Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности общей и местной иммунореактивности у женщин при хроническом вульвовагините кандидо-бактериальной этиологии.

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Особенности общей и местной иммунореактивности у женщин при хроническом вульвовагините кандидо-бактериальной этиологии."

На правах рукописи

РГБ ОД

1 п кол л

Учеваткина Александра Евгеньевна

Особенности общей и местной иммунореактивности у женщин при хроническом вульвовагините кандидо-бактериальной

этиологии.

03.00.24 -микология 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт - Петербург 1999

Работа выполнена в Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования МЗ Российской Федерации

доктор медицинских наук Н.В.Шабашова

кандидат медицинских наук, доцент А. К. Мирзабалаева

доктор медицинских наук, профессор В.Л. Быков

доктор медицинских наук Н.Б. Серебряная

Ведущее учревдение: Центральный научно-иследовательский кожно-венерологический институт, Москва.

Защита состоится «__»_ 1999 года в _часов на заседании

Диссертационного Совета (Д 074.16.04) при Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ (193015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, 41)

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке академии.

Автореферат разослан «___»_1999 года

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, с.н.с. A.B. Соболев

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

30*.*- О

Общая характеристика работы.

Актуальность. Воспалительные заболевания половых органов у женщин репродуктивного возраста, в том числе вульвовагиниты, занимают ведущее место в структуре гинекологической патологии и потому остаются острой проблемой (Прилепская В.Н., 1996; Назарова Е.К., 1997; Серов В.Н„ 1997). Несмотря на использование современных этиологических средств, воспалительный процесс принимает хронический характер с частыми рецидивами.

Причины, ведущие к возникновению и хронизации вульвовагинитов, окончательно не выяснены. Большинство авторов рассматривают в качестве основных причин возникновения заболевания длительный прием антибактериальных препаратов, иммуносупрессоров, дисбактериоз желудочно-кишечного тракта, нарушения гормонального статуса, различные иммунодефицитные состояния, а также несвоевременное и неадекватное лечение (Кисина В.И., 1996; Мирзабалаева А.К., 1992; Назарова Е.К., 1997). С другой стороны, снижение общей иммунореактивности, различные гормональные нарушения могут создавать условия для изменения микроэкологии влагалища, усиливая болезнетворные свойства условно-патогенных микроорганизмов, прежде всего грибов рода Candida (Быков B.JI. 1988; Краснопольский В.И., Радзинский В.Е., Буянова С.Н., 1997). Частота генитального кандидоза, возбудителем которого в 68-95% случаев является Candida albicans, в последнее 10-летие возросла почта в 2 раза (Прилепская В.Н.,1996; Серов В.Н., 1997; Nyijesy P., Seeney S.M., Grody М.Н.,1995). В структуре инфекционной патологии нижних отделов гениталий это заболевание составляет 40-45%. В то же время, в развитии хронических воспалительных заболеваний женских половых органов возросла роль и других условно-патогенных микроорганизмов: Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis (Сафронова M.M., 1991; Бондарев Н.Э., 1997; Серов В.Н., Ильенко JI.H., 1997). При развитии дисбиоза в микробных ассоциациях кроме условно-патогенных микроорганизмов часто встречаются Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Herpes virus simplex (Бурова A.A., Маликов B.E., Минаев В.И., 1997; Серов В.Н., 1997).

Изучая особенности иммунного ответа у больных хроническим вульвовагинитом различной этиологии, одни автрры обнаруживают изменения общей иммунореактивности (Матвеева Н.К., Файзулин JI.3., 1995; Глазкова Л.К., 1996), другие указывают на ее сохранение, сообщая об изменениях отдельных показателей местной защиты (Fidel P.L., LynchM.E., Sobel J.D., 1993; Бондарев Н.Э.,1997).

Именно к вопросам местной иммунореактивности при различных формах воспаления в репродуктивной системе женщины начинают обращаться многие авторы (Лебедева Т.Н., 1993; Телешева Л.Ф., Долгушин И.И., Долгушина В.Ф., 1998; Fidel P.L. Jr., Lynch М.Е., Sobel J.D., 1993). В последние 10-15 лет появились исследования местной защиты при кандидозном и некоторых бактериальных, вирусных поражениях половых путей женщин (Долгушин И.И., Долгушина В.Ф., Телешева Л.Ф.,1997; Молчанов О.Л., Кира Е.Ф., 1998). Большая часть этих работ посвящена некоторым гуморальным неспецифическим факторам, в то время как клеточные механизмы местной иммунной защиты в литературе представлены недостаточно (Телешева Л.Ф., Долгушин И.И., Долгушина В.Ф., 1998). По современным представлениям межклеточное взаимодействие, опосредованное различными цитокщами, определяет развитие иммунного ответа и противоинфекционную защиту, а также процессы регенерации тканей (Пальцев М.А., Иванов A.A., 1995; Симбирцев A.C., 1997). Однако их роль в развитии хронических вульвовагинитов, вызванных грибами рода Candida и (или) в сочетании с другими микроорганизмами, на сегодня остается мало изученной.

Цель исследования. Изучение особенностей иммунитета, способствующих развитию хронического локального воспалительного процесса генитального тракта у женщин на основе сопоставления показателей общей и местной иммунореактивности. Задачи исследования.

1. Изучить состояние общей иммунореактивности у женщин с. хроническим вульвовагинитом в зависимости от клинических особенностей: состава микробиоты влагалища, начала, течения и длительности заболевания, его стадии, наличия фоновой гинекологической и соматической патологии, тактики лечения.

2. Исследовать уровень цитокинов, синтезируемых в норме, на фоне обострения и ремиссии хронического вульвовагинита кандидозной и кандидо-бакгериальной этиологии.

3. Сопоставить изменения общей и местной иммунореактивности для уточнения основных нарушений, наиболее вероятно ведущих к хронизации процесса.

4. Обосновать возможные пути коррекции выявленных иммунных нарушений для повышения эффективности лечения хронического вульвовагинита.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Состав микробиоты половых путей женщин с обострением хронического вульвовагинита зависит от адекватности местной защитной реакции, состояния общей иммунореактивности,

взаимосвязанных с нарушениями эндокринного баланса, особенно репродуктивной системы.

2. Уровни ключевых провоспалительных цитокинов, в особенности интерферона (ИФН) и интерлейкина -1бетта (ИЛ-1р) в вагинальном содержимом больных хроническим вульвовагинитом, являются показателями адекватности местной реактивности, динамики воспалительного процесса и его прогноза, могут использоваться в качестве критериев назначения иммуномодулирующей терапии и ее эффективности.

3. В межрецидивный период у женщин с хроническим вульвовагинитом имеется тенденция к восстановлению количества основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток, но выявляется дисбаланс выработки различных цитокинов на уровне слизистой, что свидетельствует о необходимости длительной иммунореабилитации больных и, по возможности, коррекции гормональных нарушений.

Научная новизна и практическая ценность. Впервые в России подробно исследовано содержание ключевых цитокинов: общего (суммарного) интерферона, интерлейкина-1 бета, шгтерлейкина-8 и фактора некроза опухоли-альфа в вагинальных смывах у женщин, больных хроническим вульвовагинитом кандидозной и смешанной этиологии. Показано, что в зависимости от периода заболевания и состава микробиоты влагалища меняется спектр и уровень этих цитокинов. Это свидетельствует о значении адекватности ответа местных иммунных механизмов на различные микроорганизмы, обнаруживаемые в половых путях женщин для реализации полноценной защиты и воспаления. Наиболее значимым показателем состояния местной реактивности и необходимости иммунотерапии и ее эффективности при хроническом вульвовагините кандидозной и смешанной этиологии является уровень содержания суммарного ИФН и ИЛ-1(5 в вагинальных смывах, что может быть использовано в практике.

Апробация. Результаты работы доложены на семинаре П1 Международной школы иммунологов J. Humphrey (Пущино, сентябрь 1996г.); представлены на 1П Международной конференции по иммунореабилитации (Израиль, май 1997г.), на 1-й Национальной конференции РААКИ (Москва, январь 1997г.), на Юбилейной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 200-летию ВМедА в (Санкт-Петербург, ноябрь 1998г.), на 5-м Конгрессе Европейской Конфедерации Медицинской Микологии (Дрезден, июнь 1999г.).

Работа апробирована на совместном заседании Ученого Совета НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и проблемной комиссии №9 МАЛО (28.04.99r.).

Внедрение в практику. Результаты проведенного исследования, в частности, иммунологические критерии активности воспалительного процесса в женской половой сфере, иммунотерапии и ее эффективности внедрены в лекционный курс и практические занятия на циклах «Клиническая микология» и «Клиническая иммунология и аллергология» на кафедре клинической микологии, иммунологии и аллергологии Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования, а также в практическую работу клиники и консультативно-диагностического отделения НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих материалы, методы, результаты и их обсуждение, выводов, рекомендащш по внедрению в практику, списка литературы (101 отечественный источник и 44 - зарубежных). Работа изложена на 124 страницах печатного текста, иллюстрирована 23 таблицами и 3 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика больных и контрольных лиц, обследованных в ходе работы.

Для выполнения поставленных задач проведены исследования общей иммунореактивности и местной отвечаемости у 85 женщин в возрасте 1945 лет (из них 20 повторно), больных хроническим вульвовагинитом (ХВВ), находившихся на амбулаторном или стационарном лечении в НИИ Микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАЛО.' Контрольную группу составили 15 практически здоровых женщин, не страдающих хроническими заболеваниями и имеющих иммунологический статус, близкий к нормам, представленным в литературе (Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1998).

Таблица!. Общая характеристика обследованных женщин.

Группа Возраст (лет) Количество

Контроль 21-40 15

ХВВ, обострение 19-45 73

ХВВ, ремиссия ¡9-44 12

Методы исследования.

Диагноз был установлен на основании клинических данных, подтвержденных цитологическими и микробиологическими исследованиями, проведенными сотрудниками клинико-диагностической и патоморфологической лабораториями НИИ' медицинской микологии в соответствии с принятыми на кафедре клинической микологии МАЛО критериями (Аравийский P.A., Горшкова Г.И., 1995; Мирзабалаева А.К., 1996). Этот раздел работы ваполнен под руководством доцента кафедры медицинской микологии к.м.н. Мирзабалаевой А.К.

У всех обследованных женщин забирали венозную кровь из локтевой вены. Количество лейкоцитов и формулу определяли общепринятыми методами. Лимфоциты выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности (р=1,077) фиколл - урографина (Pharmacia, Швеция). Субпопуляции лимфоцитов - клетки, несущие маркеры СДЗ, СД4, СД8, СД20, СД25, СД16, подсчитывали в лимфоцитотоксическом тесте, используя моноклональные антитела (МАТ) (НПЦ "МедБиоСпеюр") и двойное флюоресцентное окрашивание.

Для оценки функциональной активности лимфоцитов использовали реакцию бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) с фитогемагглютинином (ФГА) ("Sigma") в конечной концентрации 10 и 2,5 мкг/мл и антигеном Candida albicans - фракцией белков цитоплазмы гриба, полученной в лаборатории биотехнологии НИИ медицинской микологии, в дозе ЮОмкг/мл.

Спонтанная и индуцированная зимозаном ("Sigma") реакция восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), позволяющую определил. образование супероксидного анион-радикала, была использована для оценки функционального состояния нейтрофилов (НФ).

Содержание иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови оценивали методом радиальной диффузии в агаре по Манчини с помощью наборов моноспецифических сывороток (НИИ им. Мечникова, Москва).

Специфические антитела к грибам Candida albicans в сыворотке крови определяли принятым в НИИ медицинской микологии методом иммуноферментного анализа ИФА (Игнатьева С.М. с соавт., 1988).

Вагинальные смывы (ВС) собирали орошением заднего свода влагалища 5 мл стерильного физиологического раствора. Центрифугированием лаважа отделяли надосадочную жидкость, образцы которой до момента постановки реакций хранили при -20° С (Кира Е.Ф. с соавт., 1992) .

Активность суммарного интерферона (ИФН), включающего ИФН-а и ИФН-у оценивали микрометодом по задержке цитопатического действия

вируса везикулярного стоматита, штамм Индиана в культуре человеческих фибробластов М-19 (Ершов Ф.И.,1995).

Уровни интерлейкина-1бета (HJI-lß), интерлейкина-8 (ИЛ-8) и фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-а) в ВС определяли в твердофазном иммуноферментном анализе с использованием тест-систем, разработанных в СПб НИИОЧБ (Котов А.Ю., Трофимов А.Н., Перумов Н. Д.,1993).

Результаты обрабатывали параметрическим (t-критерий Стьюдента) и непараметрическим ( критерий U) методами (Siegel, 1956). Используя коэффициент линейной корреляции (г), проводили корреляционный анализ (Гублер Е.В., 1978; Тьюки Дж„ 1981).

Результаты исследований.

Первой задачей нашего исследования явилось изучение особенностей общей и местной иммунореактивности у женщин с ХВВ в стадии обострения в зависимости от спектра микроорганизмов, выделенных из половых путей.

У женщин контрольной группы в большинстве образцов вагинального содержимого цитокины не обнаружены, за исключением двух случаев выявления ИФН (4 и 6 ME/мл), одного случая - HJI-lß (160пг/мл). Невысокая концентрация ИЛ-8 установлена в 26,7% образцов ВС (табл.5). Это не противоречит существующему мнению, что в слизистых оболочках, постоянно контактирующих с факторами внешней среды, могут присутствовать провоспалительные цигокины в невысоких концентрациях (Ершов Ф.И., 1995; Симбирцев A.C., 1997).

В первую группу больных были включены 16 женщин в возрасте от 21 до 45 лет, с диагнозом хронический кандидозный вульвовагинит, так как на момент исследования были выделены только грибы рода Candida. Средняя длительность заболевания в этой группе составила 4,4 года. Клинические особенности пациенток этой группы представлены в табл.2.

Таблица 2. Клинические особенности больных ХВВ в зависимости от этиологии.

Клинические особенности Группа (n)

K16) 2- (23) 3. (22)

Микроорганизмы, выделяемые у больных из половых путей на момент обследоса;:ия(хроме Lactobacillus): -Cándida albicans -Candida albicans + Bacteria (Staphylococcus epidermidis, Mycoplasma homnis, Gardnerella vaginalis и др.) -Chlamydia trachomatis +- Candida albicans+ Bacteria + + +

Частот встречаЕмости (%) Гормонозависитые нарушения репродуктивной системы 93,8 78,3 54,5

Хронический салъпингоофорит 18,8 26,1 13,6

Заболевания щитовидной железы 31,3 26,1 31,8

Дисбактериоз кишечника 26,7 34,8 36,4

Хроническая постгеморрагическая анемия 18,8 17,4 -

Начало ХВВ с эпизода острой инфекции 31,3 47,8 71,4

Начало латентное, первично хроническое течение на фоне гормонозависимых заболеваний 25 33,3

У больных этой группы в периферической крови было достоверно снижено относительное и абсолютное содержание СД4- и относительное -СД8-лимфоцитов (табл.3), по сравнению с контрольной группой.

Таблица 3. Субпопуляционный состав ЛФ периферической крови у больных ХВВ в зависимости от этиологии.

СубПопу- Контроль П=15 1. п—16 2. п=23 3. п=22

ляции ЛФ

% Абс. % Абс. % Абс. % Абс.

(М±т) (М±т) (М±т) (М±т) (М±т) (М±т) (М±т) (М±т)

СВЗ 62,7 1,534 57,5• ± 1,290 61,6 1,308 59,1 ± 1,46

1,31 ±0,116 3,40 ±0,167 ±2,9 ±0,131 2,10 ±0,106

СВ4 37,4 0,867 27,3 0,595 35,9 0,772 29,4 0,71

±2,72 ±0,066 ±3,66 * ±9,104 * ±3,60 ±0,130 ±2,74 * ±0,079

СВ8 20,0 0,458 14,7 0,370 ¡7,5 0,408 16,9 0,390

±1,70 ±0,046 ±1,65 * ±0,064 ±1,7 ±0,070 ±2,09 ±0,044

СВ22 17,3 0,415 16,4 0,363 19,2 0,442 16,8 0,41

±0,91 ±0,046 ±1,56 ±0,059 ±2,30 ±0,076 ±1,80 ±0,053

СВ25 15,5 0,379 13,0 0,285 15,5 0,320 13,6 0,31

±2,01 ±0,070 ±1,65 ±0,047 ±1,89 ±0,040 ±1,90 ±0,050

СВ16 14,7 0,328 11,6 0,260 13,2 0,299 10,6 0,24

±2,07 ±0,060 ±1,18 ±0,040 ±2,07 ±0,050 ±1,60 ±0,034

СВ4/ СВ8 2,00 ±0,20 1,91 ±0,189 2,28+0,32 2,57 ±0,74

Примечание: * - достоверное отличие от контроля (р<0,05)

Анализ индивидуальных данных показал уменьшение относительного и абсолютного количества хелперных и цитотоксических клеток в 75% и 37,5% случаях соответственно, ЕК - в 40% случаев (табл.4).

Таблица 4. Характеристика индивидуальных изменений содержания иммуноцитов в периферической крови у больных ХВВ в зависимости от выделяемых микроорганизмов.__

Группа(п) Частота(%) снижения абсолютных и относительных показателей по сравнению с контролем

сдз СД4 СД8 СД22 СД25 СД16

Юб) 18,8 75 37,5 31,3 43,8 40

2(23) 13 17,4 17,4 17,4 4,3 8,6

3(22) 27,3 36,4 27,3 31,8 36,4 45,5

Изменение коэффициента корреляции (0,7) между количеством СБ4-и СБ8-лимфоцитов в данной группе против -0,25 в контроле также свидетельствует о нарушении нормального распределения клеток при созревании этих двух основных субпопуляций лимфоцитов.

Спонтанная и индуцированная ФГА и антигеном гриба пролиферативная активность лимфоцитов достоверно не отличалась от контроля. Это свидетельствует о том, что. снижение количества регуляторных и эффекторных Т-лимфоцитов в периферической крови не сопровождается заметным изменением важной для иммунного ответа функции - пролиферативной. В то же время экспрессия рецепторов к ИЛ-2 на клетках была снижена в 43,8% (табл.4). Длительность заболевания была обратно пропорциональна • спонтанной и индуцированной ФГА пролиферативной активности лимфоцитов (г=-0,9). Содержание общих и специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови достоверно не отличалось от контрольных значений.

Следовательно, у больных этой группы выявлены отклонения содержания регуляторных и эффекторных лимфоцитов, что может быть следствием эндокринных и соматических заболеваний, которые с наибольшей частотой выявляли именно в этой группе (табл.2). Тем не менее, снижение числа иммунорегуляторных клеток не отражалось на их функциональной активности. Все это указывает на достаточно высокие компенсаторные возможности общей иммуиореактквности у больных этой группы.

Исследование уровней цитокинов в ВС оказалось для данной группы более информативным с точки зрения остроты воспалительного процесса и иммунного ответа. Так, среди больных этой группы, в ВС значительно чаще обнаруживали ИФН, ИЛ1-Р и ФНО-а, по сравнению с контролем и другими группами (табл.5).

Таблица 5. Частота выявления содержания цитокинов в ВС больных ХВВ в зависимости от этиологии (%).

Группа (п) ИФН ил-ip ФНО-а ИЛ-8

I (16) 68,8 64,3 42,9 50

2(23) 54,5 57,1 33,3 52,6

3 (22) 50 37,5 31,3 56,3

Контроль (15) 13,3 6,7 0 26,7

При этом уровни данных цитокинов при их выявлении были достоверно выше, по сравнению с контрольной группой (рис.1).

Следовательно, выявленные признаки воспаления (появление цитокинов, повышение их уровня) и клиническая симптоматика может указывать как на усиление патогенных свойств грибов, так и на невозможность существующей защитной реакции справиться с грибами. Причиной этого может быть изменение гормонального фона, определяющего состояние слизистых половых путей и, соответственно, усиление патогенности гриба.

3ООО ■ 2500 ■ 2000 ■

1500 -

1000 -

ВИФН(МЕ/МЛ)*100 0ФНО(пг/мл) Щ ИЛ-8(пг/мл) ВИЛ-1(пг/мл)

контроль

Рис.1 Уровень цитокинов в ВС у больных ХВВ в зависимости от состава микробиоты. * - достоверность отличия от контроля (р< 0,05), 1 * - отличие от группы I, 2* - отличие от группы II (р<0,05).'

Во вторую группу были включени 23 женщины в возрасте 19-45 лет с диагнозом кандидо-бакгериальный ХВВ. Кроме Candida albicans в

материале из половых путей были выделены Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Gardnerella vaginalis, Staphylococcus epidermidis, Micrococcus, Corynebacterium. Системный кандидоз наблюдали у одной женщины. Продолжительность заболевания в среднем по группе была 4,3 года. Клинические особенности больных также представлены в табл. 2.

В отличие от 1 группы, не выявлено достоверных изменений количественных показателей различных субпопуляций клеток периферической крови (табл.3) по сравнению с контролем. Обратная корреляционная связь обнаружена между длительностью заболевания и содержанием. ЕК (СД16). Это, вероятно, связано с тем, что ЕК в большей мере участвуют в местной защите, быстро покидают кровь и локализуются в тканях. Пролиферативная активность лимфоцитов в ответ на митоген и антиген гриба достоверно не отличалась от контрольных цифр и показателей 1 группы, хотя была очень вариабельна. Уровни иммуноглобулинов в сыворотке крови достоверно не отличались от контроля.

В этой группе, так же как и в первой, гораздо чаще в ВС выявляли указанные цитокины (табл.5) и содержание их было выше, чем в контроле (рис.1). Особенностями второй группы по сравнению с первой являются более высокий уровень ФНО-а и появление 2х пациенток с очень высоким содержанием HJI-8 в ВС (10000 и 12000 пг/мл). Кроме того оказалось, что в этой группе исследуемые цитокины, за исключением ИЛ-8, были в ВС у . несколько меньшего числа больных, по сравнению с первой группой. При этом уровень ИЛ-8 прямо коррелировал с содержанием ИФН (г=0,61) и ФНО-а (г=0,6), что может свидетельствовать о хроническом течении воспаления. Длительность заболевания обратно коррелировала с уровнем ИФН в ВС.

Таким образом, по сравнению с первой группой, у больных второй группы несколько реже (табл.2) наблюдали клинические проявления гормональных нарушений женской половой сферы, им неоднократно проводили, антибактериальное лечение (но не антимикотическое) по поводу урогенитальной инфекции,- Вероятно, все указанные факторы привели к активизации условно-патогенных бактерий и грибов. У этих пациенток высокая местная отвечаемость могла быть обеспечена активным привлечением иммуноцитов адекватно работающей общей иммуной системы. Тем не менее, данный уровень цитокинов не предотвратил переход острого процесса в хронический. Возможно, как и в первой группе, именно иммуномодупирующие свойства выделенных микроорганизмов приводят к усиленному образованию цитокинов, являющихся показателями активности воспаления.

Третья группа состояла из 22 женщин в возрасте 19-44 лет. Основным этиологическим отличием этой группы было обязательное выявление только хламидий или в сочетании с грибами рода Candida и условно-патогенными бактериями. Длительность заболевания в среднем составляла 2,5 года, что значительно меньше, чем в двух предыдущих группах.

Клинической особенностью этой группы было развитие заболевания после острого инфекционного процесса с массивной антибиотикотерапией (табл.2). Гормонозависимые нарушения репродуктивной системы в этой группе наблюдали реже, чем в двух первых.

В целом по группе установлено достоверное уменьшение относительного количества. СД4-лимфоцитов по сравнению с контролем (табл.5). Однако, по сравнению с другими группами, было значительно больше. больных со сниженным абсолютным и относительным количеством. ЕК (45,5%), а также с уменьшением содержания СД25-несупдах клеток (36,4%) (табл.4) и высокая корреляционная взаимосвязь между этими показателями (г=0,9). Специфическая пролиферативная активность в ответ на антиген гриба была ниже чем в первой группе. Не выявлено значимых отличий уровней общих и специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови по сравнению с другими группами.

В этой группе в ВС реже (за исключением ИЛ-8) встречались исследуемые цигокины (табл.5), по сравнению с предыдущими группами, но значительно чаще, чем в контроле. Уровни всех провоспалительных цитокинов были выше, чем в контроле, хотя достоверно увеличенным было только содержание ФНО-а. В то же время, концентрация ИЛ-ip в ВС была достоверно ниже, чем в 1-й и 2-й группах (рис.1). Возможной причиной такого дисбаланса местного содержания цитокинов может быть изменение функционального состояния клеток слизистой под действием хламидий или наоборот, слабость местной защиты является фактором, предрасполагающим к персистированию этих микроорганизмов.

Таким образом, во всех группах, сформированных на основании особенностей состава микробиоты, всегда выявляли дисбаланс синтеза цитокинов, но характер и степень этого дисбаланса зависели от спектра выделенных микроорганизмов. Именно эта неспособность к сбалансированной выработке провоспалительных цитокинов, по-видимому, играет значительную роль в поддержании ХВВ и обуславливает особенности состава микроорганизмов, вызывающих обострение. Но, как показано, среди больных каждой группы были пациентки, у которых цитокины не определялись, или их содержание было значительно выше, чем у других.

Поэтому следующим этапом нашей работы было определение взаимосвязи клинических особенностей ХВВ и отличий в составе

микробиоты уже в зависимости от местного содержания исследованных цитокинов. Учитывая, что интерфероны являются индукторами других провоспалительных цитокинов, тормозят прогрессирование воспалительной реакции, а также определяют способность клеток слизистых оболочек в норме продуцировать невысокие уровни ИФН, мы выбрали концентрацию ИФН в ВС в качестве показателя, который мог бы отразить разные варианты состояния местной иммунореактивности. Поэтому все больные были разделены на три группы в зависимости от содержания общего ИФН в ВС.

Первая группа включала 17 женщин больных ХВВ с уровнем ИФН в ВС >10 ME . Оказалось, что в большинстве случаев (64,7%) у больных на момент исследования выделяли грибы рода Candida изолированно, или в сочетании с другими условно-патогенными бактериями (подгруппа А), а у 6 пациенток (35,3%) - Candida albicans в сочетании с патогенными микроорганизмами (Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Herpes virus simplex) (подгруппа Б). При клиническом обследовании отмечен высокий процент гормональных нарушений репродуктивной системы (86,6%), на фоне которых в большинстве случаев и развивалось хроническое воспаление, дисбактериоз кишечника наблюдали в 23,5% случаев.

Установлено, что в данной группе чаще всего выявляли ИЛ-10 (в 69,2% случаев) и ИЛ-8 (в 55%). Уровни ИФН прямо коррелировали с содержанием ИЛ-8 (г=0,6), а ИЛ-8 - с ФНО-а (г=0,62). Анализ общей иммунореактивности показал достоверное снижение относительного количества общих Т-лимфоцитов и тенденцию к снижению СД4-, и СД8-несущих клеток. При этом было отмечено небольшое повышение функциональной активности Т-лимфоцитов (пб результатам РБТЛ на ФГА), что можно считать компенсаторным приспособлением иммунной системы в ответ на количественный, хотя и умеренный дефект иммунокомпетентных клеток.

Между подгруппами не было отличий по уровням ИФН, ИЛ-1р и ФНО-а (рис.2), но в подгруппе Б ИЛ-8 не выявлен ни в одном случае.

Рис.2 Содержание цитокинов в ВС у больных ХВВ в зависимости от уровня ИФН. * - достоверность отличия от контроля (р< 0,05)

Возможно, его недостаточность создала благоприятный фон для заражения патогенными микроорганизмами, так как данный цитокин обладает хемотаксическим и активирующим нейтрофильные лейкоциты эффектами, хотя нельзя исключить и обратной взаимосвязи. В подгруппе А относительное количество СДЗ- (53,5±5,7%) и СД4-лимфоцитов (28,4±5,6%) было достоверно ниже контроля, в подгруппе Б - абсолютное число С Д16-клеток (0,196±0,01х10б/мл) и тенденция к снижению экспрессии рецепторов к ИЛ-2 (СД25-клеток) (11,4±2,9%). Относительное и абсолютное количество СД16-лимфоцитов обратно коррелировало с длительностью заболевания для данной подгруппы (р=-0,45).

Таким образом, в группе больных с увеличенным содержанием ИФН в ВС в целом имелась тенденция к снижению некоторых количественных иммунологических параметров с компенсаторным повышением пролиферативной активности лимфоцитов и экспрессией на них рецепторов к ИЛ-2. Но в большей мере это относилось к подгруппе с выделением только грибов рода Candida или в сочетании с условно-патогенными бактериями. Из фоновых заболеваний в данной группе в 86,6% случаев имела место эндокринная патология.

Во вторую группу были включены 23 пациентки с уровнем ИФН в ВС от 4 до 9 МЕ/мл (рис.2).

Клиническими особенностями этой группы было то, что начало заболевания в 65% случаев было связано с сексуально-трансмиссивными заболеваниями, обусловленными патогенными микроорганизмами. Это почти в 2 раза чаще, чем в первой группе, и большинство больных вошли в подгруппу Б (56,5%). Значительно чаще, по сравнению с другими, у пациенток этой группы, наблюдали заболевания щитовидной железы: в 40% случаев - в подгруппе Айв 46,2% - в подгруппе Б.

Содержание ИЛ-ip, ФНО-а и ИЛ-8 в ВС в среднем по группе также было выше, чем в контрольной группе. При этом отмечено, что уровень всех исследованных цитокинов (особенно ИЛ-8) в ВС был ниже по сравнению с первой группой. Однако наличие патогенных микроорганизмов (подгруппа Б) сопровождалось повышением содержания ФНО-а, что мы отмечали в группе 3, выделенной в зависимости от состава микробиоты.

Среди показателей общей иммунореакшвности у больных этой группы установлено снижение количества СД4-, и СД25-лимфоциггов (в среднем у 45% и 45,5% женщин соответственно), и достоверное уменьшение относительного количества клеток • с маркером СД8 (13,9±1,9%) и СД16 (9,2±1,2%). При этом функциональная активность мононуклеаров в РБТЛ в основном не отличалась от контроля по средним показателям и была обратно пропорциональна длительности заболевания (г=-0,65). В обеих подгруппах отмечена высокая частота снижения относительного и абсолютного количества CD25-icieTOK: в 55,6% случаев в подгруппе А и 38,5% - в подгруппе Б. Подгруппа А отличалась достоверным снижением CD8- (13,8±2,25%) и тенденцией к снижению СБ4-лимфоцитов (29,4±4,9%),.а в подгруппе Б было достоверно снижено относительное количество СД16-лимфоцитов (7,7±1,7%).

Таким образом, в группе больных с умеренным повышением уровня ИФН в ВС отмечается менее выраженное увеличение содержания и других провоспалительных цитокинов. Изменения общей иммунореактивности проявлялись в умеренном снижении числа эффекторных лимфоцитов, что может быть обусловлено особенностями начала заболевания (острая гекитальная инфекция с выделением патогенных микроорганизмов и неоднократным применением антибактериальной терапии). Гормональные нарушения репродуктивной системы, по-видимому, не влияли на отличия групп, так как встречались с одинаковой частотой. Но во второй группе почти в два раза чаще наблюдали изменения щитовидной железы. Возможно, это также влияло на изменения общего иммунного ответа. На фоне снижения общей иммунореактивности, особенно эффекторного

звена, облегчается инфицирование патогенными микроорганизмами. В свою очередь их воздействие на клетки слизистой оболочки, синтезирующие цитокины, может истощать функциональные возможности этих клеток при длительном течении заболевания .

Третью группу составили больные с уровнем ИФН в ВС < 4 МЕ/мл. Эта группа была более многочисленной (33 женщины) и у преобладающего числа пациенток (54,5%) в микробиоте выявляли ассоциации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. В целом в анамнезе больных этой группы наиболее часто (в 76,9%) отмечено начало хронического воспаления с эпизода острой генитальной инфекции и повторные курсы антибактериальной терапии. Среди фоновых заболеваний также высок процент гормональных нарушений репродуктивной системы (68,8%) и щитовидной железы (28,1%), чаще чем в других группах (43,8%), выявлен дисбактериоз кишечника.

По сравнению с первой группой, среди этих больных была снижена частота выявления провоспалительных цитокинов в ВС, и имелась тенденция к уменьшению уровней ФНО-а и ИЛ-8 (рис.2). Отмечена высокая прямая корреляция между содержанием ИЛ-8 и ФНО-а (г=0,94). Показатели общей иммунореактивности как количественные, так и функциональные, в среднем не отличались от контроля.

Оказалось, что подгруппы А и Б 3-й группы отличались и по параметрам местного иммунитета. В подгруппе Б регистрировали невысокие показатели ИЛ-1Р, а концентрация ФНО-а была в 2 раза больше, чем в подгруппе А (рис.2). По-видимому, и здесь местная отвечаемость зависела от спектра выделяемых микроорганизмов.

Обращает на себя внимание, что в этой группе более благополучно состояние общей иммунореактивности (достоверных изменений нет) при том, что фоновые заболевания у этих пациенток были такими же, но встречались реже. А вот начало чаще, чем в первых двух группах, проявлялось в виде острой генитальной инфекции. Это подтверждает значимость местной иммунной отвечаемости, в частности синтеза провоспалительных цитокинов, как ее показателя, для возникновения, развития и прогноза ХВВ. По-видимому, отклонения числа и функциональной активности иммунокомпетентных клеток зависели от изменения состояния макроорганизма. Местная защитная реакция была достаточно выражена. Вероятно, именно адекватная местная отвечаемость предохраняет этих больных от более патогенных микроорганизмов. Но вместе с тем, как уже отмечалось, причиной повышенного синтеза всех цитокинов могли быть иммуномодулирующие эффекты грибов и их антигенов, поддерживающих повреждение тканей и хроническое воспаление.

Как видно из представленных выше результатов, больные ХВВ имеют изменения общей и местной иммунореактивности, часто на фоне дисбаланса гормонов, прежде всего половых. Поэтому мы проанализировали полученные результаты в зависимости от фоновой патологии. Наиболее четкие изменения иммунореактивности были обнаружены при таких состояниях как эндометриоз (группа I) и функциональные нарушения репродуктивной системы

(гиперменструальный синдром - группа П и гипоместруальный - группа III). Последние были определены клинически врачами-гинекологами.

Установлено, что у больных с гипоэстрогенемией, в отличие от других, было снижено содержание хелперных клеток, уровень ИФН в ВС (рис.3 ) и частота его выявления (57,1%).

1800-1 . lpg|l|l760-,2*

ШЭндметриоз(1) В Гиперменорея(И) □Гиломенорея(Ш) ■ Контроль

1600

1400-

1200 '1 Г-^*** nüSH

1000 Н'Шг80 rer.r

800 fUrIS

600 Ш Ban NtMLi

400 Ч Hüll I ■ fei168

200

ОН ИФН(МЕ/мл)*100 ИЛ-1(пг/мл)

Рис.3 Изменение содержания ИФН и ИЛ-lp в ВС у больных ХВВ в зависимости от фоновых заболеваний. *- достоверность отличия от контроля (р< 0,05), 1*- различие между группами I и II, 2*- различие между группами II и Ш (р<0,05).

У женщин с абсолютной или относительной гиперэстрогенемией количество Т-хелперов, наоборот, было выше, чем у других. При этом ИФН в ВС выявли значительно чаще (в 78,6%) и в 1/3 случаев уровень его был 20 ME и выше, что превосходило средние показатели при всех других разделениях на группы.

Анализ микробиоты показал, что при гипоэстрогенемки чаще выделяли внутриклеточные микроорганизмы (Chlamydia trachomatis, Herpes virus simplex). Уровень ИФН именно у этих пациенток был ниже, чем у остальных в этой группе. По-видимому, в данной ситуации гипоэсгрогенемия играет значительную роль в развитии ХВВ в силу указанных выше причин. В противоположность этому при гиперэстрогенемии преобладающим микроорганизмом в микробиоте был

С. albicans, а инвазия внутриклеточными паразитами наблюдалась в 2 раза реже, но именно у этих пациенток уровень ИФН тоже был низким.

Таким образом, на основании полученных результатов следует еще раз подчеркнуть известное положение о значении гормонов репродуктивной сферы и их дисбаланса в развитии ХВВ, что связано прежде всего с влиянием гормонов на состояние клеток слизистой оболочки половых путей, определяющих местную защиту слизистых от инвазии микроорганизмами, в том числе посредством выделяемых цитокинов.

В число обследованных было включено12 женщин с диагнозом ХВВ в стадии ремиссии (табл.1), у которых отсутствовали или были слабо выражены клинические признаки воспаления. При этом в большинстве случаев среди другой флоры преобладали лакгобациллы (10 - Ю^ОЕ/мл), в 2-х случаях их не обнаруживали, а в микроценозе преобладали Gardnerella vaginalis (5х 105-Ю6КОЕ/мл). Candida albicans был обнаружен во влагалище в 1-м случае, а в кишечнике - в 58% случаев.

Таблица 6. Местный уровень цитокинов у больных ХВВ в зависимости от стадии заболевания_

Группа ИФН (МЕ/мл) М мин/макс. ИЛ-1 (т/мл) М мин/макс. ФНО (пг/лш) М мин/макс. ИЛ-8 (пг/мл) М мин/макс.

Обострение п=61 10,9 4/48 389,0 70/1200 1186,2 200/4200 555,7 65/2050

Ремиссия п=12 8,7 6/14 0 2600 (*) 160 (*)

Контроль п=15 5,0 4/6 0 0 86,3 65/100

Примечание ( *)- положительное значение выявлено в 1 случае.

Как и у больных ХВВ в стадии обострения (44,3%), у 45% пациенток в стадам ремиссии не выявлен ИФН в ВС, ИЛ-1р - не обнаружен ни в одном случае, а ФНО-а и ИЛ-8 оказались довольно высокими у одной пациентки (табл.6).

Показатели общей иммунореактивности достоверно от контроля не отличались, хотя у 36 % женщин этой группы число СД4- и СД8-, у 46% -СД22-, у 55% - СД25 - лимфоцитов и у 30% - СД16-клеток было все же снижено. Величина спонтанного пролиферативного ответа лимфоцитов обратно коррелировала с длительностью вульвовагинита, что совпадает с некоторыми данными в обострении и показывает, что пролиферативная активность стабильно меняется при хронической инфекции урогенитального тракта в сторону снижения, независимо от активности воспалительного процесса в данный момент. Функциональная активность НФ в НСТ-тесте существенно не зависела от остроты процесса: в периоде

обострения показатели спонтанного НСТ-теста составили в среднем 25,6±3,9%, индуцированного - 34,2±4,0, а в периоде ремиссии -НСТсп.=23,0±3,2%, НСТ инд.=33,7±1,3%.

Выявленные показатели недостаточности общей

иммунореактивности, а также отличия в содержании провоспалительных цитокинов в ВС на фоне оставшейся соматической и эндокринной патологии объясняют невозможность полного выздоровления, предотвращения периодического инфицирования с полноценной элиминацией возбудителя и, как следствие этого, хроническое течение воспалительного процесса. По-видимому, и в периоде ремиссии больные нуждаются в иммунореабилитации.

. Суммируя вышеприведенные данные, можно сказать, что пониженный уровень ИФН в ВС чаще всего наблюдали у больных, в микробиоте которых присутствовали патогенные микроорганизмы. С этой точки зрения уровень названного цитокина в ВС может служить в определенной степени прогностическим критерием - у пациенток с низким уровнем . ИФН наиболее вероятно в дальнейшем присоединение патогенных микоорганизмов. Это положение послужило основанием для проведения больным ХВВ с низким местным уровнем ИФН иммуномодулирующей терапии. Для этой цели был выбран Виферон -препарат рекомбинантного человеческого ИНФа2а (500000МЕ) в виде ректальных суппозиториев, содержащий также витамины А и С, разработанный в НИИ и эпидемиологии и микробиологии им.Н.Н.Гамалеи, РАМН, Москва. Препарат назначали (д.м.н. Н.В.Шабашова, к.м.н. А.К.Мирзабалаева) по 2 свечи в день в течение 10 дней, после десятидневного перерыва курс повторяли (группа I). В эту группу вошли 9 больных ХВВ кандидо-бакгериальной этиологии в стадии обострения. В группу сравнения (II) включены И женщин с таким же диагнозом, которых лечили традиционно принятыми в НИИ медицинской микологии этаотропными и симптоматическими средствами.

Клинически на фоне антимикотической терапии в сочетании с Вифероном у больных I группы наблюдали субъективное улучшение, объективно - отсутствовали признаки воспаления. При микробиологическом контроле грибы не были выявлены, за исключением одного случая, когда было обнаружено небольшое колическтво (ЗхЮ1 КОЕ/'мл) невегетирующих форм. У пациенток этой группы наблюдали стойкую ремиссию на протяжении 6 месяцев. Среди больных II группы после проведенной терапии также наблюдали улучшение не только субъективно, но и по данным клинического и микробиологического обследования. Однако среди женщин этой группы лишь в одном случае

наблюдали ремиссию на протяжении 5 месяцев, остальные пациентки обращались повторно значительно раньше.

после (Б) лечения.

У больных обеих групп содержание ИФН в ВС до лечения было О МЕ/мл (рис.4), а других провоспалительных цитокинов - ИЛ-1Р и ИЛ-8, наоборот, превышало значения, полученные нами при обследовании здоровых женщин (рис.4). После лечения уровень ИФН достоверно увеличивался в группе I (5,4 ±1,5 МЕ/мл) и практически не изменялся у пациенток в группе сравнения (II) (только в одном случае выявлено повышение ИФН до 2 МЕ/мл). В то. же время, у этих женщин содержание ИЛ-1р и ИЛ-8 в ВС оставалось повышенным, что свидетельствует о сохранении воспалительного процесса, хотя клинические и микробиологические данные соответствуют ремиссии. У больных, которых лечили Вифероном, уровень других цитокинов снизился практически до нуля, что указывает на исчезновение воспалительных явлений и может быть гарантией полной ремиссии.

Таким образом, применение лечебного препарата, содержащего ИФН, приводило к повышению его уровня в ВС и одновременному исчезновению других провоспалительных цитокинов (ИЛ-1р и ИЛ-8), что свидетельствует о регуляторной роли экзогенного ИФН и его терапевтической эффективности для достижения не только клинической и микробиологической, но и иммунологической ремиссии. Учитывая полученные результаты, можно рекомендовать Виферон в качестве I иммуномодулирующего препарата при ХВВ, по крайней мере, у женщин, у

которых уровень ИФН в ВС при обострении заболевания приближается к нулю.

Выводы.

1. Хронический вульвовагинит с выделением преимущественно Candida albicans из половых путей в фазе обострения чаще сопровождается высокой, но несбалансированной локальной выработкой ключевых провоспалительных цитокинов (ИЛ-10, ФНО-а, ИФН, ИЛ-8), на фоне измененной общей иммунореактивности и дисфункции женской половой сферы.

2. Выделение из микробиоты Chlamydia trachomatis изолированно или в сочетании с Candida albicans и другими условно-патогенными микроорганизмами протекает с выраженным дисбалансом местной продукции ключевых цитокинов (снижение ИФН и ИЛ-lp при повышении уровня ФНО-а в вагинальном содержимом) и снижением числа естественных киллеров в периферической крови.

3. Уровень ИФН в ВС является наиболее значимым показателем состояния местной иммунореактивности при обострении хронического вульвовагинита, а также может рассматриваться в качестве прогностического критерия, указывающим вероятность инвазии патогенными и, особенно, внутриклеточными микроорганизмами.

4. Экзогенный рекомбинантный ИФН-а («Виферон») эффективен для терапии хронического, вульвовагинита, так как регулирует местную воспалительную реакцию, уменьшая образование других провоспалительных цитокинов.

5. Период ремиссии ХВВ разной этиологии характеризуется неполным восстановлением показателей общей иммунореактивности, баланса цитокинов в вагинальном содержимом (на фоне эндокринных и соматических нарушений), что указывает на необходимость длительного применения иммуномодулирующей терапии.

Практические рекомендации.

1 .При хроническом вульвовагините кандидозной или кандидо-бактериальной этиологии рекомендуется оценивать уровни ИФН и ИЛ-!{3 в вагинальном содержимом в качестве показателей состояния местной иммунореактивности и активности воспалительного процесса, а также прогноза и определения эффективности лечения.

2. При низких уровнях ИФН в ВС в комплекс терапии ХВВ рационально включать иммуномодулирующие средства типа «Виферон» с

целью коррекции местной иммунореактивности независимо от стадии заболевания (обострение или ремиссия).

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Шабашова Н.В., Фролова Е.В., Учеваткина А.Е., Ариенко Р.Ю. Клинико-иммунологическое обоснование иммуномодулирующей терапии хронических вульвовагинитов. // Сборник научных трудов научно-практической конференции «Новые перспективы применения препаратов интерферона в педиатрии и гинекологии».-СПб,-1997.-С.54-55.

2. Шабашова Н.В., Мирзабалаева А.К, Фролова Е.В., Учеваткина А.Е. Местный синтез цитокинов и общие иммунные показатели при хроническом вульвовагините. // Сборник трудов I Национальной конференции РААКИ.-М.-1997.-С. 351.

3. Шабашова Н.В., Мирзабалаева А.К, Фролова Е.В., Учеваткина А.Е. Общая иммунореактивность и местный синтез цитокинов при хроническом кандидозном вульвовагините. // Тезисы докладов IE Международного конгресса по иммунореабилитации и реабилитации в медицине".-Израиль,-1997.-С165.

4. Учеваткина А.Е. Оценка показателей общего и местного иммунитета у больных хроническим кандидо-бактериальным вульвовагинитом. // Тезисы докладов Юбилейной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 200-летию Военно-медицинской академии.-СПб.-1998,-С.130.

5. Учеваткина А.Е., Шабашова Н.В., Мирзабалаева А.К, Фролова Е.В. Сравнительный анализ общей и местной иммунореактивности у больных хроническим вульвовагинитом смешанной этиологии. // ЖМЭИ.-1998,-№6.-С.21-24.

6. Shabashova N.V., Frolova E.V!, Mirzabalaeva A.K., Uchevatkina А.Е. Proinflammatory cytokine expression in vaginal fluid in women with reccurent vulvovaginitis caused by Candida albicans and Candida-bacterial agents. // 5th Congress of the European Confederation of Medical Mycology and 33. Tagung der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft. -Drezden.- 1999.

7. Учеваткина A.E., Шабашова Н.В., Мирзабалаева А.К, Фролова Е.В. Общая и местная иммунореактивность при хроническом вульвовагините кандидо-бактериальной этиологии. // Проблемы медицинской микологии.-1999.-№2.-С.40-44.