Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности низкопороговых кальциевых каналов нейронов сенсомоторной и зрительной коры мозга в период раннего онтогенеза

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности низкопороговых кальциевых каналов нейронов сенсомоторной и зрительной коры мозга в период раннего онтогенеза"

Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

Ісаєв Дмитро Сергійович ' ‘ УДК 612.822

- 5 />Гі? ®

Властивості низькопорогових кальцієвих каналів нейронів сенсомоторної та зорової кори мозку щура під час ранього

онтогенезу

03.00.13 - фізіологія людини та тварин

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ-1998 р.

Дисертацією е рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України

Науковий керівник

Доктор біологічних наук, проф., академік НАНУ Костюк Платон Григорович Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАНУ, директор

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, проф., зав. відділом фізіології головного мозку інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України В. М. Сторожук

Кандидат біологічних наук, вчений секретар Міжнародного центру молекулярної фізіології Федулова Світлана Анатоліївна

Провідна установа

Кафедра фізіології людини та тварин Національного Університету ім. Г. Г. Шевченка

спеціалізованої вченої ради Д-01.І3.01 при інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту фізіології ім. О. О. Богомольця, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

о І Ч годині на засіданні

Автореферат розісланий “ /О ” _1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

/Г\ доктор біологічних наук [] —'-3.0. Сорокіна-Маріна

ВСТУП Актуальність проблеми

Дослідженнями останніх десятирічч в галузі нейрофізіології електрозбудливих мембран, встановлено, що потенціал-керовані кальцієві канапи грають виключно важливу роль в регуляції та взаємозв’язку різних клітинних функцій. Саме цим пояснюється той великий інтерес, який вони викликають до себе. Загальновизнано, що потенціал-керовані кальцієві канали клітин різних тканин поряд з загальними властивостями мають і ряд суттєвих особливостей. Також показано, що навіть у межах одного об’єкту кальцієва провідність не гомогенна, а базується на активності декількох типів потенціал-керованих кальцієвих каналів (Веселовский Н.С., Федулова С.А 1983). Ці типи каналів характеризуються різною потенціалзалежністю, кінетикою та фармакологічною чутливістю. Фізіологічна роль такого різноманіття ще не до кінця виявлена. Ця обставина, поряд з найважливішою роллю самих іонів кальцію у життєдіяльності клітини, обумовлює необхідність ретельного дослідження загальних та особливих властивостей різних типів кальцієвих каналів та пошуку засобів вибіркового фармакологічного впливу на них.

Серед кальцієвих каналів особливе місце займають низькопорогові (НЛ) канали. Вперше НП Са2+ струм вдалось відділити від високопорогового кальцієвого струму при аналізі вольтамперних характеристик кальцієвого струму на нейронах спино-мозкових гангліїв (Веселовский Н.С., Федулова С.А 1983). Згодом низькопороговий кальцієвий струм виявився і на других структурах (Carbone Е., Lux H.D 1984), але дані про його властивості та про період появлення та зникнення у процесі онтогенезу до цих пір є суперечливими. Незважаючи на те, що наявність цих каналів виявлено порівняно давно, їх осі субодиниця до цих пір не виділена. НП кальцієві канали відрізняються від ВП кальцієвих каналів більш швидкою інактивацією, більшою метаболічною стабільністю і потенціалом активації, зсунутим в гіпервід’ємну область. Ці канали виявляються тільки в нейронах деяких структур мозку, але навіть в тих структурах, в яких вони присутні, іноді їх вдається зареєструвати тільки в певний період онтогенезу. До останнього часу лишається нез’ясованим питання про фармакологічну чутливість НБ кальцієвих каналів, особливо їх чутливості до дигідропіридінів; так, одні автори стверджують, що НП кальцієві канали чутливі до дигідропіридінів, інші ж не виявляють цієї властивості. В своєму дослідженні Тарасенко та ін. на ядрі ЛД таламусу показали одночасну наявність на мембрані нейронів двох типів НП кальцієвих каналів; при цьому один з них був чутливий до ніфедіпіну, а інший до Ni2+. Автори роблять висновок про те, що існує декілька типів НП каналів.

Загальноприйнято, що НП канали беруть участь в генерації ритмічної активності

відповідних нейронів і припускається, що ці канали грають велику роль в деяких патологічних процесах в нейронах мозку.

Найменш вивченими є характеристики НП кальцієвих каналів в найбільш великій і складній структурі мозку - корі великих півкуль. Тому це питання і було поставлене в цій роботі.

Мета дослідження

Визначити властивості низькопорогових Са2+ каналів у нейронах зорової та сенсомоторної кори.

Завдання дослідження

1. Визначити тип(и) НП Са2+ каналів, присутніх у нейронах зорової та сенсомоторної кори.

2. Прослідкувати зміни властивостей НП Са2+ струмів у нейронах зорової та сенсомоторної кори в процесі ранього онтогенезу.

3. Порівняти властивості НП Са2+ каналів у нейронах зорової та сенсомоторної кори.

Наукова новизна роботи

Виявлено, що нейрони зорової кори мозку щурів експресують НП Са2+ канали тільки протягом дуже короткого часу раннього онтогенезу. Показано, що нейрони сенсомоторної кори експресують декілька типів НП Са2* каналів

Теоритичне та практичне значення роботи

Описані явища безпосередньо відображають роботу механізмів клітинного диференціювання і функціональної інтеграції нервових клітин в роботу вищих від ділів ЦНС. Даний напрямок досліджень може привести до розуміння механізмів, що приводять до нейрональної специфікації. На нейронах досліджених зон нової кори виявлені як НП Са2+ канали, чутливі до дигідропіридінів, так і нечутливі до цієї групи речовин. Подальші дослідження чутливості НП Са2+ каналів до фармакологічних речовин може привести до виявлення лікарських препаратів, що вибірково впливають на функцію певної групи нейронів.

Особистий внесок

Експерименти по дослідженню властивостей НП Са2+ каналів у ейронах сенсомоторної кори та експерименти по визначенню фармакологічної чутливості НП Са2+ каналів нейронів зорової кори були виконані автором особисто. Експерименти по визначенню змин властивостей НП Са2+ струмів нейронів зорової кори у процесі ранього

онтогенезу проводились разом з к. б. н. Тарасенко А. Н. У розробці концепції роботи активну участь приймали інші співавтори друкованих робот.

Апробація роботи

Основні положення роботи викладались і обговорювались на ХХХІІІ-му Міжнародному Конгресі фізіологічних наук (Санкт-Петербург, 1997), International Workshop «Intracellular signaling» (Kiev 1997), 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (San Francisco 1997), Meeting of The British Physiological Society (Cambridge, 1997). 3a матеріалами дисертації опубліковано 3 статті у міжнародних журналах.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ Об’єкт дослідження

Експерименти були проведені на нейронах зорової (ЗК) та сенсомоторної (CM) кори щурів in situ (на зрізах).У цьому випадку клітини зберігають своє природне оточення та мінімально пошкоджуються механічно. Ферментативна обробка у експерименті не використовувалась. Зони були ідентифіковані у відповідності зі стереотаксичним атласом мозку гцурів (Paxinos G., Watson С. 1944). Для спостережень поверхні зрізу та визначення шарів кори використовувався об’єктив 3.2х Semiplan, встановлений у неінвертований мікроскоп (Ergoval, Carl Zeiss). Ідентифікація типу клітин кори проводилась при використанні об’ктиву х20 Leitz Wetzlar.

Для досліду брали щурів чотирьох вікових груп: 2-х, 3-х, 12-и та 17-и діб від народження (день народження-Р).

Після декапітації щурів, мозок швидко виймався та переносився на 3-4 хвилини у холодний (4°С) фізіологічний розчин, склад якого вказаний нижче. Потім мозок розділяли на дві півкулі, одну з яких нарізали в сагітальній площині на зрізи при використані вібратому. Одержані зрізи товщиною 300 мкм переносили в розчин, який містив (у мМ): . NaCl 125, КС1 2.5, СаСЬ 2, MgCb 1, NaHC03 24, NaH2P04 1.25, глюкоза 25, феноловий червоний 10'3; pH розчину був 7,4 при оксигенуванні карбогеном (95% 02 та 5% СОг). Після інкубації впродовж однієї години при температурі 32°С та потім двух годин при кімнатній температурі (біля 22°С) один із зрізів переносився до камери для проведення вимірювання.

Реєстрація та обробка результатів

Трансмембранні струми вимірювались у режимі фіксації мембранного потепціалу -методика patch-clamp в конфігурації «ціла клітина» (Hamill О.Р. et. аі. 1981). Скляні мікропіпетки вироблялись із легкоплавких капілярів діаметром 1,8 мм. Для виділення кальцієвих струмів використовувався безнатрієвий розчин (NaO) який містив Choline-Cl (у

мМ): 113, ТЕА-С127, CaCh 2, MgCh 0.5, Tris-Cl 20; pH доводився до 7,4 додаванням Tris-OH. Крім того, у розчин додавався тетродотоксин (ТТХ) у концентрації 1 мкМ, що дозволяло повністю заблокувати потенціал-керовані кальцієві канали; для подавления калієвих струмів використовувався розчин який містив (у мМ): CsCl 130, MgCb 5, ТЕА-С1 10, СаСЬ 1, EGTA 10, TrisCl 10; pH доводився до 7,3 додавшим CsOH. З метою блокади високопорогових кальцієвих струмів у внутріклітинний розчин додавались 5 мкМ F'. Для дослідження фармокологічних властивостей кальцієвих каналів використовувались такі речовини: нифедіпін, розчинений у етіловому спирті, CdCl2, №СІ2, етосукцимід, мібефраділ, які додавались у безнатрієвий розчин у концентраціях, вказаних в результатах та аплікувались при використанні мікропіпетки з діаметром 40-50 мкм під тиском.

Аплікуюча та петч-піпетка розташовувались безпосередньо над сомою досліджуваного нейрона. Оскільки діаметр кінчика аплікуючої піпетки (40-50 мкм) в декілька разів перевищував розміри соми нейрона (5-15 мкм), а доданий в розчин ТТх у концентрації 1 мкм блокував ТТХ-чутяивий Na+ струм за час меньш ніж 1 с, можна допустити, що концентрація речовин, що аплікуються біля поверхні мембрани збігалась з концентрацією речовини на кінчику піпетки.

Реєстрація струмів проводилась при використанні аналового підсилювача РОК-ЗМ. Усі отримані данні записувались на жорсткий диск та оброблялись спеціальними програмами. Обчислювання параметрів струмів проводилось програмою Datasel, з наступною математичною обробкою даних та побудуванням малюнків- Sigma Plot.

Реєстрація струмів на нейронах кори проводилась при кімнатній температурі, використовувалась методика patch-clamp у конфігурації «ціла клітина» (Hamill О.Р. et. аі. 1981). Внутрішній діаметр кінчика піпетки підбирався відповідно зі ступенем постнатального розвитку та типом клітини, обраної для реєстрації. Звичайно внутрішній диаметр кінчика піпетки становив від 3 до 6 МОм для Р2, РЗ коркових нейронів та від 2 до 4 МОм для Р12 та Р17 нейронів.

Пасивні електрині властивості нейронів кори різного віку визначались шляхом аналізу ємнісних викидів струму та струму витоку під час створення контакту між піпеткою та клітиною до та після прориву мембрани. Струм витоку компенсувався апаратно та контролювався впродовж всього експерименту. Ємність реєструючої піпетки (Ср) та ємність «цілої клітини» оцінювались по ємнісним викидам струму у відповідь на гіперполярізуюче зміщення -10 мВ від підгримуємого потенціалу (Vh) -90мВ. Для подальшого аналізу брались тільки ті клітини, в яких спад ємнісного транзієнту «цілої клітини» міг бути апроксимований однією експонентою, у цьому випадку клітина могла бути розглянута як ізопотенціальний об’єкт (Kay A.R., Wong R.K.S. 1987). Ємність клітинної мембрани (Ст) визначалась шляхом

віднімання Ср від ємності «цілої клітини».

Значення послідовного опору (Rs) визначалось двома шляхами: використанням константи часу (т) ємнісного транзієнту, залисанного після прориву клітинної мембрани (Rs = т/Cm), та шляхом ділення амплітуди ємнісних струмів на зміну напруги, що подавалась. Клітини, у яких падіння напруги, визначене значенням послідовного опіру та амплітуди низькопорогового струму, було більш ніж б мВ, у ході подальшого аналізу не розглядались. У подальшу обробку брались тільки ті клітини, потенціал-керована активація струмів яких не мала перегинів.

В експерименті застосовувалось 2 протоколи. У випадку, коли клітина стабільно витримувала напругу -95 мВ як підримуючу, Са2+ струми отримувались шляхом подання зростаючих деполярізаційних імпульсів. У випадку коли клітина не витримувала такої напруги, що визначалось як поява характерних завад, збільшення витоку та зміщення базової лінії, підтримувалась напруга від -60 до -50 мВ та подавався 250 мс імпульс до -95 мВ для активування НП Са2+ каналів. Для стабілізації мембраних струмів, реєстрації проводились через 5 хв після прориву клітинної мембрани. Амплітуда струму одержувалась як різниця між піковим значенням струму та нульовою лінією. Криві струмів були апроксимовані за моделлю Ходжкіна-Хакслі при використанні методів описаних раніше (Coulter D.A., Huguenard J.R., Prince D.A. 1990). Реєстрації амплітуди струмів, а також постійні часу активації та інактивації, приведені у роботі, отримані при значеннях напруги, що відповідають значенням напруги на максимумі вольт-амперних характеристик. Отримані результати представленні у одиницях ± с.с.п. (середня статистична помилка).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для вивчення змін експресії НП Са2+ каналів на нейронах зорової та сенсомоторної кори проводилось чотири серії експериментів на зрізах мозку 2-х, 3-х, 12-ти та 17-ти денних щурів.

Пасивні властивості кортикальних нейронів

Представлені результати отримані на пірамідних та непірамідних нейронах різних шарів.

Ємність мембрани нейронів 5-6 шару кори зростала з віком. Ємність Р2 нейронів як для зорової, так і для сенсомоторної кори становила 20-30 пФ. У РЗ нейронів ємність зростала до 30-40 пФ. Р12 нейрони ЗК глибоких шарів по ємності клітинної мембрани можна було поділити на дві групи: у одній 70-90 пФ, у другій 40-45 пФ.

У нейронах 2-го шару ЗК ми не знайшли достовірної різниці в ємності клітинної мембрани у процесі постнатального розвитку. Значення ємності мембрани коливалось від 40

до 60 пФ незалежно від віку щурів. Нейрони СМ кори Р17 за ємністю мембрани також можна було достовірно поділити на дві групи: одна від 55 до 75 пФ, друга- від 110 до 130 пФ. Популяція нейронів 2-го шару СМ кори Р17 була гомогена по ємності мембрани; ємність становила від 75 до 90 пФ.

Зміна властивостей НП Са2+ струмів нейронів зорової кори у процесі постнатального

розвитку

Са2+ струм, що швидко інактивується у Р2 нейронах, викликався деполяризацією до -55 мВ від утримуємого потенціалу -95 мВ. Са2+ струм, що не інактивується, виявлявся при деполяризації більш позитивній ніж -40мВ, але його амплітуда була значно менша ніж у струму, що інактивується. На вольт-амперній характеристиці можна побачити присутність двох типів вхідного Са2+ струму на —45мВ та -15мВ (мая. 1).

Мал. 1. Низькопороговий Са2+ струм у нйронах зорової кори на другий день після народження. А. Реєстрація струму. В. Вольт-амперна характеристика вхідного Са2+ струму.

Мал. 2. Са + струм у нейронах зорової кори 12-и дених щурів. А. Реєстрація струму в присутності іонів ї~. В. Вольт-амперна характеристика Са2+ струму в контролі та в присутності іонів ї".

На РЗ нейронах ЗК 5 та 6 шарів спостерігався високопороговий Са2+ струм з амплітудою значно більшою ніж амплітуда Са2+ струму, що інактивується. Слід відмітити, що амлітуда НП Са2+ струму нейронів РЗ була значно менша, ніж амплітуда НП Са2+ струму у нейронів Р2. Вольт-амперна характеристика мала два характерних максимуми Са2+ струму при -55 мВ та -15 мВ.

На Р12 нейронах нам не вдалось виявити Са2+ струм в межах від -75 до -45 мВ. Крива мала один пік на -15 мВ. Це показує, що на Р12 нейронах присутній лише ВП Са2+ струм. Щоб підтвердити цей висновок, у внутрішньоклітинний розчин було додано 5 мкМ Тпя-Р для блокади ВП Са2+ струму. На представленій вольт-амперній характеристиці можна

А

побачити лише один пік Са2+ струму на -15 мВ (мал. 2).

Нам не вдалося знайти НП Са2+ струми на нейронах середніх шарів зорової кори ні на другий, ні на 12-й день постнатального розвитку щурів. Зміни у процесі розвитку, що спостерігаються на нейронах глибинних шарів зорової кори, були ідентичні до змін, що мали місце на нейронах поверхневого шару.

Фармакологічні властивості нейронів другого та глибинних шарів зорової кори

Як було показано раніше (Tarasenko A.N. et al. 1997), нейрони латеродорсального (ЛД) ядра таламусу експресували два типи НП Са2+ каналів. Один тип був чутливий до ніфедіпіну, а другий до нікелю. У теперішньому дослідженні ми знайшли (мал. 3), що НП Са2+ канали зорової кори були чутливі до ніфедіпіну (100 мкМ). Після аплікації нікелю (NiCb, 100 мкМ) амплітуда НП Са2+ струму не змінювалась як на нейронах поверхневого так і глибинних шарів.

Зміни властивостей НП Са2+ струмів нейронів сенсомоторної кори у процесі онтогенезу

На нейронах Р2 CM кори викликався Са2+ струм, що швидко інактивуєеься після деполярізації до -50 мВ від підтримуємої напруги -95 мВ. Са2+ струм, що не інактивується, викликався від напруги більш розитивної ніж -40 мВ. На вольт-амперній характеристиці видно два піки Са2+ струму на -50 мВ та -15 мВ. Середня амплітуда струму, що швидко інактивується, була 37.5±5 пА. Статистично достовірно нейрони глибоких шарів можна було поділити на дві групи по постійній часу інактивації НП Са2+ струму: 25±5 мс та 59±7 мс.

На Р17 нейронах глибоких шарів CM кори виявлявся добре виражений Са2+ струм з максимумом біля -15 мВ. Нейрони глибинних шарів CM кори можна було поділити на дві групи по значенню електричної ємності мембрани: перша група - 40-5-45 пФ, та друга група -

70-^90 пФ. Аналіз кінетики інактивації НП струмів у нейронів груп 1 та 2 показав, що у

клітин групи 1 постійна часу інактивації складала 36±3 мс (мал. 4) та у клітин групи 2 - 65+3 мс (мал. 5).

Для більш повного уявлення про властивості НП Са2+ каналів у нейронах глибоких

л

Р2

-SO mV ..............._............

-OS mV----------------------1 І—------------

В

100 та

2» V «» -■

Мал. 3. Дія ніфедіпіну на НП Са2+ струм у нейронах зорової корп. А. Реєстрація струму в контролю та після аплікації ніфедіпіпу. В. Ніфедіпін-чутлива компонента отримана, як різниця між струмом у контролі та після блоку ніфедіпіну. Апроксимація проводилась за моделлю Ходжкіна-Хакслі. Постійна часу інактивації дорівнює 28 мс.

-50 -95 -

А

-бо .

V, mV -60 -40 -20 0

500 рА|

боа

100 рА 1 Ґ" " ’

-BOO І. рА

Мал. 4. НП Са струм у нейронах першої групи глибоких шарів сенсомоторної кори. А. Реєстрація струму. Апроксимація проводилась за моделлю Ходжкіна-Хакслі. Постійна часу інактивації складала 36 мс. В. Вольт-амперна характеристика Саї+ струму.

Мал. 5. НП Са струм у нейронах другої групи глибоких шарів сенсомоторної кори. А. Реєстрація струму. В. Постійна часу інактивації складала 62 мс. ост показує різницю між струмом та апроксимуючою кривою. С. Вольт-амперна характеристика Са2+ струму.

CM кори були проведені фармакологічні тести.

Фармакологічні властивості НП Са2+ каналів нейронів глибинних шарів CM кори

Як і на нейронах зорової кори, ми намагались визначити, який тип НП Са2+ каналів експресується в нейронах глибоких шарів CM кори відповідно розподілу, описаному раніше (Tarasenko A.N. et. al 1997). Було встановлено (мал. 6А), що НП канали групи 1 блокуються ніфедіпіном (100 мкМ блокувало 8б±5 % НП струму). Крім того, НП струм нейронів групи 1 блокувався кадмієм (CdCb 10 мкМ, 89+4 %, мал. 6В) та не блокувався нікелем (№С12 100 а мкМ).

-50 mV “S3 шУ -

500 рА

Мал. 6. Фармакологічні властивості НП Са * струмів у нейронах першої групи глибоких шарів сенсомоторної (СМ) кори. А. Блокуючий ефект ніфедіпіну. Б. Дія іонів С(І2+ на НП Са2- струм.

Cd

/

НП Са + канали нейронів групи 2 блокувались нікелем (№С12 100 мкМ 68±7 % струму, мал. 7) та не гоо № .блокувались ніфедіпіном (100 мкМ) та кадмієм (С<ЮІ2 ~~ 10 мкМ). Судячи по описаним властивостям, цей тип

каналів може бути віднесений до «повільних» каналів, а

-50 тУ -100 тУ

1

Мал. 7. Блокуючий ефект іонів №2+ на НП Са2+ струм у нейронах другої групи СМ кори.

НП Са2+ канали групи 1 - до «швидких» каналів, виявлених раніше на нейронах ЛД ядра таламусу (Тагазепко еі аі., 1997). НП Са2+ канали обох груп були нечутливі до етосукциміду (100 мкМ).

Властивості НП Са + каналів у нейронах поверхневого шару СМ кори

На Р2 нейронах другого шару СМ кори був виявлен НП Са2+ струм у відповідь на деполярізуючий імпульс до -50 мВ від утримуємо! напруги - 95 мВ (мал. 8). Середня ампітуда цього струму складала 37±5 пА, постійна часу інактивації - 192±18 мс. На нейронах Р17 другого шару виявлявся НП струм з максимумом біля -50 мВ та амплітудою 123+4 пА. Значення постійної часу інактивації НП Са2+ каналів нейронів другого шару СМ кори було значно більшим, ніж значення постійної часу інактивації НП Са2+ струмів у будь-якій з груп нейронів глибиннихких шарів.

Фармакологічпі властивості НП Са2+ каналів нейронів другого шару СМ корп

НП Са2+ канали нейронів другого щару СМ кори не були чутливі до ніфедіпіну (100 мкМ) та до ікелю (100 мкМ), що не дозволяє віднести цей тип каналів ні до «швидких», ні до

ОСТ

\

100 рА

г * 209 те

А

-55 ш\’ -105 тУ

100 рА

- V, тУ

-60 -40 -20 0

\

N1

./-200 -400 -Є00 1, рА

Мал. 8. НП Са2+ струм у нейронах поверхневого шару СМ кори. А. Реєстрація струму. В. Апроксимація струму за моделлю Ходжкіна-Хакслі. С. Вольт-амперпа характеристика Са2+ струму.

•Д.

200 рАІ

МіЬ

и

к

Мал. 9. Блокуюча дія мібефраділу на НП Са2+ струм у нейронах поверхневого шару СМ кори.

А

«повільних» (Tarasenko et al., 1997). Аплікація CdCh (10 мкМ) та етосукциміду (100 мкМ) не змінювала амплітуди реєструємого струму. Досліджений струм виявився чутливим до мібефраділу (мал. 9). У концентрації 100 мкМ ця речовина блокувала струм на 37+5 %.

ОБГОВОРЕННЯ

Раніше було показано на ряді нсрвних структур, що щільність Нп Са2+ каналів у значній мірі залежить від ступеня постнатального розвитку. На нейронах DRG щурів було показано, що за 7 діб до народження щільність НП Са2+ каналів дуже низька та доходить до максимуму відразу після народження (Fedulova et al., 1994). З іншого боку, ні в одному DRG нейроні дорослих щурів не було знайдено активних НП каналів. В пірамідних нейронах гіпокампу щурів НП Са2+ струми реєструвались тільки в незрілих клітинах, та були відсутні у нейронах, виділених з мозку дорослих щурів. Як показано у нашій роботі, НП Са2+ канали експресуються лише впродовж короткого терміну ранньої стадії постнатального розвитку у нейронах глибинних та поверхневого шару зорової кори. Щільність ВП каналів у цей період набагато нижча, ніж щільність НП каналів. Вірогідно, що НП Са2+ канали на ранній стадії розвитку є основними воротами для входу Са2+ у клітину. Цікаво, що ці канали по своїх кінетичним та фармакологічним властивостям аналогічні раніше описаним «швидким» НП Са2+ каналам у нейронів ЛД ядра таламусу щурів. Можливо, що в обох випадках канали виконують одну і ту ж функцію нейрональної диференціації та утворення синаптичних контактів. Але на протележність ситуації на таламічних нейронах, на нейронах зорової кори щільність НП каналів на третій день постнатального розвитку суттєво знижується на відміну від щільності ВП каналів. На нейронах зорової кори 12-и дених щурів ми не знайшли НП Са2+ струму; на нейронах таламусу «швидка» компонента НП Са2+ струму у цей період була добре виявлена. Можна допустити, що процеси утворення контактів та нейронального диференціювання, що визначаються діяльністю НП Са2+ каналів, займають більш короткий термін на нейронах зорової кори, ніж на нейронах таламусу. Як було показано раніше, тільки на пірамідних нейронах викликались НП Са2+ спайки; дослідження проводились на нейронах 2-3 та 5-6 шарів 2-3 дених щурів фронтального кори морської свинки (De la Pena et al., 1996). Це може означати, що нейрони середніх шарів диференці юються дуже рано та досягають зрілості ще до народження.

У зв’язку з вищевикладеними припущеннями, цікаво прослідкувати постнатальні зміни у властивостях НП Са2+ струмів на CM корі. На другий день після народження у глибоких шарах CM кори щурів можна виявити як НП Са2+ струм з такою ж амплітудою та постійною часу інактивації, як у НП Са2+ струму на зоровій корі, так і другий струм, що суттєво відрізняється по кінетичним та фармакологічним характеристикам від вищезгаданого.

Характерно, що у першому випадку струм по своїм фармакологічним властивостям, а саме по чутливості до дігідропіридінов, не відрізняється від НП Са2+ струму у зоровій корі та «швидкої» компоненти ЛД ядра таламусу. У другій же популяції клітин струм нагадує повільну компоненту НП струму нейронів ЛД ядра таламусу (Tarasenko et al., 1997).

У нашій роботі ми знайшли три підтипи НП Са2+ каналів у клітинах різних областей кори, що дозволило досить чітко порівшгги їх властивості. Цікаво, що нейрони неокортексу мають різні властивості у залежності від їх розташування не тільки у різних зонах кори, але й в її різних шарах. Так, у дослідженні показано, що властивості НП Са2+ каналів нейронів другого та глибинних шарів зорової кори не відрізняються, а властивості НП Са2+ каналів нейронів поверхневого та глибоких шарів CM кори мають дуже велику різницю. Цей факт дає можливість допустити, що різні області кори відрізняються не тільки за своїми специфічними зв’язками, але й за властивостями самих клітин. Таке явище, як експресія різних НП Са2+ каналів та різні часові характеристики експресії, можуть привести до суттєвих розбіжностей у функціюванні клітин та структур, в які вони входять.

Все вищезгадане показує, що вивчення НП Са2+ каналів на різних об’єктах може забезпечити прогрес у розумінні механізмів ритмічної активності, процесів, які мають місце при постнатальному розвитку, та механізмів, що регулюють клітинну диференціацію, а також дослідити причини виникнення деяких захворювань, вірогідно пов’язаних з порушенням експерсії НП Са2+ каналів.

ВИСНОВКИ

1. На сагітальних зрізах зорової та сенсомоторної кори головного мозку щурів визначені особливості експресії різних типів Са2+ каналів у нейронах різних шарів у залежності від ступеня постнатального розвитку тварин.

2. Встановлено, що на нейронах зорової кори дводених щурів в поверхневих та глибинних шарах присутні ніфедіпін-чутлилий НП Са2+ струм зі середньою амплітудою 25±3 пА та постійною часу інактивації 30+2 мс. Цей струм зникає у нейронах 12-и дених щурів.

3. У нейронах 4-го шару зорової кори не було зареєстровано НП Са2+ струмів.

4. Нейрони поверхніх та глибоких шарів сенсомоторної кори експресують НП Са2+ канали . аж до 17-го дня постнатального розвитку.

5. За фармакологічними та кінетичними властивостями НП Са2+ каналів нейрони шостого шару сенсомоторної кори можуть бути поділені на дві групи. В однієї групи нейронів цього шару НП Са2+ канали за своїми властивостями аналогічні НП Са2+ каналам нейронів зорової кори. У другій групі нейронів шостого шару НП Са2+ струми не чутливі до ніфедіпіну у концентрації 100 мкМ та блокуються іонами Ni2+ (NiCh) у концентрацій'

25 мкМ. Постійна часу інактивації цих струмів складала 60 мс.

6. У нейронах 2-го шару сенсомоторної кори зареєстрований НП Са2+ струм, нечутливий до використаних у наших експериментах блокаторів (ніфедіпін, NiCb, CdCh). Постійна часу інактивації цього струму складала 160±8 мс.

7. Одержані результати показують, що НП Са2+ канали функціонально необхідні для визначеного терміну онтогенетичної диференціації коркових нейронів. Цей терімін охоплює перші два тижні постнатального розвитку у нейронів поверхневих та глибинних шарів зорової кори та є більш тривалим у частини нейронів сенсомоторної кори, у яких НП Са2+ канали характеризуються особливою фармакологічною чутливістю. Ці дані можуть бути корисними для з’ясування специфічних фармакологічних впливів на Са2+-залежні нейрональні процеси у корі великих півкуль.

По отриманим даним було опубліковано такі праці:

1. Two types of low-voltage activated Ca2* channels in neurones of rat laterodorsal thalamic nucleus. Tarasenko A. N., Kostyuk P .G., Eremin A. V. & Isaev D. S. Journal of Physiology, 499.1, pp. 77-86.

2. Нифедипинчувствительный низкопороговый кальциевый ток в нейронах латеродорсального ядра таламуса крысьи Д. С. Исаев, А. В. Еремин, О. А. Палыгин, А. Н. Тарасенко. Нейрофизиология, 29, с. 136-141.

3. Multiple Types of Low Voltage-Activated Calcium Channel in Brain Neurons. I Dzhura, A. Eremin, D. Isaev, P. Kostyuk, O. Lyubanova, V. Naidenov, Y. Shuba & A. Tarasenko. Meeting on low-voltage-activated Ca2<" channels. Montpellier, 1996. Book of proceedings, pp. 74-82.

Тези доповідей

1. P. Kostyuk, A. Tarasenko and A. Eremin. Low-voltage activated calcium currents in thalamic rat brain slice. European Journal of Physiology 1995; suppl. to v.430, No.4, R32: 95.

2. Tarasenko A. N., Eremin A. V., Isaev D. S. and Kostyuk P. G. Two types of low-voltage

activated Ca2+ channels in rat thalamic neurones. The 2nd meeting of European Neuroscience 1996. Abstract Book, P. 13: 9.24. .

3. N. Tarasenko, A. V. Eremin & D. S. Isaev. Developmental changes in the expression of different types of low-voltage activated Ca2+ channels in rat laterodorsal thalamic neurones. XXXIII International Congress of Physiological Sciences. Abstract Book. P012.01.

4. D. S. Isaev, A. V. Eremin, A. N. -Tarasenko, O. A. Paligin & P. G. Kostyuk. Developmental changes in expression of low-voltage-operated Ca2+ channels in rat cortical and thalamic neurons. 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology 1997. Abstract

Book, A971: 672.

5. D. S. Isaev, A. V. Eremin, O. A. Paligin, A. N. Tarasenko & P. G. Kostyuk. Pharmacological and kinetic properties of low-voltage-activated Ca2+ channels in rat sensorimotor cortex. The meeting of Physiological Society. University of Cambridge 15th to 17th December.

6. V. Eremin, D. S. Isaev, O. A. Paligin, A. N. Tarasenko & P. G. Kostyuk. Difference in expression of low-voltage-operated Ca2+ channels in visual and sensorimotor rat cortical neurones during early postnatal development. The meeting of Physiological Society. University of Cambridge 15th to 17th December.

Наведена дисертація викладена на 94 сторінках, включаючи список літератури (138 джерел), включає в себе вступ, огляд літератури, методику, результати досліджень, обговорення та висновки. У роботі використано 12 ілюстрацій.

Анотації:

Ісаєв Д. С. Властивості низькопорогових кальцієвих каналів нейронів сенсомоторної та зорової кори мозку щура під час ранього онтогенезу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидату біологічних наук за спеціальністю

03.00.13 - фізіологія людини та тварин. - Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України. Київ-1998.

Дисертація присвячена дослідженню властивостей низькопорогових кальцієвих каналів у нейронах нової кори щурів в процесі ранього постнатального розвитку. Результати проведених досліджень показали, що низькопорогові Са2+ канали в нейронах поверхневого та глибинних шарів зорової кори присутні тільки впродовж декількох днів після народження. У нейронах сенсомоторної кори знайдено три типи низькопорогових Са2+ каналів. Властивості низькопорогових Са2+ каналів нейронів сенсомоторної кори залежать від розміру нейронів та розташування нейронів у шарах кори.

Ключові слова: нова кора, низькопорогові Са2+ канали.

Исаев Д. С. Свойства низкопороговых кальциевых каналов нейронов сенсомоторной и зрительной коры мозга крысы в период раннего онтогенеза. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности

03.00.13 - физиология человека и животных. - Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины. Киев-1998.

Диссертация посвящена изучению свойств низкопороговых Са2+ каналов на нейронах новой коры крыс в процессе раннего постнатального развития. Результаты проведенных исследований показали, что низкопороговые Са2+ каналы на нейронах верхнего и глубоких слоев зрительной коры присутствуют только в течение нескольких дней после рождения. На нейронах сенсомоторной коры обнаружено 3 типа низкопороговых Са2+ каналов. Свойства низкопороговых Са2+ каналов нейронов сенсомоторной коры зависят от размера нейронов и их расположения в слоях коры.

Ключевые слова: новая кора, низкопороговые Со2* каналы.

Isaev D. S. Properties of low-voltage-activated calcium channels in neurons of sensorimotor and visual cortex of rat brain during early ontogenesis. - Manuscript.

Thesis for PhD degree by specialty 03.00.13 - human and animal physiology. - Bogomoletz institute of Physiology NASc of Ukraine. Kiev-1998.

The dissertation is devoted to investigation of properties of LVA Ca2* channels in rat neocortical

neurons during early postnatal development. The obtained results indicated that low-voltage-activated Ca2+ channels present in visual cortical neurons of superficial and deep layers only during a few days after birth. It was found 3 types of low-voltage-activated Ca2+ channels in sensorimotor cortical neurons. The properties of these channels depend on neuronal size and their position in cortical layers.

Key words: neocortex, low-voltage-activated Cachannels.