Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности распознавания аллоантигена и условия дифференцировки в популяциях CD8+ Т-лимфоцитов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности распознавания аллоантигена и условия дифференцировки в популяциях CD8+ Т-лимфоцитов"

московский государственный университет им. м.в. ломоносова

На правах рукописи удк 612.112.94.017.1

аносова наталья геннадьевна

особенности распознавания аллолнтигена и условия дифн5ренцир0вки в популяциях cd8+ т-лшфошггов

(сшцвальность 03.00.06 - вирусология)

автореферат •диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории механизмов регуляции иммунитета (руководитель - д.м.н., проф. Б.Д. Брондз) НИИ канцерогенеза ОВД РАМН и на кафедре вирусологии (заведующий -академик РАН, проф. И.Г. Атабеков) Московского Государственного Университете им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Б.Л. БРОНЮ, кандидат медицинских наук И.А. ПОПОВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

В.Г. ГАЛАКТИОНОВ, доктор медицинских наук Е.Г. СЛАВИНА

Ведущая организация: Медико-генетический научный центр РАМН

Защита состоится * 1994 г. в </0 час. на

заседании Специализированного Ученого Совета Д.053.05.70 Московского Государственного Университета им. Ы.В. Ломоносова по адресу 119899, Москва, Воробьевы горы. Биологический факультет МГУ, молекулярный корпус "А"

С диссертацией . можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан Се-А^ГЛ^ы^ 1994 года

Ученый секретарь Специализированного

Ученого Совета, П

/ кандидат химических наук гмО^

В.Н. КАГРАМАНСВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Актуальным вопросом современной иммунологии продолжает оставаться клеточный и молекулярный механизм распознавания чужеродных антигенов Т-лимфоцитами. В рамках этого вопроса не первый план выходит проблема развития иммунного ответа в аллогенной системе. Понимание закономерностей этого процесса откроет новые перспективы для решения важных вопросов современной медицины и прежде всего проблемы отторжения трансплантируемых органов и тканей. Молекулярные механизмы вллораспознавания также, как и структура аллогенных мишеней, распознаваемых аллореактивными Т-клетками, остаются до конца не выясненными. Крайне мало изучены процессы дифференцировки блловнтиген-спещфгсеских Т-лимфоцитов, приводящие к появлению, у клеток-предшественников функций эффекторных клеток. Немаловажным является вопрос о том, через одни и те же этапы или нет проходит дафференцировка клеток, впервые встречающихся с антигеном, и клеток памяти (КП).

Актуальность темы исследования обусловливается также •теоретической и практической значимостью изучения роли коре цапторов и адгезивных молекул в Т-клеточном распознавании. Данные исследования предоставляют дополнительные возможности селективной регуляции иммунных реакций отторжения трансплантата.

Цель работы. Целью диссертационной работы явилось изучение особенностей распознавания аллоантигена популяциями СШ+ цитотоксиче ских Т-лимфоцитов (ЦГЛ) в зависимости от различной аффинности Т-рецептора (TcR) и от участия в распознавании CD8 и LFA-1 .ко-рецепторнмх молекул, а также сравнение природы аллогенных эпитопов, распознаваемых супрессорным и

цитотоксическим подклассами CD8+ Т-лимофоцитов. Вторая проблема исследования заключалась в выяснении условий дифференцировки предшественников эффэкторных первичных ЦГЛ и КП в' аллогенной системе.

Задачи исследования. 1. 6 аллогенной системе сравнить

условия и скорость дифференцировки пре дарственников первичных ЦТЛ и КП, являющихся предшественниками вторичных Вффекторных ИГЛ.

2. Изучить влияние ко-рецвпторной молекулы CD8 (1у2) на функции аллоанти-ген-специфических зффекторных ЦГЛ и КП в зависимости от аффинитета TcR.

3. Исследовать роль р-цепи адгезивной молекулы LF1-1 в процессе аллоанти-ген-специфическоа активации Т-лимфо-цитов.

'4. Выяснить возможные различия в распознавании антигенных эпитопов CD8+ аллореактивныни Т-лимфоцитами, опосредующими специфические супрес-сорную и цитотоксичесую активности в одних и тех se условиях иммунизации.

Научная новизна. В представленной работе получены экспериментальные . • данные, свидетельствующие в пользу существования различных условий дифференцировки предшественников первичных аффехторных ЦГЛ и КП. Впервые показано, что для созревания первичных ЦГЛ из про-ЦГЛ на заключительном этапе

антиген-завг"чшой дифферендаровки синтезы РНК и бежа являются необходимыми. Напротив, формирование вторичных ЦТЛ из КП происходит в условиях ингибирования указанных синтезов.

В оригинальной экспериментальной системе с использованием адсорбции-элюции иммунных лимфоцитов на монослоях макрофагов (Мф) выяснен вопрос о необходимости CD8 молекулы при взаимодействии низкоаффинных TcR с аллоантигеном. Для (З-цепи адгезивной молекулы LFA-1 выявлены ноше бозмокности в ко-стимуляции аллогенного иммунного ответа.

Показана возможность генерации Т-клеток, опосредующих как специфическую супрессорну», так и специфическую цитотоксическую активности при одних и тех же условиях иммунизации. Получешше данные свидетельствуют о том, что одна и та же популяция CD8+ Т-лимфоцитов может проявлять различные функциональные активности, а распознавание аллоантигенного эпитопа функционально различными субпопуляциями происходит сходным образом, по-видимому, в контексте собственных молекул МНС класса I.

Практическая значимость работа. Диссертационная работа •вносит определенный вклад в развитие фундаментальных представлений о- механизмах функционирования и диЭДеренцировке специфических эффекторннх ЦТЛ, важных для развития, в первую очередь противоопухолэго и противовирусного иммунитета.

Результаты работы, свидетельствующие о том, что ЦТЛ и специфические Т-супрессоры (СТС) могут иметь сходный характер распознавания антигена In rivo, могут Сыть полезны при разработке подходов иммунотерапевтичэского воздействия на популяцию Т-лимфоцитов, опосредующих супрессорний эффект.. Поскольку стратегия иммунотерапии зависит как от выяснения эпитопов, распознаваемых

СТО, так в такой же мере и от решения вопроса о существовании СТО как отдельной линии дафференцировки Т-клеток.

Результаты работы внедрены в учебный процесс и используются в курсах лекций по фунданектальной иммунологии для студентов биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и факультета физико-химической биологии Крымского медицинского института.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований, вошедшие в диссертационную работу, были представлены на отечественных и зарубежных конференциях и симпозиумах: на I г езде иммунологов России (Новосибирск, 1992), I съезде аллергологов и иммунологов Азербайджана (Баку, 1992), VIII Международном конгрессе по иммунологии (Будапешт, Венгрия, 1992), Меадурародаом симпозиуме "Структура и функции регуляторных полипептидов" (Москва-Ярославль, 1992), XI республиканской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета цри различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск,1992), III съезде гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Респ. Молдова (Кишенев, 1992), Международной конференции по механизмам киллинга (Израиль, 1993), Республиканской конференции по иммунологии (Луганск, 1993).

Полученные экспериментальные данные докладывались на лабораторных и. межлабораторных -конференциях, а также на совместной конференции лабораторий механизмов регуляции иммунитета, противоопухолевого иммунитета и иммунохимии опухолей НШ канцерогенеза ОЩ РАМН и кафедры вирусологии биологического факультета МГУ*

Материалы диссертации отражены в 17 научных публикациях.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. Ко-рецепторная . молекула CD8 оказывает существенное влияние на проявление цитолитического потенциала ЦГЛ, несущих низкоафЕинше рецепторы.

'2. Адгезивная молекула LFA-1 способна передавать индуктивный ко-стимуляторныЗ сигнал через свою (Э-субъедгапщу.

3. Адлореактивные CD8*" Т-лимфоциты со специфическими супрессорной и цитотоксической активностями, индуцированные в одних и тех же условиях иммунизации, способны распознавать узкую аллоантигенную детерминанту в измененном (отличном от донорского) контексте.

4. Условия и пути антиген-зависимой дифЗеренцировки предшественников первичных ЦГЛ и КП в эффекторные- ЦГЛ различны.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на

страницах машинописного текста. Она состоят из введения, пяти глав обзора литературы, раздела материалов и методов исследования, четырех глав собственных результатов, главы обсуждения результатов, выводов и списка используемой литературы, содержащего 154 источника. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 6 таблицами''

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

1. Лабораторные животные.

Мышей линий С57В1/б(Вб) (H-2b), BIO.BR(BR) (H-2k), В10.М <H-2f), B10.D2 (H-2d), • B10.D2(R101) (KdIdBb), B10.A(4R) <KkI-AkI-EpRI-EabDb), B6.C-H-2bm12(bm12) (H-2bra12), DBA/2 (H-2d), BDF1 (B6XDBA/2) (H-2bxd), CBA (Hr-2k), BCP, (ВбкиВА) (Н-г1**) получали из разведения 0HII РАМН. Крыс линии Lewis для получения

асцитов также получали из разведения ОНЦ РАМН.

2. Моноклональныв антитела.

Анти-С£в антитела, продуцируемые гибридомой H35f7.2, использовались либо в виде супернатанта от гибридами, либо в виде асцита крыс lewis; атя-СЫ - в виде, супернатанта от- гибридош 3.168; адти-Thy-l.2 - в виде супернатанта от гибридомы G4. Гибридому С4 любезно предоставил А. Червонский. Гибридомы, продуцирующие антитела к р-цепи и ко всей молекуле liPA-1, были любезно предоставлены нашей лаборатории профессором М. Pleresa. Данные антитела использовались в виде супернатантов от гибридом.

3. Индукция аффекторных первичных ЦТЛ в In vivo-In vitro

системе.

Облученные 2000 рад аллогенные клетки селезенки вводили в подушки лап (п/л) мышей-реципиентов по 2x1клеток в объеме 40 мкл в каждую лапу. Через 4 суток у иммунных реципиентов забирали клетки регионарных лимфоузлов, отмывали и инкубировали в трехсуточной монокультуре в С02-инкубаторе (5% С02) в полной ростовой среде (KPMI-1640 (Plow Laboratories, США) С 7-10» эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mu L-глутамина (Flow, Англия), 100 ед/МЛ гентамицина, 10 пМ КЕРЕЗ (MioroMologioal ABBoeiates, США)), содержащей. 2 тМ 2-меркалтоэтанола (Calblochem. США). Клетки инкубировали в 24-луночных плашках (Llnbro, Англия) в концентрации 5x106 в "2 мл среды на лунку.

4. Индукция эффекторных первичных ЦТЛ in vivo.

ИГЛ индуцировали путем введения мышам 25 млн клеток тимомы EL-4 (гаплотш Н-2Ь) в объеме 0,5 мл внутрибршинно (в/бр). Через 11 суток сшюноциты иммунных реципиентов тестировали в цитотоксическом тесте (ЦГТ).

5. Индукция эффекгорньи вторичных ЦГЛ In vivo.

ЦТЛ поучали из селезенок мышей спустя б суток после повторной в/бр иммунизации клетками ЕЪ~4 (по 25 млн на мышь). Первичная в/бр иммунизация реципиентов EL-4 проводилась за 1,5-2 месяца до вторичной.

6. Индукция КП (предшественников вторичных ЦГЛ) In vivo.

После в/бр введения реципиентам 25 млн EL-4 со 2 по 7 месяцы

включительно среда иммунных спленоцитов и клеток мезентериальных лимфоузлов определялись КП.

7. Индукция СТС In vivo.

СТО индуцировали у мышей внутривенной (в/в) иммунизацией большой дозой 9x107 облученных 2000 рад на установке "Стебель ЗА" клеток аплогенной селезенки в объеме до 1 мл. СТС извлекали .из селезенки и/или мезентериальных лимфоузлов иммунных животных на 4 сутки после иммунизации.

8. Постановка цитотоксического теста.

Суспензию лимфоцитов в определенной концентрации вносили в лунки с мечеными Na^Cro^ (51Сг) кпетками-мишенямк и помещали в COg-HHKyöaTop (37®С). В качестве клеток-мишеней использовали перитонеальные MJ различных- линий мышей или ь-клетки Ltk~ (H-2k гаплотипа) и их производные 1-4, трансфецированные Н-2КЬ молекулой (любезно предоставлены профессором«H.Alien). Через 16-18 часов после внесения суспензии, среду из лунок отбирали и переносили в пластиковые ампулы. Выход 51Сг в среду считали в гамма- спектрометре. Цитогоксический индекс (ЦИ) оценивали

щ

по формуле: ДО - (a-c)/(b-c)zicm, где "а" и "Ь" - выход Сг, соответственно, при добавлении эффекторных лимфоцитов и при полном разрушении мишеней в присутствии 1% раствора тритона

ХИОО, "о" - спонтанный выход 5,Сг в среду (в импульсах в минуту).

9. Тест на подавление пролиферации в смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ).

CTG, извлеченные из иммунных животных, обрабатывали митомицином С (Sigma, США) при 37®С 30 мин в концентрации 25 мкг/мл среды RPMI-1640 и добавляли в СКЛ. В качестве реагирующих лимфоцитов (респондвров) использовались клетки лимфатических узлов мышей той же линии, что и доноры СТС, в количестве 3x1 (Р. а ь качестве стимуляторов - облученные 2000 рад на установке "Стебель ЗА" спленоциты линии, использованной для индукции СТС (в контроле - сингенной линии) в концентрации Ю6 клеток. Смесь трех типов клеток культивировали в полной среде для СКЛ - RPMI-1640 о 5% .человеческой сыворотки, 2 mil L-глутамина, 100 ед/мл гентамицинз, 2 шМ 2-меркаптоэтанола, 25 шМ HEPES - в лунке 96-луночной плашки с V- или ü-образшм дном (Llnbro, Англия) при соотношении СТС, респондеров и стимулирующих клеток 0,3:1:3 (по 50 мкл каждой суспензии). Микрокультуры инкубировали в течение 4 суток при 37°С в С02-инкубаторе. Затем в каждую лунку добавляли па 20 мкл среды HPMI-1640 с 0,04 МБк 3Н-тимидина (удельная активность 1 Ku/mM). Через 16.чесов клетки переносили с помощью прибора "Cell Harvester" (Plow," Англия) на стекловолоконные фильтры а считали включение радионуклида в жидкостном сщштимяциокном счетчике. Результаты выражали в виде индекса супресош <ЦС). ИС= ((a-C1)-(b-C2))/(a-C1)x100í, где "а1 и "t>" -включение ^tí-тымндина при добавлении в аллогенную СКЛ, соответственно, интактных а иммунных лимфоцитов; "С1" и "С2" -включение мелей в сингенной СКЛ при добавлении тех же клеток.

Специфичность супрессии определяли при использовании в СЮ! стимулятороь, полностью отличных от иммунизирующей линии по аллелю Н-2.

10. Обогащение и разделение на фракции иммунных лимЕоцитов с помо!цыо адсорбция- злвдии на монослоях различных гаплотипов.

Монослои Мф, посаженные на пластиковые флаконы, предварительно промывали средой Игла с 1С® сыворотки крупного рогатого скота, затем среду отсасывали и вносили приготовленную суспензию иммунных лимфоцитов в среде Игла, 100 ед/мл гентамицинй, 10* сыворотки крупного рогатого скота,. Лимфоциты адсорбировались на Мф за 2 часа в С02-инкубаторе при 30°С - для эффекторов и 37°С - для КП. Концентрация вносимых лимфоцитов была около 4x1в 3 кл. Через 2 часа флаконы помещали на качалку (Infors, ФРГ) на 4-5 мин, 80 об/ьссн, затем ставили вертикально и собирали яеприкрепившиеся лимфоцит». После, чего монослой Мф промывали 3-5 раз средой Игла без сыворстки, кавдый раз отсасывая отсосом. Адсорбированные клетки дважды элшровали с помотаю теплого раствора проназы (Signa, США) в концентрациях 25 и 100 мкг/мл в присутствии таких ке концентраций панкреатина (Calblochem, США) кявдыЯ раз в течении 30 мин при 37®С. Затем проназу инактивировапи ЗОК сывороткой крупного рогатого скота, элшрованннв лимфоциты отмывали и использовали в функциональных тестах.

11. Ингибиторы.

В качестве ингибитора-синтеза РНК использовали актиномкцин D (АО) в дозе 0.03 мкг/мл, в качестве ингибитора синтеза белка -эметин. (Ет) в дозе 0.5 мкг/мл, в качестве ингибитора синтеза ДНК - оксимочевину (HU) - 0.5 тМ и цигозинарабинозид (ага-С) - 10

мкг/мл. Все реактивы фирмы Sigma, США.

Результаты исследования

1. Ыоноклональные антитела к CDS молекуле подавляют цитотоксическую активность зффекторных 1ГГЛ с низкоа<Минными

рецепторами.

В качестве ЦГЛ использовали клетки селезенок мышей линии R101 после в/бр иммунизации клетками EL-4 (см.стр.б). В начале исследования проводили обогащение и разделение ЦГЛ на фракции по аффинитету антиген-специфических , рецепторов с помощью адсорбции популяции иммунных клеток на монослоях Мф донорской В6. посторонних 4R в BR и реципиентной R101 (в контроле) линий, с последующей их злвцией и отмывом. Затем фракционированные иммунные лимфоциты инкубировали с анти-Свв антителами и отмывали. Функцию иммунных лимфоцитов тестировали в ЮТ, где в качестве мишеней использовали мышшые Хг-клетки гаплотипа Н-2к и их трансфецированняе производные 1-4. Оказалось, что низкоаффшные фракции ЦГЛ , алшрованные с Мф посторонних линий 4R и BR, высоко чувствительны к действию анти-СБв моноклональных антител (мкАТ) (см.рис.1В и С). ВысокоафЕвсшыэ ЦГЛ. обогащенные на Мф донорской линии В6, напротив, проявили слабую чувствительность к названным мкАГ (рис. 1А). Более того, если ЦГЛ были предварительно истощены на Мф посторонней линии, а затем елюированы с Мф донорской линии, то они оказывались- полностью резистентными к данным мкАГ (рис.11)). Контроль представлен на рисунке 1Б (ЦГЛ, элюированные с , Мф реципиентной линии R101).

Таким образом,было показано, что цитотоксическая функция

значительно угнетается анти-С1>8 мкАТ только во фракциях . специфических эффекторных ЦГЛ, элюированных с монослоэв Мф посторонних линий. Эти данные подтверадают необходимость CD8 молекулы для реализации функции ЦГЛ, несущего низкоаффинный рецептор к индуцирующему антигену.

2. Моноклональиые антитела к CD8 молекуле не оказывают влияния на цитотоксическую активность потомков КП.

КП получали в системах Rf 01 анти- В6 или B10.D2 анти- Вб (см.стр.7). Иммунные сплеиоциты отбирали через 1,5-2 месяца после иммунизации реципиентов. КП разделяли на фракции путем адсорбции-элюции на монослоях Мф линий В6, BR или R101 и затем культивировали 3 суток в монокультуре для дафференцировки в эффекторные ЦТЛ. Извлеченные из монокультуры клетки обрабатысали штя-CdQ мкАТ, отмывали и использовал! в функциональном тексте на выявление цитотоксической активности (ЦТА). Тестирование проводили на меченых 51Сг ь-клетках. Фракция КП, элюированная с монослоя Мф донорской линии В6 (см.рис.2А), через 3 суток после нахоадения в монокультуре, обладала высокой специфической ЦТА. В 'аналогичных фракциях КП, элюированных с монослоев Мф посторонних t линий BR и 4В, после их дифференцировки in vitro, также была выявлена значительная ЦТА ' (см.рис.2В,С), что подтверждает возможность нормальной дафференцировки КП в эффекторные вторичные ЦТЛ после стимуляции аллельными вариантами аллоантигена.

Фракции КП, обогащенные клетками как с высоко-, гак и с низкоафЗЕинными рецепторами-к индуцирующему антигену, после их дафференцировки в эффекторные ЦГЛ, не были чувствительны к анти-CD8 мкАТ (рис.2). Полученные данные позволяю! говорить о несущественной роли CD8 молекулы для реализации функции потомков

*

111 оредл ■ ЕШ лиги-сва АТ

Рис.1. цитотоксическая активность эФФекторных ЦТЛ, обработанных анти-С1Ю ихАГ > А - после адсобции-элоции на монослое Мф линии В6, В - 4Я. С - ВН. Е - И101. 0 -предварительно истощенные на монослое МФ линии Вй, а затеи адсорбированные и элюироваиные с ИФ Вб. По оси ординат -специфический цитотрксическип индекс (*). Лоза эФФекторов на лунку 900 (х 10 I. Представлены данные 7 независимых экспериментов.

% Нп

ЁШ среда . ШШ ыгги-СМ АТ

Рис.2. Цитотоксическая активность КП после адсорбции -элюции на монослоях и« донорской Бб (А) посторонних ВН <В) и 4Й 1С) и сингенноя К101 (0) линия и последуовей дифференцировки в трехсуточной монокультуре. Иммунные клетки перед тестом обрабатывали анти-СЮ мкаТ. Результаты представлены для дозы 900 х 10 клеток- эффекторов на лунку. По оси ординат - специфический цитотоксическия индекс (»). Представлены данные 3 независимых экспериментов.

КП, что весьма вероятно обусловлено высоким аффинитетом их рецепторов.

3. Влияние мовоклональных антител к Р-цепи lpa-1 молекулы на

цитотоксическую активность и пролиферацию эффекторных ЦТЛ.

Популяция R101 анти-Вб эффекторных ЦТЛ, полученная in vivo (см.стр.6), была разделена на фракции, элюированные с монослоев Мф реципиентной R101, посторонней В10.М и донорской Вб линий. ЦТА данных фракций тестировали на меченых 5,Сг ь-клетках. , При добавлении мкАТ к ß-цепи LPA-t молекулы в ЦТТ было обнаружено усиление лизиса клеток-мишеней всеми перечисленными фракциями ЦТЛ (см.рис.З). Причем лизис мишеней эффекгорными ЦГЛ, элшрованными с Мф реципиентной- линии, усиливался сильнее всего (рис.ЗА). Результаты отражены в виде отноиения специфического лизиса. в опыте (при добавлении антител) к лизису в контроле (без обработки антителами). •

Было сделано предположение, что усиление ЦТА связано с усилением пролиферации в популяции эффекторных ЦТЛ под действием антител к ß-цепи LPA-1 молекулы. Для проверки этого предположения •клетки тех же фракций ЦТЛ помещали в культуру с облученными интактными клетками-стимуляторами донорской линии Вб, антителами к р-цепи LFA-1 молекулы и ^-тимидином (см.стр.8). Б опыте, в присутствие антител, было показано усиление пролиферации во всех фракциях ЦТЛ в ответ на аллоантигенную стимуляцию (см.рис.4). Наиболее интенсивная пролиферация была выявлена во фракции ЦТЛ, элюированной с монослоя Мф • реципиентной линии (рис.ДА).. Таким образом, связь между пролиферативной реакцией и ' цитотоксической функцией эффекторных ЦТЛ после их стимуляции антителами к ß-uorm ьра-1 молекулы представляется весьма вероятной. МкАТ ко всей

4.0

о.»

■

fsrw jr г.

11. • •

■ fc. .

hr * Л "< t л j* г

—• w s х f""

• t . ЪьШ щш ш * * teasa 1 L

ИЗ ореда Шк MiTa-XJAl

AT

Рис.3. Цитотокснческая активность Фракция эффекторных ЦТЛ-1, элюированных с монослоев ЫФ реиипиетноя Н101 (А), посторонней Bio.к (В) и донорской вб (CI линии после их обработки.анти-LFA-l (»-цепь) мкАТ. Доза эФФекторов на лунку 900 х 10 . По оси ординат - специфический иитотоксическия индекс (в абсолютных единицах). Представлены суммарные данные 4 независимых экспериментов.

гд

1.5-

O.S

о •*■

V ••: t

т

JJi.l „i !

ШП1-Ш1

«шти—UA1 AT

Рис.4. ПролиФеративн&я активность фракция эффекторных ЦТ Л, элсированных с монослоев мф реципиентноя В101 (а), посторонней £10.Ы (В) и донорской Вб (С) линия, в ответ на клетки-стимуляторы линии Вб, после их обработки анти-ил-1 или анти-иА-1 (р-иепь) мкАТ. По оси ординат -индекс пролиферации 1а абсолютных единицах). Представлены суммарные данные 4 независимых экспериментов-

в

3

1

е

в

молекуле LFA-1 снижали пролиферативную активность в исследуемых фракциях • аффекторных ЦГЛ (см.рис.4), что ■ соответствует характеристикам этих антител, описанным в литературе. Необходимо отметить, что в отсутствие сигнала со стороны клеток-стимуляторов, мкАТ к р-цепи LFA-1 не . оказывали влияния на пролиферацию ЦТЛ.

Представленные экспериментальные данные свидетельствуют о возможности проведения р-субъединицей LFA-1 молекулы ко-стимуляторного активационного сигнала.

4. Сходный характер ■ распознавания аллоантигенных эпитопов CD8"1" Г-лимфоцитами с цитотоксической и супрессорной активностями.

В данной части работы исследовался вопрос о структуре аллогеиных мишеней, распознаваемых Т-клетками со специфическими супрессорной и цитотоксической активностями при индукции этих клеток в одних и тех же условиях иммунизацаии. В экспериментах использовали следующие линии мышей: Вб , Ьт12 , DBA/2 , BD?1 , сва , вср1 и 4r. Мутант Ьи12 отличается от мышей Вб тремя аминокислотными заменами в Ар цепи I-A молекулы в положениях 67, 70 и 71. Мыши Вб, как и мыши 4R, не экспрессируюг молекулу l-в и новая мутантная детерминанта на Apbm12 молекуле может служить для лимфоцитов мышей Вб антигенным эпитопом. Мыши линий СВА и BCF, вкспрессируют Е^ цепь, которая содержит участок,' соответствующий 67-71 аминокислотам A^bm12 цепи, т.е. экспрессируюг мутантный участок в измененном контексте по сравнению с линией bm12. Кроме того, мыши ВСР1 , как и мыши BDF1, содержат данный участок в составе экспрессируемой ЗрЬ цепи. Молекулы МНС классе II мышей DBA/2 не содержат в первичной последовательности данного мутантного участка.

Мышей Вб иммунизировали в/в и в п/л <см.стр.6-7) ешюноцитами мышей Ьт!2 и лимфоциты мезентериалы&х лимфоузлов и спленоциты в/в иммунизированных реципиентов, а так асе лимфоциты регионарных лимфоузлов реципиентов, иммунизированных в п/л, извлекали на 4 сутки после иммунизации и использовали одновременно в тестах на выявление цитотоксичности и способности подавлять пролиферацию в СКЛ. В качестве стимуляторов в СКЛ использовали облученные спленоциты, а в качестве клеток-мишеней в ЦТТ - меченые 51Сг Мф перечисленных выше линий мышей. Установлено, что способность к подавлению пролиферации в СКЛ может выявляться у иммунных лимфоцитов независимо от пути введения антигена. При этом иммунные лимфоциты могли распознавать

■V*

не только донорские стимуляторы Ьт12, но и стимуляторы ВВР1. Стимуляторы Шк/2. распознавались, как правило, хуже или не распознавались совсем. Результаты для случая в/в иммунизации представлены в таблице 1 (опыты 1 и 4) и для случая иммунизации в п/л - в таблице 2 (опыты 1 и 2). В то ке время есть опыты, свидетельствующие о том, что достоверное распознавание мишеней ша/2 и 4й все же возможно при обоих способах иммунизации (см.таблицу 1, опыт 3 и таблицу 2, опыты 2, 3 и 4).

Слабая, но статистически достоверная специфическая ЦГА чаще выявлялась в популяциях лимфоцитов на 4 сутки после иммунизации в п/л (см. рис. 5 и опыты 1, 4), а в опыте 1 - и для "иммунных лимфоцитов после в/в иммунизации (см. рис 6). При этом, как и в опытах по подавлению пролиферации, распознавание мишеней Ът12 коррелировало, как правило, с распознаванием клеток Вш^ и нераспознаванием ВВА/2 (см. рис.5 и 6).

Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что

. Таблица 1.

Индексы подавления <*» 'Пролиферации Вб анти - Ьш12 в СКЛ при добавлении в нее иммунных Вб анти-Ьт12 лимфоцитов. премированных с помощью в/в иммунизации

N кони. СТИМУЛЯТОРЫ

эксп млн/мл bal 2 BDF, DBA/2 BCFj СВА 4R

1 4 4в> 32» 0 - ' - -

3 4 36» 0 0 7 37«

2 . 26» - 30« 0 11 в

4 2 33* 35" 9« - • • - -

Таблица 2.

Индексы подавления • *> пролиферации Вб аити - bal2 в СКЛ при добавлении в неб иммунных Вб.анти — Ьт12 лимфоцитов, примированных с помоиьо иммунизации я п/л

N конц.. стии/лятош

экса. млн/мл bal 2 BDFj DBA/2 BCFj CÉA 4R

i 4 92» 30* 13 - - -

2 39« 52« 0 - - -

2 4 48» 43» 21« 2Т» 9 0

3 4 30« - 9 18» 24» . 19»

4 2 38» 16 33« - - -

'Статистически достоверный уровень различия между значениями в опыте и в контроле (р<0.03».

Ьт12

BDF,

DBA/2

im

so»

«00

Рис.5. Штотоксическая активность, индуцированная иммунизацией мышей Вб облученными спленоиитзми мышей Ъа12 в п/п. На четвертые сутки после иммунизации цитотокедчееку» активность иммунных лимфоцитов определяли по выходу ' £г из меченых Иф. По оси абсцисс - доза эффекторов (х 10 I на лунку; по оси ординат - специфический цитотоксическия индекс '(*). Представлены результаты J экспериментов для случаев, когда выявлялась перекрестная реактивность на мишенях cur,.

Ыи12

BDF,

DBA/3

Рис.в. Цитотоксичесхая активность, индуцированная

иммунизацией швея В5 облученными спленоиитами мнвея Ът12 в/в. На четвертые сутки после иммунизации цитотокедческуо активность иммунных лимфоцитов определяли по выходу £г из меченых Мф. По оси абсцисс - доза эффекторов (х 10 > на лунху; по оси ординат - специфический цитотоксическия индекс (Ж).

отсутствует корреляция как. меаду выявлением супрессорной и цитотоксической активностей в популяциях иммунных лимфоцитов, так и между характером распознавания клеток Ею?, и БВА/2 и 4й в цитотоксическом и пролиферативном тестах, при условии выявления в популяции клеток как с цитотоксической, так и с супрессорной активностями одновременно. Полз енные результаты можно интерпретировать в том смысле, что клетей мышей Вв?, распознаются несколько лучше, чем клетки мышей' пва/2 независимо от используемого способа иммунизации и применяемого теста. Вероятно, как ЦТ Л, так и СТО распознают пептид, содержащий мутантную последовательность из молекулы, в контексте собственных

молекул'МНС класса I.

5. Влияние ингибиторов синтезов ДНК. РНК и белка на. дифференвдровку предшественников первичных Ш и КП.

Клетки-предшественники эффекторных первичных ЦГЛ получали из регионарных лимфатических узлов мышей й101, ВЮ.С2 или СБА после их иммунизации в п/д спленоцитами' мышей Вб (в первых двух случаях) шш В10.П2 (в последнем случае) (см.стр.6). Дальнейшую дифференцировку проводили в трехсуточной монокультуре.

Для изучения необходимости процессов транскрипции, трансляции и пролиферации при дифференцировке первичных пре-ЦТЛ в эффекторныэ ЦГЛ, ингибиторы вносили в культуру через 48 часов после начала культивирования. По окончании культивирования клетки отмывали и тестировали в ВДТ (см.рис.7). В качестве клеток-

•51

мишеней использовали меченые Сг ВД донорской и посторонних линий. Представленные данные свидетельствуют о значительном подавлении цитотоксичности под действием всех использованных ингибиторов. При этом жизнеспособность-.в популяциях клеток,

% so

к В С D

ООО тцо ШЗ 300 т но ШЗ 100 тыо

Рис.Т. Цитотсксическая активность ЭФФекторных ЦТЛ-1, генерированных & трехсуточной монокультуре из пре-ЦТЛ-1. А -без добавления ингибитора, В - Em, С - AD, D - ara-С. В качестве клеток-ыивенея использовали меченые Сг иф линии Вб. Лозы эффекторов на лунку 900, 300 и 100 (х 10 I* По оси ординат - специфический цитотохсический индекс IX». Представлены данные 3 независимых экспериментов.

%

ИИ ООО тыо ШШ 300 тыо Ш 100 ГКО

Рис.6, йитотоксическая активность КП из мезентериальных ЛУ после культивирования в однонаправленной трехсуточной культуре в присутствии клеток-стимуляторов линии Вб. А -КП из селезенки без добавления ингибитора. В - КП из мезентериальных ЛУ без добавления ингибитора, С-, С- и Е -КП из .мезентериальных ЛУ, культивируемые в присутствии £т, АИ и дга-С4 соответственно. Дозы эффекторов на лунку 900, 300 и 100 1х 10 ). По оси ординат - специфический иитотоксическии индекс (К). Представлены данные 3 независимых экспериментов.

культивируемых в присутствии любого из ингибируюиих агентов, не отличалась от контрольной. Таким образом, мохно говорить о необходимости всех синтезов в клетке вплоть до появления значительной функциональной активности.

КП получали как из селезенок, так и из назентервальнш. лимфоузлов иммунных реципиентов лингч ЯЮ1 или ВЮ.гё (см.стр.7). Дальнейшую дифференцировку в тих клеток проводили в культуре в присутствии клеток-стимуляторов донорской линии В6. Ингибитор« вносили в культуру через 48 часов после начала культивирована«. Через 20-24 часа после добавления ингибиторов клетки извлекала из культуры, отмывали и тестировали в ЦГТ. Проведенные эксперименты не выявили влияния ингибиторов на генерацию ИГА у КП (ряс.8). Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что ингибиция синтезов ДНК. РНК и белка в КП кз мезевтеряальных лимфоузлов и селезенки на заключительном этапе дафференцаровха не влияет на динамику генерации ИГА.

. вывода

1. Созревание первичных ИГЛ на заключительном этапа антиген-зависимой дифференцировки требует синтезов ДШ, РШ и белка. Формирование вторичных ИГЛ из клеток памяти происходит в условиях ингибирования указанных синтезов.

2. Способ введения антигена не является реваиотм в определении функциональной активности индуцируемых Т-лнмфодатов. Как специфическая супрессораая. так и специфическая цитотоксическая активности индуцируется при иммунизации внутривенно и в подуши» лап.

3. В мутактной системе Вб анти-Ъш12 индуцированы

эффекторные Т-лимфоциты, обладающие как специфической супрессорной, так и специфической цитотоксической'функциями. Обе функционально различные субпопуляции распознав мутантную . последовательность ьш12 из молекулы Ар в составе чужеродной молекулы Ер, то есть в измененном контексте. -

4. Взаимодействие ко-рецепторной молекулы Gd8 с лигандощ облегчает реализацию функции эффекторного ЦГЛ с низкой аффинностью Т-клэточного рецептора.

5. Связывание моноклоналышми антителами р-'цепи LPA-1 молекулы ко-сгимулируег пролиферацию а цитотоксическую активность аллоантиген-спэциХичесита ЦГЛ

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЙЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. .Kronin V., Anoßova N.. Popov I., Polesskaya A., Brondz В., KrivoBhein У. Intravenous injeotion of allogeneio oells oan prime T-lymphocytee with oytotoxio activity, Immunol.Letters, 1993,35,1,13-18.

2. Попов U.A., Брондз Б.Д., Аносова Н.Г., Кривошеив Ю.С., Кронин В.В. Влияние молекулы 1у2 на функцию аллоантиген-специфических эффекторных ЦГЛ в зависимости от вариабельности аффинитета их рецепторов, Билл, экспер. биол. и мед., 1993,115.5,492-493.

3.Попов U.A., Аносова Н.Г., Бакова A.A., БронДз Е.Д., Кривошеий Ю.С., Кронин В.В. Моноклональные антитела к р-цепи молекулы LPA-1 способствуют повышению цитотоксического индекса эФ1екторных лимфоцитов и стимулируют их пролиферацию, Бюлл. экспер. биол. и мед., 1993,115,6,639-640.

4. Попов И.А., Аносова Н.Г., Брондз Б.Д., Кривошеин Ю.С.,

Бакова А.А., Крошз В.В.- Стимуляция пролиферативной реакции иммунных сшеноцитов ыонокюнальннми антителами к р-цепи молекулы if А-1 МОЗС8Т Приводить К усилению ИХ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ, БХХДЛ. экспер. бкол. и мед., 1993,116,7.60-61.

5. Kronin V.V., Anoeova Н.О., Brondz В.П., Chemyshova A.D., Krivoehein Y.S., Popov I.A. Induotion of alloantlgen - spooifiq cytotoxio end cuppreeoor aotivitiea of lymphooytea by intravenous Immunization of mice when donor and reoipient differ in olase II IfflO rooleoule, HioroMol.J., 1993.55,5.51-55. • 6. Аносова Н.Г., Пронин B.B., Чернышева А.Д., Бровдз Б.Д., Кривошвин D.C., Попов И.А. Сравнительное изучение перекрестной реактивности Т лимфоцитов о цитотоксической а супресорной активностями, специфичных к этгашам неубранных ыолекул гистосовмастямоста класса II, Биологические мембрана, 1993,5,453-461.

7. ?opov I.A., Brondz B.D., Corelio Ь.В., Bafeova A.A., KrivoBhein V.S., Anoeova И.О., Aptikaeva 0.?. Difference in sensitivity of anti-X*1 0И. eluted from the donor and third-party oaorofago monolayers to anti-ly2 antibody, Abetraata-SprInger-Verlag of 8th International Congress of Isramology (Budapest, Hungary), 1992,p.74.

8. Anoeova И.О., Popov I.A., Oorello L.H., Brondz B.D., Krivoeheln V.S., Pedoaeyeva t. ?., BaXova A .A. The study of enti-LPA-1 antibody effect on enti-H-2Kb OTL, Ibid.,p.269.

9. Попов И.А., Аносова Н.Г., Бровдз В.Д., Горелик. Л.Н., Кривошеш Ю.С. Эффект антя-1УА-1 моноклон&яьных антител при лизисе алдаантиген-спвцифическими аффекторными Т-лимфоцитами клеток-мншеней в ЦГТ, Тезисы докладов I -съезда аллергологов и

иммунологов Азербайджана (Баку), 1992,0.15.

10. Попов И.А.,-Аносова Н.Г., Кривошеин Ю.С. ' Исследование фенотипа лимфоидных клеток с помощью моноклональшк антител к молекула LFA-1 (CD11a), Тезизи докладов к XI/республиканской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях". (Челябинск), 1992,с.47.

11. Попов И.А., Аносова Н.Г., Кривошеин Ю.С. Влияние моноклональных антител к молекуле LFA-1 (CDtla) на цитотоксичность эффекторных Т-лимфоцитов, специфичных к аллоантигену Н-2КЪ, после их обогащения адсорбцией-эладией на донорском, постороннем и реципиентном монослоях макрофагов, тамже,с.84.

12.. Popov I.A., Anosova И.О., Corelio L'.fi., Bakova A.A., Krivoshein Y.S., Kronln V.V., Pedoeeyeva E.V., Brondz B.D. Monoclonal antibodies to CD11a/CD18 molecule increase the proliferation of alloantigen-epecifio cytotoxic Г oells -in the mixed. lymphocyte culture, Abstracts International Symp. "Structure and function ol regulator peptides'.' (Moscow-YaroBlavl), 1992,p.64.

13. Брондз Б.Д., Попов H.A., Кронин B.B., Кривошеин D.C., Аносова Н.Г. Созревание иммунных клеток-пращиественников. во вторичные еффекторные циготоксические Т-лимфоциты,' Тезизы докладов III съезда гигиенистов, эпидемиологов, . микробиологов и паразитологов Респ. Молдова (Кишенев), 1992,с.23.

14. Брондз Б. Д., Попов H.A., Кривошеин D.C., Аносова Н.Г.

Различив рецепторов эффекторных цитотоксических Т-лимфоцитов и

' < ч

клеток памяти по тонкой специфичности & степени аффинитета,

тамке,с.40.

15. Brondz В., Anoeova N.. Apt Исаеva 0.,; Chervonaky A.,

\

Ivar.ov V., Kazanslcy D., Kojioh A., Iwpatov A., Moahnikov S., Popov I. Differenoa between CD8+ oytotoxio T-lymphooytee (CTL). their aeoondary preoursora (pCTI-2 memory oella) and euppreeaor T oelle (To) epeoifio to the sane 1ШС olaea I molecule in reoognizable epitopes extent of affinity and differentiation conditions, and inhibition of CTI, by tvmour-epeoifio Ts for the following prevention of immunodeficiency by mAB to the selective To membrane marker, Abstraota, Author Index and list of Participants UffiO workshop on cell^rnediated cytotoxicity (Ilan.Iaraal), 1993.P.13.

16. Аносова Н.Г., Попов И.А., Кронмн B.B., Брондз Б.Д. Влияние вктиноющина d на дафференцировку первичных и вторичных аллоантиген-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов in vitro, Тезисы докладов республиканской конференции по иммунологии (Луганск), 1993,0.18.

17. Кронин В.В., Аносова Н.Г., Федосеева Е.В. Различные функциональные активности спленоцитов, индуцируемые при внутривенной иммунизации мышей аллоантигенами, Тезисы докладов I съезда иммунологов России (Новосибирск), 1992,с.254-255.