Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности микрофлоры при воспалительных процессах желчевыводящих путей у больных желчнокаменной болезнью

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности микрофлоры при воспалительных процессах желчевыводящих путей у больных желчнокаменной болезнью"

005015092

На правах рукописи

Рукосуева Татьяна Владимировна

Особенности микрофлоры при воспалительных процессах желчевыводящих путей у больных желчнокаменной болезнью

03.02.03 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 МАР шг

Иркутск - 2012

005015092

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Перьянова Ольга Владимировна Винник Юрий Семёнович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Данчинова Галина Анатольевна

(заведующая лаборатории трансмиссивных инфекций Федерального бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук)

доктор медицинских наук, профессор Киборт Рудольф Вадимович (профессор кафедры микробиологии ГБОУ ВПО « Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития)

Ведущая организация:

ФГУН «Казанский научно- исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителя и благополучия человека

Защита диссертации состоится <.с$» ¿.¿¿¿¿/і'Ц 2012 г. в_часов на заседании диссертационного совета ДМ $01.038.01 Федерального бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: г. Иркутск, ул. Карла Маркса, 3. Почтовый адрес: 664025, г. Иркутск, а/я 539

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан « 2012 г.

Учёный секретарь /

диссертационного совета, //// ' у/

кандидат медицинских наук /СуШ^ Кулеш Дмитрий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

За последние годы в цивилизованных странах и в том числе России отмечается неуклонное увеличение числа больных желчнокаменной болезнью (ЖКБ), которым необходимо хирургическое лечение. В нашей стране показатели заболеваемости ЖКБ удваиваются каждое десятилетие. По данным статистики среди острых заболеваний брюшной полости операции на желчном пузыре и желчевыводящих протоках занимают второе место после аппендэктомии (Ермолов А.С. с соавт., 1999; Дадвани С.А. с соавт., 2000; Нестеренко Ю.А. с соавт., 2003; Бородач А.В. с соавт., 2008; Лоранская И.Д. с соавт., 2009).

Несмотря на достижения современной медицины, при данной патологии возможны неблагоприятные исходы, осложнения, необходимы большие экономические затраты на медицинскую помощь. ЖКБ приобретает всё большую актуальность и является не только медицинской, но и серьёзной социальной проблемой (Сивец Н.Ф. с соавт., 2004; Черданцев Д.В. с соавт., 2006; Винник Ю.С. с соавт., 2009).

До сих пор остаётся открытым вопрос о причинах холелитиаза. Есть мнение, что в патогенезе желчнокаменной болезни существенная роль принадлежит микрофлоре кишечника и гепатобилиарной зоны. Известно, что высокие концентрации дезоксихолевой кислоты в желчи обуславливают повышение риска холестеринового холелитиаза. Образование вторичных желчных кислот, в том числе дезоксихолевой, происходит в результате дегидроксилирования хо-левой кислоты ферментами бактерий, обитающих в толстой кишке. В основном это эубактерии и клостридии (Зубарева Н.А., 1999; Ильченко А.А., 2004; Fuku-shima К. et al., 1998). Нарушения кишечного биоценоза в сторону увеличения количества дегидроксилирующих бактерий приводит к повышению концентрации дезоксихолевой кислоты в желчи. Эти процессы усугубляются с возрастом пациентов, особенно на пятом - восьмом десятилетии жизни (Лейшнер У., 2001; Einarsson К. et al., 1985; Imazumi R. et al., 1992).

Избыточный рост условно-патогенных бактерий в кишечнике, диссеми-нация их в организме на фоне снижения барьерных и других защитных факторов приводит к контаминации желчевыводящей системы и развитию воспалительного процесса (Валышев А.В. с соавт., 1996; Fons M. et al., 2000; White J.S., 2001 ; Hunter J.O. et al., 2002).

Желчнокаменная болезнь опасна тяжёлыми осложнениями, прежде всего такими, как острый холецистит осложнённый перитонитом. Присоединение инфекции может провоцировать деструктивные процессы в стенке желчного пузыря и перивезикальной области. Такие осложнения, обусловленные бактериальным фактором, представляют собой прямую угрозу жизни пациента (Ермолов А.С. с соавт., 2004; Бирюкова C.B. с соавт., 2006; Farrel R.J., et al., 2002).

Анализ литературы по проблеме желчнокаменной болезни показал, что микробиологический аспект этой патологии слабо изучен. Поэтому вопрос о значении бактериохолии в возникновении заболеваний билиарной системы и её

влиянии на результаты оперативных вмешательств является актуальным (Bergan T. et al., 1979; Sung J.Y. et al., 1992; Cainzos M. et al., 1997). Однако результаты бактериологических исследований желчи при данной патологии не всегда сопоставимы. Этому способствует микробиологическое исследование желчи, полученной при дуоденальном зондировании или из дренажных трубок. Практически не встречаются в литературе исследования других материалов кроме желчи, например стенки желчного пузыря, но необходимость таких исследований очевидна (Якубовский C.B., 2006; Зорькин A.A. с соавт., 2009).

По мнению ряда авторов, роль анаэробной инфекции в абдоминальной хирургии велика и продолжает возрастать (Джалашев Я.Х. с соавт., 1986; Арикъянц М.С. с соавт., 1991; Богомолова Н.С. с соавт., 1996; England D.M. et al., 1977; Marne С. et al., 1986). При этом единичны работы, посвящённые изучению анаэробных микроорганизмов при осложнённых формах острого каль-кулёзного холецистита. Недостаточно данных и они противоречивы, по результатам определения чувствительности биликультур к антибактериальным хими-опрепаратам. В клинической практике лечение осложнённых случаев острого холецистита проводится без выделения актуальных возбудителей, основываясь на эмпирических знаниях, поэтому исследования в этом направлении необходимы (Гальперин Э.И., 1983; Даценко Б.М. с соавт., 1995; Савельев B.C. с соавт., 1997; Гостшцев В.К., 2007).

Цель исследования.

Изучение микрофлоры гепатобилиарной зоны при желчнокаменной болезни, осложнённой гнойно-воспалительным процессом, с целью оптимизации антибактериальной терапии у больных острым калькулёзным холециститом.

Задачи исследования:

1. Изучить качественный и количественный состав микрофлоры желчи, стенки желчного пузыря, желчных конкрементов, дуоденального содержимого при различных клинико-морфологических формах калькулезного холецистита.

2. Определить этиологическую значимость анаэробных микроорганизмов в развитии гнойно-воспалительных и деструктивных осложнений желчнокаменной болезни.

3. Изучить антибиотикочувствительность актуальных возбудителей гнойно-воспалительных и деструктивных осложнений при желчнокаменной болезни.

4. Изучить качественный и количественный состав микробиоценоза кишечника у больных с постхолецистэктомическим синдромом.

Научная новизна и теоретическая значимость. Впервые установлена взаимосвязь между клинико-морфологическим диагнозом и качественным и количественным составом микрофлоры желчи, стенки желчного пузыря и

желчных конкрементов при остром калькулёзном, флегмонозном калькулёзном и гангренозном калькулёзном холециститах.

Впервые получены региональные данные о чувствительности выделенных от больных ЖКБ культур к антибактериальным препаратам.

Впервые проведено изучение биологических материалов при воспалительных процессах ЖВП на наличие анаэробных микроорганизмов молекуляр-но-генетическим методом.

Теоретический аспект работы заключается в научном анализе полученных результатов микробиологической диагностики, определяющих дальнейшую перспективу применения этих методов для оптимизации лечебно-диагностических мероприятий при остром калькулёзном холецистите и ПХЭС.

Практическая значимость работы

Определена целесообразность проведения микробиологической диагностики при остром калькулёзном холецистите и постхолецистэктомическом синдроме, включающая применение молекулярно-генетических методов исследования.

Рекомендовано проведение бактериологического исследования аспирата ДПК до операции, так как спектр и высеваемость микроорганизмов из данного материала соответствует результатам, полученным при исследовании стенки желчного пузыря. Предоперационное исследование дает возможность определить актуального возбудителя и его чувствительность к антимикробным хими-опрепаратам.

Доказано, что для успешной диагностики необходимо использовать в качестве материала для лабораторного исследования образцы стенки желчного пузыря, полученные интраоперационно.

Установлено, что наибольшей активностью по отношению к микрофлоре при гнойно-воспалительных процессах гепато-билиарной зоны обладают цефа-лоспорины 1П поколения (цефотаксим, цефтазидим), аминогликозиды (амика-цин, гентамицин), фторхинолоны (ципрофлоксацин). Эти препараты можно рекомендовать для эмпирической антимикробной химиотерапии при данной патологии.

Выявлено, что удаление желчного пузыря приводит к развитию дисбакте-риоза П - III степени, сопровождающегося диспептическими расстройствами. Рекомендовано применение пробиотических препаратов после холецистэкто-мии, способствующее уменьшению дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника, вызванных патологическими процессами в желчевыделительном аппарате.

Внедрение результатов исследования в практическое здравоохранение

Результаты изучения микробного спектра клинических материалов у больных с осложнёнными формами желчнокаменной болезни используются для прогноза развития и исходов данной патологии, выбора тактики терапии в I хирургическом отделении, отделении реанимации и интенсивной терапии МУЗ

ГКБ№ 7 г. Красноярска. Результаты определения антибиотикочувствительно-сти внедрены в практику и служат для составления формуляров антибиотиков, используемых в схеме лечения больных с ОКДХ. Данными исследованиями обоснована необходимость дополнения схемы консервативной терапии больных, перенёсших холецистэктомию, назначением пробиотиков. На основании результатов исследования разработаны методические указания «Оптимизация лечебно-диагностических мероприятий при остром калькулезном холецистите и постхолецистэктомическом синдроме» для врачей-хирургов и гастроэнтерологов, клинических ординаторов, интернов и студентов старших курсов медицинских вузов. Результаты исследования и основные рекомендации внедрены в учебный процесс кафедр общей хирургии и микробиологии ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого».

Положения, выносимые на защиту:

1. Характер воспалительного процесса в желчевыделительном аппарате при различных клинико-морфологических формах калькулезного холецистита обусловлен особенностями качественного и количественного состава били-арной микрофлоры.

2. В развитии гнойно-деструктивных осложнений желчнокаменной болезни важную роль играют анаэробные бактерии, находящиеся в некультивируе-мой форме, но выявляемые молекулярно-генетическими методами.

3. Наиболее репрезентативным для оценки воспалительного процесса желче-выделительных путей является бактериологическое исследование стенки желчного пузыря.

4. Удаление желчного пузыря при желчнокаменной болезни приводит к развитию дисбактериоза кишечника II - П1 степени, что требует применения про-биотических препаратов.

Апробация диссертации Основные положения работы доложены на Всероссийской научной конференции с международным участием «Социальные аспекты хирургической помощи населению в современной России» (Тверь, 2008), на Всероссийской юбилейной научно-практической конференции патологоанатомов с международным участием, к 100-летию со дня рождения профессора П.Г. Подзолкова (Красноярск, 2008), на III Сибирском Конгрессе «Человек и лекарство» (Красноярск, 2009), на симпозиуме с международным участием «Питание в профилактике социально-значимых заболеваний» (Красноярск, 2009), Японско-Российской международной конференции «Current Life-Threatening Infections Medical Countermeasures Medical Exchange and Networks» (Япония, Ниигата, 2010), на конференции с международным участием, посвя-щённой 90-летию кафедры микробиологии Иркутского медицинского универ-

ситета (Иркутск, 2010), методическом совещании кафедры микробиологии им. доц. Б.М. Зельмановича КрасГМУ, (Красноярск, 2010), совместном заседании проблемных комиссий «Фундаментальная медицина» и «Актуальные вопросы хирургии» КрасГМУ (Красноярск, 2011).

Публикации результатов

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе две в журналах, рекомендованных ВАК, а также монография, написанная по материалам исследования автора, и методические указания.

Личный вклад автора состоит в разработке плана исследования, проведения работ по подготовке проб к исследованиям, непосредственного проведения бактериологического исследования клинических материалов, полученных от больных с желчнокаменной болезнью и постхолецистэктомическим синдромом, систематизации материала, статистической обработке, анализе и интерпретации результатов.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 17 таблицами, 24 рисунками, тремя приложениями. Указатель литературы содержит 195 названий, из них 98 зарубежных источников.

Работа выполнена на кафедрах микробиологии (заведующая кафедрой -к.б.н., доц. О.В. Перьянова) и общей хирургии (заведующий кафедрой - д.м.н., проф. Ю.С. Винник) и в Центральной научно-исследовательской лаборатории (заведующий - д.м.н., проф. Ю.В. Котловский) ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Исследования методом AFM выполнены д.м.н. A.A. Гайдаш на базе зондовой нанолабораторш INTEGRA в Центре коллективного пользования Томского государственного университета.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы, объём и методы исследования

В результате проведенного бактериологического исследования был изучен качественный и количественный состав микробного пейзажа образцов биологического материала от пациентов с различными клинико-морфологическими формами калькулёзного холецистита (ООКХ, ФКХ, ГКХ), а также пациентов с диагнозом ПХЭС. У обследованных лиц были получены пробы пузырной желчи, образцы ткани стенки желчного пузыря, желчные конкременты - интраопе-рационно, а также венозная кровь, аспират ДОК - в результате медицинских манипуляций, испражнения - при естественной дефекации, забор проб и доставка в лабораторию осуществлялись согласно МУ 4.2. 2039-05. Возраст больных составил от 20 до 79 лет, средний возраст: 57,8 ± 7,5 лет.

Таблица 1.

Объём выполненных исследований

Диагноз Бак. метод (пробы) ПЦР (пробы) Материалы

ОКХ 58 - Аспират ДПК, кровь, желчь, стенка желчного пузыря, желчные камни

ФКХ 78 49

ГКХ 52

Полипоз ЖП 3 -

ПХЭС 2 23 Аспират ДПК, кровь

Дисбактериоз кишечника (ПХЭС) 18 Фекалии

Всего 211 72 283

Всего исследовано: 283 пробы (в т.ч.211 - бактериологическим методом) клинического материала от 145 больных, находившихся на лечении в хирургическом отделении МУЗ ГКБ № 7 г. Красноярска.

Данное исследование прошло экспертизу и получило одобрение локального этического комитета ГОУ ВПО КрасГМУ.

Пробы биологических материалов засевали на питательные среды, рекомендованные МЗ СССР (Приказ № 535 утв. 22.04.1985 г.) и ВОЗ по методу Gould (кроме крови и фекалий), что позволяет определять общую численность микроорганизмов в материале. Для выделения анаэробной микрофлоры посев проводили на агар Шадлера с последующим культивированием в газогенераторных пакетах Generbag фирмы «bio Мепеих»(Франция). Таксономическую принадлежность выделенных культур определяли традиционными методами с учётом их морфо-тинкториальных, культуральных, биохимических и антигенных свойств.

Идентификацию анаэробных микроорганизмов проводили с использованием тест-системы api 20А (фирма "bio Merieux", Франция) при помощи специального программного обеспечения.

Определение чувствительности выделенных культур к антибактериальным препаратам проводилось диско-диффузионным методом на агаре Мюлле-ра-Хинтона в соответствии со стандартами NCCLS, при этом в качестве контрольных использовали референтные штаммы S. aureus АТСС 29213, Е. coli ATСС 25922, Р. aeruginosa АТСС 27853, E.faecalis АТСС 29212 согласно МУК 4.2.1890-04. Для определения чувствительности к антибиотикам анаэробных микроорганизмов использовались тест-система АТВ ANA (BioMerieux, Франция)

Пациенты с диагнозом ПХЭС были обследованы с целью диагностики кишечного дисбактериоза бактериологическим методом (Приказ МЗ РФ № 231 от 09.06.2003 г.)

Биологический материал пациентов с деструктивными формами кальку-лёзного холецистита (ФКХ, ГКХ) был исследован молекулярно-генетическим методом (ПЦР). Выделение ДНК проводилось по стандартной методике путем сорбции на носителе с последующей отмывкой и элюцией. Для определения микроорганизмов полученную ДНК использовали для проведения ПЦР реакции со специфическими праймерами к генам: Bacteroides fragllis, Bacteroides spp., Porphyromonas spp., Prevotella spp., Prevotella melaninogenica, Fusobacterium spp. После завершения ПЦР анализировали продукт амплификации по результатам электрофореза в 2% агарозном геле, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор» с последующей визуализацией на компьютере.

Образцы желчных конкрементов исследовались методом атомно-силовой микроскопии. AFM-сканирование осуществлено контактным методом на воздухе с помощью кремниевых зондов серии CSG10 (радиусом закругления 10 нм) в условиях постоянной силы и высоты с частотой развертки 1,56 Hz.

Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ Ms Excel, методами, принятыми в медицине и биологии. Описательная статистика представлена в виде коэффициентов и ошибки для доли (± ш), вычисления средней. Для оценки достоверности различий относительных величин, выраженных в процентах, использовали критерий согласия Пирсона у1 (хи-квадрат), точный критерий Фишера, для статистической оценки различий выборочных средних (при нормальном распределении) использовали t-критерий. Статистически значимыми считали различия показателей при р< 0,05.

Результаты исследований и их обсуздение

При бактериологическом исследовании биологических образцов от пациентов с острым холециститом, статистически значимые различия высеваемости микроорганизмов ( р<0,01) были установлены между результатами посевов желчи, давших самый низкий показатель и образцов стенки желчного пузыря (наиболее высокий показатель среди стерильных в норме биотопов). Из 81 пробы желчи только 31 дали рост на питательных средах, что составило 38,3 ± 5,4% (рис. 1). Это объясняется бактерицидным влиянием желчных кислот на микрофлору.

Наиболее устойчивыми к желчным кислотам, согласно данным литературы, являются энтеробактерии и энтерококки (Чернякова В.И., Смирнова Т.В., 1978; Андрейчин М.А., 1980; Гриценко В.А., 2000; Claesson B.L. et al.,1984; Sung J.Y., Costerton J.W., 1992; Sartor R.B.,Lichtman S.N., 1995). При исследовании желчи основную долю среди выделенных нами микроорганизмов составили энтеробактерии (50,0 ± 8,3%), среди которых доминировали Е. coli (30,6 ± 7,7%), Klebsiella spp.(l 1,0 ± 5,2%), а также представители родов Citrobacter, Еп-

terobacter, Serratia в равных долях. Удельный вес Enterococcus spp. составил 19,4 ± 6,6%. Другие микроорганизмы были представлены в менее значительном количестве (табл. 4).

...........---

: I :

дуоденальное содержимое желчь стенка желчного пузыржелчные камни

Примечание: ** - р<0,01при сравнении образцов желчи и стенки желчного пузыря

Рис. 1. Высеваемость микроорганизмов из различных образцов у больных ЖКБ

Установлено, что частота выделения биликультур также зависела от кли-нико-морфологической формы калькулёзного холецистита и варьировала от 12,0 ± 6,4 % при ООКХ (р<0,001) до 51,6 ± 8,8% при ФКХ и 50,0 ± 10,6% при ГКХ. Следовательно, кроме бактерицидного эффекта компонентов желчи и различной биличувствительности бактерий, существенное значение в формировании эндогенной инфекции гепатобилиарной зоны имеет характер инфекционного процесса. При этом можно предположить, что в патогенезе холецистита острый воспалительный процесс последовательно переходит в стадию флегмонозного, а затем гангренозного, сопровождаясь всё более глубокими деструктивными поражениями тканей. В соответствии с изменяющимися условиями изменяется микробный состав пораженных тканей, что в свою очередь, также оказывает влияние на патогенез заболевания.

Образцы, полученные от пациентов с ФКХ, дали самый высокий процент высеваемости, наиболее разнообразный видовой спектр микроорганизмов, включая Р. aeruginosa, С. albicans и анаэробные бактерии (табл. 2). Именно при этой форме холецистита достоверно чаще (р<0,01) были выделены ассоциации микрорганизмов (59,1 ± 7,0%) (рис. 2).

Таблица 2.

Микробный пейзаж и частота встречаемости микроорганизмов при разных

Микроорганизмы ООКХ % ± m ФКХ %±m ГКХ %±m

Е. coli 11,8±8,1 21,0±5,2 42,0±8,7

С. freundii - 1,6*1,6 6,5±4.4

К. pneumoniae - 6,5±3,1 9,7±5,3

К. oxvtoca -

S. marcescens - 1,6±1,6 -

E.agglomercms 5,9±5,9 . 6,5±4,4

Е. aerogenes - 1,6±1,6 -

Proteus spp. ■ 1,6±1,6 -

Энтеробактерии всего , 17,7±9,5 33,9±6,0 64,7*8,6

5. epidermidis 17,7±9,5 21,0±5,2 6,5±4,4

S. saprophytics - -

Е. faecalis 35,3±11,9 14,6±4,5 19,4±7,1

Е. faecium -

Гр+ кокки всего 53,0±12,5 35,6±6,1 25,9±7,7

P. aeruginosa 5,9±5,9 14,5±4,5 3,2_t3,2

P. putrefaciens - -

A. calcoaceticus 5,9±5,9 - -

A. Iwoffi - 1,6±1,6 -

Moraxella spp. - 3,2±2,2 6.5±4,4

НГОБ всего №±8,1 193±5,0 9,7±5,3

P. constellatus - 4,8±2,7 -

Peptococcaceae 5,9±5,9 -

С. albicans - 6,5±3,1 -

Neisseria spp. 5,9±5,9 - -

Actinomyces spp. 5,9±5,9 - -

Прочие всего 17,7±9,5 m5*4,0 1

TtJK~

70,00% 60,00% 50,00% 40,00%

30,00% Ь

!

20,00% 10,00» j-0,00% +-

Примечание: ** - р<0,01при сравнении ООКХ и ФКХ, ФКХ и ГКХ

Рис. 2. Удельный вес проб, из которых получен рост микроорганизмов в ассоциациях при разных формах холецистита

Согласно данным литературы, у больных холециститом снижается реактивность организма, характеризующаяся снижением активности и уровня неспецифических факторов защиты, уменьшением количества иммуноглобулинов и нарушениями клеточного звена иммунитета (Сопуев A.A., 2005; Alvaro D., 1999; Minter R.M. et al., 2005). Так A.B. Бородач с соавторами (2008) считают, что бактерицидные свойства желчи снижаются по мере возрастания объёма воспалительной экссудации в просвет желчного пузыря, что приводит к пролиферации микробных клеток. Одновременно возрастают общая бактериальная обсеменённость тонкой кишки, что обуславливает энтеро-портальную траксло-кацию УПМ. Именно флегмонозный процесс характеризуется обширным поражением стенки желчного пузыря, зачастую с вовлечением других прилежащих органов и тканей. У многих обследованных нами пациентов - в 62,9 ±8,1% случаев, диагноз ФКХ или ГКХ усугублялся развитием осложнений: перивези-кального абсцесса, местным гнойным, серозным или гнойно-фиброзным перитонитом, эмпиемой желчного пузыря.

Высеваемость бактерий и количество их в исследуемом материале при деструктивных формах калькулёзного холецистита были достоверно высокими (р<0,001) по сравнению с ООКХ. Пациенты с диагнозом «полипоз желчного пузыря» также были обследованы как группа сравнения, при этом посев их биоматериалов (желчь и стенка желчного пузыря) были стерильны (рис. 3).

Примечание: *** - р<0,001нри сравнении ООКХ и деструктивных форм холецистита Рис.3. Процент высеваемости микроорганизмов при разных формах ЖКБ

Наши исследования показали, что существует зависимость между микробным пейзажем исследованных образцов и диагнозом пациентов (рис. 4). Так, ФКХ характеризовался присутствием примерно в равных долях энтеробак-терий (33,9 ± 6,0%) и грамположительных кокков (35,5 ± 6,1 %), причём среди последних преобладали Staphylococcus spp. Известно, что эти микроорганизмы относятся к гноеродной микрофлоре, а полученные нами данные доказывают их участие и в развитии гнойно-воспалительного процесса при ЖКБ.

70,00% 60,00% 50,00% 10,00% 30,00% 20,00% ют 0,00%

ООКХ ФКХ гкх

®энтеробактерин ^ гр+кокки ® НГОБ ® прочие

Примечание: *** - р<0,001 по сравнению с ООКХ;* - р<0,05 при сравнении ФКХ и ГКХ Рис.4 Микробный пейзаж при различных формах холецистита

Другой спектр микроорганизмов был выделен из клинических образцов, полученных от больных с ГКХ. Видовой состав был менее разнообразным, и

представлен достоверно чаще (р<0,001) представителями семейства Enterobacteriaceae (64,5 ± 8,6%). При этом 41,9 ± 8,7% приходилось на долю Е. coli. Из данных литературы известно, что эшерихии часто выделяются при гангренозных процессах различной локализации (Гриценко В.А., 2000; Гостищев В.К., 2007; Marne С. et al.,1986). Результаты нашей работы достоверно показали, что ГКХ вызывают в основном Е. coli (р<0,001). При деструктивных формах острого холецистита возрастает концентрация сиаловых кислот (Бородач A.B. с соавт., 2008; Panek М. et al., 2000), изменяются другие биохимические показатели, что возможно формирует спектр микрофлоры пораженных тканей. Именно при деструктивных процессах развивающихся при ФКХ и ГКХ достоверно выше (р<0,05) было количество бактерий в исследуемом материале и в среднем составило > 107КОЕ/г (табл. 3).

Таблица 3.

Диагноз Среднее количество м/о в 1г (КОЕ/г) п (количество проб, давших рост)

ООКХ** 2,0Х106КОЕ/г. 17

ФКХ 9,6X10" КОЕ/г 62

ГКХ 1,5X10'КОЕ/г 31

Примечание: ** - р<0,01 при сравнении ООКХ и ФКХ, ООКХ и ГКХ

Большинство авторов, изучавших проблему микробного заселениия тканей гепатобилиарной зоны, проводили исследование проб желчи. Однако выделение только биликультур не может в полной мере характеризовать бактериальную флору при данной патологии. Так, С.В. Якубовский (2006), А.А. Зорькин с соавт.(2008) считают целесообразным для выделения актуального возбудителя проводить микробиологическое исследование стенки желчного пузыря. В нашей работе удалось сопоставить результаты бактериологического исследования различных материалов, полученных от больных ЖКБ (рис. 5).

При посеве образцов ткани стенки желчного пузыря рост дали 64,5 ± 6,8% проб (рис.1). Этот результат достоверно превышает высеваемость из желчи (р<0,01). Микробный пейзаж тканей желчного пузыря был наиболее вариабельным по видовому составу среди изученных нами биологических материалов и также зависел от клинико-морфологической формы острого холецистита.

Спектр микроорганизмов в тканях стенки у пациентов с ФКХ был представлен значительной долей кокковой флоры (44,0 ± 9,9%), которая состояла из Staphylococcus spp., Enterococcus spp. и Peptococcus constellatus.

Доля НГОБ составила 28,0 ± 8,9%, и в основном это были синегнойные палочки.

Представители Enterobacteriaceae встречались в 24,0 ± 8,5% случаев и доминирующим видом среди выделенных культур были Е. coli. Также были выделены С. albicans в 4,0 ± 3,9% случаев.

60,00% 50,00%

40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 0,00%

аспират ДПК желчь стенка желчного желчные намни

пузыря

3 энтеробактерии ' гр+кокки ® НГОБ прочие

Рис.5. Микробный пейзаж различных биологических материалов при ЖКБ

Менее разнообразный микробный пейзаж стенки желчного пузыря был при ООКХ; чаще выделялись Е. faecium (33,3 ± 19,2%), а также S. epidermidis, P. aeruginosa и Е. coli (по 16,6 ± 15,1% соответственно).

При гангренозных процессах (р<0,01) микрофлора стенки желчного пузыря представлена главным образом энтеробактериями (58,8 ± 11,9%), при ведущей роли кишечной палочки - 41,2 ± 11,9% от всех выделенных при ГКХ культур (табл. 2).

Из образцов стенки желчного пузыря были выделены микроорганизмы, как в ассоциации, так и в монокультуре. Ассоциации были обнаружены при всех формах калькулёзного холецистита, но достоверно чаще (р<0,01) при ФКХ - в 59,1 ± 7,0% случаев. Ассоциации были представлены при ООКХ Р. aeruginosa и S. epidermidis, при ГКХ - Е. faecium и Е. coli, при ФКХ - S. epidermidis и

P. aeruginosa', S. epidermidis и Е. faecium, S. epidermidis и С. albicans. Монокультуры представляли: К. pneumoniae, P. aeruginosa, С. albicans, Moraxella spp, P. constellatus

В целом микрофлора тканей стенки желчного пузыря была представлена примерно в равных долях представителями семейства Enterobacleriaceae и грамположительными кокками - 35,4 ± 6,9% и 35,8 ± 6,9% соответственно. Удельный вес НГОБ составил 22,9 ± 6,1% (рис 5).

Показатель высеваемости при изучении желчных конкрементов также был значительным - 53,6 ± 9,4%, а видовой состав микрофлоры напоминал микрофлору стенки желчного пузыря, что обусловлено единым механизмом их эндогенного инфицирования. Однако условия формирования микробиоценоза в этих материалах различны, и это оказало влияние на полученные результаты. Бактерии, выделенные при посеве желчных камней, были представлены прежде всего видами, с высокой адгезивной способностью. При исследовании желчных конкрементов было выявлено, что на их поверхности чаще обнаруживаются грамположительные кокки, доля которых составила 46,7 ± 12,8% (в т.ч. стафилококки 26,7 ± 11,4%, энтерококки 20,0 ± 10,3%). Кроме того, были выделены

энтеробактерии (33,3 ± 12,2%), P. aeruginosa (13,3 ± 8,8%) и дрожжеподобные грибы рода Candida (6,7 ± 6,5%) (табл. 3). По два вида бактерий обнаружены на желчных конкрементах только при ФКХ и представлены следующими ассоциациями P. aeruginosa и S. epidermidis; С. albicans и S. epidermidis.

Таким образом, было показано, что желчные конкременты являются одним из основных факторов в развитии воспалительного процесса в желчном пузыре и желчевыводящих протоках, так как кроме механического воздействия на ткани (травмирование, обтурация), служат локальным очагом хронической инфекции у больных ЖКБ.

При этом этиологический аспект холелитиаза до сих пор не Изучен. Существуют некоторые представления о роли микроорганизмов и воспаления в этом процессе (Дедерер Ю.М. с соавт., 1983; Таджиев И.Я. с соавт., 1991; Дад-вани С.А. с соавт., 2000; Мараховский Ю.Х., 2003; Lee D.K. et al., 1999; Bellows C.F. et al., 2005). Результаты исследований образцов, выполненных методом атомно-силовой микроскопии, позволяют предположить, что в механизмах образования желчных камней ключевая роль может принадлежать нанобактериям, а точнее тому комплексу, который они образуют совместно с зародышевыми предшественниками окристаллизованных фосфатов кальция и коллагеновыми волокнами. По версии, разрабатываемой А.А.Гайдаш, для образования кальций фосфатных камней необходимо обязательное участие всех трех компонентов данного комплекса. Учитывая наши данные о ведущей роли бактериального обсеменения в развитии воспалительных процессов в стенке желчного пузыря, мы полагаем, что события могут развиваться по следующей схеме (рис.6):

Рис.6. Предполагаемая роль микробного инфицирования тканей желчного пузыря в процессе холелитиаза.

Все пробы содержимого ДПК дали рост микроорганизмов вне зависимости от клинической формы заболевания (рис. 1), поскольку данный биотоп не является стерильным и в норме, но в этиологически значимой концентрации (> Ю5КОЕ/мл) микроорганизмы высевались в 62,5 ± 17,1% случаев. Этот результат является значительным и свидетельствует о формировании благоприятных условий для размножения УПМ в кишечнике больных ЖКБ. Это доказывает и тот факт, что в половине изученных образцов дуоденального содержимого микрофлора была представлена ассоциациями из двух видов бактерий. Наиболее часто микст-инфекция в этих образцах встречалась при ООКХ. Ассоцианты

представлены: Е. agglomerans и A. calcoaceticus; Enterococcus spp. и S. epidermi-dis; Enterococcus spp. и Peptococcus spp; при ФКХ - Moraxella spp.к Peptococcus spp. У пациентов с диагнозом ПХЭС выделялись только монокультуры, представленные C.freundii, Moraxella spp. в равных долях. В материале из ДПК, полученном от больных с ФКХ, выделялись также монокультуры Е. coli, К. oxyto-са, C.freundi.

Эндоскопия пациентов с гангренозными процессами желчевыводящих путей не проводилась, и материал для посева отсутствовал.

Таким образом, микрофлора дуоденального содержимого у обследованных больных представлена в основном энтеробакгериями - 38,5 ± 13,5%. На грамположительные кокки (преимущественно энтерококки) и НГОБы приходилось по 23,0 ± 11,7% соответственно. Чаще других выделялись Enterococcus faecium, C.freundii, Moraxella spp. У двух обследуемых были выделены анаэробные грамположительные кокки Peptococcus spp. (табл.3).

Видовой спектр выделенных из ДПК микроорганизмов, позволяет предположить, что контаминация гепатобилиарной системы происходит в основном из желудочно-кишечного тракта, что в основном соответствует данным литературы (Зак В.И., Швецов С.А., 1990; Валышев A.B. с соавт., 1996; Никитенко В.И. с соавт., 2004; Maluenda F. et al., 1989; Parks R.W. et al., 1996; Casafont F. et al., 1998). Это является результатом избыточного заселения тонкого кишечника, снижения барьерных функций слизистой оболочки кишечника при ЖКБ, нарушения функции сфинктера Одди и собственно желчного пузыря.

Таблица 4.

Микробный пейзаж и высеваемость микроорганизмов в различных биологических материалах от больных ЖКБ

Микроорганизмы % Аспират ДПК %±m Желчь %±П1 Стенка желчного пузыря %±ш Желчные камни %±ш

Энтеробак-терии 40,2±4,6 Е. coli 7,7 ±7,4 30,6±7,7 27,1±6,4 20,0il0,3

C.freundii 15,4±10,0 2,8±2,7 2,1±2,1

К. pneumoniae 7,7±7,4 11,0±5,2 4,2±2,9 -

К. oxytoca

S. marcescens - 2,8±2,7 . -

E.agglomeratis 7,7±7,4 2,8±2,7 2,1±2,1 -

E. aerogenes - - 6,7±6,5

Proteus spp. - - - 6,7±6,5

всего 38.5л. 13.5 50,ftt8,3 33.3±12.2

Грамположительные кокки 34,8±4,5 S. epidermidis 7,7±7,4 13,9±5,8 17,0±5,l 26,7±П,4

S. saprophyticus

E. faecalis 15,4±10,0 19,4±6,б 18,8±5,6 20,0±10,3

E. faecium

всего 33.3±7.9 • 35,8±6,9 - 46,7±12,9

НГОБ . 16,1±3,5 P. aeruginosa 5,6±3,8 15,0±5,2 13,3±8,8

P. putrefaciens - -

A. calcoaceticus 7,7±7,4 - - -

A. Iwoffi - - 2,1±2,1 -

Moraxella spp. 15,4±10,0 - - -

всего - ä-Sas 23,Ш 1,7 5.6±3.8 22,9±6.1 13,3i8,8

НАБ P. constellatus - 2,8±2,7 2,1±2,1 -

3,б±1,8 Peptococcaceae 15,4±10,0 - -

Грибы 3,6±1,8 С. albicans - 5,6±3,8 2,1±2,1 6,7±6,5

Прочие Neisseria spp. - - 2,l±2,l -

1,8±1,3 Actinomyces spp. - 2,8±2,7 - -

Изучение количественного состава исследуемых материалов показало высокую степень обсеменённости (107 - 108 КОЕ/г) всех образцов при разных клинических формах желчнокаменной болезни, но чаще (р<0,01) при флегмо-нозном и гангренозном процессах. Это свидетельствует о роли выявленных микроорганизмов в развитии патологии желчевыделительного аппарата. В этиологически значимом количестве чаще других выделялись Е. coli и Е. fae-cium, которые встречались во всех давших рост пробах и при всех клинических формах калькулёзного холецистита.

Следовательно, было установлено, что желчь, стснка желчного пузыря и желчные конкременты у больных различными клиническими формами ЖКБ инфицированы преимущественно микрофлорой характерной для кишечника. При этом выявлена взаимосвязь между клинической формой воспалительного процесса в желчевыделительном аппарате и спектром микрофлоры. Полученные нами результаты показали, что наиболее информативным и объективным при остром холецистите, является исследование тканей стенки желчного пузыря, т. к. здесь менее выражено воздействие бактерицидных свойств желчи и не требуется наличие у микроорганизмов факторов, способствующих формированию биоплёнки.

При этом микрофлора ДПК по спектру, показателю высеваемости коррелирует с результатами исследования стенки желчного пузыря (рис.5), что позволяет ещё до операции обследовать больного и получить объективные данные для проведения периоперационной антибактериальной профилактик осложнений воспалительного характера.

Чаще исследованные образцы клинического материала содержали монокультуры, лишь 21,4 ± 4,0% изученных проб дали рост микроорганизмов в ассоциации из двух видов, что в основном согласуется с данными литературы (Жарская С.Л., 1994; Жулев С.А., 1999; Якубовский C.B., 2006; Bergan T. et al., 1979). При этом необходимо учитывать состав микробных ассоциаций при назначении антибактериальных препаратов.

Среди бактерий, участвующих в микробных ассоциациях наиболее часто встречались эпидермальные стафилококки (табл. 4). Интересно, что в 36,4 ± 4,7 % это были комбинации с Enterococcus spp. Известно, что между этими микроорганизмами возможны генетические рекомбинации, приводящие к формированию резистентности к антимикробным препаратам, например ванкомицину, что особенно актуально в случае выявления MRSE (Зайцев A.A., Карпов О.И. 2003; Гельфанд Б.З. с соавт. 2006). Выделение с той же частотой стафилококков и синегнойной палочки в одном биотопе, а также стафилококков и грибов (27,3 ± 4,3%) заставляет проводить адекватный подбор антимикробных препаратов для лечения больных ЖКБ.

Таблица 5.

Ассоциации микроорганизмов в образцах, полученных от пациентов с ЖКБ.

Микроорганизмы, выделенные в ассоциациях Частота встречаемости (n=22) Количество комбинаций Ассоцианты (количество культур)

S. epidermidis 11 3 Enterococcus spp. (4) Pseudomonas spp.( 4) С. albicans (3)

Е. coli 8 4 Klebsiella spp. (3) Pseudomonas spp. (2) C.freundii (2) Enterococcus spp. (1)

Enterococcus spp. 6 3 S. epidermidis (4) E. coli (1) Peptococcus spp. (1)

, Pseudomonas spp. 5 2 S. epidermidis (3) E. coli (2)

Klebsiella spp. 4 2 E. coli (3) Moraxella spp. (1)

С. albicans 3 1 S. epidermidis (3)

C.freundii 2 1 E. coli (2)

Moraxella spp. 2 2 Peptococcus spp. (1) Klebsiella spp. (1)

Peptococcus spp. 2 2 Enterococcus spp. (1) Moraxella spp. (1)

A. calcoaceticus I 1 E. agglomerans (1)

Анаэробная флора была обнаружена всего у трёх пациентов из числа обследуемых, но каждый раз ассоциировалась с особенно тяжёлым течением болезни. Это были представители рода РерГососсия, удельный вес которых в спектре всех выделенных культур составил 3,6 ± 1,7%. Так, у пациента на фоне флегмонозного процесса развилась эмпиема желчного пузыря, содержимое которого имело гнойный характер и при посеве этого материала получена монокультура анаэробных кокков РерХососст сот1е11аШ в этиологически значимом количестве (> 107 КОЕ/мл). Учитывая возможную актуальность анаэробов, мы посчитали целесообразным обследование пациентов с деструктивными формами холецистита - ФКХ и ГКХ, а также с ПХЭС методом ПЦР на наличие в их клинических образцах анаэробной флоры (табл.6).

Положительный результат был получен у 58,8 ± 11,9% обследованных лиц с ОДКХ, а при исследовании бактериологическим методом анаэробные микроорганизмы были выделены всего в 5,2 ± 2,9 % среди этой категории больных, что доказывает, в данном случае эффективность молекулярно-генетических методов исследования (р<0,001). Из 49 клинических образцов, исследованных методом ПЦР, в 16 определялась ДНК анаэробных микроорганизмов, что составило 32,6 ± 6,5%.

Результаты ПЦР при исследовании образцов клинического материала

Таблица 6.

Образцы М/о Степка желчного пузыря <п=14) Желчь (D=10) Кровь (п=25) Всего (п==49)

Bacteroides spp. 1 4 5

B.fragilis 2 1 1 4

Porphyromonas spp. - - - -

Prevotella spp. - 1 - 1

Prevotella melanino-genica - - - -

Fusobacterium spp. 5 1 - 6

Всего 7 4 5 16

Наиболее высокий показатель положительных проб, как и при исследовании культуральным методом, дали образцы тканей стенки желчного пузыря -50 ± 13,3%, (семь из 14 проб). На втором месте по результативности исследований были образцы желчи - четыре положительных результата из 10 проб, что составило 40 ± 15,4%. Реже всего ДНК анаэробных бактерий определялась в образцах крови, в 20 ± 10,0% случаев, при исследовании 25 проб положительны . были пять.

В стенке желчного пузыря доминировали Fusobacterium spp. (71,4 ± 11,6%), реже определялась ДНК Bacteroides fragilis (28,6 ± 11,6%). В образцах желчи половину положительных проб составили в равных долях В. | fragilis и Bacteroides spp. По 25,0 ± 11,1% пришлось на Fusobacterium spp. и | Prevotella spp. соответственно. В образцах крови определялась только ДНК. ! Bacteroides spp. (80 ± 10,0%) и В. fragilis (20,0 ± 10,0%). Таким образом, среди неспорообразующих анаэробных бактерий в исследованных пробах было выявлено наличие ДНК представителей рода Bacteroides - в девяти образцах (56,3 ± 12,4%) и рода Fusobacterium - в шести образцах (37,5 ± 12,1%) однократно (6,2 ± 6,0%)была обнаружена ДНК бактерий рода Prevotella. У пациентов с диагнозом ПХЭС, также были исследованы образцы крови в отношении неспорообразующих анаэробных бактерий при помощи ПЦР. Были изучены 23 образца крови, полученные от 18 больных, все они дали отрицательный результат. Отсюда следует, что НАБ, в частности бактероиды, играют важную роль в этиологии деструктивных форм калькулёзного холецистита, но не при ПХЭС.

Большинство - 77,5 ± 7,5% штаммов микроорганизмов, выделенных из различных биологических материалов больных ЖКБ, были чувствительны к изученным антибактериальным препаратам. Однако среди всех изолированных в ходе данного исследования культур, в пробах у больных ЖКБ доминировали Е. coli, и именно эти штаммы в 18,0 ± 6,9% случаев были резистентны к некоторым из применявшихся в терапии антибиотикам. Анализ результатов пока-

зал, что Е. coli являются также частым ассоциантом с другими микроорганизмами, при этом выявлены случаи формирования гетерорезистентных штаммов C.freundii.

В группе НГОБ, отсутствовали резистентные штаммы Moraxella spp. Все они были чувствительны к цефтазидиму, цефаперазону, амикацину, гентамици-ну, ципрофлоксацину. Культуры P.aeruginosa в 50,0 ± 8,9% случаев были резистентны к цефаперазону и чувствительны к другим антисинегнойным препаратам.

Среди грамположительных кокков, все штаммы Е. faecalis и Е. faecium были чувствительны к амикацину, гентамицину и ципрофлоксацину, а S.epidermidis к оксациллину, гентамицину, ципрофлоксацину, за исключением двух - к линкомицину. Выделенные штаммы анаэробных кокков были резистентны к метронидазолу, который считается препаратом выбора при лечении анаэробных инфекций.

Таким образом, стартовую эмпирическую терапию целесообразно назначать с учётом предполагаемой микрофлоры, например комбинацией цефалос-поринов II-III поколений с антианаэробными препаратами; комбинацией фтор-хинолонов с антианаэробными препаратами, которые являются эффективными в отношении актуальных микроорганизмов при изучаемой патологии.

Однако обязательна последующая коррекция лечения по результатам бактериологического исследования интраоперационно полученных проб биологического материала, особенно целесообразны посевы тканей стенки желчного пузыря. При этом более быстрый ответ из лаборатории, может быть получен при использовании методов генодиагностики, являющийся и более результативным (р<0,001) в отношении анаэробных микроорганизмов.

Известно, что заболевания билиарной системы сопровождаются нарушением пищеварения, которое может проявляться жалобами на боль, тошнотой, метеоризмом и нарушениями стула. При желчнокаменной болезни и хроническом холецистите формируются застойные явления в желчном пузыре и желчных протоках, нарушения оттока желчи и неадекватное поступление порции желчи в двенадцатиперстную кишку во время пищеварения. В результате нарастания патологических процессов в гепатобилиарной зоне больного формируется так называемый синдром «отключённого желчного пузыря», когда важнейшие функции этого органа практически отсутствуют.

Больные с острым калькулёзным холециститом подвергаются операционному удалению желчного пузыря вместе с конкрементами, поскольку другого эффективного метода лечения не существует. У таких пациентов зачастую формируется постхолецистэктомический синдром, который выражается в наличии выше указанных жалоб (Канищев П.А. с соавт., 1986; Абдуллаев A.A., 1988; Агафонова H.A., 2002; Черданцев Д.В. с соавт., 2006).

Ввиду снижения защитной функции желчного пузыря, выражающейся в бактерицидном действии желчи, в кишечнике больного ЖКБ происходит избы. точный бактериальный рост, при этом уменьшается количество представителей облигатной кишечной нормофлоры и происходит её замещение условно-патогенными бактериями.

С целью диагностики кишечного дисбактериоза нами были обследованы пациенты, перенёсшие холецистэктомию с разными сроками давности после оперативного вмешательства, а также группа пациентов перед операцией, с диагнозом ЖКБ. Все они имели жалобы типичные для постхолецистэктомическо-го синдрома. В результате бактериологического исследования было установлено, что все пациенты имели ту или иную степень кишечного дисбактериоза, проявляющегося в нарушении качественного и количественного состава флоры кишечника. У 27,8 ± 10,5% обследованных отмечается значительное снижение количества бифидобактерий, у 77,7 ± 9,8% - в составе энтеробактерий (отсутствие кишечных палочек с типичными свойствами, появление лактозоотрица-тельных и гемолитических форм и др.), у 67,1 ± 11,4% - присутствие УПМ (стафилококки, грибы рода Candida, клостридии и др.) в количестве выше нормы (рис.7). У значительной части пациентов изменения были сочетанными.

77,7%" 1

j

пик« j

1

i

Бифидобактерии Энтеробактерии УПМ

Примечание: * - количество бифидобактерий ниже нормы,** - количество типичных Е.соИ ниже нормы. УПЭ выше нормы, *** - УПМ выше нормы

Рис.7. Характер дисбиотических нарушений у пациентов с ПХЭС (доля обследуемых, у которых выявлено увеличение и / или снижение показателей относительно нормы)

В целом исследование показало, что у 55,6 ± 11,7% больных с ПХЭС был установлен дисбактериоз кишечника III степени, и у 44,4 ± 11,7% - II степени. Причём, чем более длительным был послеоперационный стаж у пациентов, тем более глубокими были изменения микробиоценоза кишечника (р-0,05). Из них 85,7 ± 8,2% перенесли холецистэктомию три и более (до 15) лет назад и имели 1П степень дисбактериоза кишечника, в то время как перенёсшие операцию до двух лет назад в 72,7 ± 10,5% имели П степень.

Для коррекции дисбиотических нарушений всем прооперированным пациентам с ЖКБ и пациентам с диагнозом ПХЭС были назначены пробиотиче-ские поликомпонентные препараты, которые содержат резистентные к антибиотикам штаммы лактобактерий, бифидобактерий, энтерококки, что даёт возможность их применения на фоне лечения. (Лыкова Е.А., 2001; Лоранская И.Д., 2003; Урсова Н.И., 2005). По данным клиницистов, у всех обследованных нами пациентов, получавших пробиотические препараты, в составе комплексного лечения, отмечалось улучшение состояния, исчезли симптомы диспепсии и другие жалобы, восстановилось нормальное пищеварение.

Практические рекомендации

1. Комплексное клинико-лабораторное обследование и ведение послеоперационных больных с острым калькулёзным холециститом должно осуществляться с учетом особенностей микрофлоры гепатобилиарной зоны и зависимостью её состава от клинико-морфологического диагноза.

2. Целесообразно проводить лабораторную детекцию микрофлоры ЖВП, а также наличие бактериемии у больных с ОДКХ с помощью ПЦР анализа.

3. Стартовая терапия должна заключаться в комплексном применении этио-тропных препаратов, эффективных в отношении как аэробной, так и анаэробной флоры, при последующей коррекции лечения на основании данных анти-биотикограммы. У больных до проведения холецистэктомии возможно получение аспирата ДПК с целью выделения и идентификации актуального возбудителя воспалительного процесса для рационального назначения антибактериальной терапии.

4. Холецистэкгомия и ПХЭС являются показанием для обязательного назначения пробиотических препаратов.

Выводы

1. Установлена зависимость микробного пейзажа от вида исследуемого материала и клинико-морфологической формы калькулёзного холецистита. Наиболее информативным материалом для исследования является стенка желчного пузыря, при исследовании которой получены самый высокий показатель высе-ваемости (64,5%), наиболее широкий спектр микроорганизмов (энтеробактерии, грамположительные кокки, НГОБ, грибы, анаэробы), в том числе с использованием ПЦР (50%).

Острый воспалительный процесс при холецистите инициируют чаще всего энтерококки; развитие деструктивных изменений тканей при ФКХ - разнообразные представители УПМ, в т.ч. неспорообразующие анаэробные бактерии и дрожжеподобные грибы, представленные чаще ассоциациями; гангренозные изменения тканей стенки желчного пузыря обусловлены в основном Е. coli (42%).

2. В составе микрофлоры желчи, стенки желчного пузыря, желчных конкрементов, дуоденального содержимого, крови при различных клинических формах осложнённой желчнокаменной болезни преобладали микроорганизмы сем. Enterobacteriaceae (40%), в т.ч. удельный вес Е. coli составил 55,6%; Klebsiella spp. - 15,5%. Грамположительные кокки, доля которых составила 34,8%, более чем в половине случаев представлены Enterococcus spp.. Среди представителей НГОБ (16%) доминирует Р. aeruginosa. Неспорообразующие анаэробные бактерии, представленные Peptococcus spp., составили 3,6%. Микроорганизмы были представлены в основном в монокультуре (79,6%); ассоциации из двух видов составили 21,4%.

3. Выявляемость анаэробных бактерий методом ПЦР-анализа достоверно выше, чем культуральным методом (р<0,001). Чаще других при деструктивных

формах холецистита определялись ДНК Bacteroides spp. (в т.ч. В. fragilis) -56,3% и Fusobacterium spp. - 37,5%. У пациентов с постхолецистэктомичсским синдромом ДНК анаэробных бактерий не выявлена.

4. В формировании желчных камней важную роль может играть комплекс, образованный нанобактериями, зародышами нанокристаллов фосфатов кальция и коллагеновыми волокнами при воспалительном процессе в желчном пузыре.

5. Установлено, что все штаммы Е. coli чувствительны к цефтриаксону и цефотаксиму; в 9,0% случаев резистентны к амикацину, гентамицину и в 18% -к спарфлоксацину и ципрофлоксацину. Штаммы P. aeruginosa в 50% случаев были резистентны к цефоперазону и чувствительны к другим изученным анти-синегнойным препаратам. Культуры анаэробных P. constellatus устойчивы к метронидазолу.

6. У всех больных с постхолецистэктомическим синдромом выявлено развитие дисбактериоза кишечника, в т.ч. в 55,6% случаев дисбактериоза III степени и в 44,4% случаев - П степени.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Винник, Ю.С., Перьянова, О.В., Теплякова, О.В., Рукосуева, Т.В. и др. Вариабельность микробиоценоза гепатобилиарного тракта у больных с острым калькулезным холециститом // Социальные аспекты хирургической помощи населению в современной России: матер, всерос. науч. конф. с междунар. участием. Успенские чтения. -, 2008.- вып. 5. - С. 168169.

2. Винник, Ю.С., Перьянова, О.В., Рукосуева, Т.В. и др. Особенности микрофлоры желудочно-кишечного тракта при различных клинических формах желчнокаменной болезни // Интеллект-2008: сб. матер, всерос. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых.- Красноярск, 2008.- ч. II - С.79-83.

3. Рукосуева, Т.В., Серова, Е.В., Розова, Л.Е. Особенности микрофлоры желчевыводяхцих путей у больных с желчнокаменной болезнью // Сб. науч. тр. Всероссийской Юбилейной науч.-практ. конф. патологоанатомов с международным участием, к 100-летию со дня рожд. проф. П.Г. Под-золкова. - Красноярск, 2008. - С. 338-341.

4. Рукосуева, Т.В., Серова, Е.В., Розова, Л.Е. Антибиотикорезистентность микроорганизмов, выделенных из различных патологических материалов больных с желчнокаменной болезнью // Человек и лекарство: матер. III Сиб. конгр,- Красноярск, 2009. - Т. 2. - С. 76-79.

5. Рукосуева, Т.В., Серова, Е.В., Розова, Л.Е. Нарушения состава микрофлоры кишечника при желчнокаменной болезни у пациентов после хо-лецистэктомии и результаты их коррекции // Питание в профилактике

социально-значимых заболеваний: матер, симп. с междунар. участием. -Красноярск, 2009. - С. 102-105.

6. Rukosueva, T.V., Peryanova O.V., Serova E.V. Bacterial colonization of gallbladder in patients with calculosus cholecystitis // Japan-Russia International Workshop 2010: Current Life-Threatening Infections: The 54th ISTC Japan Workshop.- Medical Countermeasures Medical Exchange and Networks, 2010. - P.65.

7. Винник, Ю.С., Миллер, C.B., Серова, E.B., Теплякова, О.В., Мухин, С.П., Перьянова, О.В., Рукосуева, Т.В. Желчнокаменная болезнь и постхоле-цистзктомический синдром. - Красноярск: Версо, 2010. - 234 с.

8. Рукосуева, Т.В., Перьянова, О.В., Серова, Е.В. Изучение бактериохолии в генезе калькулезного холецистита при желчнокаменной болезни // Журн. инфекционной патологии. - 2010. - №3, - С. 122-123.

9. Рукосуева, Т.В., Серова, Е.В., Розова, JI.E. Микробный пейзаж патологического материала от больных с различными клиническими формами желчнокаменной болезни II Сиб. мед. обозрение. - 2010. -№3.- С. 84-88.

Ю.Винник, Ю.С., Миллер, С.В., Серова, Е.В., Коваленко, А.Н., Теплякова, О.В., Мухин, С.П., Перьянова, О.В., Рукосуева, Т.В. Оптимизация лечебно-диагностических мероприятий при остром калькулезном холецистите и постхолецистэктомическом синдроме метод, указания - Красноярск: Версо, 2010.-52с.

П.Рукосуева, Т.В. Микробиологический аспект в патогенезе желчнокаменной болезни и её осложнений воспалительного характера // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - Иркутск, 2011.- №4(80) Часть 2. -С.325-329.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ

АБП - антибактериальные препараты

ГКХ -гангренозный калькулёзный холецистит

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДПК - двенадцатиперстная кишка

ЖВП - желчевыводящие пути

ЖКБ - желчнокаменная болезнь

КОЕ - колониеобразующие единицы

НАБ - неспорообразующие анаэробные бактерии

НГОБ - неферментирующие грамотрицательные бактерии

ОДКХ - острый деструктивный калькулёзный холецистит

ПХЭС - постхолецистэктомический синдром

ПЦР - полимеразная цепная реакция

УПМ - условно патогенные микроорганизмы

УПЭ - условно патогенные энтеробактерии

ФКХ -флегмонознык калькулёзный холецистит

MRSE - метициллинрезистентный Staphylococcus epidermidis

AFM - Atomic force microscopy - атомно-силовая микроскопия

АТСС - American Type Cultures Collection

NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards -

Национальный комитет по клиническим лабораторным стандартам США

Заказ ¿'¿Тираж 100 экз.

Отпечатано: ООО «Новые компьютерные технологии» 660049 г. Красноярск, ул. К.Маркса, 62, офис 120 тел.: (391) 226-31-31,226-31-11