Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности накопления красителя флуоресцеина натрия клетками в культуре

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности накопления красителя флуоресцеина натрия клетками в культуре"

Московский ордена Ленина, ордена Трудового Красного Знамени и ордена Октябрькой Революции Государственный университет им. М.В.Ломоносова

Физический факультет

Р Г Б Ой

Тихонова Ольга Владимировна

"Особенности накопления красителя флуоресцеина натрия клетками в культуре"

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА - 1994

На правах рукописи УДК 535.333

Работа выполнена в" отделе микроэлектроники НИИЯФ МГУ

Научный руководитель

Официальные оппоненты

- доктор биологических наук, профессор Л.Б.Рубин

- доктор физ.-шт. наук, профессор В.В.Фадеев

- доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник А.Н.Ерин

Ведущая организация : - Ш&РАН, г. Москва

30

'Защита состоится _19Э4г. в ; часов в

аудитории на заседании специализированного Ученого Совета

КЗ ОФГТ (К.053.05.77) в МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, ГСН; г. Москва, Воробьевы горы, МГУ, физический факультет

'С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан " 1994 Г.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат физ.-мат. наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тгиы.

Флуоресцентная диагностика (<Ш злокачественных новообразований имеет большое значение в клинической практике. В основе метода декит способность некоторых красителей преимущественно накапливаться в опухолевых тканях. При сблучешш опухоли светом определенного спектрального состава, близкого к максимуму полосы поглощения красителя, можно получать контрастную картину распределения красителя в ткани, что позволяет 'аффективно диагносцировать локализацию опухоли. . Достоверное обнаружение местоположения опухоли необходимо и в том случае, когда в качестве лечения применяется фотодинамическая терапия (ФДТ). ФДТ , основана на том, что некоторые красители - фотосенсибилизаторы (ФС) накапливаются в опухоли и при облучении светогя в полосе поглощения переходяг в возбужденное состояние. В этом состоянии молекулы красителя участвуют в фотохимических реакциях, которые, в конечном счете, приводят к гибели клеток. Однако, красители, применяемые при ФДТ, накапливавтя не только в опухолях, но и в нормальных тканях. Исходя из этого, особое значение имеет точное определение локализации опухоли, что как раз позволяет ФД.

.Как для ФД, так и для ФДТ в качестве красителя гложет быть использованы производные гематопорфирина (ПГП) или их фракции. Однако, ПГП имеет ряд недостатков: нестабильность как на свету, так и в темноте, длительное невнведение из тканей, слабое поглощение в красной области оптического спектра, для которой характерно более глубокое проникновение света в ткани, недостаточная селективноть накопления в опухоли по сравнении с псрмсй. ■■■■•■•

В связи с этим активно ведется поиск новых, более эффективных для целей ФД красителей. Клинические исследования последних лет показали, что краситель флуоресцеин натрия {Фл) с высокой селективностью накапливается в ряде злокачественных образований человека. Этот краситель , обладает высокой стабильностью, не токсичен для организма и имеет практически стопроцентный квантовый выход флуоресценции. Это позволяет эфЗрективно использовать Фл для ФД. При этом достоверность диагностики высока - не хуже ВЪ%. Кроме того, использование Фл дает хорошую возможность для диагностики рака на самых ранних, начальных этапах развития патологии, вплоть до предрака.

- Одной из актуальных проблем в изучении возмонности ФД является исследование механизмов накопления и локализации Фл в клетках. Вагными параметрами, влияющими на накопление красителя в клетках, является концентрации "ионов водорода во внутриклеточной и внешней среде. От величины внутриклеточного р!^ зависит распределение молекул красителя по ионным формам внутри' клетки. Ввиду этого, представляется актуальной задача исследования роли рН в процессе накопления Фл клетками. Кроме того, на процесс накопления (5л в клетках влияет температура, ионный состав внешней среда, концентрация красителя во внешней среде. ^

Основной целью работы являлось исследование особенностей механизма накопления Фл клетками в культуре.

При этом решались следующие задачи:

1. Иследовать-зависимость кинетики накопления Фл в клетках от величины рН внутриклеточной и внешней среды.

2. Проанализировать изменение кинетик накопления и выведения Фл из клеток сори сменене ионного состава и величины рН внешнего

5уфера.

3. Изучить влияние температуры на накопление Фл в клетках.

4. Исследовать ■возможность связывания -Фл внутри клеток и зависимоть этого процесса от величину внутриклеточного рН и концентрации Фл в клетке.

На запггу выносятся следуиие положения:

1. Разработана методика,- позволяющая производить измерение величины внутриклеточного рН с-точностью не хуже 0,03 единиц рН з отдельно взятой клетке одновременно с исследованием накопления красителя внутри клеток'с возможной вариацией внешних параметров: рН и ионного состава внешней среды, температуры и концентрации красителя.

2. Обнаружено, что накопление красителя в клетках существенны?,! образом зависит от величины градиента рН мезду клеткой и внешей средой. Получены кинетики накопления для различных значений рНе внешнего буфера на различных клеточных культурах.

3. На основе анализа экспериментальных данных сделан вывод о . том, что краситель Фл мокет связываться с белковнми молекулами внутри клетки, причем доля связанного красителя достаточно велика и зависит от величины внутриклеточного рН^ Получены зависимости связывания Фл внутри клетки от его концентрации, причем при больших концентрациях красителя наблюдается эффект "насыщения связывания". Сделаны оценки концентрации возможных "мест связывания" в клетке ~ 10_3ТЛ, величины константы диссоциации Кд2= 5*1и энергии'связи красителя в комплексе с белком г 10кТ.

4. Проанализированы зависимости накопления Фл от ионного состава внешнего буфера и температуры. На основе полученных

кинетик был сделан вывод о несущественной роли активного транспорта и определящей роли пассивной диф$узии нейтральной форщ Фл в процессе проникновения молекул красителя внутрь клетки.

5. Иэстроена математическая модель, описывающая влияние величины рН внутри и вне клетки на процесс внутриклеточного накопления Фл, учитывающая проникновение красителя в клетку за счет пасегвной диффузии его нейтральных молекул и возможное связывание красителя внутри клетки.

6. Обнаружено явление медленного выведения красителя из клетки прг смене величины рНе внешнего буфера.

Научная новизна.

Построена математическая модель накопления Фл клетками с учетом связывания красителя в клетках. Предложенные системы уравнений учитывают распределение молекул Фл по ионным формам внутри и вне клетки и характеризуют влияние внутриклеточного и внешнего рй на щхщесс накогшения Фд.

Сделали оценки процентного содержания связанного красителя в клетке. Обнаружены зависимость накопления от концентрации красителя во внешнем буфере и эффект "насыщения связывания". Сделаны оданки концентрации возможных "мест связывания" красителя в клетке, величины константы диссоциации и энергии связи красителя в комплексе с белком. Обнаружено явление аномально медленного выведения красителя из клеток при изменении рН внешнего буфера.

Научная и практическая ценность.

Экспериментально показано, что повысить эффективность ФД можно путей дополнительного закисления внеклеточной среда .и путем

внСора оптимальной концентрации красителя.

Предложен флуориметрический метод, который позволяет определить величину рН среды, в которой находится краситель, в том числе и в клетке,.без использования дополнительных зондов и контролировать ее в процессе изменения внеших параметров.

Полученные результаты представляют интерес и с точки зрения выбора оптимальных условий для эффективного проведения ФД раковых опухолей в клинике.

Основные результаты диссертации доложены на 111 и 1V Республиканских школах-семинарах по лазерной биологии и медицине ( Тарту, 1991 и 1992 гг.) и опубликованы в 4-х печатных работах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, семи глав, заключения и списка цитируемой литературы. Диссертация излоеэнэ на //3 страницах, содержит рисунков, "7 таблиц. Список литературы включает наименований.

Во введении дана краткая характеристика исследуемых проблем, сформулированы цели, актуальность и задачи работы.

В первой главе на основе анализа данных различных экспериментальных и теоретических работ обосновывается актуальность и повышенный . интерес к проблеме исследования накопления различных красителей в клетках и тканях. Обозначен круг медицинских, биофизических и биологических проблем, которые могут быть решены в результате исследования процесса накопления красителя в клетках. В первую очередь, именно в результате

селективного накопления ряда красителей стало еозмоеным осуществлять флуоресцентную диагностику и фотодинакическую терапию злокачественных образований. В этой главе дан краткий обзор красителей, используемых в фотодинамической терапии и флуоресцентной диагностике, проанализированы требования, предъявляете к красителям,- используемым для терапии и диагностики. Общими требованиями для этих двух типов красителей являются :

преимущественное, а в случае диагностики высоко селективное, накопление красителей в опухоли

- сравнительно быстрое выведение из организма

- интенсивное поглощение в красной области спектра (650-900 ем), для которой ткани наиболее прозрачны (случай глубоколегащп опухолей).

- отсутствие токсичности под воздействии дневного света.

_В случае красителей, применяемых . для, диагностики,

существеншвят требованиями являются нетоксичность и высокая - >

селективность накопления в опухоли с достинением необходимой контрастности по отношению к норме. Всем этим требованиям безусловно удовлетворяет Фл, что позволяет эффективно использовать его для диагностики. Кроме того, проведенные клинические исследования с этим красителям, показали высокую степень достоверности- диагностики (85%).

Для красителей, используемых при фотодинамической терапии, существенный является высокая фотохимическая активность, то есть высокий квантовый выход генерации синглетного кислорода '02 или свободных радикалов. -

Исследование накопления в клетках не только красителей, но и

различных лекарственных веществ тесно связано с вопросим анализа фармакокинетшш, перераспределения и выведения различных веществ из организма.

Кроме того, способность некоторых красителей накапливаться в клетках, находится в непосредственной связи с различными параметрами клетки, влияющими на процесс накопления. Исследуя спектральные характеристики этих красителей, из»52Еение их концентрации внутри клетки в зависимости от различпнх внешних воздействий и условий , можно с хорошей точностью измерить величину внутриклеточного рН, получить топографию распределения величины рН по клетке, измерить величину трансмембранной разности потенциалов на цитоплазматической мембране клетки, получить информацию о величине и динамике изменения концентрацез ионов Са2+ внутри клетки.

В конце этой главы на основе анализа данных, приведенных в литературном обзоре, обосновывается цель и задачи диссертационной работы.

Вторая глава посвящена описанию материалов я методов, используемых в экспериментальной работе. В параграфе "Материалы" описываются условия наращивания клеток и приготовление препарата с метками для экспериментальных исследований. Препарат представляет собой проточную камеру, которая позволяет осуществлять смену внешней среды или поддерживать постоянными ионный состав, рН внешней среда и концентрацию в ней Сз в течение всего эксперимента. В этой главе приведены также составы всех используемых в эксперименте буферов и ' диапазон вариации концентраций красителя во внешнем буфере.

Поскольку регистрация накопления красителя фяуоресцеина

натрия в клетках производится по отношению сигналов его флуоресценции от клеток и от раствора, то возмокны два способа регистрации флуоресценции Фл в клетках и, следовательно, две модификации экспериментальной установки, которые и описаны в пунктах 2 и 3 данной главы. Один из них основан на равномерной засветке возбуждающим излучением всех клеток в поле видения микроскопа и регистрации всей картины в свете флуоресценции на телевизионной камере. Полученное изображение оцифровывается и обрабатывается на ЭВМ. В данном случае при регистрации изображения клеток через определенные промежутки времени можно получить кинетику накопления Фл для каждой клетки в поле видения.

Второй способ измерений основан на фокусировке возбуждающего излучения на одной клетке и и регистрации сигнала флуоресценции с помощью ФЭУ. Этот метод позволяет определять стационарное накопление Фл. Кроме того, устанавливая перед ФЭУ кассету с передвижными интерференционными фильтрами, можно проводить измерения .рН внутри клетки..В эксперименте необходимо проводить, измерения внутриклеточного рН с хорошей точностью, поскольку именно этот параметр влияет на накопление.

В . последнем пункте второй главы . описана, методика использования Фл для измерения величины внутриклеточного рН. В зависимости от рН окружения, Флв растворе может находиться в различных ионных формах. Причем спектральные характеристики 'различных ионных форм отличаются друг от друга. Отношение интенсивностей флуоресценции Фл на двух длинах волн А.^517 нм и А.г=550 нм было выбрано в качестве рН-чувствительной величины. С использованием нигерицина в пшеркалиевом буфере на клетках была построена калибровочная зависимость. Разработанная методика

Ю

позволяет определять величину рН внутри клеток с 'точностью не хуне 0.03 единиц рН.

Третья глава содержит результаты изучения зависимости накопления Фл от величины внешнего и внутриклеточного рН и сравнения экспериментальных данных с моделью накошения Фл, учитывающую наличие разницы величин рН мевду клеткой и внешней средой. Сравнительный анализ экспериментальных данных и расчитанных из модели величин приводит к выводу о необходимости учета возможного связывания Фл внутри клетки.

В эксперименте при регистрации на камере были получены кинетики накопления Фл в клетках ( рис. 1 ). Каздую такую кинетику можно характеризовать стационарным параметром накопления Г и характерным временем процесса т. Было обнаружено, что среднее по полю клеток значение стационарного параметра зависит от величины рНе внешнего буфера, в котором находится краситель. Зависимость экспериментальных средних значений Рт от величины рНе внешнего буфера' представлена "на* рис- 2. Была выдвинута гипотеза о накоплении Фл из-за наличия разности рН внутри и вне клетки. Известно, что Фл может существовать в растворе в различных зарядоглх формах, причем доля разных форм зависит от величины рН окружающей среда. Если нейтральная молекула Фл, хорошо растворяясь в липидной мембране и пассивно диффундируя сквозь нее, проникает в-клетку ( в область более щелочных рН ), то она отщепляет протон , превращается в анион и уже но макет проникнуть сквозь мембрану и еыйти из клетки. При этом изменение концентрации Фл в клетке с^ определяется потоками нейтральной формы из внешней среда в клетку и обратно.

Таким образом:

~ = СоаоК-°1а1К ( 1 >

аъ

где Сс - концентрация Фл во внешней среде, а0 и а^ - деля нейтральной формы Фл вне и внутри клетки . соответственно, К -проницаемость мембраны.

Доля нейтральной фэрш красителя может быть вычислена по формуле:

а=СН+]г/([Н+]2+к_[Н+]+К_К0) ( 2 )

В этом выражении [н+] есть концентрация ионов водорода. Константа равновесия моноанион - дианиоя есть К_=10_бЛМ, константа равновесия моноанион - нейтральная молекула есть Ко=10"и"4'М. Решение уравнения ( 1 ) для параметра накопления характеризущего отношение концентраций Фл внутри и вне клетки, имеет вид:

тЗ^/^А-етф^/т)) , где т=1/Ках ( з )

При этом стационарное значение параметра накопления есть Рщ^о/о^. Однако расчитанные - из модели--с учетом измеренных-внутриклеточных и известных внеклеточных величин рН значения оказались меньше наблюдаемых в эксперименте при тех же величинах р^ внешнего буфера. Было выдвинуто предположение, что дополнительное накопление может быть вызвано связыванием Фл внутри клетки.

Для проверки гипотезы накопления по градиенту рН между клеткой . и. внешней средой были проведены эксперименты по исследованию накопления Фл в клетках асцитной карциномы Эрлиха, результаты которых описаны в этой же главе. Эти исследованные клетки интересны тем, что величина их внутриклеточного рЕ^ меньше величины рНц внешнего буфера в диапазоне рНе= 6.2 - 7.2 ед. рН.

Предложенная теоретическая модель предсказывает незначительное накопление Фл в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Именно это и наблюдалось в эксперименте.

Кроме того, в этой главе исследуется распределение стационарных величин параметров накопления для клеток на одном и том же поле видения микроскопа при фиксированном рНе внешнего буфера, а • также распределение величин внутриклеточного рН^ для этих клеток, обсуждается зависимость от величины рН^ внутри клетки при фиксированном рН0 и исследуется распределение стационарных параметров накопления при фиксированном как внешнем, так и внутреннем рН. Для всех распределений приведены основные

параметры: средние, дисперии и коэффициенты асимметрии.

^ 1

Четвертая глава посвящена исследованию связывания Фл внутри клеток. Было установлено, что Фл внутри клеток спообен связываться с белковыми молекулами. При этом параметр накопления за счет связывания зависит от величины рН внутри клетки. Экспериментальная зависимость представлена на рис. 3. Данные получены при использовании гиперкалиевого буфера с нигерицином. В этих условиях происходит выравнивание внутриклеточного рН с внешним, и все накопление вызвано только связыванием, красителя внутри клетки.

В конце этой главы представлена теоретическая модель-накопления Фл в клетке с учетом возможного связывания красителя внутри клетки. Исходя из модели, была получена зависимость стационарного значения параметра накопления г от величины рйд внешнего буфера, теоретическая зависимость 7я(рНе) показана на рис. 2 сплошной линией. Этот рисунок демонстрирует хорошее

согласие теории и эксперимента.

Еще одрм свидетельством в пользу выдвинутой теоретической модели были 'результаты экспериментов по зависимости накопления Фл от концентрации его во внешнем растворе, результаты которых описаны в предпоследнем пункте данной главы. Предложенная теоретическая модель связывания Фл в клетке предсказывала так называемый эффект "насыщения связывания" и, как следствие, уменьшение стационарного значения параметра накопления с ростом концентрации красителя вне клеток, начиная с некоторой критической концентрации. Причиной этого является конечная концентрация возможных "мест связывания" для Фл в клетке м*'0*. В проведенных экспериментах и наблюдалось заметное уменьшение стационарного параметра накопления с ростом внешней концентрации Фл, начиная с величины с*=1*ю-4к ( рис. 4 ). Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод о линейности накопления по концентрации вплоть до 8*10 °М. Из полученной экспериментальной зависимости 1"В(С0) методом минимизации %г были сделаны оценки константы диссоциации Фл Кв=5*1й_/*Н, концентрации возможных мест связывания м*о1;=1СГ3м и энергии связи' на одну молекулу Фл в комплексе с белком ?г=10КГ.

Пятая глава посвящена исследованию изменения накопления Фл в ( клетках при варьировании ионного состава внешнего буфера. Основная часть экспериментов проводилась в сбалансированном солевом буфере Дальбекко. В буфере без ионов или Са2+

кинетика накопления Фи и значение стационарного параметра накопления не изменялись. Картина накопления не менялась и при смене полноценного буфера Дюльбекко на буфер без ионов Ка+шш к+.

Из анализа этих данных был сделан вывод о том, что активный транспорт не играет роли в проникновении Фл сквозь мембрану, и - изменение разности потенциалов на плазматической мембране клетки ( в гиперкалиевом буфере ) не приводит к изменению в накоплении красителя.

В этой главе также приведены результаты исследования кинетик накопления - выведения Фл в клетках при смене рНд внешнего буфера. Если процесс накопления в буфере с некоторым значением рН достиг стационара, и, затем, происходит смена на буфер с, более щелочным рН, то, исходя из теоретической модели, будет происходить частичное выведение Фл из клеток. Зная величины рН0 для обоих буферов и измеряя рН^ клеток для каждого буфера, можно' вычислить до какого уровня будет выведен Фл из клеток и оценить характерное время этого процесса. В эксперименте наблюдалось так ■называемое "аномально медленное выведение", то есть наблюдаемые характерные времена выведения Фл до нового стационарного уровня •• оказались-заметно больше расчитанных из модели. . Для выяснения. причин этого явления требуется серия дальнейших экспериментов и исследований.

В шестой главе .было проведено сравнение кинетик накопления Фл при различных значениях температуры. В эксперименте использовался специальный термостатированный столик, который позволял постоянно поддерживать фиксированную температуру. Измерения проводились 1фи пяти различных значениях температуры, для которых были получены стационарные параметры накопления ?ш и характерные времена г ( см. таблицу ( ).

Таблица 1. Средние значения стационарных параметров накопления, характерных времен накопления и коэффициенты проницаемости мембраны для различных значений температуры.

т (°С) т (и1п) т К (б-1)

13 °С 72 ± 13 10.4 ± 1.8 0.23

20 °С 46 г 13 10.7 1 2.5 0.36

25 °С 24-5 14 ± 4.0 0.70

28 °с 18 ± 6 • 12.5 ± 4.0 0.93

37 °с 14 ± 4 9-0 ± 2.8 1 .2

Поскольку существенное понижение температуры приводит лишь к • значительному замедлению кинетики, но не •■ влияет на • величину ■ • стационарного параметра накопления, был сделан вывод о проникновении Фл за счет пассивной диффузии сквозь мембрану клетки.

Седьмая глава посвящена сравнительному анализу двух моделей накопления Фл в клетках: за счет проникновения всех зарядовых и нейтральной формы красителя или * только нейтральных молекул красителя. Сравнение результатов теоретических расчетов и полученных экспериментальных данных позволяет сделать вывод о том, что наблюдаемое накопление гасителя в клетках обусловлено проникновением только нейтральных молекул Фл сквозь мембрану.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ВЫВОДЫ.

1. Разработана методика, позволяющая производить.измерение величины внутриклеточного рН с точностью не хуже 0,03 единиц рН в отдельно взятой клетке одновременно с исследованием накопления красителя внутри клеток с возможной вариацией внешних параметров: рН и ионного состава внешней среды, температуры и концентрации красителя.

2. Обнаружено, что накопление красителя в клетках существенным образом зависит от величины градиента рН между клеткой и внешней средой. Получены кинетики накопления- для различных значений рКе внешнего буфера на различных меточных культурах.

3. На основе анализа экспериментальных данных сделан вывод о том, что краситель Фл мокет связываться с белковыми молекулами внутри клетки, причем доля связанного красителя достаточно велика и зависит от величины внутриклеточного рН±. Получены зависимости связывания Фл внутри клетки от его концентрации, причем при больших концентрациях красителя наблюдается эффект "насыщения связывания". Сделаны оценки концентрации возможных "мест связывания" в клетке м^г, Ю-3 М, величины константы диссоциации К^ 5*10-4М и энергии связи красителя в комплексе с белком те 10кТ на одну молекулу красителя.

4. Проанализированы зависимости накопления Фл от ионного состава внешнего буфера и температуры. На основе полученных кинетик был сделан вывод о несущественной роли активного транспорта и определяющей роли пассивной диффузии нейтральной формы Фл в процессе проникновения молекул красителя внутрь

клетки.

5. Построена математическая модель, описывающая влияние величины рН внутри.. и вне клетки на .процесс внутриклеточного. накопления Фл, учитывающая проникновение красителя в {снетку за счет пассивной диффузии его нейтральных молекул и возможное связывание красителя внутри клетки.

6. Обнарукево явление медленного выведения красителя из клетки ггои смене величины pHg внешнего буфера.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих печатных работах:

1. О.В.Брагинская, К.В.Петров, В.И.Полсачез, Л.Б.Рубин, О.В.Тихонова, В.Б. Шнейдер "Накопление флуоресцеина натрия клетками в культуре"//Сб. Лазерная биология и лазерная медицина: практика, часть 1, стр. 119-125, Тарту, 1991 г.

2. О.В.Брагинская, К.В.Петров, Л.Б.Рубин, О.В.Тихонова,

А.Б.Чеботарева, В.Б.Шнейдер "Зависимость накопления флуоресцеина натрия клетками в культуре от внешних условий"//Сб. Лазерная биология и медицина. Новые применения, стр. 116-124, Тарту, 1992

3. О.В.Брагинская, В.В.Лазарев, 0.В.Тихонова, В.Б.Шнейдер "Роль связывания красителя флуоресцеина натрия в процессе его накопления в клетках" //Биофизика, т. 39, вып. 1, стр. 68-73,

,1994 г.

4. O.V.BraginskEja, Y.V.Lazarev, I.N.Pershina, K.V.Petrov,

Ъ.В.Rubin and O.Y.Tikhono7a "Sodium Fluorescein Accumulation in Cultured CellG" // Gen. Physiol. Biophys., v.12, p. 453-464, 1993

time (mm)

Рис. 1 Кинетики накопления флуоресцеина для: двух клеток К562.

7.06.0-

2.01.0-

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 С (*1СГ4М)

Рис. 4. Зависимость параметра накопления Fm от концентрации r-срасителя во знешнеи буфере

•fO

и~1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-

6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4

рН

Рис. 2 Зависимость стационарного параметра накопления К от величины рН внешнего буфера. О - эксперимент; сплошная линия — теоретическая модель.

4.0

3.5 -

3.0 -

РЕЧ

2.0

1.5 -

1.0

С)

о

?

ф ф

—1-1-1-1-1-1-1-Г"—I-1-1-1-г—

6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6

рН

Рис.3 Зависимость стационарного параметра накопления за счет связывания Р„ь от величины рН внутри клеток

2.5