Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Перенос энергии электронного возбуждения от продуктов катализируемого пероксидазой окисления гетероауксина на флуоресцирующие акцепторы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Перенос энергии электронного возбуждения от продуктов катализируемого пероксидазой окисления гетероауксина на флуоресцирующие акцепторы"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

на правах.рукописи

КРЫЛОВ Сергей Николаевич

УДК 535.379+535.373.2

ПЕРЕНОС ЭНЕРГИИ ЭЛЕКТРОННОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ ОТ ПРОДУКТОВ КАТАЛИЗИРУЕМОГО ПЕРОКСИДАЗОЙ ОКИСЛЕНИЯ ГЕТЕРОАУКСИНА НА ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ АКЦЕПТОРЫ

С3.00.С2 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученей степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1990

Работа Еиполнзна нз кафедре атомной физики, физики плазмы и микроэлектроники физического факультета МГУ.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Л.Е.Рубин, кандидат физико-математических наук В.В.Лазарев

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук Ю.В.Морозов, доктор биологических наук, профессор И.М.Иванов

Ведущая организация: Институт химической физики АН СССР.

в аудитории СфА физического факультета МГУ на заседании спе-■ циалпзлрованного совета Я 3 отделения физики твердого тела (К 053.05.77) физического факультета МГУ.

Адрес: 119399, г. Москва, ГСП, Ленинские горы, МГУ, физический факультет, ученому секретарю специализированного совета а 3 отделения физики твердого тела.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Защита состоится

Т.М.Козлова

1990 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми

Настоящая работа посвящена рассмотрению закономерностей безизлучателыгого переноса энергии от фкрмеьтатквно генерируемых электронно-возбузкдеш'ых продуктов на флуоресцирующие акцепторы. Инторес к этой проблеме вызван рядом важных результатов, полученных в последнее время. В частности, было обнаружено, что некоторые окислительные ферментативные реакции приводят к образовании долгоживущих (триплетных) электронно-возбужденных молекул-продуктоз. Эти молекулы способны передавать энергию на биологически важнче молекулы (РНК, ДНК, рибофлавин и др.) с Фотохимически-подобным преобразованием последних. Данные результаты указывают на принципиальную возможность фотохимически-подобных реакций в отсутствие внешнего источника света. Привлекательность такой гипотезы очевидна. Современная биохимия (за исключением биохимических аспектов фотосинтеза) рассматривает молекулы в основных электронных состояниях. Согласно этим представлениям, максимальная энергия, используемая в одном акте биохимической реакции, есть энергия гидролиза макроэргических связей. Она, как правило, находится в пределах 30450 кДж/ моль, что соответствует 0.3+0.5 эВ на молекулу. Это значительно ниже энергии электронного возбуждения. Если реакция требует больших затрат энергии, то она, согласно этим представлениям, протекает в несколько этячоз, получая энергию порциями. Очевидно, что использование энергии электронного возбуждения сделало бы возможным протекание таких реакций в одну стадию, аналогично истинным фотохимическим реакциям.

Эффективность темновых фотохимически-подобных реакций должна, видимо, определяться: зо-первых, эффективностью образования электронно-возбуждатых молекул-доноров энергии и, во-вторых, эффективностью переноса энергии электронного возбуждения на акцептор, который либо сам претерпевает фотохимически-подобные изменения, либо сенсибилизирует тахио изменения в других молекулах.

Цель работы и постановка задач

Целью настоящей работа являлось изучение закономорнос-

1-159/зг

тей образования электронно-возбужденных молекул, возникающих в ходе катализ!1руемого пероксидазой аэробного разложения кн-долил-З-уксусьой кислота (ИУК). а также изучение эффективности переноса энергии от этих молекул на акцепторы энергии. Используемый метод изучения - хемилюминесценпшй. В качестве акцепторов электронной энергии были выбраны фотохимически-стабильные флуоресцирующие красители.

Были поставлены следующие задачи:

1) Разработать и создать экспериментальную установку дпл изучения спектрально-кинетических закономерностей сверхзла-бой хемилшииесцепции (ЮГ).

2) Изучить спектральные и кинетические характеристики Хй в ходе катализируемого пероксидазой аэробного окисления ИУК.

3) Изучить влияние флуоресцирующих красителей на химические и хемилюминесцентные параметры реакции ферментативного окисления ИУК.

4) Определить эффективность переноса энергии с ферментативно генерируемых электронно-возбужденных молекул на флуоресцирующие красители.

Научная новизна результатов

Создана высокочувствительная автоматизированная установка, позволяющая изучать спектрально-ккштическю характе-• ристики сверхслабой ХЛ (с чувствительностью «100 квантов в сек.). Обнаружено, что при катализируемом пероксидазой окислении ИУК образуется, по крайней море, три типа электронно-всзбувдешшх продуктов, излучаюцих при разных длинах волн. Определены вотви ферментативной реакции, в которых они формируются. Изучено влияние акцепторов экергм на ход феркун-тотизной реакции. Разработан новый подход к изучешп. переноса энергии с ферментативно генерируемых злектронно-возбукденшх продуктов на эти молекулы-акцепторы. Обнаружен эффективней перенос энергии на некоторые красители из ряда ксантеновых и фенантролиновнх; показано отсутствие переноса на исследованные оксазолиновие и акридиновые красители. Определены константы Штерна-Фольмера для переноса энергии. Для объяснения эффективного переноса энергии предложена модель ассоциации фермента с красителем - акцепторы энергии. Обнаружено ранне неизвестное явление возрастания скорости фер-

ментативной реакции при переносе энергии от возбужденных продуктов, образуемых в ходе ее. Предложены гипотетические модели, объясняющие это явление.

Практическая ценность

Созданный хемилюминомэтр может быть использован при исследовании широкого круга задач. В частности, для определения активности иммунных систем растений и животных. Хекзшо-минесцентный способ может быть применен для определения концентрации ИУК.

Результаты экспериментов по спектральному и кинетическому изучению ХЛ, возникающей при окислении ИУК, могут быть использованы при реше;ши ряда задач биоэнергетики. Результаты экспериментов по переносу энергии на фдуоресцирущие красители говорят о возможности существования "фотохимии в темноте" и стимулируют исследования в данной области.

Апробация работы и публикации

Результаты диссертационной работы доложены на 18 ежегодной конференции молодых ученых и специалистов КазГУ им. С.М.Кирова (Алма-Ата, 18-22 марта 1989 г.), на 20 конференции молодых ученых биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (Москва, 24-29 апреля 1989 г.), на научных семинарах кафедры атомной физики и кафедры биофизики физического факультета МГУ. По материалам диссертации опубликовано 4 ра-' боты.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 175 страницах машинописного текста и состоит из введения, семи глав, выводов и списка литературы. Диссертация содержит 44 рисунка и 11 таблиц в тексте. Цитируется 128 литературных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Перенос энергии от форментаипзно образуемых

электронно-возбужденных молекул (обзор литературы)

В п. 1.1 рассматриваются современные представления о

2-159/у

механизмах образования и функциональной роли электронно-возбужденных молекул в биологии, вн. 1.2 - общие закономерности безызлучательного переноса энергии электронного возбуждения в растворах, в п. 1.3 - вопроси переноса энергии от ферментативчо образованных электронно-возбужденных продуктов Отмечается, что исследуемое катализируемое пероксидазой разложение ИУК является весьма сложной многостадийной реакцией, в настоящее время недостаточно хорошо изученной; в частности, не идентифицированы некоторые продукты реакции.

Глава 2. Материалы и методы

В п. 2.1 перечислены используемые в экспериментах материалы, их. источники, и способы очистки. Б работе использовались: L-гистидаш, азид натрия, пороксидаза хрена (RZ 3.0), индолил-3-уксусная кислота, индол-3-альдегид, динатриевая соль флуоресцеика, эритрозин В, родамин 6Ж, бенгальский розовый, акридиновый оранжевый, акридиновый желтый, бромистый этидий, фосфат натрия и бифосфат калия (все - "Sigma", США), глицерин ("Serva", ФРГ), этанол, перекись водорода, дважды перегнанная ледяная уксусная кислота, хлорная кислота, хлорное железо ( марки ОСЧ, отечественного производства). Окса-золиновые красители (СФОБПХ, МФОБПХ, МФОЭПТ) были любезно предоставлены проф. Е.А.Лукьянец (НИОЩК), 4'-фторзамещенный флуоресцеин был синтезирован и любезно предоставлон А.А.Оси-повым и В.И.Ильюшиным (НКИЯФ, МГУ).

В п. 2.2 описаны методы исследования; перечислены используемые в работе приборы.

Глава 3. Экспериментальная установка для изучения

свехслабой хемилюминесценции (хемилюминомегр)

В п. 3.1 описана схема (рис.1) установки. Исследуемые образцы (2) помещаются в светонепроницаемую камеру (1). Излучение одного из образцов регистрируется фотоэлектронным умножителем (ФЭУ) (3), с калиброванной спектральной чувствительностью, преобразующим кванты света в импульсы тока. Первоначально импульс тока усиливается в предусилителе (4), затем - в линейном усилителе (Ь). Дискриминатор (6) отрезает импульсы, несоответствующие требуемому участку на кривой ам-

Рис.1. Схема экспериментальной установки для изучения сверхслабой хемилюминесценции (пояснения в тексте).

плитудного распределения импульсов ФЭУ. Далее импульс подается в блок масштабирования и временной развертки (7), являющийся портом для ввода сигнала з анализатор (8) ("АРОНА", США-).

В режиме спектральных измерений в работу установки включаются: блок управления шагового деигателя 1 (9) и шаговый двигатель 1 (ЩД1) (10), вращащий барабан фильтров (11).

ХЛ от исследуемой ферментативной реакции при заданных условиях продолжается в течение нескольких часов. Целью работы, по существу, являлось изучение влияния ряда экспори-монталышх параметров (рН, концентрации реагентов и др.) на спектральные и кинетические характеристики излучения. Если измерения тгри различных значениях этих параметров проводить последовательно, то временной дрейф температуры, чувстви-

тельности ФЭУ и других трудно контролируемых параметров будет оказывать влияние на результаты. Влияние временного дрейфа можно свести к минимуму, если измерения для нескольких образцов идут как бы параллельно, т.е. циклически проводится поочередная кратковременная (»10 сек) регистрация интенсивности ХЛ от каждого образца. Для этого кюветы с образцами располагают на вращающемся барабане (14). В движение он приводится с помощью блока управления ЩЦ2 (12) и самого ШД2 (13).

Управление установкой в автоматическом режиме, а также обработка результатов измерений осуществляются с помощью микропроцессорного устройства анализатора импульсов.

Вспомогательными элементами установки являются источники питания: ?27 В, ±12 В, +5 В, +0+2 кВ, термостат (на рис. не указаны), а также переферийные устройства анализатора: клавиатура (15), дисплей (16), дисковод (17), магнитофон (18), принтер (19), графопостроитель (¿0).

Спектральное разрешение при измерении спектров ХЛ составляло «<10 нм. Наилучшее временное разрешение определяется аппаратными возможностями анализатора и составляет 1 мкс.

В п. 3.2 подробно описаны элементы установки. В п. 3.3 описаны реализуемые на экспериментальной установке режимы работы: режим спектральных измерений с ..одним образцом и режим спектральных измерений с шестью образцами.

В п. 3.4 описаны методы обработки результатов измерений. Приведены алгоритмы вычисления спектра ХЛ и аппроксимации его несколькими спектральными компонентами. Кроме того, дано краткое описание программного обеспечения для обработки результатов измерений.

Глава 4. Хемилюминесценция при катализируемом

пероксидазой аэробном окислении ИУК

В н. 4.1 изложены результаты экспериментов по изучению режима протекания реакции. Реакция катализируемого пероксидазой окисления ИУК в растворе без добавления Н202 идет с потреблением кислорода, поэтому кинетика реакции может определяться скоростью поступления кислорода в реакционную смесь. Для определения режима протекания реакции в кюветы помещались разные объемы одинаковых реакционных смесей. Та-

юм образом варьировались высоты столбов растворов. Кислород в кювету может поступать только через границу раздела раствор - воздух за счет диффузии. Если скорость поступления 02 меньше скорости его переработки, то реакция будет протекать лшь в поверхностном слое, и должно наблюдаться возрастание времени переработки субстрата с увеличением высота столба реакционной смеси. Показано, что время световой реакции не зависит от высоты столба. Креме того, наблюдается линейная зависимость интенсивности ХЛ от высоты раствора. Это позволяет заключить, что свэтосбор происходит со всего объема реакционной смеси, и что реакция протекает в кинетическом режиме.

В п. 4.2 рассматривается влияние рН на зависимость ХЛ системы МУК/ пероксидаза (НИР)/ 0, от времени. Из рис.2 видно, что при увеличении рН происходят относительное уменьшение первого во времени пика интенсивности ХЛ и рост второго.

1-10"

отсч./с

4 ■

О

рН 7.4

3.8

I

80

О 20 40 60

Время, мин.

Рис.2. Зависимость интегральной по спектру интенсивности (I) ХЛ системы МУК/ НИР/ 02 от времени при разных рН.

3-159/у

7

Изучение спектров ХЛ в этих условиях показало, что они изменяются со временем, а именно, происходит их сдвиг в коротковолновую область. Все этс указывает на конкуренцию между не сколькими ветвями реакции и, следовательно, на неоднородный характер спектра ХЛ. Показано, что спектр является суперпозицией трех спектральных компонент с максимумами при 420, 465 и 535 нм. Относительный вклад этих компонент существенно зависит от условий протекания реакции, т.е. варьируя условия, можно не только регулировать, но и контролировать ход протекания реакции.

В п. 4.3 описаны эксперименты по идентификации элек-тронно-возбукденных продуктов. Сравнение вклада трех спектральных компонент с выходом конечных продуктов реакции показывает, что возбужденные молекулы, излучаицие при 420 нм, формируются в цепи образования индола, при 465 нм - в цени образования 3-метилоксиндола, при 535 нм - в цепи образования индол-3-альдогида, что можно изобразить следующей приближенной схемой:

Ш (420 нм)

1

X.........—» индол

(465 нм)

т

ИУК —♦ .....;.....—» Х2.......—» 3-матилоксиндол

1п> (535 нм)

\т

Х3........—» индол-3-альдегид

Специальные эксперименты показали, что максимумы спектров флуоресценции реакционных смесей расположены в более коротковолновой области, чем максимумы спектров ХЛ. Это, скорее всего, указывает на то, что возбужденные продукты образуются в триплетном (фосфоресцентном) возбужденном состоянии, если предположить отсутствие переноса энергии на другие молекулы с последующим переизлучением.

Глава 5. Перенос энергии от возбужденных молекул, образуемых при катализируемом пероксидазой окислении ИУК

В п. 5.1 анализируются особенности определения эффективности переноса энергии для случая ферментативно образуемых электронно-возбужденных продуктов - доноров энергии. Особенности такой системы заключаются в том, что, во-первых, "накачка" доноров энергии (продуктов реакции) производится непрерывно по ходу реакции; кроме того, для излучающих продуктов не известны времена жизни и квантовые выходы ХЛ и, наконец, нельзя исключить, что введение в систему акцепторов энергии может оказывать влияние на путь протекания реакции. Нами была сформулирована и решена задача по определению эффективности переноса энергии от ферментативно образованных доноров энергии для общего случая, когда неизвестны излуча-тельные характеристики (время жизни и квантовый выход) донора энергии. Предложено уравнение для определения константы Штерна-Фольмера (К ) при переносе энергии.

В п. 5.2 приведены результата экспериментов по изучению влияния некотрых ксантеновых красителей на ХЛ системы ИУК/ КНР/ 02. При добавлении флуоресцеина, эритрозина к бенгальского розового происходит смещение спектра излучения в область флуоресценции красителя. Кроме того, происходит возрастание интенсивности излучения и уменьшение полного времени "световой реакции", т.е. хемилюминесцентной стадии ферментативной реакции. Степень этих изменений зависит от типа кра-. сителя и от условий протекания реакции (рис.3). Изменения спектров и интенсивности ХЛ указывают на межмолекулярный перенос энергии с ферментативно генерируемых электронно-возбужденных молекул на флуоресцирующие акцепторы. Уменьшение полного времени "световой реакции" указывает на то, что флуоресцирующие красители влияют на ферментативную реакцию, вызывая возрастание ее скорости. Эта закономерность сама по себе очень необычна и заслуживает, на наш взгляд, внимательного исследования. Кроме того ее следует учитывать при определении Ksv для переноса энергии. Очевидно, что увеличение скорости реакции приводит к возрастанию интенсивности "накачки" доноров энергии и, таким образом, может приводить к ошибкам в определении эффективности переноса энергии. Предложены две методики учета активирующего влияния красителей

Время, часы

Рис.3. Зависимость от времени квантовой интенсивности ХЛ системы ИУК/ Ш1Р/ 02, рН 7.4 при добавлении 5 мкМ различных ксантеновых красителей: 1 - флуоресцеин, 2 -эритрозин, 3 - бенгальский розовый, 4 - родамин 6Ж, 5 - без красителя.

при определении константы Штерна-Фольмера.

В п. 5.3 обсуждаются закономерности переноса энергии на представитель ряда оксазолиновых красителей - бромистый эти-дий. Обнаруконо, что перенос знерпш происходит только на начальных стадиях реакции, на которых регистрируется и возрастание скорости реакции. Кроме того отмечено незначительное изменение полного времени световой реакции.

В п. 5.4 отмечается, что введение в реакционную емзеь акридиновых и оксазо.чкновых красителей не оказывает заметного влияния ни на ход реакции, ни на ХЛ, несмотря на спектральную рапрешенность переноса энергии,

В п. 5.5 обсундаются результаты экспериментов по переносу энергии. Для переноса энергии на некоторые ксантеновые и фенантролиновые красители были получены значения К «104+105 М-1. Если считать акцептор свободно распределенным в растворэ, то характерный радиус передачи возбуждения при таких значениях К составит Ло«1000 А, что, очевидно, является аномально большой величиной. Это не может Сыть объяснено никакими известными физическими механизмами безыз-лучательной передачи электронного возбуждения. В связи с этим было высказано предположение, что краситель не является свободно распределенным в растворе, а образует комплекс с ферментом. 3 этом случае эффективное расстояние меаду фер-ментативно образованным донором энергии и акцептором будет значительно меньше, чем расстояние между донором и свободно распределенным акцептором. Опираясь на такие представления, разницу в эффективности переноса энергии можно было бы объяснить разными эффективностями связывания различных красителей с пероксидазой. Это предположение подтверждается и тем, что на родамин 6Ж перенос энергии вообще не идет, хотя по интегралу перекрытия, как уже отмечалось, его можно было бы ожидать. И, кроме того, ■ это предположение подтверждается расчетам:!, которые показали, что константа Штерна-Фольмера для переноса энергии в комплексе будет меньше или равна константе ассоциации красителя с ферментом (Кзт г; Касо). Проверка гипотезы об ассоциации красителя с ферментом обсуждается в следующей главе.

Глава 6. Комплексообразование флуоресцирующих красителей с пероксидазой

В п. 6.1 рассмотрены особенности флуоресцентных методов определения константы ассоциации (Касо) комплекса белок-краситель. Описаны методики определения К пероксидазы с флуоресцирующими красителями посредством измерения анизотропии флуоресценции'и интенсивности флуоресценции красителя при возбуждении смеси ННР-краситель в полосе поглощения кра-

сителя.

В пп. 6.2 и 6.3 изложены результаты экспериментов по определению Касс с пзроксидазой для ряда ксантеновых, акридиновых, фенантролиновых и оксазолиновых красителей (табл.1).

Таблица 1. Константы ассоциации комплекса НИР - краситель, а такжо отнокения квантовых выходов связанного и несвязанного красителя. В скобках указаны соответствующие значения рН.

Краситель к „ » ю3 м-1 асс % вз^св б

Флуоресцеин 0.3(7.4), 5.6(5.6), 1.1(3.8) 0.5

Эозин 5.7(5.6) 0.4

Родамин 6Ж 4.0(7.4) 0.5

АкридиноЕЫй оранжевый 4.0(7.4), 3.3(5.6) 0.3

Акридиновый желтый 5.0(7.4) 0.2

ФФОВПХ*) 4.0(7.4) . 0.4

МФОБПХ*' 3.3(7.4) 0.4

МОЭПХ*) 3.3(7.4) 0.4

*)

ФЮБПХ - 4[5-(4-феши1)фэ1шл-1 ,з-оксазолин-2-ил]-Н-бензшти-ридшшй хлорид, МФОБПХ - 4[5-(4-метокси)фонил~1,3-оксазолин-2-ил]-М-бвнзш2Пиридишй хлорид, МФОЭПТ - 4(5-(4-метокси)фе~ нил-1,3-оксазолш1-2-ил]-Н-этилпиридиниа толуолсульфонат.

Полученные для Касо значения значительно меньше соотвотству-мцих значений и, каззлось бы, нз могут объяснять эффективный перенос энергии. Вместе с тем, анализ методики определения Касс по анизотропии флуоресценции показывает возможность артефактов, приводящих к занижению измеряемых значений

Касс-

В п. 6.4 обсуждаются причины, способные привести к занижению измеряемой величины Каос- Среди таковых ' отмечается

возможность разрушения комплекса HRP-краситель за счет разницы энергии при поглощении кванта свата (в полосе поглощения) и при его излучении. Эта разница объясняется как чисто физическими причинами (сдвиг Стонса), так и условиями проведения эксперимента (необходимость отстройка регистрации флуоресценции от возбуждения). Разностная энергия расходуется на заселение колебательных степеней свободы молекулы красителя, т.е. на "разогреЕ" молекулярного комплекса, что может привести к разрыву стабилизирующее его связей. Полученные оценки говорят, что в условиях наших экспериментов выделяемой энергии вполне достаточно для разрушения комплекса даже с К ~1012 М~1, не говоря уже о К *105 м-1, т.е. о вели-

ä с с асс

чине, необходимой (см.п. 5.5) для объяснения измеренных значений К «105 М-1. Другой причиной занижения измеряемого значения Каос может быть невозможность регистрировать незначительные изменения величшш анизотропии флуоресценции в случае сохранения у связанного красителя, например, двух врапательных степеней свободы, способных приводить к значительной деполяризации флуоресценции. По всей вероятности, эти два явления и есть причина несовпадения Kgv и Касе.

Глава 7. Связь между переносом энергии и скоростью

ферментативной реакции

В п. 7.1 изложены результаты экспериментов по изучению влияния флуоресцирующих красителей на скорость ферментативной реакции. Как уже отмечалось, добавление некоторых красителей в систему ИУК/ ННР/ 02 сопровождается активацией разложения ИУК. Это можно наблюдать как по уменьшению полного вромени световой реакции (см.рис.З), так и по ускорению переработки субстрата, наблюдаемому с помощью колориметрического метода (рис.4). В таблице 2 приведены значения Ksv, степени сокращения времени световой реакции (Т-Т )/Т, (Т и

кр

'Г - соответственно длительности ХЛ без красителя и в его присутствии), а также коэффициенты ускорения переработки субстрата v /и, (и и v - соответственно скорости переработки субстрата в присутствии и в отсутствии красителя).

При анализе табл.2 обращает на себя внимание тот факт, что для всех ксантеновых красителей имеется прямая корреляция между эффективностью переноса энергии и степенью умень-

1J

Таблица 2. Перенос энергии на различные красители и активация ферментативной реакции, возникающая при их добавлении.

Краситель К [М-1 ] (Т-Т )/Т [%] икр/и

флуоресцеин фгорзвмещенный флуоресцеин эритрозин бенгальский розовый бромистый этидий родамин 6Ж 1.2«105 3.8*104 1.1*10* «104 2.4»10л 0 34 23 17 ГУ 1 0 0 4.9 4.2 3.3 1.7 2.1 1

Таблица 3. Перенос энергии на флуоресцэин и активация им реакции при различных рН. . .

рН 5.6 6.2 7.4

2.7x104 8.3«10А 1.2*10 5

ик/и 1.5 3.9 4.9

шения полного времени световой реакции, т.е.' эффективностью активации. Добавление бромистого этидия, как уже отмечалось, не приводит к уменьшению полного времени световой реакции, однако вызывает ускорение исчерпания ИУК на начальных стадиях реакции, когда и наблюдается аффективный перенос энергии на этот краситель.

Аналогичная корреляция наблюдалась при использовании в качестве акцептора одного из красителей - флуоресцеина, но при изменении рН раствора. Как уио отмечалось, при изменении рН изменяются как ход ферментативной реакции так и спектр ХЛ системы ИУК/ННР/02. Спектр же поглощения флуоресцеина в том же диапазоне рН меняется незначительно. Таким образом, изменяя рН реакционной смеси, можно изменять интеграл перекрытия за счет изменения спектров излучения донора при практически неизменном спектре поглощения акцептора и, следовательно, влиять на эффективность переноса энергии. В табл. 3 приведе-

ны значения коэффициентов ускорения реакции и /о, а также

кр

значения Ка5. для переноса энергии. Из табл.3 видна прямая связь эффективности переноса энергии на краситель со степенью производимой им активации ферментативной реакции. На основе этих фактов было выдвинуто предположение о том, что перенос энергии оказывает влияние на скорость катализируемого пероксидазой разложения ПУК.

Время, мин.

Рис.4. Влияние ксантеповых красителей на зависимость от вро-мени концентрации ИУК в системе ИУКЛШР/О , рН 7.4: 1 - без красителя, 2 - бенгальский розовый (5 мкМ), 3 - эритрозин (5 мкМ), 4 - флуоресцеин (5 мк.4), 5 -родамин 6Ж (5 мкМ).

П. 7.2 посвящен обсуждению возможных механизмов влияния переноса энергии на скорость ферментативной реакции, современные представления о действиях активаторов ферментативных реакций сводятся к тому, что активатор ассоциируется с ферментом и вызывает изиене'юш конформацки белка, способствующие ускорению реакции. Такое объяснение, очевидно, является весьма общим и не обозначает конкретных механизмов процесса активации. Обнаруженная корреляция мовду переносом знергии и активацией ферментативной реакции позволяет предположить, что активация катализируемого пвроксидазой окисления ИУК вызывается переносом энергии от электронно-возбуздекн• :с продуктов реакции. Т.к. передача энергии алек-тронного возбуждения идет от продуктов реакции, то можно заключить, что именно она может каким-то образом активировать процесс распада комплекса фермбнт - продукт (ЕР).

В диссертации рассмотрены два из возможных механизмов возрастания скорости ферментативной реакции при передаче энергии от ферментативно образуемых электронно-возбужденных молокул на флуоресцирующие акцепторы: разрыв комплекса фермент - продукт и влияние переноса энергии на электронно-конформвциошше взаимодействия в белке. 1) Разрыв комплекса фермент-продукт

Известно, что продукт, образованный в активном центре фермента часто оказывается весьма прочно связан с активным центром фермента. Стадия разрыва этого комплекса может быть лимитирующей в реакции. Энергию для разрыва комплекса ЕР способен поставлять "термостат", ко при больших значениях свободной энергии комплексообразования и при комнатной температуре вероятность этого процесса невелика в связи с низкой заселенностью высоких колебательных уровней Есех молекул. Если молекула продукта образуется в электронно-возбужденном состоянии, то на разрыв связи продукт - фермент может потенциально быть затрачена часть энергии электронного возбуждения. Это возможно в том случае, если часть электронной энергии передается на возбуждение колебательных степеней свободы молекул продукта. Согласно принципу Франка-Кондона, излуча-телышй переход с верхнего электронного состояния в нижнее всегда наиболее вероятно происходит с заселением колебательных степеней свобода последнего (переход 1 на рис.ба), обес-

а

б

Рис.5. Диаграмма энергетических переходов в молекуле продукта: а - в отсутствии акцептора энергии, О-в присутствие акцептора.

печивая, таким образом, принципиальную возможность разрыва связи белок-продукт. Очевидно, что необходимым условием для этого является превышение колебательной энергии над энергией связи. Однако, если возбужденное состояште продукта является триплетным (до.ягоживущим), то излучательный переход 1 становится запрещенным по спину и имеет низкую константу скорос-

.■и. Безызлучательний переход 2 также маловероятен. Таким образом, молекула продукта может оказаться в метастабилыюм связанном состоянии, препятствуя восстановлению активной формы фермента. Если вблизи электронно-возбужденного продукта находится эффективный акцептор энергии, то происходит стимулированный переход 1 (рис.56) со скоростью значительно большей, чем без акцептора. Далее избыток колебательной энергии основного состояния продукта тратится на разрыв комплекса белок-продукт (амплитуда колебаний столь велика, что молокулы перестают быть связанными) и фермент возвращается в активное состояние. Таким образом, наличие красителя (в качестве акцептора) вблизи электронно-возбужденного продукта может увеличивать скорость ферментативной реакции. В данной модели важным является возможность ассоциации красителя вблизи активного центра фермента, причем на таком расстоянии от электронно-возбужденного продукта, чтобы скорость три-плет-синглетного переноса энергии была достаточно велика. Согласно существующим представлениям это расстояние должно допускать перекрытие электронных оболочек молекул донора и акцептора.

2) Электрокно-конформационные взаимодействия Известно, что изменение электронного состояния фермента приводит к изменению его конформации. Можно представить ситуацию, в которой триплетное электронное возбуждение продукта, образованного в активном центре, вызывает препятствующие его выходу конформационные преобразования в белке. Причиной таких конформационшх изменений может быть, например, поляризация белковой матрицы в поле диполя возбужденного продукта. Характерные времена конформациониых изменений ферментов т>10~3 с. Они вполне достаточны для длительного блокирования выхода продукта из активного центра.

Наличие красителя (в качестве акцептора энергии) вблизи электронно-возбужденного продукта будет приводить к быстрому переносу энергии от продукта на флуоресцентное состояние красителя с последующим быстрым излучением кванта света. Очевидно, что этот процесс может весьма эффективно конкурировать с электронно-конформационными взаимодействиями и, таким образом, ускорять выход продукта из активного центра фермента и вызывать возрастание скорости ферментативной ре-

акции.

Как и в первой модели, здесь требуется близкое располо-кение акцептора к электронно-возбужденному продукту для разрешения триплет-синглетного переноса энергии. Отличие состоит в том, что во второй модели ферменту придается более активная роль - предполагается важность мобильности ого структуры.

ВЫВОДЫ

1) Создана высокочувствительная автоматизированная установка, позволяющая изучать спектрально-кинетические характеристики сверхслабой ХЛ («100 квантов в сак.)

2) Обнаружено, что при катализируемом пвроксидазоЯ окислении ИУК образуется, по крайней мере, три типа элоктронно-возбуждешшх продуктов, излучающих при разных длинах волн. Опрэдэлины ветви ферментативной реакции, в которых они формируются.

3) На основе учета влияния йлуоресцируищх красителей на ход ферментативной реакции разрзботан лоеый подход к изучению переноса энергии с Ферментативно генерируемых элоктронно-возбуждешшх молекул на эти красители.

4) Изучен перенос энергии с ферментативно генерируемых элек тронно-возбуждешшх молокул на некоторые флуоресцирующие красители из ряда ксантеновых, акридиновых, фэнантролшэ-внх и оксазслшювых. Обнаружен эффективный перенос энергии на ксаитеьоЕые и фенантролиновке красители. Спраделе-ны константы Штерна-Фольмера для переноса энергии.

б) Предложена ассоциативная модель для объяснения эффективного переноса энергии.

6) Обнаружено ранее неизвестное явление возрастания скорости ферментативной реакции при переносе энергии от возбувдбн-ных 1фо.дуктов, образуемых в ходе ее на некоторые флуоресцирующие красители.

7) Предложены гипотетические модели, объясняющие это явление.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Крылоз С.Н. Генерация электронно-возбужденных состояний при ферментативном окислении фитогормона - ИУК. - В сб.: Тезисы докладов Кеквуз. дсонф. мол. ученых КазГУ - Алма-Ата, 1989, 4.1, с.164.

2. Крылов С.Н. Перенос энергии с форментативно образованных электронно-возбужденных молекул на флуоресцирующие акцепторы. - В сб.: Проблемы современной биологии. Тр. 20 научи. конф. молодых ученых биол. фак. МГУ. - М., 1989, ч.-2. с.1У9-203. - Деп. в ВИНИТИ 5.02.90. й 642-В90.

3. Крылов С.Н., Лазарев В.В., Рубин Л.Б. Кинетика спектров • хемилюминесцанции при окислении гетероауксина пероксида-

зой. - Докл. АН СССР, 1990, т.310, * 4, с.1000-1004.

4. Крылов С.Н., Лазарев В.В., Рубин Л.Б. Изучение кинетических и спектральных характеристик квантовой интенсивности хемилюминосценции а также переноса энергии на некоторые флуоресцирующие акцепторы при аэробном окислении ИУК пе-роксидазой. - Деп. в ВИНИТИ 15.02.90. * 939-В90.

Полп.в печ.9.10.90. Формат изд.60x84 1/16

Объем 1.Я£п.л Заказ 159 Тптох 1 Т)__

ГТП"Печатник"Мосгорпечать Н.Краснохолмская д.5