 по 7 месяцы

включительно среди иммунных сплэноцитов и клоток мезентериальных лимфоузлов определялись КП.

7. Индукция СТО ln vivo.

СТО индуцировали у мышей внутривенной (в/в) иммунизацией большой дозой 9x107 облученных 2000 рад на установке "Стебель ЗА" клеток аллогенной селезенки в объеме до 1 мл. СТО извлекали .из селезенки и/шш мезентериальных лимфоузлов иммунных животных на 4 сутки после иммунизации.

8. Постановка цитотоксического тоста.

Суспензию лимфоцитов в определенной концентрации вносили в лунки с мечеными íiag51 Сг04 (51Сг) клетками-мишенями и помещали в ■ COg-инкубвтор (37°С). В качестве клоток-мшшней использовали перитонеальные Ыф различных линий мышей или 1>клвтки Ltk" (H-2k гаплотипа) я их производные 1-4, грансфецированные Н-2КЬ молекулой (любезно предоставлены профессором н.Allen). Через 16-18 часов после внесения суспензии, среду из лунок отбирали и переносили в пластиковые ампулы. Выход 51Сг в среду считали в гамма- спектрометре. Цитотоксический индекс (UM) оценивали по формуле: ЦИ - (а-с)/(Ь-с)х1005б, где "а" и "Ъ"' - выход 51Сг, соответственно, при добавлении эффекторных лимфоцитов и при полном разрушении мишеней в присутствии \% раствора тритона

Хм 00, "с" - спонтанный . выход ®1Сг в среду (в импульсах в минуту).

9. Тест на подавление пролиферации в смешанной культуре лимфоцитов (СИЛ).

СТО, извлеченные из иммунных животных, обрабатывали митомивдном С (Signa, ОМ) при 37°С 30 мин в концентрации 25 мкг/мл среды RPMI-1640 и добавляли в СКЛ. В качестве реагирующих лимфоцитов (респондеров) использовались клетки лимфатических узлов мышей той же линии, что и доноры СТО, в количестве 3x105, а ь качестве стимуляторов - облученные 2000 рад на установке "Стебель ЗА" спленоциты линии, использованной для индукции СТО (в контроле - сингенной линии) в концентрации Ю6 клеток. Смесь трех типов клеток культивировали в полной среде дня СКЛ - RPMI-1640 о 5S .человеческой сыворотки, 2 тМ L-глугамина, 100 ед/мл гентамицина, 2 шМ 2-меркаптоэтанола, 25 mW HEPES - в лунке 96-луночной плавки с V- или U-образшм дном (Linbro, Англия) при соотношении СТО, респондеров и стамулирущих клеток 0,3:1:3 (по 50 мкл каждой суспензии). Микрокультуры инкубировали в течение 4 суток при 37°С в С02-инкубаторе. Затем в каждую лунку добавляли по 20 мкл среда BPMI-1640 с 0,04 МБк ^-тимидина (удельная активность 1 Ku/mM). Через 16. часов клетки переносили с помощью прибора "Cell Harvester" (Flow,' Англия) на стекловолоконные фильтры а _ считали включение радионуклида в жидкостном сцинтидляционном счетчике. Результаты выражали в виде индекса супрессии (МО). ИСв ((а-С1)-(Ь-С2))/(а-С1)х100«, где "а! и "Ь" -включение "л-тамадана ори добавлении в аллогенную СКЛ, соответственно, интактаых к иммунных лимфоцитов; "С1" и "С2". -включение метки в сингенной СИЛ при добавлении тех же клеток.

Специфичность супрессии определяли при использовании в CKJI стимуляторов, полностью отличных от иммунизирующей линии по аллелю Н-2.

10. Обогащение и разделение на фракции иммунных лимфоцитов с помощь» адсорбции-элвдии на монослоях Мф различных гаплотипов.

Монослоя Мф, посаженные на пластиковые флаконы, предварительно промывали средой Игла с 10Ж сыворотки крупного рогатого скота, затем среду отсасывали и вносили приготовленную суспензию иммунных лимфоцитов в среде Игла, 100 ед/мл гентамицина, 10* сыворотки крупного рогатого скота.. Лимфоциты адсорбировались на Мф за 2 часа в С02-инкубаторе при 30°С - для эффекторов и 37®С - для КП. Концентрация вносимых лимфоцитов была около 4x1О7 в 3 мл. Через 2 часа флаконы помещали на качадесу (Iniors, ФРГ) на 4-5 мин, 80 об/мин, затем ставили вертикально и собирали неприкрепившиеся лимфоциты. После, чего монослой Мф промывали 3-5 раз средой Игла без сыворотки, каждый раз отсасывая отсосом. Адсорбированные клетки двакды элюировали с помощью теплого раствора проназы (Sigma, США) в концентрациях 25 и 100 мкг/мл в присутствии таких же концентраций панкреатина (Calbiochem, США) каждый раз в течении 30 мин при 37°С. Затем проназу инактивировали 30% сывороткой крупного рогатого скота, элюированнне лимфоциты отмывали и использовали в функциональных тестах.

11. Ингибиторы.

. В качестве ингибитора- синтеза РНК использовали актиномкцин D (АС) в дозе 0.03 мкг/мл, в качестве ингибитора синтеза белка -эметин. (Бп) в дозе 0.5 мкг/мл, в качестве ингибитоиа синтеза ДНК - оксимочевину (HU) - 0.5 шМ и цитозинарабинозид (ага-С) - 10

мкг/мл. Все реактивы фирмы $1®па, США.

Результаты исследования

1. Моноклональные антитела к СРЗ молекуле подавляют цитотоксическую активность эФЬекторных 1ГГЛ с низкоаДДинными

рецепторами.'

В качестве ЦГЛ использовали клетки селезенок мышей линии ВЮ1 после в/бр иммунизации клетками Е1-4 (см.стр.б). В начале исследования проводили обогащение и разделение ЦГЛ на фракции по аффинитету антиген-специфмеских . рецепторов с помощью адсорбции популяции иммунных клеток на монослоях Мф донорской В6, посторонних и Вй и реципиентной И101 (в контроле) линий, с последующей их элюцией и отмывом. Затем фракционированные иммунные лимфоциты инкубировали с анти-СШ антителами и отмывали. Функцию иммунных лимфоцитов тестировали в ЦТТ, где в качестве мишеней использовали мышиные Ь-клетки гаплотипа Н-2^ в их трансфецированные производные 1-4. Оказалось, что низкоаффинные фракции ЦГЛ , элюированные с Мф посторонних линий 4Л и ВИ, высоко чувствительны к действию анти-СМЗ моноклональных антител (мкАТ) (см.рис.1В и С). Высокоаффинные ЦГЛ, обогащенные на Мф донорской линии Вб, напротив, проявили слабую чувствительность к названным мкАТ (рис. 1А). Более того, веди ЦГЛ были предварительно истощены на Мф посторонней линии, а затем элюированы с Мф донорской линии, то они оказывались полностью резистентными к данным мкАТ (рис.Ю). Контроль представлен на рисунке 1Б (ЦГЛ, элюированные с , Мф реципиентной линии 81 СИ ).

Таким образом.было показано, что цитотоксическая функция

значительно угнетается анта-СШ мкАТ только во фракциях . специфических эффекторных ЦТЛ, элкированных с монослоев Мф посторонних линий. Эти данные подтверждают необходимость СШ молекулы для реализации функции ЦГЛ, несущего низкоаффинный рецептор к индуцирующему антигену.

2. Моноклональаые антитела к Ср8 молекуле не оказывают влияния на цитотоксичоскую активность потомков КП.

КП получали в системах R101 анти- В6 или B10.D2 анти- Вб (см.стр.7). Иммунные спленоциты отбирали через 1,5-2 месяца после иммунизации реципиентов. KR разделяли на фракции путем адсорбции-элюции на монослоях Мф линий Вб, BR или R101 и затем культивировали 3 суток в монокультуре для дифференцироьки в эффекторные ЦГЛ. Извлеченные из монокультуры клетки обрабатывали анти-СМ мкАТ, отмывали и использовал! в функциональном тексте на выявление вдтотоксической активности (ИГА). Тестирование проводили на меченых 51Сг Х-клетках. Фракция КП, элюированная с монослоя Мф донорской линии Вб (см.рис.2А), через 3 суток после нахоадения в монокультуре, обладала высокой специфической ЦТА. В 'аналогичных фракциях КП, элшровашшх с монослоев Мф посторонних , линий BR и 4R, после их дафференцировки in <vitro, также была выявлена значительная ЦТА ' (см.рис.2В,С), что подтверждает возможность нормальной дафференцировки КП в эффекторные вторичные ЦТЛ после стимуляции аллельными вариантами аллоантигена.

Фракции КП, обогащенные клетками как с высоко-, так и с низкоаффинными рецепторами-к индуцирующему антигену, после их дафференцировки в эффекторные ЦТЛ, не были чувствительны к анти-CD8 мкАТ (рис.2). Получегшне данные позволяю! говорить о несущественной роли СШ молекулы для реализации функции потомков

*

Ш1 среда ШШ «гги-сва АТ

Рис.1. Цитотоксическая активность эффекториых ЦТЛ, обработанных анти-СОв мкАТ » А - после адсоСции-элсиии на монослое «Ф линии Вб. В - 4Я, С - ВП, Е - Н101. В -предварительно истощенные на монослое Мф линии ЬВ, & затем адсорбированные и элоированные с Мф Вб. По оси ординат -специфический цитотоксическия индекс О). Доза Эффекторов на лунку 900 (х 10 1. Представлены данные 7 независимых экспериментов.

£Ш средь . ВШ шпк-соа АГ

Рис.2. Цитотоксическая активность КП после адсорбции -элмши на монослоях Мф донорской £6 (А) посторонних БН (В) и <к (С) и сиигенноя В101 Ю) линия и последующей дифферениировки в трехсуточной монокультуре. Иммунные клетки перед тестом обрабатывали анти-ССб мкАТ. Результаты представлены для дозы 900 х 10 клеток- эффекторов на лунку. По оси ординат - специфический цитотоксическия индекс (X). Представлены данные 3 независимых экспериментов.

КП, что весьма вероятно обусловлено высоким аффинитетом их . рецепторов.

3. Влияние моноклональкых антител к ß-цепи lfa-1 молекулы на

цитотоксическую активность и пролифьрацию эффекторных ЦГЛ.

Популяция R101 анти-Вб эффекторных ЦТЛ, полученная in vivo (см.стр.б), была разделена на фракции, элюированные с монослоев Мф реципиентной R1Q1, посторонней В10.М и донорской Вб линий. ЦТА данных фракций тестировали на меченых 51 Cr г-клетках. При добавлении мкАТ к ß-цеш грл-1 молекулы в ЦТТ было обнаружено усиление лизиса клеток-мишеней всеми перечисленными фракциями ЦТЛ (см.рис.3). Причем лизис мишеней эффекторными ЦГЛ, элюированными с Мф реципиентной- линии, усиливался сильнее всего (рис.ЗА). Результаты отражены в виде отношения специфического лизиса, в опыте (при добавлении антител) к лизису в контроле (без обработки антителами). ■

Было сделано предположение, что усиление ЦТА связано с усилением пролиферации в популяции эффекторных ЦТЛ под действием антител к ß-цепи LFA-1 молекулы. Для проверки этого предположения клетки тех же фракций ЦГЛ помещали в культуру с облученными интактными клетками-стимуляторами донорской линии Вб, антителами к ß-цепи LFA-1 молекулы и ^-тимидином (см.стр.8). Б опыте, в присутствие антител, было показано усиление пролиферации во всех фракциях ЦГЛ в ответ на аллоантигенную стимуляцию (см.рис.4). Наиболее интенсивная пролиферация была выявлена во фракции ЦТЛ, элюированной с монослоя Мф- реципиентной линии (рис.4А).. Таким образом, связь между пролиферативной реакцией и ' цитотоксичэской функцией эффекторных ЦТЛ после их стимуляции антителами к ß-цепи ЬРА-1 молекулы представляется весьма вероятной. МкАТ ко всей

Рис.3. Цитотоксическая активность Фракции эффекторных 1ГТЛ-1. элвированных с монослоев К« реиипиетноя Riol (А>, посторонней ВЮ.М <В> я донорской В6 (С) линия после их обработки'анти-LFA-l (р-цепь J мкАТ. Доза эФФекторов на лунку 900 х ю . По оси ординат - специфический иитотоксическия индекс (в абсолютных единицах). Представлены суммарные данные 4 независимых экспериментов.

Рис.4. ПролиФвративиая активность Фракция эФФекторных ЦТ Л, элвированных с монослоев Мф реципиентнои Riol (А), посторонней BIO .М (В> и донорской Бб 1С) линии, в ответ на клетки-стимуляторы линии В6, после их обработки аити-LFA-l или алти-LFA-l (р-цепь) мкАТ. По оси ординат -индекс пролиферации (в абсолютных единицах). Представлены суммарные данные 4 независимых экспериментов-

молекуле IFA.-1 снижали пролиферативную активность в исследуемых фракциях • вф!екторных ИГЛ (см.рис.4), что- соответствует характеристикам этих антител, описанным в литературе. Необходимо отметить, что в отсутствие сигнала со стороны клеток-стимуляторов, мкАТ к р-цепи ЬРА-1 не . оказывали влияния на пролиферации ЦГЛ.

Представленные экспериментальные данные свидетельствуют о возможности проведения р-субъединицей LFA-1 молекулы ко-стимуляторного активационного сигнала.

4. Сходный характер • распознавания аллоантигенных зпитопов Сав+ Т-лимфоцитами с цитотоксической и супрессорной активностями.

В данной части работы исследовался вопрос о структуре аллогенных мишеней, распознаваемых Т-клетками со специфическими супрессорной и цитотоксической активностями при индукции этих меток в одних и тех же условиях иммунизацвии. В экспериментах использовали следующие линии мышей: Вб , bmia , dba/2 , bd?1 , сва , BCPt и 4R. Мутант bml2 отличается от мышей Вб тремя аминокислотными заменами в А^ цепи I-A молекулы в положениях 67, 70 и 71. Мыш Вб, как и мыши 4R, не акспрессируют молекулу l-в и новая мутантная детерминанта на Apbm12 молекуле может служить для лимфоцитов мышек Вб антигенным эпитопом. Мыши линий СВА и BCF1 акспрессируют цепь, которая содержит участок," соответствующий . 67-71 аминокислотам Apbm12 цепи, т.е. акспрессируют мутантный участок в измененном контексте по сравнению с линией bm12. Кроме того, мыши ВСР1 , как и мыши ВС?!, содержат данный участок в составе зкспрессируемой ВрЬ цепи. Молекулы МНС классе II мышей DBA/2 не содержат в первичной последовательности данного мутантного участка.

Мышей Вб иммунизировали в/в и в п/л (см. стр.6-7) епленоцитами мышей Ьт12 и лимфоциты мезентериальнЫх лимфоузлов и спленоциты в/в иммунизированных реципиентов, а так же лимфоциты регионарных лимфоузлов реципиентов, иммунизированных в п/л, извлекали на 4 сутки после иммунизации и использовали одновременно в гестах на выявление цитотоксичности и способности подавлять пролиферацию в СКЛ. В качестве стимуляторов в СКЛ использовали облученные спленоциты, а в качестве клеток-мишеней в ЦГТ - меченые 51Сг Мф перечисленных выше линий мышей. Установлено, что способность к подавлению пролиферации в СКЛ может выявляться у иммунных лимфоцитов независимо от пути введения антигена. При этом иммунные лимфоциты могли распознавать не только донорские стимуляторы Ьш12, но и стимуляторы ВБР,. Стимуляторы 1)ВА/2 распознавались, как правило, хуже или не распознавались совсем. Результаты для случай в/в иммунизации представлены в таблице 1 (опыты 1 и 4) и для случая иммунизации в п/л - в таблице 2 (опыты 1 и 2). В то же время есть опыты, свидетельствующие о том, что достоверное распознавание мишеней 1®А/2 и 4к все же возможно при обоих способах иммунизации (см.таблицу 1, опыт 3 и таблицу 2, опыты 2, 3 и 4).

Слабая, но статистически достоверная специфическая ИГА чаще выявлялась в популяциях лимфоцитов на 4 сутки после иммунизации в п/л (см.рис. 5 и опыты 1, 4), а в опыте 1 и для иммунных лимфоцитов после в/в иммунизации (см., рис 6). При этом, как и в опытах по подавлению пролиферации, распознавание мишеней Ъш12 коррелировало, как правило, с распознаванием клеток Врр^ и нераспознаванием ЮВА/2 (см. рис.5 и 6).

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что

. Таблица 1.

Индексы подавления (X) пролиферации Вб анти - Ьш12 в СКЛ при добавлении в нее иммунных Бб анти-Ъш12 лимфоцитов, примированных с помощь о в/в иммунизации

N конц. СТИМУЛЯТОРЫ

ЭКСП млн/мл Ьт12 В0Р1 ОВА/2 ВС^ СБА 46

1 4 32» 0 - ' - -

3 4 56» - 0 0 7 37«

2 . 26» - 30» 0 11 в

4 2 33. 33« 9» - • ■ - -

Таблица 2.

Индексы подавления О) пролиферации Вб анти - Ьт12 в СКЛ при добавлении в неб иммунных В6.анти-Ьп12 лимфоцитов, примированных с помощью иммунизации л п/л

N КОНЦ.. СТИМУЛЯТОРЫ

ЭКСП. млн/мл Ьт12 В0Р1 СВА/2 ВС^ СВА 4Н

1 4 92» 30» 13 - - -

2 39. 02* 0 - - -

2 4 4в» 43« 21» 27» 9 0

3 4 30. - 9 18» 24» . 19»

4 2 38» 16 35» - - -

'статистически достоверный уровень различия между значениями в опыте и в контроле (р<0-05)..

bml2 -в- BDF, -4- DBA/2

100

SOO

MO

Рис.5. Цитотоксическая активность, индуцированная иммунизацией мышей Вб облученными спленоиитеш мышея Ъв12 в n/л. На четвертые сутки после иммунизации цитотокэдческуо активность иммунных лимфоцитов определяли по выходу ' fr из меченых МФ- По оси абсцисс - доза эффекторов (х 10 1 на лунку; по оси ординат - специаический цитотоксическия индекс ' (*). Представлены результаты 3 экспериментов для случаев, когда выявлялась перекрестная реактивность на мипенях BDFt•

Ьга12 "в" BDF, -4- DBA/г

Рис.6. Цитотоксическая активность,, индуцированная иммунизацией млея Вб облученными спленоиитами мышея от! 2 в/в. На четвертые сутки после иммунизации цитотокедческую шшилгп. иммунных лимфоцитов определяли по выходу Хг из

- -------- ---- ---------- ю' 1 м

8КТИ&Н ОСТЬ г» I. ________...........

меченых Ыф. ~По оси абсцисс - доза эффекторов «х лунку; по оси ординат - специфический цитотоксический индекс С»).

отсутствует корреляция как. меаду выявлением . супрессорной и цитотоксической активностей в популяциях иммунных лимфоцитов, так н между характером распознавания клеток ВБ71 и БВА/2 и 4и в цитотоксическом и пролиферативном тестах, при условии выявления в популяции клеток как с цитотоксической, так и с супрессорной активностями одновременно. Пол} енные результаты можно интерпретировать в том смысле, что клетки мышей ВБР, распознаются несколько лучше, чем клетки мышей ' бва/2 независимо от используемого способа иммунизации и применяемого теста. Вероятно, как ЦГЛ, так и СТО распознают пептид, содержащий мутантную последовательность из молекулы, в контексте собственных

молекул МНС класса I.

5. Влияние ингибиторов синтезов ДНК. РНК и белка на лифференцировку предшественников первичных ЦТЛ и КП.

Клетки-предшественники эффекторных первичных ЦТЛ получали из регионарных лимфатических узлов мышей й101, ВЮ.вг или СБА после их иммунизации в п/л сплевоцитами ' мышей Вб (в первых двух случаях) или В10.О2 (в последнем случае) (см.стр.6). Дальнейшую дифферешдаровку проводили в трехсуточной монокультуре.

Для изучения необходимости процессов транскрипции, трансляции и пролиферации при дафференцировке первичных пре-ЦТЛ в эффекторные ЦТЛ, ингибитор« вносили в культуру "через 48 часов после начала культивирования. По окончании культивирования клетки отмывали и тестировали в ЦТТ (см.рис.7). В качестве клеток-мишеней использовали меченые 51 Сг Мф донорской и посторонних линий. Представленные данные свидетельствуют о значительном подавлении цитотоксичности под действием всех использованных ингибиторов. При этом жизнеспособность -.в популяциях клеток,

% м

EU ООО тыо Ш8 ЗОО *ыо . ЕШЗ 100 тыо

Рис.Т. Цитотоксическая активность эффекторных ЦТЛ-1, генерированных ь трехсуточной монокультуре из пре-ЦТЛ-1. А -без добавления ингибитора, В - Ев. С - АБ, 0.- ага-С. В качестве клеток-мишеней использовали меченые Сг КФ линии В6. Дозы Эффекторов на лунку 900, 300 и 100 (х 10 I. По оси ординат - специфически« цитотоксическия индекс <*!• Представлены данные 3 независимых экспериментов.

X

к в. сов

ÜH ООО ruo ЕШ 300 тыо E3S 100 *ыо

Рис.в. Шгготоксмческая активность КП из мезентериальных ЛУ после культивирования в однонаправленной трехсуточной культуре в присутствии клеток-стимуляторов линии Вб. Л -КП из селезенки без добавления ингибитора, В - КП из меэентериальных ЛУ без добавления ингибитора, C-, D- и Б -КП из меэентериальных ЛУ, культивируемые в присутствии Em. АО и ага-С. соответственно. Дозы эффекторов на лунку 900, 300 м 100 (х 10 ). По оси ординат - специфический цитотоксическия индекс (*>. Представлены данные 3 независимых экспериментов«

культивируемых в присутствии любого из ингибирупцих агентов, не отличалась от контрольной. Таким образом, можно говорить о необходимости всех синтезов в клетке вплоть да появления значительной функциональной активности.

КП получали как из селезенок, так и из мвзентериадьных лимфоузлов иммунных реципиентов лингЧ Я101 или ВЮ.П2 (см.стр.7). Дальнейшую дифференцировку этих клеток проводили в культуре в присутствии кпеток-стнмуляторов донорской линии Вб. Ингибиторы вносили в культуру через 48 часов после начала культивирования. Через 20-24 часа после добавления ингибиторов клетки извлекала из культуры, отмывали и тестировали в ШТ. Проведенные эксперименты ве выявили влияния ингибиторов на генерацию ИГА у КП (ряс.8). Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что ингибиция синтезов ДНК, РНК и белка в КП аз мэзентериалышх лимфоузлов и селезенки на заключительном этапе дафференцнровки не влияет на динамику генерации ИГА.

ВЫВОДЫ

1. Созревание первичных ИГЛ на заключительном этапа антиген-зависимой дифференцировки требует синтезов ДНК, И® и белка. Формирование вторичных ЦТЛ из клеток памяти происходит в условиях ингибирования указанных синтезов.

2. Способ введения антигена не является реаащим в определении функциональной активности нндуцеруемых Т-лимфоцито?. Как специфическая супрессорная, тая в специфическая цито токсическая активности индуцируются при иммунизации внутривенно и в подушкж лш.

3. В мутангной системе Вб анти-Ът!2 индуцированы

эффекторшэ Т-лимфоцита, обладающие как специфической супрессорной, так и специфической цитотоксической функциями. Обе функционально различные субпопуляции распознав мутангную последовательность ьт12 из молекулы А^ в составе чужеродной молекулы Eß, то'есть в измененном контексте. -

4. Взаимодействие ко-рецепторной молекулы CD8 с лигандощ облегчает реализацию функции эффекгорного ЦТЛ с низкой аффинностью Т-клеточного рецептора..

5. Связывание моноклональными антителами ß-цепи líA-1 молекуjл ко-стимулирует пролиферацию и цитотоксическую активность аллоавтиген-специСичесрта ЦГЛ

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. .Kronin V., Anosova N., Popov I.» Polesskaya A., Brondz В., Krivoshein Y. Intravenous injeotion of allogeneic oells oan prime T-lymphooytes with cytotoxic aotivity, Immunol.letters, 1993,35,1,13-18.

2. Попов H.A., Врондз Б.Д., Аносова Н.Г., Кривошеин D.C., Кронин В.В. Влияние молекулы 1у2 на функцию аллоантиген-специфических вффекторных ЦГЛ в зависимости от вариабельности аффинитета их рецепторов, Бюлл. экспер. биол. и мед., 1993,115,5,492-493.

3. Попов И.А., Аносова К.Г., Бакова A.A., ВронДз Б.Д., Кривошеин Ю.С., Кронин В.В. Моноклональные антитела к ß-цепи молекулы 1FA-1 способствуют повышению цитотоксического индекса эффекторных лимфоцитов и стимулируют их пролиферацию, Бюлл. экспер. биол. и мед., 1993,115,6,639-640.

4. Попов И.А., Аносова Н.Г., Брондз Б.Д., Кривошеин Ю.С.,

Бакова А.А., Кроннн В.В.- Стимуляция пролиферативной реакции иммунных спленоцитов моноклоналышми антителами к р-цепи молекулы IfA-1 мокет приводить к усилению их цитотоксичности, Бюлл. экспер. биол. и мед., 1993,116,7,60-61.

5. Kronin V.V., Anoeova Н.О., Brondz В.В., Chemyshova A.D., KrivoBheln Y.S., Popov I.A. Induotion of alloantigen - speoifio oytotoxio and suppressor aotlvitles of lymphooytea by Intravenous immunization of mloe when donor and recipient differ in class 12 MHO moleoule, Uiorobiol.J., 1993.55,5.51-55.

6. Аносова Н.Г., Кроннн B.B., Чернышева А.Д., Ерондз Б.Д., Кривошэин D.C., Попов И.А. Сравнительное изучение перекрестной реактивности Т лимфоцитов о цатотоксической к супрасорюй активностями, специфичных к эштопам мембранных молекул гистосовместииости класса II, Биологические мембраны, 1993,5,453-461.

7. Popov I.A., Brondz B.C.. Gorello I>.N., Bafcova A.A., Krivosheln Y.S., Anoeova И.О., Aptikaeva Q.P. Differenoe in sensitivity of anti-K11 CTL eluted frco the donor and third-party oaorofage monolayers to anti-Ly2 antibody, Abetraots-Springer-Yerlag of 8th International Congress of Iranunology (Budapest, Hungary), 1992.p.74.

8. Anoeova И.О., Popov I.A., Oorelio L.N., Brondz B.C., Krivoahein Y.S.. Jedoeeyeva B.Y., Bakova A.A. The study of antl-LPA-1 antibody effeot on anti-H-2Kb CTL. Ibld.,p.269.

9. Попов И.А., Аносова Н.Г., Брондз Б.Д.. Горелик Л.Н., Кривошеин S.C. Эффект анти-ЫА-1 ноноклональных антител при лизисе авдаантнген-спевдфическюш «¡факторными Т-лим5оцатами клеток-мишеней в Щ"Г, Тезисы докладов I -съезда аллергологов и

иммунологов Азербайджана (Баку), 1992,с,15.

10. Попов И.А., -Аносова Н.Г., Кривошеин Ю.С.' Исследование фенотипа лимфоидных клеток с помощью моноклональных антител к молекула ЬРА-1 (CD11a), Тезизы докладов к XI.'республиканской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях". (Челябинск), 1992,с.47.

11. Попов И.А., Аносова Н.Г., Кривошеин D.C. Влияние моноклональных антител к молекуле LFA-1 (CD11a) на цитотоксичность зффекторных Т-лимфоцитов, специфичных к аллоантигену Н-2КЪ, посла их обогащения адсорбцией-элюцией на донорском, постороннем и реципиентном монослоях макрофагов, тамже',с.84.

12.;Popov I.A., Anosova N.O., Corelio L'.li., Bakova A.A., Krivoshein Y.S., Kronln V.V., Fedoeeyeva E.V., Brondz B.D. Monoclonal antibodies to CD11 a/CD18 moleoule inorease the proliferation of alloaдtigen-specifio cytotorio !P oells -in the mixed lymphocyte culture. Abstracts International Symp. "Struoture and function of regulator peptides'1 (Moeoow-YaroBlavl), 1992,p.64.

13. Брондз В.Д., Попов И.А., Пронин В.В., Кривошеин Ю.С., Аносова Н.Г. Созревание иммунных клеток-предшественников, во вторичные эффекгорные цитотоксические Г-лимфоциты,' Тезизы докладов ill съезда гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Респ. Молдова (Кишенев), 1992,с.23.

14. Брондз Б.Д., Попов И.А., Кривошеин D.C., Аносова Н.Г. Различие рецепторов вффекторных цитотоксических Т-лимфоцитов и клеток памяти по тонкой специфичности № степени аффинитета,

тамжв.с.40.

15. Brondz В., Anoeova Н., Aptikaeva G.,; Chervonsky А., Ivanov Y., Kazanaky D., Коjioh A., Lupatov A., Moshnilcov s., Popov I. Difference between CB8+ oytotoxio T-lymphooytes (CTL), their eeoondary precursors (pCTI-2 memory oelle) and suppressor T ooIIb (Те) epeoifio to the same MHC olaee I nrolecule in reoognizable epitopes extent of affinity and differentiation conditions, and inhibition of CTL by tumour-epeoifio Ts for the following prevention of immunodefioienoy by mAB to the seleotive Те membrane marker, Abetraote. Author Index and List of Partioipante И1В0 workehop on oell-^mediated cytotoxicity (Ilan.Ieraal), 199Э.Р.1Э.

16. Аносова Н.Г., Попов И.А., Кронш В.В., Брондз Б.Д. Влияние актиномицина D на дифференцировку первичных и вторичных аллоантиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов in vitro, Тезисы докладов республиканской конференции по иммунологии (Луганск), 1993,с.18.

17. Кронин В.В., Аносова Н.Г., Федосеева Е.В. Различные функциональные активности сплэноцитов, индуцируемые при внутривенной иммунизации мышей аллоантигенами, Тезисы докладов I съезда иммунологов России (Новосибирск), 1992,с.254-255.