Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение процессов ингибирования и инициации пероксидазно-оксидазной реакции окисления гетероауксина

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение процессов ингибирования и инициации пероксидазно-оксидазной реакции окисления гетероауксина"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

Р Г Б ОД

_ п л t/T ЩГ,

Ulli ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.334

ЧЕБОТАРЁВА Алла Борисовна

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ИНГИБИРОВАНИЯ И ИНИЦИАЦИИ ПЕРОКСИДАЗНО-ОКСИДАЗНОЙ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ ГЕТЕРОАУКСИНА.

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА - 1995

Работа выполнена в отделе микроэлектроники НИИЯФ МГУ

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор Рубин Л.Б, кандидат физ.-мат. наук, с.н.с. Лазарев В.В.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Агауллаханов Ф.И. доктор биологических наук, профессор Веселовский В.А.

Ведущая организация

- Институт химической физики РАН им. Н.И.Семёнова

/ ^ р

Защита состоится "А?" «^Г^ГХх 1995 г. в часов в

аудитории на заседании диссертационного совета №3 ОФТТ

(К.053.05.77) в МГУ им. М. В.Ломоносова по адресу: 119899, ГСП, г.Москва, Воробьёвы горы, МГУ, физический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан "{Зи СС 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат физ.-мат. наук

Котельникова О.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы.

Настоящая работа посвящена изучению механизма ингибирова-ния и инициации пероксидазно - оксидазной реакции окисления ин-долил-3-уксусной кислоты (ИУК). Интерес к исследованию этой реакции вызван рядом причин. Во-первых, ИУК является важным фито-гормоном, стимулирующим рост растений. Окисление ИУК эндогенными окевдазами, по-видимому, определяют ее активность in vivo. Регуляция же ферментативного окисления ИУК in vivo происходит при воздействии природных ингибиторов данной реакции, например, некоторых фенольных соединений. Во-вторых, пероксидазно- оксидазное окисление ряда субстратов, в том числе и ИУК и NADH является предметом активного как экспериментального, так и теоретического исследования. Интерес со стороны исследователей вызван прежде всего возможностью наблюдения в этих реакциях широкого спектра сложных динамических режимов: триггерного (бистабильность), автоколебательного с существованием двух предельных циклов (большого и малого), хаоса. Изучение различных режимов является в свою очередь инструментом в исследовании: позволяет строить модель пероксидазно-окси-дазной реакции, выявляя различные ее ветви.

В настоящее время не существует общепринятой точки зрения на механизм протекания реакции ферментативного окисления ИУК и проблемы, связанные с ее ингибированием и активацией. Поэтому целью данной работы являлось изучение основных закономерностей процессов ингибирования и инициации как инструмента в исследовании основных механизмов протекания реакции ферментативного окисления ИУК . Используемые методы исследования - хемилюминесцент-ный и спектрофотометрический.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние различных фенольных соединений на реакцию ферментативного окисления ИУК пероксидазой хрена (HRP).

2. Исследовать возможность реинициации остановленной реакции различными способами.

3. Создать математическую модель, описывающую явления ин-гибирования и инициации данной перохсидазно-оксидазной реакции.

Научная новизна.

Обнаружены и исследованы пороговые эффекты при инициации остановленной КК реакции пероксвдазно-оксидазного окисления ИУК при добавлении перекиси водорода и под действием видимого света в присутствии фотосенсибилизатора. Проведено сравнение эффективности различных красителей-фотосенсибилизаторов в системе ИУК/КК/НЯР/Ог. Построена математическая модель, хорошо описывающая экспериментально наблюдаемые пороговые эффекты.

В ходе изучения влияния ксантеновых красителей на ферментативное окисление ИУК опровергнута распространенная точка зрения о существовании процесса переноса энергии от возбужденного субстрата к красителю в ходе этой реакции.

Научная и практическая ценность.

Полученные результаты свидетельствуют в пользу свободно-радикального механизма реакции пероксидазно-оксидазного окисления ИУК, протекающей in vivo . Описывается механизм действия различных фенольных ингибиторов, в том числе и природных, на аэробное ферментативное окисление ИУК, что дает возможность контролировать функции фитогормона ИУК in vivo.

Исследование явлений бистабильности при ингибировании и инициации реакции окисления ИУК и их моделирование актуальны для направления, изучающего сложные динамические режимы в химических системах.

Апробация работы и публикации.

По теме диссертации сделан доклад на 21-й Конференции Американского Общества Фотобиологов (Чикаго, июнь 1993). Основные результаты диссертации опубликованы в 6 печатных работах.

Объём и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, шести глав, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 111 страницах, содержит ЪЦ рисунков, таблиц. Список литературы включает «го наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Глава 1. Роль свободных радикалов в реакции пероксидазио-

оксидазпого окисления ИУК (обзор литературы).

В п. 1.1. приводятся различные точки зрения на механизм реакции окисления ИУК пероксидазой. Отмечается, что исследуемое катализируемое пероксидазой окисление ИУК является весьма сложной многостадийной реакцией, в настоящее время недостаточно хорошо изученной. П. 1.2 посвящен описанию хемилюминесценции (XJI), сопровождающей реакцию окисления ИУК. В п. 1.3. рассматриваются современные представления о механизмах ингибирования ферментативного окисления ИУК фенолышми соединениями.

Глава 2. Механизмы фотосеисибилизированного окисления (обзор

литературы).

Поскольку описываемое в экспериментальной части явление фотоинициации ингибированной реакции окисления ИУК происходит в присутствии в системе красителей-фотосенсибилизаторов, эта глава посвящена описанию реакций, которые могут протекать в реакционной смеси под действием света. В п.2.1. рассматривается общая теория

процесса фотосенсибилизированного окисления, в пп.2.2. и 2.3. -основные пути взаимодействия фотосснсибилизатора с кислородом и с субстратами, в п.2.4. содержится обобщение всех известных механизмов фотосенсибилизированного окисления и обсуждается роль свободных радикалов в этих процессах.

Глава 3. Материалы и методы.

В п.3.1. перечислены используемые в экспериментах материалы, их источники, способы приготовления растворов..

В п.3.2. описаны методы исследования, перечислены используемые в работе приборы. Основные методы изучения реакции - хемилю-минеецентный и сиектрофотометрический. Кинетики и спектры XJI в ходе ферментативного разложения ИУК регистрировались на хемилю-минометре, созданном в нашей лаборатории. В светонепроницаемой термосгатирусмой камере располагался барабан с держателями для шести кювет. Барабан приводился во вращение шаговым двигателем. Под дном кюветы располагался чуствительный фогокатод ФЭУ-130. Область спектральной чувствительности ФЭУ находилась в пределах от 200 до 650 им, при максимальной чувствительности - 400 им. Фотоэлектронный умножитель работал в режиме счета фотонов.

Для снятия спектров XJ1 на второй вращающийся барабан между дном кюветы и фотокатодом ФЭУ помещался набор обрезающих оптических фильтров . Он также приводился в движение шаговым двигателем.

Импульсы, генерируемые ФЭУ, регистрировались многоканальным анализатором импульсов LP 4900В ("AFORA", США). Многоканальный анализатор снабжен микропроцессорным устройством, которое осуществляет контроль за ходом эксперимента н позволяет обрабатывать получаемые результаты.

В экспериментах, связанных с фотоинициацией остановленной реакции, для облучения реакционной смеси видимым светом использовался осветитель ОВС-1. Интегральная плотность мощности излуче-

ния измерялась с помощью радиометра EGG-550 (США ), и составляла (7.1 ± 0.5)*10"3Вт/см2 . Спектр излучения снимался на оптическом многоканальном спектроанализаторе OSA WP-4 (Spectronic, ФРГ). Свет по световоду заводился в камеру хемилюминометра. Кинетику хемилюминесценции начинали регистрировать через 20 секунд после окончания освещения. Интенсивность источника света изменялась с помощью стандартных стеклянных нейтральных фильтров.

Спектры поглощения снимали на двухлучевом спектрофотометре "HITACHI 557" (Япония), используя хварцевые кюветы с длиной оптического пути 1см. Образование продуктов окисления ИУК наблюдали по разности поглощения на 242 и 296 нм (длины волн, на которых коэффициент экстинкции ИУК одинаков).

Глава 4. Ингибирование реакции окисления ИУК фенолами.

В этой главе приводятся экспериментальные данные по влиянию различных фенольных ингибиторов на ферментативное окисление ИУК.

При изучении влияния ряда фенольных ингибиторов на систему ИУК/ЬШР/02 наблюдался пороговый эффект: концентрация ингибитора ниже определенного (порогового) значения не вызывала остановку окислительной реакции. Если концентрация ингибитора превышала пороговое значение, то хемилюминесценция не наблюдалась и реакция прекращалась. Пороговая концентрация ингибитора зависит от его химической природы: (Табл.1 )

Таблица 1. Минимальные концентрации ингибиторов необходимые для остановки реакции окисления ИУК (1мМ) катализируемого пероксцдазой (0.1 мкм) (ингибитор добавлялся до фермента)

Пороговая концентрация

Ингибитор ингибитора (мкМ)

Кофейная кислота 0.40 н- 0.45

Пороговая концентрация

Ингибитор ингибитора (мкМ)

Галловая кислота 1.20- 1.32

Гидрохинон 0.52 - 0.64

Катехол 0.64 0.80

3,4-Диметилфенол 18.4 * 20.0

4- М етоксифенол 0.96 - 1.04

2-Аминофенол 0.96 4 1.04

6-Хлоро-4-нитро-2-аминофенол 1.20 ч- 1.28

Ингабированная реакция спонтанно реинициировалась через некоторое время задержки. Спонтанная реинициация наблюдалась лишь когда концентрация ингибитора ненамного превышала пороговое значение. В обратном случае время задержки было больше, чем максимальное время наблюдения (36 часов). Логарифм величины задержки был пропорционален концентрации ингибитора.

Из проведенных нами экспериментов однозначно вытекает, что фенольные ингибиторы не действуют ни на фермент, ни на субстрат. Действительно, остановленная нэдпороговой концентрацией ингибитора реакция не инициируется при добавлении фермента. Кроме того, пороговая концентрация ингибитора не зависит от концентрации фермента, если фермент добавляется к субстрату после ингибитора. Эти данные исключают возможность существенного влияния ингибитора на активность фермента.

Надпороговая концентрация ингибитора примерно на три порядка ниже начальной концентрации субстрата. Последнее указывает на то, что выведение субстрата из реакции за счет связывания с ингибитором также невозможно, т.е. ингибитор не действует на субстрат.

Для объяснения порогового эффекта при ингибировании мы предположили, что ингибитор, который не действует ни на фермент, ни на субстрат, действует как ловушка свободных радикалов II, участвующих в цепной реакции окисления И УК. Л является производным

субстрата 8 и его следовые количества присутствуют в растворе субстрата.

Независимость величины пороговой концентрации ингибитора от срока хранения раствора ИУК позволяет предположить, что радикал Я находится в квазиравновесии с субстратом 8: к!

Б -> Я (4.1)

Известно, что пероксидазно-оксидазные реакции могут протекать в режиме ферментативной свободно-радикальной цепной разветвленной реакции. Грубо цепная разветвленная реакция может быть описана следующим уравнением реакции: к2

5 + Я-> 2Я (4.2)

ИНР.02

Рост скорости цепной реакции будет ограничен квадратичной реакцией уничтожения радикалов Я: кз

Я + Я К-К (4.3)

Опираясь на идентичность действия ловушки радикалов - анфена и изученных нами фенольных соединений на ферментативное окисление ИУК, можно предположить, что фенольные ингибиторы являются, по существу, ловушками (тушителями) свободных радикалов К:

к4

Я + I I» + Р, (4.4)

где I и 1° - ингибитор и его радикал соответственно, Р[ - продукт реакции. Радикал ингибитора может, в свою очередь, восстанавливаться до молекулы ингибитора: к5

1° -> I (4.5)

здесь донор электрона не конкретизирован. Кроме того, очевидной является реакция квадратичного "необратимого " уничтожения I:

к6

Iе + Г -> I-I (4.6)

Предполагается, что I" менее реакционноспособный, чем R в отношении реакции (4.2.), т.е. 1° не может приводить к развитию цепной реакции.

Полученная экспериментально немонотонная зависимость задержки реакции от концентрации пероксидазы говорит, видимо, о том, что реакция (4.2.) не единственная реакция с участием фермента и радикала R. При большой концентрации фермента становится существенной реакция ферментативного уничтожения R:

R + HRP <=> RHRP-> Р2 + HRP (4.7)

где Рг - продукт реакции.

Согласно этой системе пороговый эффект описывается следующим образом. Реакции (4.1)-(4.4) и (4.7) указывают на существование некоторой критической концентрации ингибитора, при которой коэффициент размножения радикалов R будет равен единице. Если концентрация ингибитора выше критической, то коэффициент размножения меньше единицы, ниже - больше единицы. В первом случае реакция останавливается. Во втором случае цепная реакция развивается лавинообразно до тех пор, пока ее скорость не ограничится реакцией (4.3). При этом концентрация ингибитора относительно быстро стремится к нулю за счет реакций (4.4) и (4.6). Данная критическая концентрация ингибитора соответствует, видимо, экспериментально определяемой пороговой концентрации ингибитора.

Спонтанная решшциация реакции, наблюдаемая для некоторых ингибиторов , возникает, вероятно, потому, что даже в остановленной реакции, благодаря процессу (4.1), концентрация R не равна нулю. При этом происходит медленное "небратимое" уничтожение ингибитора в процессах (4.4) и (4.6). В некоторый момент времени концентрация ингибитора становится ниже критического значения. Коэффициент размножения свободных радикалов R становится больше единицы и

цепная реакция лавинообразно развивается. Концентрация ингибитора относительно быстро стремится к нулю, окисление ИУК протекает по объпной кинетике.

Глава 5. Инициация реакции окисления ИУК, ингибировашгой кофейной кислотой.

В п.5.1 приводятся результаты экспериментов по проверке влияния перекиси водорода на ингибированную реакцию окисления ИУК. Было обнаружено, что добавление перекиси водорода приводит к инициации остановленной реакции. При этом наблюдался пороговый эффект: инициация имела место только когда концентрация перекиси водорода была больше некоторого порогового значения (рис.1).

Time, hours

Рис.1. Влияние добавления Н2С>2 на XJI системы 1мМ ИУК/ 1мкМ К К/ 0.1 мкМ HRP. Концентрация Н2О2 (мкМ): 1) 0 (контрольный эксперимент без КК); 2)0.2; 3)0.05. Стрелкой указан момент добавления II2O2. Вставка содержит спектрофотометроческис данные по формированию продуктов окисления ИУК в условиях, показанных на рисунке.

Величина пороговой концентрации перекиси водорода пропорциональна концентрации кофейной кислоты в системе ИУК/НЯР/Ог- Общее количество перекиси водорода, необходимое для

п

инициации остановленной реакции при добавлении перекиси небольшими порциями с интервалом 6-7 минут было больше, чем в случае добавления одной порцией. Также проводился спектрофотометрический анализ системы при порционном добавлении Н2О2, откуда можно заключить, что в реакционной смеси происходит постепенное разложение КК - исчезает характерный максимум поглощения КК на 310 нм.

Полученные экспериментальные результаты обсуждаются в контексте свободно-радикальной цепной реакции ферментативного окисления ИУК.

В п.5.2. представлены результаты экспериментов по фотоинициации остановленной реакции в присутствии красителей-фотосенсибилизаторов. Нами было впервые обнаружено и исследовано явление фотоинициации реакции окисления ИУК, остановленной КК. Установлено, что процесс фотоинициации происходит только в присутствии в системе ИУК/НЯР/Ог/КК красителя-фотосенсибилизатора. Из семи исследованных красителей - бенгальского розового (БР), метиленового голубого (МГ), эозина У (ЭУ), флуорссцеина натрия (Фл), эозина В , эритрозина , и родамина 60 - фотоинициация наблюдалась лишь с БР, ЭУ, МГ и Фл.

Для фотоинициации наблюдался пороговый эффект: если время освещения было больше некоторого порогового значения, то наблюдалась характерная для окисления ИУК кинетика хемилюминесценции (Рис.2 , кривая 1), т.е. происходила инициация ингибированной реакции. В противном случае наблюдаемая кинетика хемилюминесценции была близка к экспоненциально затухающей (Рис.2 , кривая 2) - инги-бированная реакция не инициировалась. При исследовании спектра ХЛ системы ИУК/Щ1Р/О2/КК/краситель в экспериментах по фотоинициации было выяснено, что происходящий после прекращения освещения процесс "иысвечивания" (см. рис.2 ), имеет максимум на длине волны флуоресценции красителя.

h» \

Время, мин.

Рис. 2. Кинетика хемшюминесценции системы 1мМ ИУК/0.1 мкМ HRP/ 0.5мкм КК: (1) - в случае решшциации при времени освещения t—10 с. (2) - при отсутствии рсииициации: t=5 с.

Из величины порогового времени облучения было определено полное число квантов света, поглощенных раствором красителя за время облучения, неоходимое для инициации реакции:

N = * V* t* Тф.)* 1(1)* Xd\, hc

что справедливо для 2.3*s(X)*x*[D) « 1

Здесь i.Q.) - экстинкция красителя , 1(>.) - спектр излучения лампы, [D] - концентрация красителя, х - толщина слоя раствора в кювете, h - постоянная Планка, с - скорость света, V - объем стандартной реакционной смеси, t - время облучения раствора.

Зависимость между концентрацией кофейной кислоты I в реакционной смеси и дозой поглощенных квантов N оказалась линейной со всеми используемыми фотосенсибилизаторами, как видно из рис.3. Из рис.3 можно получить данные о сравнительной эффективности использованных фотосенсибшшзаторов (Таблица 2 ).

о с

8 Т

4 -г

3 -

2 -

1 -

!пор

I, Концентрация КК, мкМ

Рмс.З. Зависимости полного числа поглощенных квантов N. необходимых для рс инициации, от концентрации КК 1 для красигелей: (1)ЭУ, 0.2мкМ; (2) МБ, ЗмкМ; (3) БР, 1мхМ; (4) Фл, 2мкМ, в системе 1мМ ИУК/ ОЛмкМ ИКР

Таблица 2.

Краситель Фл БР МГ ЭУ

относительная эффективность 1 2.5 4.9 7.4

Проведенные измерения показали, что доза поглощенных квантов 14, необходимая для инициации реакции, не зависит от интенсивности облучения и концентрации красителя.

Для более полного понимания механизма фотоинициации было исследовано влияние ксантеновых красителей на нормально протекающее аэробное окисление ИУК пероксидазой, о чем идет речь в п.5.3.. Было обнаружено, что добавление красителей в систему ИУК/НЯР/02 приводит к : а) появлению в спектре ХЛ полосы, соответствующей флуоресценции красителя; б) увеличению полной интен-

сивности XJ1; в) уменьшению времени световой реакции; г)ускорению окисления ИУК и д) слабому обесцвечиванию красителя.

Кроме того, исследовалось влияние системы HRP-H2O2 на ксантеновые красители. Было обнаружено, что красители обесцвечиваются в присутствии HRP и Н2О2 . Обесцвечивание сопровождается хемшиоминесценцией, спектр которой совпадает со спектром флуоресценции красителя. Используя флуоресцеин , мы определяли количество квантов, излучаемых (при длине волны флуоресценции красителя) при окислении одного моля красителя. Эта величина оказалась равной V]=(4±0.4)*1014 для системы ИУК-НИР-02 -краситель и v2 =(4.2+0.1) *1014 для системы Н2О2 -HRP-краситель. Значения vi и \>2 совпадают в пределах экспериментальных ошибок. Очевидно, что излучение в системе Н2О2 -HRP-краситель вызвано только окислением красителя. Если бы в системе ИУК-НЯР-Ог -краситель в излучение красителя вносил вклад перенос энергии с ферментативно образуемых электронно-возбужденных продуктов, то это привело бы к возрастанию vj относительно vi . Таким образом, мы можем заключить, что перенос энергии не вносит вклад в излучение красителя в системе ИУК-HRP-02 -краситель. Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод о том, что все спектральные и кинетические изменения ХЛ, возникающие при добавлении красителей в систему ИУК-НКР-Ог , являются результатом совместного окисления ИУК и красителей.

В п.5.4. обсуждаются результаты экспериментов по фотоинициации ингибированной реакции окисления ИУК. Механизм фотоинициации исследуемой реакции рассматривается исходя из известных механизмов фотосенсибилизированного окисления биологических субстратов. Образованные под действием света триплетно - возбуждённые молекулы способны вызвать пояазение свободных радикалов. Такой процесс можно представить в следующем сокращенном виде: h\

D + S + 02-»D + R-t- 020- (5.1.)

где О - краситель, Б - субстрат, Л - радикал субстрата. Краситель в такой реакции выступает как переносчик электрона от субстрата к кислороду.

Таким образом, в предположении свободно - радикального механизма реакции ферментативного окисления И УК и рода КК как ловушки свободных радикалов, участвующих цепной реакции, в ходе реакции (5.1) в систему вносится некоторое количество радикалов Я, что приводит к инициации реакции. Непосредственная регистрация радикалов, образующихся при освещении в наших экспериментальных условиях практически невозможна вследствие их малой концентрации и сложности данной химической системы. Но нам удалось оценить характерное время жизни этих радикалов. В ходе экспериментов было обнаружено, что для инициации реакции полное время освещения порциями больше времени непрерывного освещения. Так как результаты экспериментов показывают, что количество радикалов, вносимых в систему, пропорционально времени облучения, то указанный факт означает, что за время паузы между облучениями количество радикалов уменьшается по некоторому закону. Для определения кинетики радикалов реакционная смесь облучалась двумя порциями до достижения инициации, причём длительность первого облучения составляла половину порогового Т, а интервал времени ( между порциями варьировался. Если для достижения инициации в систему необходимо добавить концентрацию радикалов К, то во всех экспериментах за время первой порции добавлялось К/2. Это обеспечивало постоянство начальных условий для всех задержек г, в ходе которых концентрация уменьшалась по неизвестному закону К/24(х). Во время второй порции облучения с измеряемым временем Т*(1) в систему должна добавляться концентрация радикалов К.-К/2*[(0. Учитывая постоянство скорости добавления радикалов при облучении, можно написать, что К (1-^0/2)/ Т*(») = Я / Т, откуда следует: ф) = 2 (1-Т*0)/Т)

На рис.4 представлена экспериментальная зависимость f(t) для красителя БР.

l.Oi

9

s 9

О

15 30 45

60

Время, мшг.

Рис.4. Кинетика допоротовой концентрации радикалов, вносимых в систему 1мМ ИУК/ 0.1мкМ ИКР/ 0.5мкМ БР/ 0.5мкМ КК при освещении.

При аппроксимации экспериментальных точек, функцией Г(1)=ехр(-Й) было оценено характерное время жизни радикалов, образующихся в реакционной смеси при освещении: 1рад~ 1/к=(77±8)мш1ут.

Глава 6. Математическое моделирование процессов ингибирования и инициации реакции окисления ИУК.

Эта глава посвящена моделированию явлений бистабильности для реакции пероксидазного окислешш ИУК в присутствии фенолов, проявляющихся в ее пороговом ингибировашш и пороговой фотошти-циации, оценке кинетических констант модельных реакций на основе экспериментальных данных, а также проведению численных кинетических расчетов процессов ингибирования и инициации исследуемой реакции.

В п.6.1. приводится система дифференциальных уравнений, соответствующих реакциям (4.1)-(4.6), описывающим процесс фенольного ингибирования. Ограничиваясь квазистационарным по Б случаем, и

пренебрегая в случае малой концентрации 1° уравнением (4.6), на начальных этапах развития реакции ее поведение будет описываться системой из двух уравнений:

dR/dt = k,S0 + k2S0R - k3R2 - k4RI (6.1)

dl/dt = -lqRI + k5(Io - I) (6-2)

St=o~So ; lt=o = lo Дальнейшее исследование динамики системы сводится к построению фазового портрета, отвечающего этой системе.

Для удобства рассмотрения данной системы уравнений приведем ее к безразмерному виду:

— = А + г-г2-Bri (6.3)

dt

| = €(-ri + D(l-i)), (6.4)

^з . n _ k4[I]0 . „ _ k4 _ ksk3

где А = — —• и- ^' 'о • г - —п- 53 •

к2 [в],' к2[Я10 ' " к,' ~ к2к4|8]0 5

Таким образом, I нормирована на начальную концентрацию ингибитора, время I - на характерное время достижения системой стационарного состояния в отсутствии ингибитора, R- на максимальную для всех условий концентрацию радикалов.

Фазовые траектории системы на плоскости (¡,г) удовлетворяют дифференциальному уравнению вида:

<1г А + г - г2 - Вп Пересечение изоклин вертикальных и горизонтальных касательных, ц и ¡{, дает координаты стационарных точек гь г2, на фазовой плоскости (рис.5). В данной системе возможно существование трех стационарных состояний, наличие которых необходимо для существования бифуркации состояния равновесия.

Рис.5. Фазовый портрет динамической системы: ^, ¡,- изоклины горизонтальных и вертикальных касательных, соответственно;

линиями-----указаны сепаратрисы;-* указывает траекторию движения

системы при освещении.

Исследование стационарных точек на устойчивость показало, что точки Г] и гз являются устойчивыми узлами и отвечают режимам ингибированной и протекающей реакции. Стационарная точка гп является седлом.

При описании явления фотоинициации полагалось, что поскольку время облучения раствора светом в присутствии сенсибилизатора намного меньше, чем время протекания самой реакции, а наблюдаемая кинетика реакции в случае ее инициации такая же, как в отсутствии ингибитора, действие красителя заключается в изменении начальных условий системы, а именно в увеличении начальной концентрации радикалов ИУК (см.5.1). Изображающая состояние системы точка на фазовом портрете будет при этом смещаться из Г1 вправо. Характер изменения 1 при увеличении г определит фазовую траекторшо в процессе облучения. Учитывая близость сепаратрис, входящих в седло, к вертикальным прямым, можно видеть, что, независимо от формы фазовой траектории в процессе облучения, для реинициации системы светом требуется увеличить концентрацию радикалов от Г] до г2. Требуемое для

инициации реакции количество радикалов, вносимых при облучении, определяется выражением:

При значении В, для которого г2=Г1, обе левые стационарные точки сливаются, а при дальнейшем уменьшении концентрации ингибитора остается лишь правый устойчивый узел Г3. Это означает, что значение

соответствует пороговой концентрации I, ниже которой реакция не ингибируется.

В п.6.2. содержится оценка 5 констант модельных реакций на основе экспериментальных данных : к| < 10"10 * а, с"1; кг = 4.0 М^с"1; кз = 41 М^с"1; к4 = 9*103 М^с"1; к5 = 10'3*а, с*1 ; где а - эффективность преобразования кванта света в радикал.

И в заключении этой главы приводятся результаты компьютерных расчетов - численная проверка математической модели, которая подтвердила, что данная система реакций действительно описывает явление бистабилыюсти. В тексте приводится программа, которая вычисляет корни уравнения (6.5), определяет характер стационарной точки, рассчитывает методом Рунге-Кутта и рисует фазовые траектории системы.

(6.6)

(6.7)

выводы.

1. Изучен процесс ингибирования реакции ферментативного окисления ИУК различными фенольными ингибиторами.

2. Подтвержден механизм ингибирующего действия фенолов как ловушек свободных радикалов, участвующих в ферментативной реакции.

3. Обнаружен пороговый эффект инициации остановленной кофейной кислотой (КК) реакции при добавлении в систему перекиси водорода. Изучены основные закономерности этого процесса.

4. Обнаружен пороговый эффект фотоинициации остановленной КК реакции в присутствии в системе красителей - фотосенсибилизаторов. Проведено сравнение эффективности различных фотосенсибилизаторов.

5. Исследовано влияние ксантеновых красителей на ферментативное окисление ИУК . Сделан вывод о совместном окислении красителя и ИУК. Опровергнуты представления о существовании процесса переноса энергии от возбужденного субстрата к красителю в ходе этой реакции.

6. Создана математическая модель, хорошо описывающая явления бистабилыюсти при иншбировании и инициации реакции окисления ИУК с позиции роли фенольных ингибиторов как ловушек свободных радикалов - инициаторов реакции пероксидазно-оксидазного окисления ИУК.

7. Проведены численные кинетические расчеты для процессов ингибирования и инициации окисления ИУК в рамках модели, согласующиеся с экспериментальными данными.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих печатных работах:

1. Krylov S.N., Chebotareva А.В. "Peroxidase-catalized cooxidation of indole-3-acetic acid and xantene dyes in the absense of hydrogen peroxide". - FEBS Lett., 1993, v.324, No 1, p 6-8;

2. Krylov S.N., Krylova S.M., Cliebotarev I.G., Chebotareva A.B."Inhibition of enzymatic indole-3-acetic acid oxidation by substituted phenols. Reinitiation of the stopped reaction." - Phytochemistry, 1994, v.36, No 2, p 263-267.

3. Krylov S.N., Chebotareva A.B. " The effect of light on inhibited peroxidase-oxidase reaction." - Proc. of the 21-th Annual Meeting of American Society for Photobiology. Cliicago, 26-30 June 1993. -Photochcm. Photobiol. 1993, v.57, Supplement, p 92.

4. Крылов C.H., Чеботарева А.Б. "Влияние ксантеновых красителей на катализируемое пероксидазой окисление индолил-3-уксусной кислоты."- Биохимия, 1994, т.59, вып.5, стр 6-9.

5. Лазарев В.В., Е.Р. Мартынова Е.Р., Чеботарёва А.Б." Фотоишгцмация пероксидазно-оксидазной реакции, ингибированной фенолом" - ДАН, 1995, т.344, №4.

6. Лазарев В.В., Любимова М.Л., Чеботарёва А.Б." Моделирование процесса фотоинициации пероксидазно-оксидазной реакции, ингибированной фенолом" - ДАН, 1995, т.344, №5.