Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности молекулярной подвижности и межмолекулярного взаимодействия белков сыворотки крови в норме и при патологии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности молекулярной подвижности и межмолекулярного взаимодействия белков сыворотки крови в норме и при патологии"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

Физический факультет

На правах рукописи УДК 577.32

Бойко Анна Витальевна

ОСОБЕННОСТИ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ПОДВИЖНОСТИ И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре молекулярной физики физического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор физико-математических наук,

профессор Петрова Галина Петровна

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук,

профессор Рууге Энно Куставич

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Уткина Марина Вячеславовна

Ведущая организация: Физический институт им. П.Н. Лебедева РАН

Защита диссертации состоится 23 июня 2005 года в¿/¿/часов на заседании диссертационного совета К 501.001 08 в МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, г. Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, Физический факультет, аудитория .

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке физического факультета МГУ.

Автореферат разослан $3 мая 2005 года. Ученый секретарь

диссертационного совета К 501.001.08, кандидат физико-математических наук

Г.Б. Хомутов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Белки - высокомолекулярные природные органические вещества, играющие фундаментальную роль в структуре и жизнедеятельности организмов. Изучение белков как основного составного элемента живой природы, а также оценка влияния внешних факторов на белковые системы представляет собой огромный интерес для современной медицинской биофизики, молекулярной физики и экологии.

Макромолекулы белков и биополимеров являются уникальными для исследования с помощью методов молекулярной оптики, поскольку масса белковой макромолекулы строго определена для каждого типа белка, при этом поверхность белковой молекулы имеет определенную величину заряда, которую можно изменять путем изменения рН раствора. Кроме того, молекулы белков обладают высокими значениями дипольного момента порядка несколько сотен Дебай (И).

Белки в виде водных растворов присутствуют во всех живых организмах, определяя многие жизненно важные функции. Развитие патологических процессов в организме, таких как сердечно-сосудистые и онкологические заболевания сопровождается изменениями ряда молекулярных параметров в клетках, тканях, а также в сыворотке крови. Поэтому исследование поведения белковых макромолекул в растворах, которые при определенных условиях могут быть использованы в качестве моделей сыворотки крови или лимфы, является очень важным для понимания процессов, происходящих в живых организмах.

Решающую роль в успешном лечении распространенных заболеваний и, прежде всего, сердечно-сосудистых и онкологических играет их ранняя диагностика. В последние годы для этих целей применяется сложная дорогостоящая аппаратура типа ЯМР - томографа. К сожалению, такая

уникальная аппаратура, имеющаяся в единичных экземплярах в наиболее крупных медицинских центрах, не может обеспечить массовую профилактическую диагностику заболеваний на ранних стадиях их развития Поэтому создание достаточно простых, недорогих, но эффективных диагностических методов остается актуальной проблемой практической массовой медицины. Совершенно очевидно, что успешная разработка новых физических методов диагностики распространенных заболеваний зависит от понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе данного заболевания.

Сравнительно недавно было обнаружено новое явление - образование наночастиц - молекулярных кластеров в растворах белков в присутствии солей тяжелых металлов. Детальное исследование взаимодействия ионов металлов с белками в растворе показало общность механизмов образования макромолекулярных кластеров при развитии онкологического заболевания и при наличии ионов тяжелых металлов в растворе.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было исследование молекулярно-динамических процессов, происходящих в растворах белков сыворотки крови при воздействии различных параметров методами статического и динамического рассеяния света, а также проверка возможности использования этих методов для диагностики онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний

Исходя из общей цели, в диссертации ставился ряд практических задач: 1 Исследование растворов макромолекул белков при изменении ряда физико-химических параметров среды, в том числе при взаимодействии с ионами легких и тяжелых металлов с помощью методов статического и динамического светорассеяния 2. Исследование водных растворов белков в качестве модели сыворотки крови методами светорассеяния.

3. Использование метода статического рассеяния света для диагностики онкологических заболеваний.

4. Исследование растворов сыворотки крови крыс в норме и при искусственно вызванной ишемии мозга.

5. Исследование молекулярных параметров сыворотки крови крыс при искусственно вызванном геморрагическом инсульте.

Научная новизна диссертации

1. С помощью методов статического и динамического светорассеяния проведено систематическое исследование водных растворов альбуминов (BSA, HSA) и -у-глобулина при изменении ряда параметров среды, таких как концентрация макромолекул, рН (определяющий поверхностный заряд белков) и ионная сила (определяемая концентрацией ионов солей).

2. Впервые показано, что молекулярно-динамические свойства макромолекулы углобулина в растворе, такие как коэффициент деполяризации, коэффициент межмолекулярного взаимодействия и коэффициент трансляционной диффузии - существенным образом связаны с концентрацией белка, ионной силой и знаком поверхностного заряда на белке и имеют экстремумы в изоэлектрической точке.

3. Обнаружено образование наночастиц - белковых кластеров в водных растворах -у-глобулина, содержащих ионы тяжелых металлов, в частности ионы свинца.

4. Впервые обнаружена возможность возникновения двух структурных переходов в растворе "у-глобулина, содержащего ионы легких или тяжелых металлов.

5. Проведены эксперименты с растворами белков (альбумины, ^глобулин), взятых в различных соотношениях по концентрации в качестве моделей сыворотки крови, что позволило лучше понять результаты исследований нативных образцов сыворотки крови.

6 Показано, что статические и динамические параметры макромолекул белков сыворотки крови в растворах могут значительно различаться по величине для здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями. Подтверждено, что в растворах сыворотки крови онкологических больных коэффициент межмолекулярного взаимодействия макромолекул белков имеет отрицательную величину и может рассматриваться как основной диагностический параметр.

7. Впервые методами статического и динамического рассеяния света изучены изменения молекулярных параметров белков сыворогки крови крыс при искусственно вызванной сосудистой патологии. Из сравнения полученных данных с контрольными значениями обнаружено изменение усредненных масс рассеивающих частиц и соответствующих коэффициентов трансляционной диффузии при развитии ишемии и геморрагического инсульта.

8. Впервые обнаружено, что при развитии сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний поведение молекулярных параметров белков сыворотки существенно различается.

Научно - практическая значимость исследования

Полученные в работе результаты способствуют развитию представлений о молекулярно-динамических процессах, происходящих в растворах белковых макромолекул, содержащих ионы легких и тяжелых металлов, а также вносят вклад в понимание природы межмолекулярных взаимодействий.

Изученное в работе поведение белковых макромолекул в растворах и их взаимодействие с ионами различных солей, в том числе с ионами тяжелых металлов, позволяет установить возможный молекулярный механизм патологических изменений в сыворотке крови. Данное исследование имеет практическое значение для решения задач экологии и медицины.

Материалы диссертации могут быть использованы при разработке физических методов диагностики распространенных заболеваний, а также для создания диагностических приборов. Методы молекулярной оптики позволяют проводить диагностику распространенных заболеваний на ранних стадиях их развития и дают возможность отличать онкологические заболевания от других, например сердечно-сосудистых.

Защищаемые положения

1. На основании полученных в работе экспериментальных данных по коэффициентам межмолекулярного взаимодействия впервые показана возможность возникновения двух структурных переходов в растворе у глобулина, содержащего ионы легких или тяжелых металлов.

2. Обнаружено образование наночастиц - белковых кластеров в водных растворах ^-глобулина в присутствии ионов тяжелых металлов, таких как ионы свинца.

3. Установлено, что некоторые параметры макромолекул белков сыворотки крови, а именно коэффициенты межмолекулярного взаимодействия, эффективные массы рассеивающих частиц и коэффициенты трансляционной диффузии могут значительно различаться по величине для здоровых людей и пациенюв с онкологическими заболеваниями.

4. Обнаружено изменение усредненных масс рассеивающих частиц и соответствующих коэффициентов трансляционной диффузии при развитии ишемии и геморрагического инсульта у экспериментальных животных.

Апробация работы

Основные результат диссертационной работы были представлены на конференциях: Международные конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004, 2005»

(Москва, 2004, 2005), «Первая Троицкая конференция по медицинской физике» (Троицк, 2004), Четвертая Всероссийская научная конференция «Физические проблемы экологии» (Москва, 2004), 15 юбилейная конференция «Лазеры в науке, технике и медицине» (Сочи, 2004), 11 Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2004), Научная конференция «Ломоносовские чтения - 2005» (Москва, 2005), International Quantum Electronics Conference (Moscow, 2002), Italian-Russian Student Forum (Italy, 2003), International conference ALT-02 (Switzerland, 2002), ALT-03 (UK, 2003), ALT-04 (Italy, 2004), International Conference ICONO/LAT 2005 (St. Petersburg).

Публикации

По материалам диссертационной рабо1ы имеется 19 публикаций, в числе которых 7 статей в российских и международных научных журналах

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и списка литературы, содержащего 112 наименований. Объем работы составляет 115 страниц, включая 46 рисунков и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы Обоснована актуальность темы, сформулирована цель и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит общие сведения о химическом составе и строении белковых макромолекул, их физических свойствах и методах исследования.

Изложены основные положения теории Дебая-Хюккеля, описывающей поведение полиэлектролитов в растворе в свете простейшей модели твердых сфер, погруженных в сплошную среду и взаимодействующих по закону Кулона. Согласно этой теории, каждая молекула оказывается окруженной атмосферой противоионов, что приводит к частичной экранировке кулоновских взаимодействий.

Введены понятия ионной силы, водородного показателя среды и изоэлектрической точки, определена связь водородного показателя с поверхностным зарядом макромолекулы.

Вторая глава посвящена описанию методов исследования, использованных в работе.

В разделе 2.1 приводится описание метода статического рассеяния света. Приведены основные положения теории интегрального рэлеевского рассеяния света на флуктуациях плотности и флуктуациях концентрации растворенного вещества для растворов малых частиц. Освещены особенности влияния анизотропии рассеивающих частиц на деполяризацию рассеянного света и ослабления света в растворах.

Согласно теории Дебая с помощью экспериментально измеренного коэффициента рэлеевского рассеяния

можно определить массу рассеивающих частиц М и коэффициент

межмолекулярного взаимодействия В для неидеальных разбавленных растворов

9

с учетом вириального разложения осмотического давления по степеням концентрации с, поскольку в этом случае

( сНК

= — +2Вс + ... М

где коэффициент К - фактор Кабанна - связан с величиной коэффициента деполяризации рассеянного свс!а в случае поляризованного по оси 2

возбуждающего луча д, формулой К(д,) 3 + ЗД„

I, 3 - 4Д,

Кроме того, соотношение Лорентц-Лоренца позволяет получить среднюю поляризуемость молекулы

« = + ап +«„-) =

паМ ( <1п

3 4 " " "" 7 2кЯ А \ ¿с Коэффициен! деполяризации можно связать с анизотропией тензора поляризуемости у, для вертикально поляризованного падающего света:

д, =---г •

45 а + 4 у

Если предположить, что рассеивающие молекулы имеют только две различные компоненты тензора поляризуемости, то последние выражения позволяют рассчитать значения анизотропии тензора поляризуемости и его компонент.

В разделе 2.2 описывается метод динамического светорассеяния. Динамические параметры макромолекул могут быть изучены с помощью метода корреляционной спектроскопии. В этом методе исследуется корреляционная функция флуктуации интенсивности рассеянного света, обусловленных броуновским движением частиц раствора. При этом могут быть определены коэффициенты трансляционной диффузии частиц и их гидродинамические радиусы.

Концентрационные зависимости коэффициента трансляционной диффузии О, и параметра рассеяния определяются одним и тем же вириальным коэффициентом. Связь между коэффициентом Д , массой молекулы М и характеристической вязкостью белкового раствора т] определяется уравнением:

кТ

где Л — радиус частицы.

Глава 3 представляет собой обзор литературных данных, отражающий современные представления о трехкомпонентных распорах полиэлектролитов, и состоит из двух разделов.

В первом разделе изложены особенности взаимодействия макроионов в растворе, содержащем кроме низкомолекулярного растворителя еще и третью компоненту - сильный электролит. Согласно теории Скэтчарда, парные взаимодействия в таких растворах описываются вторым вириальным коэффициентом в разложении для свободной энергии, выражение для которого имеет вид:

М\\Ьтъ 2 4 + 20ют3/

Коэффициент взаимодействия меняется с ростом суммарного заряда на белке 7 по параболическому закону (эффект Доннана) с минимумом в изоэлектрической точке (¿=0) и может принимать отрицательные значения при существенных взаимодействиях (р2з) между макроионом и ионом соли. При возрастании ионной силы (т3) вокруг заряженной молекулы белка в растворе возникает облако противоионов, экранирующее кулоновские взаимодействия; коэффициент В уменьшается и стремится к величине, характерной для полностью незаряженных молекул и определяемой ван-дер-ваальсовыми силами, однако параболический вид зависимости В(2) сохраняется.

Второй раздел освещает результаты работ, посвященных исследованию белковых растворов методами светорассеяния. Особое внимание уделено работе Эдсолла, подтверждающей теорию Скэтчарда и серии недавних работ, основным результатом которых стало открытие нового явления -формирования макромолекулярных кластеров в белковых растворах, содержащих ионы тяжелых щелочных металлов Отмечаются качественные

изменения зависимости второго вириального коэффициента от поверхностного заряда белка и характерный скачок массы рассеивающих частиц в области изоэлектрической точки белка для растворов сывороточного и яичного альбуминов, содержащих соли рубидия и цезия. Приведены также результаты экспериментов по изучению анизотропии рассеивающих частиц, их средней поляризуемости и деполяризации рассеянного света.

Глава 4 содержит подробное описание эксперимента и результаты иссчедования водных растворов белков, содержащих ионы легких и тяжелых металлов, и включает в себя несколько разделов.

Раздел 4.1 посвящен описанию объектов исследования и подготовки образцов. В работе были исследованы следующие белки (на базе препаратов "Sigma" и "Serva")' бычий сывороточный альбумин (BSA), человеческий сывороточный альбумин (HSA) и 7-глобулин. Сопутствующей солью являлся ацетат свинца [РЬ(СН3COO)y311/J\, для изменения pH среды применялась соляная кислота HCl и щёлочь КОН, а для изменения ионной силы - соль NaCl. Приведены краткие характеристики физико-химических свойств использованных элементов и их соединений. Подробно изложена методика и условия приготовления исследуемых систем с заданными параметрами.

В разделе 4.2 приводится описание методики приготовления исследуемых модельных растворов сыворотки крови из смеси белков альбумина и ^глобулина при их различных массовых соотношениях.

В разделе 4.3 приводится описание экспериментальной установки. Измерения проводились на установке с He-Ne лазером ГН 25-1 и фотоэлектрической регистрацией рассеянного излучения, возможностью разделения его поляризованной и деполяризованной компонент и управления температурным режимом измерительной ячейки. В качестве эталонной жидкости использовался бензол, обеспыленный с помощью многократной перегонки и помещенный в стеклянную запаянную ампулу. Снятие сигнала, расчеты и обработка данных проводились в автоматическом режиме.

В разделе 4.4 представлены собственные результаты исследования водных растворов альбумина и у-глобулина, содержащих легкие и тяжелые ионы, методом Рэлея-Дебая.

На рис.1 показаны зависимости коэффициента межмолекулярного взаимодействия В от рН среды при различных параметрах раствора ^глобулина (в чистом растворе, при добавлении соли ЫаС1 и в присутствии ионов свинца).

Сравнение этих зависимостей позволяет предположить наличие двух структурных переходов, происходящих в водном растворе "у-глобулина при добавлении лёгкого или тяжёлого металла.

Рис.1. Зависимость коэффициента межмолекулярного взаимодействия В от рН при различных параметрах для раствора у-глобулина

Коэффициент межмолекулярного взаимодействия В в чистом растворе у-глобулина с ростом рН изменяется по параболическому закону с максимумом в области изоэлектрической точки, причем принимает отрицательные значения. В этом случае электростатические взаимодействия между молекулами у глобулина обусловлены, вероятно, силами притяжения между разноименными зарядами, расположенными на концевых участках молекул. При добавлении в раствор третьей компоненты (соли МяС/) происходит структурный переход и между частицами начинают преобладать силы кулоновского отталкивания. В этом случае взаимодействие между молекулами происходит согласно теории

Скэтчарда, пропорционально квадрату поверхностного заряда белка в~ ^ —J,

где 2 — суммарный заряд на макромолекуле, ¡1 - ионная сила, т.е. наблюдается ярко выраженный минимум в области изоэлектрической точки. Коэффициент межмолекулярного взаимодействия В для раствора у-глобулина в присутствии ацетата свинца (/¿=0,001) имеет параболическую зависимость от рН с максимумом в области изоэлектрической точки. Это связано с тем, что изменяется характер взаимодействия частиц, и начинают играть роль силы диполь-дипольного притяжения.

М*10 , г/моль

30-,

м/м„

ц-0.»

Г120 100 80 • 60 40 • 20

рН

Рис.2. Зависимости массы макромолекул М от рН дчя раствора у-глобушна в присутствии ацетата свинца при различных ионных силах

Масса рассеивающих частиц увеличивается примерно на два порядка в присутствии соли тяжёлого металла и также зависит от поверхностного заряда на белке (рис 2). При этом зависимость принимает нелинейный характер и имеет максимум в области, близкой к изоэлектрической точке. Заметим, что при малой ионной силе (/¿=0,0005) масса примерно в 10 раз превышает молекулярную массу чистого ^глобулина. Это позволяет сделать предположение об образовании наноструктур - кластеров, содержащих более десяти молекул белка. С увеличением ионной силы масса кластеров растёт.

В разделе 4.5 приведено описание и калибровка фотонно-корреляционного спектрометра. Источником света в установке служит He-Ne лазер, дающий линейно-поляризованный свет Свет от лазера, повернутый зеркалом, попадает в кювету с образцом Рассеянный под углом 90° свет регистрируется при помощи ФЭУ. Сигнал с ФЭУ подаётся на схему коррелятора, синхронизированную с компьютером.

Для проверки работоспособности установки были проведены измерения эффективного радиуса рассеяния для латекса - вещества, точное значение диаметра молекулы которого известно (D = 550 нм). Данная концентрационная зависимость при нулевой концентрации даёт значение радиуса =~ 24Ihm. Полученный результат (D-482 нм) с достаточной точностью совпадает с известным значением.

Раздел 4.6 содержит описание результатов экспериментального исследования оптических параметров белков методом динамического светорассеяния. По результатам экспериментов, проведенных с помощью фотонно-корреляционного спектрометра, было обнаружено, что зависимость коэффициента трансляционной диффузии для растворов т-глобулина от величины pH имеет вид, близкий к параболическому, величина D, резко уменьшается в области изоэлектрической точки при рН=6 (рис. 3). Измерения проводились при различных концентрациях. По приведённым кривым видно, что при увеличении концентрации белка в растворе коэффициент диффузии увеличивается. Такое аномальное увеличение коэффициента диффузии при увеличении концентрации объясняется на основе теории, предложенной Джеймсом и Эвансом

D, ^„(l-V + V),

где с-концентрация белка в растворе, /s - Z:.

Полученные результаты показывают, что в данном случае коэффициент, определяющий электрические потери энергии значительно превышает вклад гидродинамических потерь

«05« 0045 »0411 <И135 0 030

У

-о' "'и5 ^ 0 020 0 015 0 010 0 005

• ,

У

- с = !0 мг/мл с 5 МГ7МЛ с - 2 5 мг/мл

рН

Рис, 3. Зависимость коэффициента трансляционной диффузии О, при разных концентрациях у-глобулина от рН

На рис.4 приведены зависимости величины Д от рН для водного раствора чистого т-глобулина (верхняя кривая) и для раствора белка в присутствии ацетата свинца (нижняя кривая). Уменьшение значения Д и, как следствие, увеличение Я при добавлении свинца говорит об увеличении размеров рассеивающих частиц, то есть об образовании молекулярных комплексов.

■ (четапгбе-цжшь. 0 рОЛМр «и пи «104

Iх.

35 «0 45 50 5э 50 65 70 75 60 95 90 35

рН

Рис.4. Зависимость коэффициента трансляционной диффузии О, от рН в растворе чистого у-гюбулина (верхняя кривая) и в присутствии ацетата свинца (нижняя кривая)

В разделе 4.7 представлены результаты исследования смеси белков альбумина и /-глобулина при их различных массовых соотношениях:

а) альбумина больше, чем /-глобулина (нормальное соотношение белков в сыворотке «здоровой» крови);

б) / -глобулина больше, чем альбумина;

в) альбумина и /-глобулина поровну.

В случае, когда альбумина больше, чем /-глобулина, что соответствует случаю «здоровой» крови, зависимость в{рН) близка к параболической с минимумом при рИ ~6, что соответствует изоэлектрической точке у -глобулина.

В случае, когда /-глобулина больше, чем альбумина, что соответствует случаю «нездоровой» крови, зависимость В(рН) близка к параболической с максимумом также в области рН ~6.

Для случая, когда количество альбумина равно количеству /-глобулина, сН

наклон —(с) зависимость в{рН) близка к параболической с минимумом в точке с рН~б.

Средние массы рассеивающих частиц, определенные методом Рэлея-Дебая, соответствуют рассчитанным.

Коэффициенты трансляционной диффузии частиц в исследованных смесях с ростом общей концентрации белков в растворе возрастают. Такое поведение коэффициента диффузии при увеличении концентрации объясняется на основе теории, предложенной Джеймсом и Эвансом.

Раздел 4.8 посвящен обсуждению полученных результатов и выводам главы 4.

В ходе работы было обнаружено аномальное поведение макромолекул у-глобулина в растворе. Это связано с конфигурацией молекулы этого белка Молекула у-глобулина имеет трёхмерную третичную - глобулярную структуру и состоит из трёх основных плотно свёрнутых спиральных структур, две из

которых положительно заряжены, т.к. на них преобладают ионы N41, а одна -отрицательно, т.к. на ней сконцентрированы ионы ОН~. За счёт такого разделения заряда между молекулами присутствуют сильные электростатические взаимодействия:

При добавлении соли ШС1 ионы СГ "закрывают" положительный заряд на поверхности белковой молекулы и между молекулами начинают преобладать силы ку/'оновского отталкивания. С возрастанием ионной силы вокруг заряженной молекулы белка в растворе возникает облако противоионов, экранирующее кулоновские взаимодействия, коэффициент межмолекулярного взаимодействия уменьшается, однако параболический вид зависимости В(рН) сохраняется (параболы становятся более пологими). Теория Скэтчарда выполняется.

При добавлении в раствор соли тяжёлого металла характер межмолекулярного взаимодействия существенно меняется. Макромолекулы у-глобулина в растворе представляют собой частицы, основным видом взаимодействия между которыми является кулоновское взаимодействие разноименных зарядов (во всех точках, кроме изоэлектрической). Эффективное уменьшение поверхностного заряда может привести к тому, что основным видом взаимодействия между макромолекулами станет диполь-дипольное, поскольку белки, как было указано выше, имеют аномально высокие значения дипольных моментов. Такой процесс является результатом прочного связывания ионов тяжелого металла с поверхностными заряженными группами.

Действительно, связь [ион - молекула воды] определяется соотношением между электростатической энергией Еп, зависящей от ионного радиуса, и тепловой энергией кТ. Обладая большим ионным радиусом (\Уч<кТ), ионы тяжелого металла слабо удерживают гидратную оболочку, поэтому они могут образовывать кулоновские комплексы с отрицательными группами на поверхности белка и полностью компенсировать поверхностный заряд макромолекулы.

Энергия диполь-диполыгого взаимодействия молекул белка определяется соотношением:

рр 6 л £ к Т г 6 ' где р — дипольный момент, г — расстояние максимального сближения диполей. При сближении молекул на расстояние -30 А энергия Ерр может превышать тепловую почти на 7 порядка. Т.о., если эффективный поверхностный заряд '¿' 0, что наблюдается в области изоэлектрической точки, то белковые макромолекулы могут сблизиться на предельно малые расстояния и создаются такие условия (минимум свободной энергии), что молекулам выгоднее объединиться в комплексы - кластеры. В нашей работе при наблюдении этого эффекта рост массы рассеивающих частиц достигал величин порядка ста молекулярных масс ^глобулина. С возрастанием суммарного заряда на белке силы кулоновского отталкивания вновь начинают преобладать, и кластеры разрушаются.

Ионный радиус использованного в работе металла - свинца - составляет ~1,3 А. Очевидно, что ионы этого элемента слабее удерживают гидратную оболочку, чем, например, ион натрия, радиус которого ~0,8 А. Таким образом, взаимодействуя с поверхностью белка непосредственно, металл с большим ионным радиусом более прочно связывается с отрицательно заряженной группой на белке и может образовывать кулоновский комплекс на макромолекуле белка с общей гидратной оболочкой. В этом случае ' металлические ионы полностью компенсируют поверхностный заряд белковой

молекулы, вследствие чего образуются наночастицы - кластеры. Масса этих 4 кластеров значительно увеличивается с ростом ионной силы в растворе.

Можно сделать вывод, что в системе [разбавленный раствор бепка * со ?ь тяжёного металла] происходит фазовый переход в упорядоченную мезофазу.

Глава 5 посвящена использованию методов статического и динамического светорассеяния для диагностики онкологических и сердечнососудистых заболеваний.

В разделе 5.1 описывается метод диагностики онкологических заболеваний, основанный на статическом рассеянии света.

В разделе 5.2 представлены результаты сравнительных исследований белков сыворотки крови здоровых пациентов и онкологических больных.

В разделе 5.3 описываются методы получения образцов сыворотки крови крыс с искусственно вызванной сосудистой патологией. Для исследования механизмов развития ишемии мозга, созданы различные экспериментальные модели данной патологии на животных. В этой работе была использована модель гипоксии, возникающая при перевязке сонной артерии. Геморрагический инсульт у специальной линии крыс (Крушинского-Молодкиной) вызывался сильным акустическим воздействием на животных.

В разделе 5.4 представлены сравнительные результаты экспериментов с сывороткой крови животных с искусственно вызванной ишемией. В работе опыты проводились на животных двух экспериментальных групп: 1-я-контрольная группа, 2-я - опытная группа - крысы, подвергнутые операции по перевязке сонной артерии. Основные параметры, которые при этом исследовались - интенсивность интегрального рассеяния (под углом 90° к падающему лучу), масса рассеивающих частиц и коэффициент межмолекулярного взаимодействия В таб 1 представлены результаты обследования методом статического рассеяния растворов сыворотки крови животных, у которых вызывалось нарушение мозгового кровообращения путем перевязки сонной артерии. В таблице эти образцы соответствуют серии ишемия (эксперимент). Эти результаты сравниваются с данными обследования сыворотки, полученной от животных, которые подвергались так называемой ложной операции (без перевязки сонной артерии). В таблице эти результаты представлены как ишемия (контрочь). Как видно из таблицы, в случае развития

ишемии головного мозга, эффективная масса рассеивающих частиц заметно уменьшается.

Ишемия Эксперимент) Ишемия (контроль)

№ образца Мло, г/чоль М „мле, 1/МОЛ1, № образца Мдо, г/моль М „„еле, Г/МОЛЬ

1 115740 85000 1 74100 76000

2 28000 20200 2 29948 23347

3 21000 16600 3 70500 69100

4 78700 55000 4 35900 31500

5 83000 76000 5 20500 20000

Таб. 1. Экспериментально полученные значения молекулярной массы М для образцов сыворотки крови крыс с искусственно вызванной ишемией.

В разделе 5.5 представлены сравнительные результаты экспериментов с сывороткой крови крыс при искусственно вызванном гемморрагическом инсульте. Методом динамического рассеяния света с помощью оптического фотонного коррелятора были обследованы образцов сыворотки крови самок крыс (до и после развития геморрагического инсульта). Величины коэффициентов трансляционной диффузии, измеренные для случаев эксперимент и контрочъ, приведены на рис.5. Полученные результаты показывают существенное различие этого параметра для здоровых животных (до операции) и животных, подвергнутых сильному акустическому воздействию.

Инсульт (эксперимент)

Инсульт (контроль}

Рис. 5. Величины коэффициентов трансляционной диффузии О,, измеренные для случаев эксперимент и контроль при развитии гемморрагического инсульта у крыс

Раздел 5.6 посвящен обсуждению экспериментальных результатов выводам главы 5.

В заключении подведены основные итоги диссертационной работы сформулированы выводы.

выводы

По результатам работы сделаны следующие выводы:

1. Впервые показана возможность возникновения двух структурных переходов в растворе "у-глобулина, содержащего ионы легких или тяжелых металлов.

2. Обнаружено образование наночастиц - белковых кластеров в водных растворах 7-глобулина в присутствии ионов тяжелых металлов, таких как ионы свинца.

3. Обнаружена нелинейная зависимость коэффициента трансляционной диффузии Д от поверхностного заряда с минимумом в изоэлектрической точке белка.

4. Обнаружена аномальная зависимость коэффициента трансляционной диффузии £>, от концентрации 7-глобулина в растворе.

5. Установлено, что некоторые параметры макромолекул белков сыворотки крови, а именно коэффициенты межмолекулярного взаимодействия, эффективные массы рассеивающих частиц могут значительно различаться по величине для здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями.

6. Обнаружено изменение усредненных масс рассеивающих частиц и соответствующих коэффициентов трансляционной диффузии при развитии ишемии и геморрагического инсульта у экспериментальных животных.

Результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:

Статьи:

1. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Ten D.I., Boiko A.V., Fadyukova O.E. "Laser Light Scattering Diagnostics of Blood Protein Solutions" // Proceedings of Int. Conf. Advanced Laser Technologies, ALT-02, SPIE, 2002, vol.5147, p. 370-376.

2. Shcheslavskiy V.l., Petrov G.I., Saltiel S., Boiko A.V., Petrusevich V.Yu., Petrussevich Yu.M., Petrova G.P., Yakovlev V.V. "Nonlinear optical spectroscopy of collagen transformation" // Proceedings SPIE "Multiphoton microscopy in the biomedical sciences", SPIE, 2004, Vol.5323, p. 353-359.

3. Бойко A.B., Кошелев В.Б., Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Фадюкова О.Е, Тен Д.И.. «Изменение оптических параметров белков сыворотки крови при нарушениях мозгового кровообращения» // Вестник МГУ. Сер. 3. Физика. Астрономия, 2005, №3.

4. Петрусевич Ю.М., Петрова Г.П., Макуренков A.M., Бойко A.B. «Исследование сорбции ионов кобальта в водных растворах сывороточного альбумина методами ЯМР и светорассеяния» // Вестник МГУ. Сер. 3. Физика. Астрономия, в печати.

5. Бойко A.B., Гаркуша Е.В., Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Плешкова М.С., Рыжиков Б.Д., Сокол Н.В., Тен Д.И. Структурные фазовые переходы в растворах белков, содержащих ионы легких и тяжелых металлов. Препринт МГУ № 2/2005. Москва, 2005, 20 стр.

6. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Бойко A.B., Тен Д.И, Гаркуша Е.В., Перфильева И.А., Щеславский В.И., Яковлев В.В. «Особенности межмолекулярного взаимодействия и динамики молекул коллагена в водных растворах» // Вестник МГУ, Сер. 3. Физика. Астрономия, в печати.

7. Alekseev S.G., Ivanov A V , Sviridov S.V., Petrova G.P, Petrusevich Yu.M., Boiko A.V., Ten D.I. "Multiparametrical Testing of Blood Serum Solutions

24

with Diagnostic Purpose" // III. Proc. SPIE "laser Use in Oncology", SPIE, 2005, vol. 5973, p. 2-11.

Тезисы докладов

1. Priezzhev A.V., Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Saletsky A.M., Tyurina A.Yu., Boiko A.V., Voeikov V.L., Novikov K.N., Koshelev V.B., Fadyukova O.E. "Optics of blood and laser diagnostics of cardiological and oncology diseases" // International Quantum Electronics Conference 2002, 22-27 June, 2002, Moscow, Book of Abstracts, p. 145.

2. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M , Ten D.I., Evseevicheva A.N., Boiko A.V., Fadyukova O.E. "Laser light scattering diagnostic of blood solutions" // Advanced laser Technologies ALT-02 (Adelboden, Switzerland), 15-20 Sep.,

2002, Technical Digest, p. 138.

3. Boiko A V. "Laser diagnostics of hypoxia and strong acoustic stress influence on rats by measuring light scattering from blood serum samples" // Italian-Russian Student Forum (Palermo, Italy), 23-26 July, 2003, Thesis of the Forum, p. 20.

4 Boiko A V , Petrova G P , Fadjukova О E. "Laser diagnostics of ischemic and hemorragic pathologies in rats by measuring light scattering from blood serum samples" // International conference ALT-03 (Bedfordshire, UK), 19-23 Sep.,

2003, Conference digest book, p. 39.

5 Бойко А В., Иванов А.В., Петрова Г.П., Петрусевич Ю М , Тен Д.И. «Оптические характеристики белков крови в диагностике онкологических заболеваний» // Первая Троицкая конференция по медицинской физике (г. Троицк Московской обл.), 19-21 мая 2004, Сборник тезисов, стр. 5.

6. Бойко А.В., Далматова Е.В. "Исследование молекулярных параметров белков сыворотки крови крыс при нарушениях мозгового кровообращения" // Четвертая всероссийская научная конференция «Физические проблемы экологии (экологическая физика)», Москва, 22-24 июня, 2004, Сборник тезисов, стр. 110.

7. Бойко А.В. «Исследование молекулярных параметров белков сыворотки крови крыс при нарушения мозгового кровообращения» // Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004», Физический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, Сборник тезисов, стр. 218.

8. Бойко А.В., Иванов А В , Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. «Оптические характеристики белков крови при онкологических заболеваниях» /'11 всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем», г. Яльчик, 28 июня-2 июля 2004, Сборник тезисов, стр. 40.

9. Boiko A.V , Petrova G.P., Petrusevich Yu M., Ten D.I., Scheslavskiy V. I. « Laser light scattering study of nanostructures - dipole clusters formation in the solutions containing heavy metal ions» // Advanced laser Technologies ALT-04 (Italy), 10-15 Sep., 2004, Book of Abstracts, p. 74.

10.Бойко A.B., Иванов А.В., Петров-"! Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. «Оптические характеристики белков крови при онкологических заболеваниях» // 15 юбилейная конференция «Лазеры в науке, технике и медицине», г.Сочи, 18-25 сентября 2004, в печати.

П.Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Бойко А.В., Тен Д.И. «Особенности молекулярной подвижности и межмолекулярного взаимодействия белков сыворотки крови» // Научная конференция «Ломоносовские чтения -2005», секция «Физика», Физический факультет МГУ, апрель 2005, Сборник тезисов, стр. 64.

12. Petrova G.P., Petrusevich U.M., Boiko A.V., Ivanov A.V.. "The multiparametric physical method for diagnosing of widespread diseases including oncological disease based on Rayleigh light scattering is proposed" // International Conference on Coherent and Nonlinear Optics (ICONO 2005), St. Petersburg, Russia, May 11-15, 2005, Technical Digest, p. 116.

ООП Физ ф-Tíi M FN' Заказ 7-100-05

№ 1 1 5 3 5

РНБ Русский фонд

2006-4 7921

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Бойко, Анна Витальевна

Введение.

Глава 1. Основные свойства белковых молекул.

1.1. Состав и строение белков.

1.2. Поведение белковых молекул в растворе. Теория Дебая-Хюккеля.

1.3. Основные белки сыворотки крови.

Глава 2. Рассеяние света в растворах биополимеров.

2.1. Метод статического светорассеяния.

2.1.1. Основные положения теории рассеяния света.

2.1.2. Теория Рэлея-Дебая. Определение молекулярного веса рассеивающих частиц.

2.2. Метод динамического светорассеяния.

2.2.1. Теоретические основы метода динамического рассеяния света.

2.2.2. Теория Джеймса-Эванса.

Глава 3. Трехкомпонентные лиотропные системы (Обзор литературных данных).

3.1. Поведение коэффициента межмолекулярного взаимодействия в трехкомпонентных растворах. Теория Скэтчарда.

3.2. Исследование рассеивающих свойств растворов белков, содержащих малые ионы.

Глава 4. Экспериментальное исследование водных растворов белков методами статического и динамического светорассеяния.

4.1. Объекты исследования и подготовка образцов.

4.2. Создание моделей сыворотки крови.

4.3. Описание экспериментальной установки.

4.4. Результаты экспериментального исследования водных растворов белков методом интегрального светорассеяния.

4.5. Описание и калибровка фотонно-корреляционного спектрометра.

4.6. Результаты экспериментального исследования оптических параметров белков методом динамического рассеяния света.

4.7. Результаты исследования смеси белков альбумина и 7-глобулина при их различных массовых соотношениях.

4.8. Обсуждение результатов и выводы главы 4.

Глава 5. Использование методов статического и динамического светорассеяния для диагностики онкологических и сосудистых заболеваний.

5.1. Метод диагностики онкологических заболеваний, основанный на статическом рассеянии света.

5.2. Сравнительное исследование параметров белков плазмы и сыворотки крови здоровых пациентов и онкологических больных.

5.3. Методы получения образцов сыворотки крови животных с искусственно вызванной сосудистой патологией.

5.4. Сравнительные результаты экспериментов с сывороткой крови животных с искусственно вызванной ишемией.

5.5. Результаты экспериментов с сывороткой крови крыс при искусственно вызванном геморрагическом инсульте.

5.6. Обсуждение результатов и выводы главы 5.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности молекулярной подвижности и межмолекулярного взаимодействия белков сыворотки крови в норме и при патологии"

Белки - высокомолекулярные природные органические вещества, играющие фундаментальную роль в структуре и жизнедеятельности организмов. Изучение белков как основного составного элемента живой природы, а также оценка влияния внешних факторов на белковые системы представляет собой огромный интерес для современной медицинской биофизики, молекулярной физики и экологии.

Макромолекулы белков и биополимеров являются уникальными для исследования с помощью методов молекулярной оптики, поскольку масса белковой макромолекулы строго определена для каждого типа белка, при этом поверхность белковой молекулы имеет определенную величину заряда, которую можно изменять путем изменения рН раствора. Кроме того, молекулы белков обладают высокими значениями дипольного момента порядка несколько сотен Дебай (В).

Актуальность темы исследования связана с тем, что белки в виде водных растворов присутствуют во всех живых организмах, определяя многие жизненно важные функции. Развитие патологических процессов в организме, таких как сердечно-сосудистые и онкологические заболевания сопровождается изменениями ряда молекулярных параметров в клетках, тканях, а также в сыворотке крови. Поэтому исследование поведения белковых макромолекул в растворах, которые при определенных условиях могут быть использованы в качестве моделей сыворотки крови или лимфы, является очень важным для понимания процессов, происходящих в живых организмах.

Решающую роль в успешном лечении распространенных заболеваний и, прежде всего, сердечно-сосудистых и онкологических играет их ранняя диагностика. В последние годы для этих целей применяется сложная дорогостоящая аппаратура типа ЯМР - томографа. К сожалению, такая уникальная аппаратура, имеющаяся в единичных экземплярах в наиболее крупных медицинских центрах, не может обеспечить массовую профилактическую диагностику заболеваний на ранних стадиях их развития. Поэтому создание достаточно простых, недорогих, но эффективных диагностических методов остается актуальной проблемой практической массовой медицины. Совершенно очевидно, что успешная разработка новых физических методов диагностики распространенных заболеваний зависит от понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе данного заболевания.

Металлы необходимы для нормальной жизнедеятельности человеческого организма. Более 5% веса человеческого тела составляют натрий, калий, кальций и магний. Другие металлы, такие как железо, кобальт, медь, молибден, цинк и др., присутствуют в организме в связанном состоянии (гемоглобин, ферменты), а их содержание составляет менее 1% веса тела [8,12,13,24]. Тем не менее, превышение допустимой концентрации металлов в окружающей среде создает серьезную угрозу здоровью человека. Особенно опасны тяжелые металлы (ТМ). Попадая в кровь и другие биологические жидкости, они даже в небольших концентрациях способны серьезно нарушить нормальное течение физиологических процессов в организме.

Сравнительно недавно в работах [76,77,78,79,81] было обнаружено новое явление - образование наночастиц - молекулярных кластеров в растворах белков в присутствии солей тяжелых металлов. Детальное исследование взаимодействия ионов металлов с белками в растворе показало общность механизмов образования макромолекулярных кластеров при развитии онкологического заболевания и при наличии ионов тяжелых металлов в растворе.

Основной целью данной работы было исследование молекулярно-динамических процессов, происходящих в растворах белков сыворотки крови при воздействии различных параметров методами статического и динамического рассеяния света, а также проверка возможности использования этих методов для диагностики онкологических и сердечнососудистых заболеваний.

Исходя из общей цели, в диссертации ставился ряд практических задач:

- иследование растворов макромолекул белков при изменении ряда физико-химических параметров среды, в том числе при взаимодействии с ионами легких и тяжелых металлов с помощью методов статического и динамического светорассеяния;

- исследование водных растворов белков в качестве модели сыворотки крови методами светорассеяния;

- использование метода статического рассеяния света для диагностики онкологических заболеваний;

- исследование растворов сыворотки крови крыс в норме и при искусственно вызванной ишемии мозга;

- исследование молекулярных параметров сыворотки крови крыс при искусственно вызванном геморрагическом инсульте.

Существует большое число физических методов исследования как коллективных форм теплового молекулярного движения, так и динамики отдельных молекул или их фрагментов. Ультразвуковая спектроскопия, ядерный магнитный резонанс, рассеяние медленных нейтронов, спектроскопия диэлектрической релаксации, а также оптические методы -рэлеевское и комбинационное рассеяние света, люминесцентная спектроскопия, - позволяют получать сведения о взаимодействиях и движениях молекул в конденсированных средах.

В рамках преследуемых в работе целей наиболее информативным и удобным для решения поставленных задач является метод интегрального рэлеевского рассеяния света. С помощью этого метода определялись массы и поляризационные свойства рассеивающих частиц, исследовался характер межмолекулярного взаимодействия при изменении концентрации ионов металлов в растворе и зарядовых свойств поверхности белковой молекулы.

Научная новизна диссертации обусловлена рядом экспериментальных результатов, впервые полученных в данной работе:

1. С помощью методов статического и динамического светорассеяния проведено систематическое исследование водных растворов альбуминов (BSA, HSA) и 7-глобулина при изменении ряда параметров среды, таких как концентрация макромолекул, рН (определяющий поверхностный заряд белков) и ионная сила (определяемая концентрацией ионов солей).

2. Впервые показано, что молекулярно-динамические свойства макромолекулы 7-глобулина в растворе, такие как коэффициент деполяризации, коэффициент межмолекулярного взаимодействия и коэффициент трансляционной диффузии - зависят от концентрации белка, ионной силы и знака поверхностного заряда на белке и имеют экстремумы в изоэлектрической точке.

3. Обнаружено образование наночастиц - белковых кластеров в водных растворах 7-глобулина, содержащих ионы тяжелых металлов, в частности ионы свинца.

4. Впервые обнаружена возможность возникновения двух структурных переходов в растворе т-глобулина, содержащего ионы легких или тяжелых металлов.

5. Проведены эксперименты с растворами белков (альбумины, 7-глобулин), взятых в различных соотношениях по концентрации в качестве моделей сыворотки крови, что позволило лучше понять результаты исследований нативных образцов сыворотки крови.

6. Показано, что статические и динамические параметры макромолекул белков сыворотки крови в растворах могут значительно различаться по величине для здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями. Подтверждено, что в растворах сыворотки крови онкологических больных коэффициент межмолекулярного взаимодействия макромолекул белков имеет отрицательную величину и может рассматриваться как основной диагностический параметр.

7. Впервые методами статического и динамического рассеяния света изучены изменения молекулярных параметров белков сыворотки крови крыс при искусственно вызванной сосудистой патологии. Из сравнения полученных данных с контрольными значениями обнаружено изменение усредненных масс рассеивающих частиц и соответствующих коэффициентов трансляционной диффузии при развитии ишемии и геморрагического инсульта.

8. Впервые обнаружено, что при развитии сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний поведение молекулярных параметров белков сыворотки существенно различается.

В качестве основных результатов на защиту выносятся следующие положения:

1. На основании полученных в работе экспериментальных данных по коэффициентам межмолекулярного взаимодействия впервые показана возможность возникновения двух структурных переходов в растворе т-глобулина, содержащего ионы легких или тяжелых металлов.

2. Обнаружено образование наночастиц - белковых кластеров в водных растворах 7-глобулина в присутствии ионов тяжелых металлов, таких как ионы свинца.

3. Установлено, что некоторые параметры макромолекул белков сыворотки крови, а именно коэффициенты межмолекулярного взаимодействия, эффективные массы рассеивающих частиц и коэффициенты трансляционной диффузии могут значительно различаться по величине для здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями.

4. Обнаружено изменение усредненных масс рассеивающих частиц и соответствующих коэффициентов трансляционной диффузии при развитии ишемии и геморрагического инсульта у экспериментальных животных.

Практическая ценность предлагаемого исследования заключается в том, что полученные в работе результаты способствуют развитию представлений о молекулярно-динамических процессах, происходящих в растворах белковых макромолекул, содержащих ионы легких и тяжелых металлов, а также вносят вклад в понимание природы межмолекулярных взаимодействий.

Изученное в работе поведение белковых макромолекул в растворах и их взаимодействие с ионами различных солей, в том числе с ионами тяжелых металлов, позволяет установить возможный молекулярный механизм патологических изменений в сыворотке крови. Данное исследование имеет практическое значение для решения задач экологии и медицины.

Материалы диссертации могут быть использованы при разработке физических методов диагностики распространенных заболеваний, а также для создания диагностических приборов [62,67,68,69]. Методы молекулярной оптики позволяют проводить диагностику распространенных заболеваний на ранних стадиях их развития и дают возможность отличать онкологические заболевания от других, например сердечно-сосудистых.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Бойко, Анна Витальевна

выводы

По результатам работы сделаны следующие выводы:

1. Впервые показана возможность возникновения двух структурных переходов в растворе у-глобулина, содержащего ионы легких или тяжелых металлов.

2. Обнаружено образование наночастиц — белковых кластеров в водных растворах у-глобулина в присутствии ионов тяжелых металлов, таких как ионы свинца.

3. Обнаружена нелинейная зависимость коэффициента трансляционной диффузии £), от поверхностного заряда с минимумом в изоэлектрической точке белка.

4. Обнаружена аномальная зависимость коэффициента трансляционной диффузии Д от концентрации у-глобулина в растворе.

5. Установлено, что некоторые параметры макромолекул белков сыворотки крови, а именно коэффициенты межмолекулярного взаимодействия, эффективные массы рассеивающих частиц могут значительно различаться по величине для здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями.

6. Обнаружено изменение усредненных масс рассеивающих частиц и соответствующих коэффициентов трансляционной диффузии при развитии ишемии и геморрагического инсульта у экспериментальных животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Бойко, Анна Витальевна, Москва

1. Cabannes J. "La Diffusion Moleculaire de La Lumiere " // Paris, 1929.

2. Debye P. "Light Scattering in Solutions" //J. App. Phys., 1944, V.15, P.338-349.

3. Debye P.J. "Molecular-weight determination by light scattering" // Appl. Phys., 15, P.338-349, 1946.

4. Scatchard G.J., Batchelder A.C., Brown A. "Osmotic equilibrium in solution of serum albumin and sodium chloride " // J. Am. Chem. Soc. 68, P.2315-2323. 1946.

5. Scatchard G. J. "The attraction of protein for small molecules and ions " // Ann. N.Y. Acad. Sei., 1949, V.51, P.2315.

6. Edsall J.T. et al. "Light Scattering in Solutions of Serum Albumin: effects of charge and ionic strength "// J. of American Chem. Soc., 1950, V. 72, P.4641.

7. Волькенштейн M.B. "Молекулярная оптика"//ГИТТЛ, М.Л., 1951.

8. Leeper R. W., Summers L., Gilman H. //Chem. Revs. 1954, 54, №1, 101.

9. K.R.Stacey. "Light Scattering in Physical Chemistry" // Acad.Press. New York, 1956.

10. Heupam Г., Eeiuiu К. "Белки"//Изд. ИЛ, МЛ, 1958.

11. Tanford Ch. "Physical Chemistry of Macromolecules " // Willey, New York, 1961.

12. Lyman T. "Metals handbook"// V.l. Ohio, 1961

13. Лебедева КВ. "Техника безопасности в металлургии свинца и цинка " //Москва, 1963.

14. Реми Г. "Курс неорганической химии" // под ред. Новоселовой A.B., Москва, ИЛ, 1963.

15. Цветков В.Н., Эскин В.Е., Френкель С.Я. "Структура макромолекул в растворах " //Изд. Наука, 1964.

16. ФабелинскийИ.Л. "Молекулярноерассеяние света"//M. Наука, 1965.

17. Тенфорд Ч. "Физическая химия полимеров" // Изд. Химия, Москва, 1965.

18. Эйнштейн А. "Собрание научных трудов"//М. Наука, 1966.

19. Мартин Р. "Введение в биофизическую химию " // М. Мир, 1966.20. "Популярная медицинская энциклопедия" // М, Советская энциклопедия, 1966, 1040 с.

20. BierJ. "Electrophoresis"//N.Y., 1968.

21. Perrin D.D. "Dissociation constants of inorganic acids and bases " // Butterworths, London, 1969.

22. Shannon R.D., Prewitt C.T. //Acta Crystallogr., V.B26, 1046, 1970.

23. Williams A.P. "The Metals of Life " //NewYork, Willey, 1971.

24. Steinhard J., Zaiser E.M. //Adv. Protein Chem., V.10. P. 152.

25. Эскин B.E. "Рассеяние света растворами полимеров " // Изд. Наука, Москва, 1973.

26. ЛенинджерА. "Биохимия"//М., 1974.28. "Краткий справочник физико-химических величин" // под ред. Мищенко К.П., Равделя A.A., Л., Химия, 1974.

27. Вукс М.Ф. "Рассеяние света в газах, жидкостях и растворах" //Л., 1977.

28. Пилипенко А. Т. "Справочник по элементарной химии " //М., 1977.31. "Вредные вещества в промышленности. Справочник для химиков, инженеров и врачей. Неорганические и элементоорганические соединения"// 7-е изд. т.З, Л., Химия, 1977, 608 е.

29. Habbard J.В., WolymzP.G. //J. Chem. Phys., 1978, V.69, N.3, P.998.

30. Уайт Л. и др. "Основы биохимии"//M., 1981, Т.1.

31. Madden P., Kivelson D. //J. Chem. Phys., 1982, V.38, N.21, P.4244.

32. Дэвид P. "Введение в биофизику"//M., 1982.

33. Флайгер У. "Строение и динамика молекул" // М. Мир, 1982.

34. Букс. М.Ф. "Электрические и оптические свойства молекул и конденсированных сред " //Л. ЛГУ, 1984.

35. Блументаль Г. и др. "Анорганикум" // Т.1, под ред. Колъдица Л., Москва, Мир, 1984.

36. Долин П.А. "Справочник по технике безопасности" // М., Энергоатомиздат, 1985, 824 е.

37. Barlow D.J. Thornton J.M. "The distribution of charged groups in proteins"//Biopolimers, 25, P. 1717-1733, 1986.

38. ДебайП.П. "Избранные труды" // Москва, 1987, С.363.

39. Дебай П. "Определение молекулярного веса методом рассеяния света"//Л., Наука, 1987.

40. ЛенинджерА. "Биохимия"//Мир, 1987.

41. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Ширкова И.И., Ревокатов О.П. "Взаимодействие сывороточного альбумина с водой при различных концентрациях водородных ионов по данным рэлеевского рассеяния" //Вестник МГУ, Сер. Физ. Астр, 1987, Т.28, №2, С.59-63.

42. Petrova G.P. Petrusevich Yu.M. "Interaction of serum albumin with water in various concentrations of hydrogen ions investigated by light scattering" //Moscow University Physics Bulletin 28, P. 59-63, 1987.

43. Волькенштейн M.B. "Биофизика"//Изд. Наука, Москва, 1988.

44. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Borisov B.A. "Anisotropic Polaris ability and Diffusion of Proteins in Water Solution Studied by Laser Light Scattering" // SPIE, 1990, Vol.1403 Laser Applications in Life Sciences, P.387-389.

45. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М. "Способ определения изоэлектрической точки белка" // Авторское свидетельство №1578597, 15.03.1990 (приоритет 01.06.1988).

46. Лебедев Ю.А. "Второе дыхание марафонца" // М., Металлургия, 1990, 144 с., С. 65.

47. Давыдова C.J1. "О токсичности ионов металлов"//Химия, N93, 1991.51. "Справочник биохимика"//Москва, Мир, 1991.

48. ЭмслиДж. ""Элементы"//Москва, Мир, 1991.

49. Петрусевич Ю.М. "Взаимодействие биополимеров в растворе" // Докт. ducc. М., 1992.

50. Petrusevich Yu.M., Petrova G.P. "Electrostatic Interaction in Biopolymer Solutions Investigated by NMR and Laser Light Scattering " // SPIE, 1993, Vol.1884, P. 70-76.

51. Эйхлер В. "Яды в нашей пище"//М., Мир, 1993, 189 е., с.60-62. .

52. ЭмслиДж. "Элементы"//М., Мир, 1993,256с.

53. Левшин Л.В., Салецкий A.M. "Оптические методы исследования молекулярных систем" // Изд. Московского университета, 1994.

54. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М. "Электростатические взаимодействия в растворах биополимеров по данным рэлеевского рассеяния света" // Вестник МГУ, Сер. Физ. Астр., 1994, Т.35, №3, С.45-50.

55. Petrova G.P. Petrusevich Yu.M. "Electrostatic interactions in biopolymer solutions studied by Rayleigh light scattering" // Moscow University Physics Bulletin 49, P.41-46, 1994.

56. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M. "Anomalous Depolarization of Light Scattering in Dilute Solutions of Blood Proteins " // European Biomedical Optics Week BIOS EUROPE '95, Barcelona, Spain, 1995, N.2629-09.

57. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M. "Optical Parameters of Blood Serum Aqueous Solutions " // European Biomedical Optics Week BIOS EUROPE '95, Barselona, Spain, 1995, N.2628-08.

58. Г. Камминс, Е. Пайк "Спектроскопия оптического смешения и корреляция фотонов"//изд-во "Мир", Москва, 1978.

59. Суворов А.В., Никольский А.Б. "Общая химия" // Москва, Высшая школа, 1995.65. "Общая химия в формулах, определениях, схемах"//Минск, 1996.

60. Бриллиантов Н.В., Ревокатов О.П. "Молекулярная динамика неупорядоченных сред " //МГУ, 1996.

61. Petrusevich Yu. М., Petrova G.P. "The method of light scattering measurement in tumour diagnostics" // SPIE, The Int. Soc. for Opt. Engineering, CIS Selected Papers, Laser Use in Oncology. 1996. Vol. 2728. P.2-9.

62. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., S.G.Alexeev,A.V.Ivanov "The method of light scattering in the investigation of plasma blood proteins " // LALS-96 (6-Int. Conf. on las. Appl. in life Sci.) Jena, 1996, P.2-7.

63. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева A.H. "Роль тяжелых металлов в образовании белковых кластеров в водных растворах " // Физические проблемы экологии. Всероссийская научн. конф., Москва, 1997. Тезисы докладов. T.l. С.58-59.

64. Evseevicheva A.N., Petrova G.P., Petrusevich Yu.M. "Laser Identification of Macromolecule Nanosize Dipole Clusters" // ALT-97, Limoge, France. 1997, Book of Abstracts., P. 36.

65. Лидии P.A. "Справочник no общей и неорганической химии " //Москва, Просвещение, 1997.

66. Velev O.D., Kaler E.W., Lenhoff A.M. "Protein Interactions in Solution Characterized by Light and Neutron Scattering: Comparison of Lysozyme and Chymotrypsinogen" //Biophysical J., V.75, December 1998, P.2682— 2697.

67. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N. "Molecular Clusters in Water Protein Solutions in The Presence of Heavy Metal Ions" // General Physiology and Biophysics, 1998, V.17(2), 97-104, Bratislava, Slovakia.

68. Petrusevich Yu.M., Petrova G.P., Evseevicheva A.N. "Instability of Proteins in The Solution at The Presence of Toxic Heavy Metals" // Ecology of Cities. Int. Conf. Proceedings, Rhodes, Greece, 1998, P.304-313.

69. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева A.H. "Роль тяжелых металлов в образовании белковых кластеров в водных растворах" // Вестник МГУ, Сер. Физ. Астр., 1998, №4, С.71-76.

70. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева А.Н. "Физические методы мониторинга токсических тяжелых металлов" // II Всероссийская научная конференция: Физические проблемы экологии, Москва, 1999, Тезисы докладов, Т. 1.

71. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Евсеевичева А.Н., Батюк В.А., Тен Д.И. "Физические методы мониторинга токсических тяжелых металлов" // Сб. Физическая экология (Физические проблемы экологии), № 5, МГУ, физический ф-т, 1999, С. 172-181.

72. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N. "The Role of Heavy Metals in The Formation of Protein Clusters in Aqueous Solution" // Moscow University Phys. Bulletin, V.53, N.4, P.91-97, 1999, Allerton Press.

73. Петрусевич Ю.М, Петрова Г.П. "Сильные электростатические взаимодействия в растворах заряженных биополимеров" // Всероссийский съезд биофизиков, Август 1999, Москва, Тезисы докладов, Т. 1, С. 71.

74. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N., Ten D.I. "Laser Investigation of Metal Ions Adsorption on Protein Charge Surface" // International Conference ALT-99 (Italy, 1999), Book of Abstracts, №20.

75. Петрова Г.П. "Молекулярная подвижность и межмолекулярные взаимодействия в оптически анизотропных жидких системах" // Докт. диссертация, 1999.

76. Liu Y, Ma C.Q., Li К.А., Xie F.C., Tong S.Y. "Rayleigh light scattering study on the reaction of nucleic acids and methyl violet" //Anal Biochem., 268(2), 187-92 (1999 Mar 15).

77. Mukherjee A., Lutkenhaus J., "Analysis of FtsZ assembly by light scattering and determination of the role of divalent metal cations" // J. Bacteriol., 181(3), 823-32 (1999 Feb).

78. Kartel M. Т., Kupchik L.A., Veisov B.K., "Evaluation of Pectin Binding of Heavy Metal Ions in Aqueous Solutions" // Chemosphere, V.38, N.ll, P.2591, 1999.

79. Reedijk J. "Medicinal Applications of Heavy-metal Compounds " // Chem. Biology, 3, 1999, P.236.89. "Экология, охрана природы, экологическая безопасность " // под ред. Никитина А.Т., Степанова С.А., Москва, МНЭПУ, 2000.

80. Ершов Ю.А, Попков В.А., Берлянд A.C. и др. "Общая химия. Биофизическая химия. Химия биогенных элементов " // Учеб. для вузов, 2-е изд., М., Высш. шк., 2000, 560 е., с.288-295.

81. Petsev D.N., Thomas B.R., Yau S.T., Vekilov P.G. "Interactions and Aggregation of Apoferritin Molecules in Solution: Effects of Added Electrolytes" // Biophysical J., V.78, April 2000, P.2060-2069.

82. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N., Ten D.I. "Laser Investigation of Metal Ions Adsorption on Protein Charge Surface» // Proceedings of SPIE (Advanced Laser Technologies), V.4070 (2000), P.430-437.

83. Евсеевичева A.H., Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. "Токсическое воздействие ионов свинца и меди на белки плазмы крови" // III Всероссийская научная конференция Физические проблемы экологии, МГУ, физический ф-т, 2001.

84. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Ten D.I. "Formation Of Dipole Complexes In Protein Solutions With Low Concentrations Of Heavy Metal Ions: Diagnostics By The Method Of Laser Radiation Scattering" // Quantum Electronics, 32(10), 2002, p.897-901.

85. Петрова Г.П., Тен Д.И., Пшеничная НА. "Взаимодействие ионов тяжелых металлов с макромолекулами белков в водных растворах " //

86. Сб. расширенных тезисов докладов: Ломоносовские чтения. Секция физики. (Апрель 2002) С.5-9.

87. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Evseevicheva A.N. and Ten D.I. "Laser Light Scattering Study of Supermolecular Structures in Blood Protein Solutions in The Presence of Heavy Metal Ions " // LA T 2002, Moscow, Technical Digest JsuF 19, P. 173.

88. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M. and Ten D.I. "Temperature Effect on Submolecular Dipole Structures in Aqua Albumin Solutions in Presence of Pb Ions"//LAT 2002, Moscow, Technical Digest, JsuF 36, P. 181.

89. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., Ten D.I., Evseevicheva A.N., Boiko A. V., Fadyukova O.E. "Laser Light Scattering Diagnostic of Blood Proteins Solutions" // International Conference ALT-02 (Switzerland, Adelboden, 2002), Technical Digest, P. 138.

90. Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. "Образование дипольных комплексов в растворах белков с малой концентрацией ионов тяжелых металлов: диагностика методом лазерного светорассеяния"//Квантовая электроника, 2002, 32, №10, С. 1-5.

91. Petrova G.P., Petrusevich Yu.M., and Ten D.I., Evseevicheva A.N, Boiko A. V, Fadyukova O.E. "Laser Light Scattering Diagnostics of Blood Protein Solutions" // Proceedings of Int. Conf. Advanced Laser Technologies ALT-02, 2002, SPIE. (В печати)

92. Евсеевичева A.H., Петрова Г.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. "Токсическое воздействие ионов тяжелых металлов на белки плазмы крови" //Вестник МГУ, 2003 (В печати).

93. Интернет: "Эковестник Дубны. Геоэкологическая обстановка и оценка геоэкологической опасности детских дошкольных учреждений города Дубна ", 1998-1999: http://eco. dubna. ru/pro ject/dou/c. html.

94. Интернет: "Экологическая ситуация по г. Сургуту", 1991-2003: http://priroda. admsurgut. ru/monned.

95. Интернет: Загорский В.В. "Лекции по общей и неорганической химии для студентов биологического фак-та (биофизика)", 2001/2002: http://www.chem.msu.su/rus/teaching/general.

96. Интернет: Авторский коллектив МГУПБ "Химия для всех", 1999: http://school-sector, relarn. ru/nsm/chemistry/Rus/chemy. html.

97. Ш.Интернет: "Офиц.сервер Госкомэкологии России", 1999-2000: http://www, ecocom. ru/archiv/ecocom/index. html.