Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение низкопороговой кальциевой проводимости нейронов латеродорсального ядра талмуса крыс в период раннего онтогенеза

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изменение низкопороговой кальциевой проводимости нейронов латеродорсального ядра талмуса крыс в период раннего онтогенеза"

Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

З Єрьомін Андрій Віталійович

т

Зміни низькопорогової кальцієвої провідності нейронів латеродорсального ядра таламусу щурів в період раннього онтогенезу

03.00.02 - біофізика Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України Науковий керівник

Доктор біологічних наук, проф., академік НАНУ Костюк Платон Г ригорович Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАНУ, директор

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, проф., академік НАНУ, зав. відділом нервово-м’язової передачі інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України М. Ф. Шуба

Кандидат біологічних наук, вчений секретар Міжнародного центру молекулярної фізіології Федулова Світлана Анатоліївна

Провідна установа

Кафедра біофізики Національного Університету імені Тараса Шевченка, м. Київ

Захист відбудеться ” £*&&& 200_/р. о ^ годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради Д-01.13.01 при інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту фізіології ім. О. О. Богомольця, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “ ^ ^ 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук 3. О. Сорокіна-Маріна

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Функціональні властивості нервових клітин різних відділів нервової системи обумовлені особливостями їхньої морфології а також складом потенціал- та рецептор-керованих іонних каналів. Експресія канальних білків дуже різноманітна і в сильній мірі залежить від ступеня постнатального розвитку тварини. Деякі з цих білків з’являються на мембрані лише на короткий період, відповідаючи за включення диференціації попередників нейронів а також за встановлення та визрівання нервових зв’язків, у той час як інші формують базис для нормальної роботи нервової мережі. Для розуміння цих процесів особливо важливим є аналіз експресії та функціонування потенціал-керованих кальцієвих каналів, оскільки відомо, що іони Са2+ грають критичну роль в формуванні нервової системи і є головним посередником в синаптичній передачі в усіх міжнейронних з’єднаннях. У зв’язку з цим, підвищений інтерес викликає присутність низькопорогових Са2+ каналів. Загальною властивістю даного типу каналів є повна інактивація вже при потенціалі спокою; тому для того, щоб перевести їх в функціонально активний стан, потрібна попередня гіперполяризація мембрани. Однак в інших властивостях між низькопороговими (НП) кальцієвими каналами спостерігаються суттєві розбіжності. Класичний НП Са2+ канал (Т-канал) можна було заблокувати іонами №2і, при цьому він був нечутливий до дигідропіридінів (Моїщіпої й аі., 1997). Зворотній ефект споглядався в нейронах гіпоталамусу, де НГІ Са2+ струм добре подавлявся ніфедіпіном (Акаіке еі аі., 1989). Крім фармакологічних, НП Са2+ канали відрізняються також і за кінетичними властивостями. В залежності від типу клітини постійна часу інактивації НП Са2+ струму може бути близько 10 мс, 100 мс і 1 с. Локалізація ЕЛІ Са2+ каналів також різноманітна. В одних типах клітин НП Са2+ струми реєстрували на сомі, в інших -на дендритах. Таким чином, експериментальні дані свідчать про те, що популяція НП Са2+ каналів неоднорідна. Чудовим підтвердженням цього висновку сталося клонування декількох представників аі-суб’одиниці НП Са2+ каналу.

Тому дуже важливим стає питання про те, яку функцію виконує НП Са2+ канал кожного типу. Вірогідно, всі канали можуть бути активовані при потенціалах, близьких до потенціалу спокою, і таким чином сприяють генерації спонтанних Са2+ сигналів, необхідних для морфогенезу. На цей час, дані про залежність експресії НП Са2+ каналів від стадії постнатального розвитку показують, що цей процес в різних нейронах проходить по-різному. Так, в нейронах спинномозкових гангліїв пік експресії НП Са2+ каналів близько співпадав з моментом народження; в подальшому щільність цих каналів зменшувалася, і по закінченні декількох перших тижнів розвитку вони повністю зникали. В таламічних і гіпоталамічних нейронах споглядається зворотна ситуація. В цих клітинах НП Са2+ канали є головним типом потенціал-керованих кальцієвих каналів і виконують свою другу функцію: приймають участь в механізмах збудження і організації повільної ритмічної активності.

Великий інтерес викликає вивчення ролі НП Са2+ каналів в нейронах асоціативних ядер таламусу. Відомо, що нейрони цих ядер встановлюють зв’язки з багатьма структурами головного мозку, в тому числі з нейронами кори великих

півкуль. Приймаючи до уваги цю обставину, а також важливість низькопорогових кальцієвих каналів в процесах електричної активності і визрівання нейронів, в цьому дослідженні була встановлена наступна задача.

Мета дослідження. Відстежити зміни низькопорогової кальцієвої провідності в ранньому періоді постнатального розвитку в нейронах зрізів латеродорсального ядра таламусу щурів.

Задачі дослідження.

1. Визначити тип(н) низькопорогових кальцієвих струмів в нейронах латеродорсального ядра (ЛД) таламусу щура.

2. Відстежити вірогідні зміни властивостей низькопорогових кальцієвих струмів в асоціативних: нейронах таламусу під час постнатального онтогенезу.

3. Охарактеризувати фармакологічні та кінетичні властивості низькопорогових кальцієвих струмів в зрізах цих ядер.

А. Визначити можливу локалізацію низькопорогових кальцієвих струмів на плазматичній мембрані нейрона.

5. Зробити висновки про можливе функціональне значення низькопорогових кальцієвих струмів в нейронах ЛД ядра таламусу.

Наукова новизна роботи. Вперше в нейронах зрізів асоціативного ядра таламусу було показано присутність двох компонентів низькопорогового кальцієвого струму. Знайдено розбіжності в часових характеристиках експресії низькопорогових кальцієвих каналів, що відповідають за кожен з компонентів низькопорогового струму. Визначені основні фармакологічні та кінетичні властивості і параметри стаціонарної інактивації низькопорогових кальцієвих струмів. Зроблені висновки про можливу локалізацію низькопорогових кальцієвих каналів на мембрані і можливе функціональне значення двох компонентів низькопорогового кальцієвого струму в процесі життєдіяльності клітини.

Теоретичне і практичне значення роботи. Результати, що отримані на нейронах в зрізі мозкової тканини, мають, головним чином, теоретичне значення. Вони дозволяють розширити розуміння процесів диференціації клітин і встановлення міжнейронних зв’язків, а також механізмів збудження нейронів і особливостей їхньої електричної активності.

Практичне значення мають дані про вибіркову дію ніфедіпіну на “швидкий” компонент низькопорогового кальцієвого струму. Подальше дослідження фармакологічних властивостей відповідного кальцієвого каналу може призвести до відкриття нових лікарських препаратів, що вибірково впливають на цей тип кальцієвих каналів, і як слідство на процеси кальцієвої сигналізації в таламічних нейронах. Подальше вивчення фармакологічних властивостей другого компоненту низькопорогового кальцієвого струму, вірогідно, дозволить розробити речовини, які впливають на зміни електричної активності таламічних нейронів при епілептичних станах.

Особистий внесок здобувача. Експерименти по визначенню вікових змін низькопорогової кальцієвої провідності нейронів латеродорсального ядра таламусу і вивченню кінетичних властивостей низькопорогових кальцієвих струмів виконувалися автором особисто. Експерименти по визначенню фармакологічної чутливості низькопорогових кальцієвих струмів проводилися спільно з науковим

з

співробітником інституту фізіології ім. О. О. Богомольця к. б. н. Тарасенко О. М. Обробка результатів проводилася автором особисто.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідалися на: першому конгресі Федерації Європейських Фізіологічних товариств, Маастріхт, 1995; ХХХШ Міжнародному конгресі фізіологічних наук, Санкт-Петербург, 1996; Міжнародному симпозіумі Міжнародного Центру Молекулярної фізіології НАН України, Київ, 1997; Першій конференції Українського Товариства Нейронаук, Київ, 1998; Конференції “Відкриття ліків - 1999”, Сандвіч, 1999. За матеріалами дисертації надруковано 5 статей.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку літератури з 180 найменуваннями. Робота викладена на 107 сторінках без списку літератури та ілюстрована 31 рисунком.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єїсг дослідження. Експерименти були проведені на нейронах латеродорсального ядра таламусу щурів, які знаходилися в зрізі мозку. У цьому випадку клітини мінімально пошкоджуються механічно і знаходяться в своєму природному оточенні. Ферментативна обробка зрізів мозку в експерименті не проводилась. Латеродорсальне ядро було ідентифіковано у відповідності зі стереотаксичним атласом мозку щурів (Paxinos G., Watson С. 1944). Для спостереження поверхні зрізу та визначення таламічного ядра використовувався неінвертований мікроскоп Ergoval (Carl Zeiss) з об’єктивом 3.2х Semiplan. Вибір клітини, проводився при використанні об’ктиву 20х Leitz Wetzlar. Оскільки для реєстрації струмів обиралися клітини найбільшого розміру, а з двох типів нейронів латеродорсального ядра таламокортикальні нейрони за діаметром соми є більшими ніж інтернейрони, то вважалося, що експерименти проводяться саме на таламокортикальних нейронах.

Для досліду брали щурів чотирьох вікових груп: 3-х, 12-и 14-и та 17-и діб від народження (день народження позначається як Р1).

Крім експериментів на нейронах, які знаходяться в зрізі мозку, було проведено декілька контрольних досліджень на свіжоізольованих клітинах. Це було зроблено для того, щоб оцінити, наскільки адекватною є фіксація потенціалу в дистальних дендритах, що знаходяться на великій відстані від соми нейрона.

Для приготування зрізів мозку використовувалася наступна процедура. Після декапітації щурів, мозок швидко виймався та переносився на 3-4 хвилини у холодний (4°С) фізіологічний розчин, склад якого вказаний нижче. Потім мозок розділяли на дві півкулі, одну з яких нарізали в сагітальній площині на зрізи з використанням вібратому. Одержані зрізи товщиною 300 мкм переносили в розчин (рі), який містив (у мМ): NaCl 125; КС1 2,5; СаС12 2; MgCl2 1; NaHC03 24; NaH2P04 1,25; глюкоза 25; феноловий червоний 10'3; pH розчину був 7,4 при оксигенуванні карбогеном (95% Ог та 5% С02). Після інкубації впродовж однієї години при температурі 32°С та потім двох годин при кімнатній температурі (біля 22°С) один із зрізів переносився до камери для проведення вимірювання.

Методика приготування свіжоізольованих нейронів була наступною. Після декапітації тварини, аналогічно вищеописаній процедурі, мозок щура було покладено на 3-4 хвилини в холодний (4 °С) розчин рі. Далі за допомогою леза мозок різався у фронтальній площині на зрізи, товщина яких була близько 500 мкм. У відповідності зі стереотаксичним атласом мозку щура (Paxinos G., Watson С. 1944) обирався зріз, в якому знаходилось латеродорсальне ядро. Після інкубації на протязі однієї години при температурі 32 °С в розчині рі зріз перекладався в розчин (р2) наступного складу (в мМ): NaCl 125; КС1 2,5; СаСЬ 2; MgCb 1; Hepes 20; NaH2P04 1,25; глюкоза 25; феноловий червоний 10'3 %; pH розчину доводився до значення 7,4 розчином NaOH. Надалі за допомогою леза і скальпеля із двох півкуль вирізалися частини тканини, які відповідають латеродорсальним ядрам таламусу і перекладались для ферментативної обробки в розчин р2, який містив фермент Pronase Е (Serva) в концентрації 1 мг/мл. Час обробки складав 8 хвилин, температура дорівнювала 35 °С. Після відмивки ферменту розчином р2 шматочки тканини пипетувалися, і отримані нейрони перекладалися в камеру на знежирене скло. Через 30-40 хвилин клітини прикріплялися, і можна було проводити вимірювання.

Реєстрація даних та обробка результатів. Трансмембранні струми вимірювались у режимі фіксації мембранного потенціалу - методика “петч-клемп” в конфігурації “ціла клітина” (Hamill О.Р. et. аі. 1981). Скляні мікропіпетки вироблялись із легкоплавких капілярів діаметром 1,8 мм. Для виділення кальцієвих струмів використовувався безнатрієвий розчин (рЗ) який містив в мМ: Choline-Cl 113; ТЕА-С1 27; СаСЬ 2; MgCb 0,5; Tris-Cl 20; тетродотоксин (ТТХ) 1 мкМ; pH доводився до значення 7,4 додаванням Tris-OH. Присутність тетродотоксину і відсутність іонів Na+ в зовнішньоклітинному розчині дозволила повністю подавити Na+ струми. Для блокування калієвих каналів використовувався внутрішньоклітинний розчин (р4), який містив (у мМ): CsCl 130, MgCb 5, ТЕА-С1 10, СаС12 1, EGTA 10, TrisCl 10; pH доводився до 7,3 додаванням CsOH. Для дослідження фармакологічних властивостей кальцієвих каналів використовувались наступні речовини: ніфедіпін, розчинений у етиловому спирті, LaCU та NiCh, які додавались у безнатрієвий розчин рЗ у концентраціях, вказаних в результатах.

Проточна камера, в якій було розташовано зріз, заповнювалася розчином рі при кімнатній температурі. Швидкість протоку можна було регулювати зміною діаметра трубки, що подає розчин, і обиралася таким чином, щоб зріз у камері залишався нерухомим. Висмоктування рідини проводився перистальтичною помпою. Оскільки розчин було постійно оксигеновано, парційний тиск кисню в ньому був достатньо високим. Завдяки цьому вже внаслідок дифузії кисень добре проникав в середину зрізу, і в клітинах підтримувалася нормальна життєдіяльність: контури клітин були чіткими, і на них можна було проводити реєстрації струмів на протязі декількох годин.

Для виділення кальцієвих струмів на поверхню соми клітини через мікропіпетку було апліковано безнатрієвий розчин (рЗ), який містив тетродотоксин. Оскільки діаметр кінчика аплікуючої піпетки (40-50 мкм) в декілька разів перевищував розміри соми нейрона (5-15 мкм), а доданий в розчин ТТХ у концентрації 1 мкм блокував ТТХ-чутливий Na+ струм за час менш ніж 1 с, можна допустити, що концентрація речовин, що аплікуються біля поверхні мембрани

співпадає з концентрацією речовини на кінчику піпетки. Крім того, безнатрієвий розчин, який не містив ТТХ, також знімав ТТХ-чугливий Na+ струм, що говорить про адекватність такого методу аплікації розчинів. Низька концентрація іонів Na+ біля клітини, на якій проводяться реєстрації, виключає можливість з’явлення ТТХ-нечутливого Na+ струму.

Реєстрація струмів проводилась при використанні аналогового підсилювача РОК-ЗМ. Всі отримані данні переводилися в цифровий вигляд і зберігалися на жорсткому диску комп’ютера. Обчислювання параметрів струмів проводилось програмою Datasel, з наступною математичною обробкою даних та побудуванням рисунків - Sigma Plot.

Реєстрація струмів на таламічних нейронах проводилась при кімнатній температурі з використанням методики “петч-клемп” у конфігурації “ціла клітина” (Hamill О.Р. et. аі. 1981). Внутрішній діаметр кінчика піпетки підбирався відповідно зі ступенем постнатального розвитку та типом клітини, обраної для реєстрації. Звичайно внутрішній діаметр кінчика піпетки становив 2-3,5 мкм. Опір піпеток, які були заповнені внутрішньоклітинним розчином, складав від 3 до 6 МОм для нейронів РЗ та 2+4 МОм для Р12, Р14 и Р17 нейронів.

Пасивні електричні властивості нейронів таламусу визначались шляхом аналізу ємнісних струмів, а опір мембрани - за значенням струму витоку під час створення контакту між піпеткою та клітиною до та після прориву мембрани. Струм витоку компенсувався апаратно та контролювався впродовж всього експерименту. Ємність реєструючої піпетки (Ср) та ємність «цілої клітини» оцінювались по ємнісним викидам струму у відповідь на гіперполярізуюче зміщення -10 мВ від потенціалу що підтримується (Vh) -80 мВ. У подальшому аналізі розглядалися тільки ті клітини, в яких спад ємнісного транзієнту «цілої клітини» міг бути апроксимований однією експонентою; у цьому випадку клітина могла бути розглянута як ізопотенціальний об’єкт (Kay A.R., Wong R.K.S. 1987). Ємність клітинної мембрани (Сш) визначалась шляхом віднімання Ср від ємності цілої клітини.

Значення послідовного опору (R,,) визначалось двома різними шляхами: використанням константи часу (і) ємнісного транзієнту, записаного після прориву клітинної мембрани (R, = х/Сш), та як відношення величини зміщення мембранного потенціалу до амплітуди ємнісного струму. Клітини, у яких помилка фіксації потенціалу, що визначалась значенням послідовного опору та амплітудою низькопорогового струму, була більш ніж 6 мВ, у ході подальшого аналізу не розглядались. В обробку були взяті лише ті клітини, потенціал-керована активація струмів яких не мала перегинів. Крім того, для визначення типу низькопорогового кальцієвого струму було використано фармакологічне розділення.

Для реєстрації струмів було застосовано 2 протоколи. У випадку, коли клітина стабільно витримувала напругу, що підтримується, (-90 мВ), кальцієві струми отримувались шляхом подання зростаючих деполяризаційних імпульсів. У випадку коли клітина не витримувала такої напруги, що визначалось як поява характерних завад, збільшення витоку та зміщення базової лінії, підтримувалась напруга від -60 до -50 мВ та подавався 250 мс імпульс до -95 мВ для активування НП Са2+ каналів. Для стабілізації мембранних струмів, реєстрації проводились через 5 хвилин після прориву клітинної мембрани. Амплітуда струму одержувалась як різниця між

\

піковим значенням струму та нульовою лінією. Криві струмів були апроксимовані за моделлю Ходжкіна-Хакслі з використанням методів, описаних раніше (Coulter D.A., Huguenard J.R., Prince D.A. 1990). Реєстрації кривої стаціонарної інактивації, вивченім фармакологічних властивостей каналів, а також визначення постійних часу активації та інактивації, були отримані при значеннях напруги, що відповідають значенню напруги на максимумі вольтамперної характеристики струму. Отримані результати представленні в одиницях ±с.с.п. (середня статистична помилка).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Пасивні електрофізіологічні властивості таламокортикальннх нейронів.

Пасивні властивості мембран таламокортикальних нейронів латеродорсального (ЛД) ядра були вивчені за допомогою аналізу ємнісних струмів і струмів витоку, які були отримані у відповідь на гіперполяризуюче зміщення мембранного потенціалу до -70

А В А

-ЗО иВ

-90 .

200 пА І

•35 мВ

L -95—f

-95 —

ЮОмс 50 мс

200 пА| 100 пА|

V, мВ

Рис. 2. Кальцієві струми в ізольованих нейропах Р12. А. Реєстрації струмів в нейронах Р12. Б. ВАХ Са2+ струму в нейронах Р12.

І, пА І, пА

Рис. 1. Вольтамнерні характеристики (ВАХ) кальцієвих струмів в нейронах РЗ та Р12. А. Реєстрації струмів в нейронах РЗ. Б. ВАХ Са2+ струму в нейронах РЗ. В. Реєстрації струмів в нейронах Р12. Г. ВАХ Са2+ струму в нейронах Р12.

мВ від потенціалу, що підтримується, -80 мВ. Як правило, виток складав 20-5-40 пА і не залежав від віку тварини. Вхідний опір мембрани складав 250+500 МОм.Послідовний опір не перевищував 8+14 МОм для клітин РЗ и Р12, а для нейронів Р14 и Р17 був 4+8 МОм. Ємність клітинної мембрани монотонно збільшувалась з віком і дорівнювала 68 ± 3 пФ (п = 8), 86 ± 4 пФ (п = 16), 108 ± 12 пФ (п = 27), 154 ±16 пФ (п = 23) для нейронів РЗ, Р12, Р14 и Р17 відповідно.

Оскільки ємність ізольованих нейронів, в тому числі і таламокортикальних, не

Б

г

V. иВ

перевищує 15-20 пФ, подібне збільшення ємності клітинної мембрани, очевидно, пов’язане із зростанням дендритного дерева, слідством якого є збільшення площини поверхні клітини

Загальні властивості кальцієвих струмів. Типові реєстрації кальцієвих струмів таламокортикальних нейронів вікових груп РЗ та Р12 представлені відповідно на рис. 1А та 1В. Деполяризаційне зміщення мембранного потенціалу до величини -80 4- -45 мВ від потенціалу, що підтримується, -95 мВ викликало швидкоспадаючий (транзієнтний) кальцієвий струм, в той час як після деполяризації до потенціалів менш —45 мВ, з’являвся постійний компонент, який вказував на присутність високопорогового (ВП) струму.

Під час аналізу вольтамперних характеристик (ВАХ) кальцієвого струму нейронів РЗ (рис. 1Б) та Р12 (рис. 1Г) було виявлено присутність двох компонентів кальцієвого струму: низькопорогового (НП) з максимумом біля -55 мВ та високопорогового з максимумом біля -15 мВ. Єдиною розбіжністю в В АХ є різниця у співвідношенні між низько- та високопороговими компонентами. Якщо для нейронів РЗ максимум вольтамперної характеристики, який відповідає високопороговому струму, був приблизно в 3 рази більший за максимум низькопорогового струму (п = 6), то в нейронах Р12 ВП струм був тільки в 2 рази більший за низькопороговий (п = 12).

Для того, щоб визначити, наскільки адекватно проходить фіксація потенціалу в нейронах, розташованих у зрізі, були проведені контрольні експерименти на ізольованих нейронах. На рис. 2А представлена типова реєстрація низькопорогових кальцієвих струмів в ізольованих нейронах вікової групи Р12. Струми були виклика-

Рис. 3. Вольтамперні характеристики (ВАХ) кальцієвих струмів в нейронах Р14 та Р17. А. Реєстрації струмів в нейронах Р14. Б. ВАХ Са2+ струму в пейропах Р14. В. Реєстрації струмів в нейронах Р17. Г. ВАХ Са2+ струму в нейронах Р17. ні деполяризуючим зміщенням мембранного потенціалу до значень —85 -35 мВ від

потенціалу, що підтримується, -95 мВ. В тому випадку, коли деполяризація клітинної мембрани була менш -45 мВ, спостерігався транзиєнтний швидкоспадаючий струм. З подальшим збільшенням деполяризації спостерігався постійний повільноспадаючий компонент кальцієвого струму, що відповідає високопороговому. На рис. 2Б представлена вольтамперна характеристика кальцієвого струму, що зареєстровано в ізольованих нейронах Р12 (п = 9). Як і в випадку нейронів, розташованих у зрізі, на ній присутні два піки в районі -55 мВ та -15 мВ, які відповідають низько- та високопороговим компонентам кальцієвого струму. Єдина розбіжність - це різниця в амплітуді струмів, яка пояснюється тим, що на дендритах, які були втрачені під час ізоляції,

А

-45 мВ -95 _______

V, мВ

Чг”'

V, мВ

В

також знаходяться низькопорогові кальцієві канали. Таким чином, контрольний експеримент, виконаний на ізольованих таламічних нейронах, показав, що якість фіксації потенціалу є задовільною і дані, отримані на нейронах у зрізі, є адекватними.

На рис. ЗА та ЗВ представлені відповідно реєстрації низькопорогового кальцієвого струму в нейронах Р14 та Р17. Вольтамперні характеристики кальцієвих струмів в нейронах Р14 (рис. ЗБ) та Р17 (рис. ЗГ) суттєво розбігались із В АХ двох попередніх вікових груп. Крім двох піків, які відповідають низькопороговому та високопороговому струмам, на цих характеристиках був присутній третій максимум близько -65 мВ. Присутність двох піків на вольтамперній характеристиці в області потенціалів -70 -г -40 мВ можна було пояснити або присутністю другого компонента низькопорогового струму, або зміщенням ВАХ ліворуч, яке обумовлено поганою просторовою фіксацією потенціалу на дендритах. Щоб прояснити це питання, були проведеш додаткові дослідження фармакологічних та кінетичних властивостей низькопорогового кальцієвого струму.

Рис. 4. Блокуюча дія ніфсдіпіну на Рис. 5. Ніфедіпін-чутливий компо-шізькоиороговіїн Са2+ струм в нент низькопорогового кальцієвого таламічних нейронах. А. Реєстрації струму в нейронах Р17 таламусу. А. струмів в контролі та під час дії НП Са2+ струм в контролі та в ніфедіпіну. Б. Крива доза-ефект дії присутності ніфедіпіну. Б. Ніфедіпін-

Фармакологічпе розділення компонентів низькопорогового струму.

Важливою особливістю низькопорогового кальцієвого струму, зареєстрованого в нейронах РЗ та Р12, була його висока чутливість до дигідропіридінів (ніфедіпіну), чого не було у випадку класичного НП Са2+ струму (Fisher and Bourque, 1995). Разом

А

А

Р14

Р17

-60 мВ

-95

200 ыс

200 пЛ

100 мс

Б

j°,6 - 0,4

0,2

0,0

0,8

Б

Контроль

іо'° 10'* КГ* Ю"1 Ю’г

с,м

ніфедіпіну на НП Са2+ струм.

чутливий компонент був отриманий як різниця між контрольним струмом і струмом після дії ніфедіпіну.

з тим, раніше було показано, що низькопороговий кальцієвий струм в ізольованих нейронах гіпоталамусу щурів ефективно блокується ніфедіпіном (Акаіке еі аі., 1989). Для вивчення блокуючої дії ніфедіпіну низькопороговий кальцієвий струм було викликано деполяризуючим зміщенням мембранного потенціалу з амплітудою 40 мВ від потенціалу, що підтримується, -95 мВ. Час деполяризації складав 600 мс, а інтервал між імпульсами дорівнював 7 с. Під час аплікації ніфедіпіна в концентрації 0,1 мкМ на нейрони Р12 низькопороговий кальцієвий струм зменшувався несуттєво (біля 5%, п = 14). Із збільшенням концентрації речовини, струм монотонно зменшувався. Аплікація 100 мкМ ніфедіпіну викликала зворотній блок (зменшення 93 ± 5%; п = 7) низькопорогового струму в нейронах Р12. Разом з тим, в нейронах Р14 НП Са2+ струм неможливо було повністю подавити навіть під час прикладення ніфедіпіну на протязі 20 хвилин. В цьому випадку більш 10% струму залишалося незаблокованим (рис. 4А). Крива доза-ефект блокуючої дії ніфедіпіну представлена на рис. 4Б і була отримана шляхом апроксимації експериментальних даних (п = 7) модифікованим рівнянням Хіла:

Итах = а/(1+С/К<,)+Ь,

де І - струм, що залишився після прикладення речовини в концентрації С, Ітах контролі,ний струм, Ка - значення концентрації речовини, при якому спостерігається блокування половини струму, Ь - постійна складаюча струму (ніфедіпін-нечутливий компонент), а - нормуючий коефіцієнт. Значення склало З мкМ. В клітинах Р17 ніфедіпін-нечутливий компонент (струм в присутності 100 мкМ речовини) низькопорогового кальцієвого струму збільшився, якщо порівнювати його із відповідним струмом в нейронах Р12, і склав 25 ± 4% контрольного струму (п = 6). Ніфедіпін-чутливий компонент було отримано шляхом віднімання струму, що залишився після аплікації ніфедіпіну, з контрольного струму (рис. 5). Отриманий таким чином ніфедіпін-чутливий компонент (рис. 5Б) міг бути апроксимоваїшй рівнянням т2И моделі Ходжкіна-Хакслі:

І = а(1-ехр(-^хт))2ехр(-1/тн), де І - значення струму в момент часу і, хт и хь - постійні часу активації і інактивації струму відповідно, а - нормуючий коефіцієнт. На рис. 5А представлені контрольний струм і струм, який залишився після 20-ти хвилинного прикладення ніфедіпіну. Реєстрації були отримані у відповідь на деполяризацію до -60 мВ від потенціалу, що підтримується, -95 мВ. Ніфедіпін-нечутливий струм було описано рівнянням т2Ь з постійними часу активації та інактивації 7 та 67 мс відповідно. Постійна часу інактивації ніфедіпін-чутливого компоненту (рис. 5Б) була значно менша, якщо її зрівняти з відповідним параметром ніфедіпін-нечутливого компоненту, і дорівнювала 32 мс.

Для подальшого вивчення фармакологічних властивостей низькопорогових кальцієвих струмів були використані неорганічні блокатори - солі двох- та гривалентних катіонів. Було виявлено, що в нейронах Р12 іон Ьа3+ в концентрації 100 нМ зменшує на 57 ± 5% (п = 13) низькопороговий струм, який було викликано деполяризацією до -55 мВ від потенциалу, що підтримується, -95 мВ. На рис. 6А показано приклад блокуючої дії іонів Ьа3+ (ЬаС13, 1 мкМ) на низькопороговий кальцієвий струм в нейроні Р17, що був отриманий у відповідь на деполяризацію до

-65 мВ від потенціалу -95 мВ. Постійна часу інактивації струму, який залишився після блокування лантаном, дорівнювала 58 мс. Лантан-чутливий компонент, що був отриманий шляхом віднімання струму, який залишився після прикладення іонів Ьа +, з контрольного струму, міг бути апроксимований рівнянням т2Ь з постійними часу активації та інактивації 4 и 15 мс відповідно (рис. 6Б). Таким чином, лантан також можна розглядати як блокатор ніфедіпін-чутливого струму.

Аплікація іонів №2+ (у вигляді №С12), які добре блокують низькопороговий кальцієвий струм в різних типах клітин, в концентрації 25 мкМ викликала дію протилежну за ніфедіпін та лантан. Нікель знімав ніфедіпін-нечутливий компонент струму, залишаючи при цьому ніфедіпін-чутливий компонент. Приклад блокуючої дії іонів №2+на низькопороговий струм в нейроні Р14 показаний на рис. 7А. Струм

А *

Р 17

-65 иВ -95 —

и”1ішМ

500 пА|

чЮоіпраяь Б Іл^-чутливий компонент (Іл)

ттГ°4мс 200 мс

15 мс

200мс \/ і

їй, ■ 65 мс

Рис. 6. Блокуюча дія іонів на Рис. 7. Блокуюча дія іонів №2+ на НП

НП Са2+ струм. А. Реєстрації Са"" струм. А. Реєстрації струмів в

2+

струмів в контролі та в присутності контролі та в присутності іонів №2+. Б.

іонів Ьа3+. Б. Ьа^-чутливий ЇЧіі+-чутливий компонент, компонент.

було отримано у відповідь на деполяризацію до -65 мВ від потенціалу, що підтримується, -95 мВ. Постійна часу інактивації струму, що залишився після дії нікелю, дорівнювала 34 мс. Нікель-чутливий компонент був отриманий як різниця між контрольним струмом і струмом, який не був заблокований іонами нікелю (рис. 7Б). Постійні часу активації і інактивації цього компоненту склали 8 и 65 мс відповідно. Ніфедіпін в концентрації 100 мкМ повністю давив низькопороговий кальцієвий струм, який залишився після дії 25 мкМ №2+ (п = 7). Таким чином, фармакологічне дослідження (таб.1) підтвердило припущення про існування двох компонентів низькопорогового кальцієвого струму в нейронах латеродорсального ядра таламусу.

;2+ ,

Кінетичне розділення двох компонентів низькопорогового кальцієвого струму. Крім різної фармакологічної чутливості, компоненти низькопорогового кальцієвого струму мають також різні кінетичні властивості. В нейронах РЗ и Р12 можна було зареєструвати швидкоспадаючий кальцієвий струм, який був викликаний деполяризацією клітинної мембрани до значень -75 -з- -55 мВ від потенціалу, що підтримується, -95 мВ. Струм досягав максимума при деполяризації

Таблиця 1. Фармакологічні властивості компонентів низькопорогового

Тип НП Са2+ струму Вік тварини Постійна часу інактивації Фармакологічна чутливість

«швидкий», ніфедіпін-чутливий РЗ, Р12, Р14, Р17 близько ЗО мс Ніфедіпін (100 мкМ), лантан (1 мкМ)

«повільний», ніфедіпін-нечутливий Р14, Р17 близько 60 мс Нікель (25 мкМ)

А

-60 мВ -95 —

200 пА

Р12

200 мс

-60 мВ

Tj,fe28MC

РІ4

до -55 мВ. Низькопороговий струм, викликаний деполяризацією до -60 мВ від потенціалу -95 мВ, мав моноекспоненційне падіння і повністю зникав через 150 мс (рис. 8А). Аналіз часової залежності активації і інактивації струму показав, що цей струм може бути описаний модифікованим рівнянням m2h моделі Ходаскіна-Хакслі,

Рис. 8. Кінетичне розділення компонентів низькопорогового кальцієвого струму. А. Інактивація НП Са2+ струму в нейроні Р12 була описана однією експонентою с постійною часу 28 мс (“швидкий” струм). Б. НП Са2+ струм в нейроні Р14. Час інактивації “повільного” компонента склав 58 мс. аналогічно тому, як це було зроблено в попередніх роботах (Kay and Wong, 1987). Рівняння, що було використано для апроксимації струму, мало наступний вигляд:

Іса = А (1 -exp(-t/Tm))2(exp(-t/Th)-Ц/А), де t - час, тт и Th - постійні часу активації та . інактивації відповідно, І» - постійна складаюча струму, А - нормуючий коефіцієнт. Найкраща ' апроксимація (метод найменших квадратів) була досягнута при значеннях параметру ть 28,3 ± 3,6 (п = 7) и 32,3 ± 4,0 (п = 15) для нейронів РЗ и Р12 відповідно. Значення параметру тт при цьому дорівнювало 6,2 ± 1,1 (п = 22) (середнє значення для РЗ и Р12). Оскільки низькопороговий кальцієвий струм в нейронах РЗ и Р12 мав швидке падіння та був чутливим до ніфедіпіну, цей компонент був означений ж ITf (‘fast’ - швидкий).

В нейронах Р14 и Р17 кінетика падіння низькопорогового кальцієвого струму була більш складною у порівнянні з нейронами РЗ и Р12. Крім компонента, який швидко інактивується, в цих , клітинах був присутній компонент з повільною

-95

200 пА

100 мс

Г:

ths " 58 мс

Thf*18MC

інактивацією, (рис. 8Б). Повільний компонент НП Са2+ струму в чистому вигляді був отриманий після блокування швидкого компонента ніфедіпіном. Падіння ніфедіпін-нечутливого компоненту було моноекспоненційним з постійними часу 54,2 ± 4,5 (п = 26) и 68,6 ± 3,2 мс (п = 18) для нейронів Р14 и Р17 відповідно. Таким чином, повільний ніфедіпін-нечутливий компонент, означений Іу5 (‘slow’ - повільний), також міг бути добре аіфосимований рівнянням Ходжкіна-Хакслі. Значення постійної часу активації склало 7,3 ± 1,5 мс (п = 44) (середнє значення для Р14 и Р17).

Стаціонарна інактивація компонентів низькопорогового струму. Для

побудування кривої стаціонарної інактивації швидкого компонента низькопорогового кальцієвого струму було використано протокол, в якому потенціал, що підтримується, змінювався з -95 мВ до -75 мВ із кроком 5 мВ, а

-90 -80

V, мВ

9. Стаціонарна інактивація швидкого” компонента низькопорогового кальцієвого струму. А. Реєстрації струмів. Б. Крива стаціонарної інактивації.

Рис.

«4

Рис. 10. Стаціонарна інактивація “повільного” компонента низькопорогового кальцієвого струму. А.

Реєстрації струмів. Б. Крива

стаціонарної інактивації.

струми були викликані деполяризацією мембрани до потенціалу -55 мВ (максимум швидкого компонента). Реєстрації проводились на нейронах Р12, де був присутній лише швидкий компонент НП Са2+ струму (рис. 9А). Крива стаціонарної інактивації (рис. 9Б) могла бути добре описана функцією Больцмана:

Мтах = (1+ехр(У-У0>5)/к)'1, де І - значення струму при деполяризації від потенціалу V, що підтримується, Уо,5 -потенціал половинної інактивації, к - коефіцієнт похилу. Відповідні значення У0,5 та к склали -85,5 мВ та 2,8 мВ (п = 6). Таким чином, при потенціалі -75 мВ швидкий компонент низькопорогового кальцієвого струму був практично інактивований.

А

А

Приклад реєстрації струмів, які були використані для побудування кривої стаціонарної інактивації повільного компонента низькопорогового кальцієвого струму, показаний на рис. 10А. Струми були отримані у відповідь на деполяризацію до потенціалу -65 мВ від потенціалу, що підтримується, -110 -85 мВ, і

реєструвались на нейронах Р17 в присутності 100 мкМ ніфедіпіна для зняття швидкого компонента НП Са2+ струму. Крива стаціонарної інактивації повільного компонента (рис. 10Б) була зміщена ліворуч (в область більш негативних потенціалів), якщо зрівнювати її з кривою, що була побудована для ІТг. Потенціал половинної інактивації складав Уо5= -98,1 мВ, а коефіцієнт похилу к = 5,28 мВ (п = 7).

Зміпи в експресії двох компонентів низькопорогового кальцієвого струму' під час раннього онтогенезу. На підставі фармакологічного розділення компонентів низькопорогового кальцієвого струму були оцінені амплітуди кожного з компонентів для кожної вікової групи. Складаючи отримані результати, можна зробити висновок, що під час визрівання нейронів ЛД ядра таламусу проходять драматичні зміни в представленості двох компонентів НП Са2+ струму (рис. 11). В період до двох тижнів після народження нейрони експресують канал, який відповідає за швидкий НП Са2+ струм.

Амплітуда швидкого компонента збільшувалась з 138 ± 17 пА (п = 7) для нейронів РЗ до 670 ± 74 пА (п = 18) для Р17. Для нейронів Р12 и Р14 амплітуда швидкого компонента склала відповідно 389 ± 47 пА (п = 15) та 531 ± 63 (п - 26). Експресія повільного компонента суттєво відрізнялась. Цей струм в нейронах ЛД ядра таламуса можна було зареєструвати лише наприкінці другого тижня після

РиС. 11. Вікові зміни НП Са2+ провідності в нейронах ЛД ядра таламусу щура. Стовпчики представляють середні амплітуди +с.с.п. “швидкого” (Ітг, [] ) та “повільного” (Іт„ Щ ) компонентів НП Са2+ струму, як функцію віку. В дужках вказана кількість досліджених клітип. народження. Амплітуда ІТ8 різко збільшувалась зі 100 ± 9 пА для нейронів Р14 (п = 26) до 630 ± 58 пА для нейронів Р17(п= 18).

Щільність швидкого компонента низькопорогового кальцієвого струму на протязі перших 10 днів збільшувалась приблизно в два рази з 2,0 ± 0,2 пА/пФ (п = 7) для РЗ нейронів до 4,б! ± 0,5 (п = 15) для нейронів Р12. Однак подальше збільшення щільності Ітг не спостерігалось. Для вікових груп Р14 и Р17 щільність швидкого компонента складала 4,9 ± 0,6 пА/пФ (п = 26) и 4,3 ± 0,4 пА/пФ (п = 18) відповідно.

Зворотна ситуація мала місце у випадку повільного компонента. Щільність ITs суттєво збільшувалась з 0,9 + 0,1 пА/пФ для нейронів Р14 до 4,1 ± 0,4 пА/пФ для клітин Р17.

Цей новий тип низькопорогового кальцієвого каналу починав експресуватися на 12-14-й день після народження. Таким чином, поява каналів з різними фармакологічними та кінетичними властивостями, мабуть, придає нейронам асоціативних ядер особливу якість, яка відрізняє їх від нейронів інших таламічних ядер.

ОБГОВОРЕННЯ

В наших дослідах було виявлено, що в нейронах латеродорсального ядра

таламусу щурів можна виділити два компоненти низькопорогового кальцієвого

струму, які відрізняються один від одного фармакологічними та кінетичними

властивостями. Більше того, співвідношення двох компонентів в інтегральному НП 2+ • • •

Са струмі залежить від віку тварини.

Знайдені розбіжності у властивостях двох компонентів НП Са2+ струму вказують на присутність в цих клітинах двох типів низькопорогових кальцієвих каналів. Різноманітність популяції НП Са2+ каналів підтверджується багатьма авторами. В нейронах ретикулярної формації таламусу був знайдений НП Са2+ струм з більш повільною кінетикою інактивації у порівнянні зі струмом, що був зареєстрований в нейронах вентробазального комплексу ядер таламусу. Однак ніяких суттєвих розбіжностей у фармакологічних властивостях цих струмів знайдено не було (Huguenard and Prince, 1992). В нейронах зони С АЗ гіпокампу щурів було знайдено двокомпонентний НП Са2+ струм. Першій компонент за своїми кінетичними і фармакологічними характеристиками було ідентифіковано як класичний НП Са + струм. Другий компонент за своїми властивостями був схожий на високопороговий кальцієвий струм L-типу, однак він був нечутливим до органічних токсинів, що блокують канали L-типу (Avery and Johnston, 1996).

В багатьох структур експресія низькопорогових кальцієвих каналів сильно залежить від віку тварини. Разом з тим, як показали дослідження різних авторів, ця залежність в різних типах клітин виявляється по-різному. В нейронах периферичної нервової системи щурів збільшення щільності НП Са2+ каналів спостерігається безпосередньо після народження і поступово зменшується в процесі постнатального розвитку (Fedulova et al., 1991). В нейронах зорової кори щура низькопороговий кальцієвий струм можна зареєструвати на другий день після народження. На третій день щільність струму зменшується, а на 12-й день НП Са2+ струм знайти неможливо (Tarasenko et al., 1998). Інша динаміка змін НП Са2+ провідності спостерігається в таламічних нейронах вентробазального комплексу ядер та ретикулярної формації. Низькопороговий кальцієвий струм в цих клітинах збільшувався к 15-17 дню після народження, досягаючи значення близько 510 та 270 пА відповідно (Tsakiridou et al., 1995). В нейронах латеродорсального ядра таламусу присутність ITf и Its компонентів під час онтогенетичного розвитку змінювалась по-різному. Канали, що відповідають за ITf компонент, добре експресуються зразу після народження. Для РЗ нейронів щільність струму була близько 2 пА/пФ. До 12-го дня щільність збільшувалась до 4.6 пА/пФ і в подальшому практично не змінювалась

Другий компонент НП Са2+ струму можна було спостерігати наприкінці другого тижня після народження (Р14), тобто в той період розвитку, коли закінчується диференціація нейронів і створення нейронної мережі. До 17-го дня щільність цього компоненту струму збільшувалась більш ніж в 4 рази. Подібна розбіжність часових характеристик експресії двох компонентів НП Са2+ струму може вказувати на різне знаходження каналів на мембрані. Оскільки повільний компонент можна було зареєструвати в зрілих нейронах, канал, що відповідає за Irs, вірогідно, експресувався на дендритах. Раніше, знаходження НП Са2+ каналів на дендритах було показано в культивованих нейронах гипокампу: НП Са2+ струм повністю зникав після видалення дендритних відростків і не відновлювався до тих пір, поки в процесі культивування не починали зростати дендрити (Muller et al., 1992). Напроти, найбільш вірогідне місцеположення каналів, що відповідають за Ijf струм, - на сомі, оскільки вони були присутніми зразу ж після народження, коли дендритне дерево ще не дуже велике.

Розбіжності в кінетичних властивостях і часових характеристиках експресії двох типів НП Са2+ каналів може вказувати на різне функціональне значення цих каналів. «Швидкий» НП Са2+ струм, вірогідно, грає ту ж саму роль, що і НП Са2+ струм в інших збудливих клітинах, де відповідні канали з’являються на короткий період в ранньому онтогенезі. Очевидно, вони можуть генерувати Са2+ сигнали у відповідь на дуже слабке збудження, що може мати значення в регуляції морфогенезу клітини. Роль НП Са2+ каналів у кальцієвій сигналізації була підтверджена в експериментах нейронах DRG. Вимірювання показали, що вхід Са2+ через НП Са2+ канали під час коротких потенціалів дії складає 40-50% всього кальцієвого струму (McCobb and Beam, 1991). В нейронах поверхневих та глибинних шарів зорової кори низькопороговий кальцієвий струм можна було зареєструвати в перші дні після народження, а до 12-го дня він повністю зникав, тобто струм був присутній в той період, коли йде становлення міжнейронних зв’язків, зріст і визрівання нейрона (Tarasenko et al., 1998). На відміну від “швидкого” компоненту, “повільний” НП Са2+ струм є присутнім лише у зрілих нейронах ЛД ядра таламусу, і найбільш вірогідно відповідає за деякі специфічні функції, які з’являються лише у зрілих нейронів.

Таким чином, незважаючи на прогрес у вивченні НП Са2+ каналів з часу їхнього відкриття, подальші дослідження можуть призвести до більш глибокого розуміння механізмів, що регулюють зростання і диференціацію клітин, змін, які проходять у клітинах під час визрівання, механізмів, що забезпечують ритмічну активність збудливих клітин і пов’язаних з цим порушень.

ВИСНОВКИ

1. На сагітальних зрізах таламічного відділу мозку щура в нейронах латеродорсального ядра визначені особливості змін низькопорогової кальцієвої провідності в період раннього онтогенезу.

2. Встановлено, що в нейронах латеродорсального ядра таламусу триденних щурів є присутнім низькопороговий кальцієвий струм із щільністю 2,0 ± 0,2 пА/пФ і постійною часу інактивації 28,3 ± 3,6 мс (“швидкий” компонент). До дванадцятого дня постнатального розвитку щільність струму зростала до 4.6 ± 0.5

пА/пФ. В нейронах 14-и и 17-й-денних тварин суттєвих подальших змін щільності цього компоненту НП Са2+ струму виявлено не було.

3. В нейронах латеродорсального ядра таламусу щурів на 14-й-день після народження був знайдений другий компонент НП Ca2t струму із щільністю 0.9 ± 0.1 пА/пФ і постійною часу інактивації 54,2 ± 4,5 мс (“повільний” компонент). На 17-й день щільність цього компоненту НП Са2+ струму зростала до 4,1 ± 0,4 пА/пФ.

4. Знайдені два компоненти НП Са2+ струму відрізняються за фармакологічними та кінетичними властивостями. “Швидкий” компонент НП Са2+ струму ефективно блокувався ніфедіпіном з постійною Kd = 3,0 мкМ. Крім того, цей компонент ефективно блокувався іонами La3+ в концентрації 1 мкМ и був нечутливий до іонів Ni2+ в концентрації 25 мкМ. “Повільний” компонеигт ефективно блокувався іонами Ni2t в концентрації 25 мкМ і був нечутливий до ніфедіпіну в концентрації 100 мкМ.

5. Максимальна амплітуда струму “швидкого” і “повільного” компонентів спостерігалась під час деполяризації мембрани до -55 мВ и -65 мВ, а потенціал половинної інактивації становив відповідно -86 мВ та -98 мВ.

6. Отримані результати показують, що на різних стадіях онтогенетичного розвитку змінюється присутність різних типів НП кальцієвих каналів. По закінченню перших двох тижнів проходять драматичні зміни низькопорогової кальцієвої провідності, що, вірогідно, пов’язане з початком формування особливого виду електричної активності нейронів. Ці дані можуть бути корисними для пошуку специфічних фармакологічних речовин, які впливають на кальційзалежні внутрішньоклітинні процеси і механізми збудження нейронів асоціативних ядер таламусу.

За отриманими даними було опубліковано такі праці:

1. Tarasenko A. N., Kostyuk Р .G., Eremin А. У. & Isaev D. S. Two types of low-voltage activated Ca2+ channels in neurones of rat laterodorsal thalamic nucleus. // Journal of Physiology (1997), 499.1, pp. 77-86.

2. Ісаєв Д. C., Єрьомін А. В.. Палигін О. О., Тарасенко О. M. Ніфедіпінчутливий низькопороговий кальцієвий струм в нейронах латеродорсального ядра таламуса щура. //Нейрофізіологія(1997), 29, с. 136-141.

3. Tarasenko A. N., Isaev D. S., Eremin А. У. & Kostyuk Р .G Developmental changes in the expression of low-voltage-operated Ca2+ channels in rat visual cortical neurones. // Journal of Physiology (1998), 509.2, pp. 385-394.

4.1 Dzhura, A. Eremin. D. Isaev, P. Kostyuk, O. Lyubanova, V. Naidenov, Y. Shuba & A. Tarasenko. Multiple types of LVA calcium channel in brain neurons. // Low-Voltage-Activated T-type Calcium Channels. Montpellier, 1996. Book of proceedings (1998), pp. 44-52.

5. Журавльова C. О., Соткіс Г. В., Ісаєв Д. С., Єрьомін А. В.. Тарасенко О М., Костюк П. Г., Шуба Я. М. Компоненти низькопорогової кальцієвої провідності таламічних нейронів. // Нейрофізіологія (1998), 30, 249-254.

6. A. Tarasenko and A. Eremin. Low-voltage activated calcium currents in thalamic rat brain slice. // European Journal of Physiology (1995), suppl. to v.430, No.4, R32: 95.

7. A. Tarasenko, A. Eremin. D. Isaev and P. Kostyuk. Two types of low-voltage activated Ca2+ channels in rat thalamic neurones. // The 2nd meeting of European Neuroscience (1996). Abstract Book, P.13: 9.24.

8. N. Tarasenko, A. V. Eremin and D. S. Isaev. Developmental changes in the expression of different types of low-voltage activated Ca2+ channels in rat laterodorsal thalamic neurones. // ХХХШ International Congress of Physiological Sciences (1997). Abstract Book. P012.01.

9. D. S. Isaev, A. V. Eremin. A. N. Tarasenko, O. A Paligin & P. G. Kostyuk. Developmental changes in expression of low-voltage-operated Ca2+ channels in rat cortical and thalamic neurons. //The FASEB Journal (1997), 11, A971: 672.

10.Eremin A. LVA Ca2+channel is a possible drug target. // European postgraduate poster simposium “Drug discovery-99” (1999), Abstract book.

АНОТАЦІЇ:

Єрьомін А. В. Зміни низькопорогової кальцієвої провідності нейронів латеродорсального ядра таламусу щурів в період раннього онтогенезу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидату біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України. Київ-2000.

Дисертація присвячена дослідженню змін низькопорогової кальцієвої провідності у нейронах латеродорсального ядра таламусу щурів в процесі раннього постнатального розвитку. Результати проведених досліджень показали присутність низькопорогового Са2+ струму (“швидкий” компонент) вже на 3-й день після народження. На 14-й день з’являється другий (“повільний”) компонент низькопорогового Са2+ струму, який відрізняється від першого за фармакологічними та кінетичними властивостями. К 17-му дню щільність “швидкого” струму практично не змінювалась, в той час як щільність “повільного” компоненту збільшувалась в 4 рази.

Ключові слова: таламус, низькопорогові Са2+ канали, онтогенез.

Еремин А. В. Изменения низкопороговой кальциевой проводимости нейронов латеродорсального ядра таламуса крыс в период раннего онтогенеза. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины. Киев-2000.

Диссертация посвящена изучению изменений низкопороговой (НП) кальциевой проводимости в нейронах латеродорсального ядра таламуса крыс в процессе раннего постнатального развития. Впервые на таламических нейронах, расположенных в срезе мозга, было показано присутствие двух компонентов низкопорогового кальциевого тока, а также отслежены изменения НП кальциевой проводимости в раннем онтогенезе.

Низкопороговые кальциевые каналы в таламических нейронах играют принципиальную роль. Благодаря именно этому типу каналов в нейронах может развиться низкопороговый кальциевый спайк и, как следствие, веретенообразная пачечная активность - один из видов электрической активности таламических

нейронов. Кроме того, через НП Са2' каналы в клетку поступают ионы Са2+, которые влияют на множество внутриклеточных процессов, в том числе на развитие и созревание клетки. Поэтому целью настоящей работы было проследить возможные изменения НП Са2+ проводимости в первые недели после рождения.

Эксперименты проводились на нейронах, расположенных в срезе мозга, что позволило исследовать НП кальциевые токи не только на соме и проксимальных дендритах, но и на дистальных дендритах, которые теряются в процессе ферментативной обработки. Для исследований были выбраны животные четырех возрастных групп: 3, 12, 14 и 17 дней после рождения, обозначенные РЗ, Р12, Р14 и Р17 соответственно. В нейронах РЗ и Р12 был обнаружен однокомпонентый низкопороговый кальциевый ток. Регистрации токов проводились с помощью методики «пэтч-клэмп» в конфигурации «целая клетка». Вольтамперная характеристика кальциевого тока имела два пика, соответствующие низко- и высопороговому (ВП) кальциевым токам. Максимум НП тока приходился на —55 мВ, а высокопорогового - на -15 мВ. В нейронах Р14 и Р17 низкопороговый ток состоял из двух компонентов. На вольтамперной характеристике кальциевого тока присутствовало три пика, соответствующие двум компонентам НП и ВП токам. Максимумы компонентов низкопорогового тока наблюдались при деполяризации мембраны до потенциалов -65 мВ и -55 мВ.

Кинетические исследования показали, что спад НП тока, максимум которого приходится на -55 мВ («быстрый компонент»), описывается моноэкспоненциальной кривой с постоянной времени порядка 30 мс. Второй («медленный») компонент также описывался моноэкспоненциальной кривой с постоянной времени спада порядка 60 мс. Для более четкого разделения компонентов НП кальциевого тока были проведены фармакологические исследования. Было показано, что «быстрый» компонент чувствителен к нифедипину: 100 мкМ вещества вызывали обратимое подавление тока в нейронах Р12. В нейронах Р14 после аппликации 100 мкМ нифедипина «быстрый» компонент подавлялся полностью. Постоянная времени инактивации оставшегося нифедипин-нечувствительного компонента равнялась 67 мс. Постоянная времени инактивации нифедипин-чувствительного компонента, полученного как результат вычитания тока, оставшегося после приложения нифедипина, из контрольного тока, была существенно меньше и равнялась 32 мс. Кроме нифедипина было изучено влияние ионов Ьа3+ и №2+ на НП кальциевую проводимость. Оказалось, что лантан в концентрации 100 нМ эффективно блокирует «быстрый» компонент, а никель в концентрации 25 мкМ более эффективно подавляет медленный компонент. Постоянные времени инактивации никель-чувствительного и никель-нечувствительного компонентов составили 65 и 34 мс соответственно. Таким образом, компоненты низкопорогового кальциевого тока были разделены не только по кинетическому, но и по фармакологическому признакам. Стационарные инактивации «быстрого» и «медленного» компонентов также отличались. Половинная инактивация нифедипин-чувствительного и нифедипин-нечувствительного компонентов наблюдалась при значении поддерживаемого потенциала -85,5 мВ и -98,1 мВ соответственно.

На основе фармакологического разделения компонентов низкопорогового кальциевого тока были оценены амплитуды каждого компонента для каждой

возрастной группы. Результаты показали драматические изменения в выраженности двух компонентов НП Са2+ тока. В период до двух недель после рождения нейроны экспрессируют канал, ответственный за быстрый НП Са2+ ток. Амплитуда «быстрого» компонента увеличивалась со 140 пА для нейронов РЗ до 670 пА для Р17. Для нейронов Р12 и Р14 амплитуда «быстрого» компонента составила 390 и 530 пА соответственно. Выраженность «медленного» компонента существенно отличалась. Этот ток можно было зарегистрировать лишь к концу второй недели после рождения. Его амплитуда резко увеличивалась со 100 пА для нейронов Р14 до 630 пА для нейронов Р17. Плотность быстрого компонента низкопорогового кальциевого тока в течение первых 10 дней увеличивалась примерно в два раза с 2,0 пА/пФ для РЗ нейронов до 4,6 пА/пФ для нейронов Р12. Однако дальнейшего увеличения плотности «быстрого» компонента не происходило. Для возрастных групп Р14 и Р17 его плотность составляла 4,9 пА/пФ и 4,3 пА/пФ соответственно. Обратная ситуация наблюдалась в случае «медленного» компонента. Его плотность существенно увеличивалась от 0,9 пА/пФ для нейронов Р14 до 4,1 пА/пФ для клеток Р17. Этот новый тип низкопорогового кальциевого канала начинал экспрессироваться на 12-14-й день после рождения.

В работе делается вывод о возможном физиологическом значении компонентов НП Са2+ тока. «Медленный» компонент появляется в конце второй недели после рождения и, по-видимому, отвечает за специфические электрические функции данного типа нейронов, в то время как «быстрый» компонент присутствует сразу после рождение и, вероятно, играет роль в процессах развития и созревания нейрона.

Ключевые слова: таламус, иизкопороговые Са2+ каналы, онтогенез

Eremin А. V. Changes in low-voltage calcium conductance of laterodorsal thalamic rat neurones during early ontogenesis. - Manuscript.

Thesis for PhD degree by specialty 03.00.02 - biophysics. - Bogomoletz institute of Physiology NASc of Ukraine. Kiev-2000.

The dissertation is devoted to investigation of changes of low-voltage Ca2+ conductance in rat laterodorsal thalamic neurones. The obtained results indicated the presence of LVA Ca2+ current (“fast” component) at the 3rd day after birth. At the 14th day appeared the second (“slow”) component of LVA Ca2+ current. This current differs from the “fast” one by its pharmacological and kinetic properties. At the 17th day there were not substantial changes in density of the “fast” current but the density of the “slow” one became 4 times greater.

Key words: thalamus, low-voltage-activated Ca2+ channels and ontogenesis.