Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробиологические аспекты калькулезного холецистита

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробиологические аспекты калькулезного холецистита"

На правах рукописи

рг

- О СЕН 2303

ПОСПЕЛОВА Светлана Валерьевна

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КАЛЬКУЛЕЗНОГО ХОЛЕЦИСТИТА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь, 2000

Работа выполнена в Пермской государственной медицинской академии

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Э.С.Горовиц

Научный консультант: кандидат медицинских наук, доцент Н.А.Зубарсва

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Р.А.Пшеничиов,

кандидат медицинских наук В.А.Несчисляев

Ведущая организация - Уральская медицинская академия

Защита состоится « м> июля 2000 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 200.46.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан « 06 » июня 2000 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, , л

доктор биологических наук ЛиЦи^--у ' И.Б. Ившина

Актуальность проблемы

Заболевания желчевыводящих путей занимают одно из ведущих мест в соматической патологии человека (Костюченко и др., 1999; Csendes et al., 1994; Schoenfield et al., 1996; Taracs et al., 1994). Однако в наше время грань между инфекционной и соматической патологией исчезает. С одной стороны, это связано с открытием роли микробозависимых процессов в развитии и течении ряда неинфекционных болезней, с другой, со значительными изменениями состава и свойств эндогенной микрофлоры под влиянием различных химиотерапевтических препаратов.

В последние годы отмечен рост заболеваемости желчнокаменной болезнью (ЖКБ) (Иванченкова, 1999; Attilli et al., 1995; Chou et al, 1994). Большинство авторов подчеркивают высокую частоту инфицирования желчи у больных холелитиазом (Алексеев и др, 1999; Grien et al, 1994; Vavreska et al., 1994). Единый взгляд на механизм инфицирования желчевыделитель-ных путей до сих пор отсутствует, хотя теория транслокации кишечной микрофлоры в гепатобилиарную систему приобретает всё больше сторонников. Многие авторы обращают внимание на то, что при нарушении колонизационной резистентности в кишечнике происходит увеличение количества потенциально-патогенных бактерий, которые, прорываясь через барьер слизистых и региональных лимфоузлов, могут проникать во внутренние органы, вызывая эндогенные инфекции, в частности, желчевыводящей системы (Белобородова и др., 2000; Гриценко и др, 2000; Salminen et al, 1990; Senninger, 1994). В то же время лишь в еденичных работах исследователи одновременно изучали «билиарную» и «кишечную» микрофлору (Наумова и др, 1988). Практически отсутствуют данные о биологических свойствах «кишечной» микрофлоры, позволяющих транслоцирующимся бактериям колонизировать гепатобилиарную систему и сохранять жизнеспособность в желчи в присутствии гуморальных и клеточных эффекторов.

Существенно различаются точки зрения на видовой состав и частоту встречаемости билиарной микрофлоры (Рухляда и др, 1995; Семина и др, 1999; Haijola et al, 1994; Van^ler-Hazel et al, 1994). Если роль Escherichia coli при данной патологии отмечается большинством исследователей, то значение представителей Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, НГОБ и не-клостридиальных анаэробных бактерий дискутируется.

Недостаточно изученными остаются вопросы влияния микроэкологических нарушений и процессов сенсибилизации на отдаленные результаты хирургического лечения ЖКБ (Чебуркин, 1999; Белобородова, 1998).

При широком использовании антибиотиков на различных этапах лечения ЖКБ (Яковлев, 1999; Aloj.et al, 1991; Grien et al, 1994), преобладает эмпирический подход к их назначению (Костюченко и др, 1999). Однако желчные кислоты являются весьма активными химическими веществами с выраженными детергентными свойствами, в присутствии которых возможны изменения противомикробной активности антибиотиков (Бекбергенов, 1990; Васина и др, 1998; Juvonen et al, 1993; Rosenthal et al, 1993). Вместе с

тем. в диагностической практике эти аспекты в должной мере не учитываются.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы. На основании сравнительного анализа свойств били- и копрокультур, изолированных от больных, оценить роль эндогенной микрофлоры и дисбиотических нарушений в этиологии острого и хронического калькулезного холецистита.

Конкретные задачи исследования.

1. Определить микробный пейзаж желчи и желчевыводящих путей, изучить свойства изолированных культур с углубленной характеристикой факторов патогенности и персистенции.

2. Исследовать количественный и качественный состав микрофлоры кишечника при остром и хроническом течении калькулезного холецистита.

3. Провести сравнительный анализ свойств микроорганизмов, выделенных из желчи и испражнений одних и тех же больных калькулезным холециститом.

4. Изучить уровень сенсибилизации у больных калькулезным холециститом.

Исследования выполнены в соответствии с основным планом НИР Пермской государственной медицинской академии (номер государственной регистрации 01.97 0001554).

Научная новизна

На основе комплексного анализа микробного пейзажа желчи, желчевыводящих путей и микрофлоры кишечника подтверждена этиологическая роль условно-патогенных «кишечных» микроорганизмов в возникновении острого и хронического холециста.

Впервые проведено сравнительное изучение особенностей микроорганизмов, персистирующих в желчевыводящих путях и изолированных из кишечника больных с различным течением калькулезного холецистита.

В сравнительном аспекте исследовано влияние желчи на антибиоти-кочувствительность бактериальных культур, изолированных из желчи и кишечника больных ЖКБ.

Впервые предложено в схему обследования больных ЖКБ включать изучение микробиоценоза кишечника, что позволит проводить адекватную заместительную терапию, а в случае транслокации бактерий - повысить эффективность лечения антибиотиками.

Разработана оригинальная методика определения бактериохолии, позволяющая в течение 3-5 часов с момента получения материала оценить степень бактериальной обсемененности желчи (Рационализаторское предложение № 1986 от 28 мая 1998 г.), принятое к внедрению кафедрами общей

хирургии и микробиологии Пермской государственной медицинской академии.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные расширяют современное представление об этио-патогенсзе и роли эндогенной микрофлоры в развитии ЖКБ

Установлено, что в процессе заболевания происходит кишечно-печеночная циркуляция микроорганизмов, способствующая селекции штаммов с наиболее выраженными факторами патогенности, особенно адгезивной и антилизоцимной активностей.

В значительном числе наблюдений при бакгериохолии выделяются ассоциации бактерий, при этом расширяется спектр возбудителей, изолируются варианты, которые раньше не имели этиологической значимости.

Практическое значение работы заключается в том, что предложена научно-обоснованная комплексная схема обследования больных, которая наряду с традиционными исследованиями должна включать анализ микробиоценоза кишечника, что позволит в случае транслокации бактерий более обоснованно проводить антибиотикотерапию.

Установлено, что в присутствии желчи антибиотики меняют свою активность, особенно это характерно для аминогликозидов, которые образуют преципитат в желчи. Это обстоятельство необходимо учитывать при назначении ангибиотикотерапии.

Обоснована целесообразность определения уровня сенсибилизации организма (по общему Ig Е), при необходимости рекомендовано назначать десенсибилизирующую терапию.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Условно-патогенная микрофлора однотипного состава высевается при остром и хроническом калькулезном холецистите. Во всех случаях бак-териохолии доминируют представители семейства Enterobacteriaceae, в частности, Е. coli. Степень обсемененности желчи и желчевыводящих путей значительно выше при остром процессе.

2. Независимо от клинического течения заболевания, при бакгериохолии, как правило, выделяются микробные ассоциации. При этом у больных ХКХ преобладают сочетания аэро-анаэробных бактериальных культур. Ведущими в них являются штаммы с более выраженными факторами вирулентности.

3. Дисбиотические нарушения в кишечнике при ЖКБ выражены в значительной степени и могут обусловливать эндогенное инфицирование желчевыделительной системы.

4. Транслокация кишечных штаммов условно-патогенных бактерий в гепатобилиарную систему сопровождается селекцией микроорганизмов с более выраженными адгезивными, гемолитическими и другими вирулентными свойствами.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы диссертационной работы, касающиеся оптимальной схемы обследования больных ЖКБ, рационализации лечения внедрены в практическую деятельность хирургических отделений ГКБ № 2 и ГКБ № 6 г. Перми. Основные положения работы используются в учебном процессе кафедр микробиологии, общей хирургии и факультетской хирургии с курсом урологии Пермской государственной медицинской академии. Они применяются в лекционном курсе и практических занятиях, проводимых со слушателями факультета усовершенствования врачей.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции молодых ученых Пермской государственной медицинской академии, Международной научной конференции «Перспективы развития естественных наук на Западном Урале» (1996) и научной сессии Пермской государственной медицинской академии (1998). Работа апробирована на совместном заседании научной проблемной комиссии «Эпидемиология, диагностика, профилактика и лечение инфекционных заболеваний» и кафедры микробиологии Пермской государственной медицинской академии.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 149 страницах компьютерного текста, состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 178 отечественных и 77 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 19 таблицами, 29 рисунками и 2 микрофотографиями.

Материалы и методы

Проведено комплексное бактериологическое обследование 183 пациентов с воспалительными процессами в желчевыделительной системе в возрасте от 23 до 86 лет, в том числе 164 женщины и 19 мужчин. Всего выделено и исследовано 1380 бактериальных культур, изолированных из различных материалов от больных острым и хроническим калькулезным холециститом.

Проведено бактериологическое исследование образцов пузырной (183) и протоковой (89) желчи, ткани желчного пузыря (88), печени (101) и конкрементов (153), полученных интраоперационно. У этих же больных

изучался количественный и качественный состав микрофлоры кишечника (183). В динамике (на 10-11 сутки после операции) изучали желчь, полученную из дренажа холедоха (89) и содержимое толстой кишки (94).

Количественный анализ бактериальной обсемененности желчи проводили с помощью разработанной нами оригинальной методики подсчета микроорагнизмов на мембранных фильтрах! Метод основан на концентрировании клеток на поверхности фильтра в результате фильтрации определенного объема исследуемой пробы с последующим окрашиванием клеток эритрозином и их подсчете в квадратах окулярной сетки. Предложенный метод позволяет стандартно производить перерасчет количества бактерий на объем желчи вне зависимости от ее консистенции и учитывать фактическое количество микроорганизмов, включая строгие анаэробы, микроаэрофилы и бактерии со сложными пищевыми потребностями. Экспрессность метода так же является его преимуществом.

Забор желчи, тканей стенок желчного пузыря, печени, а так же камней, проводили во время операции в стерильных условиях. После ориентировочного бактериоскопического исследования образцы хирургического материала первично засевали на сахарный бульон для обогащения. Посевы инкубировали при 37°С в течение 5 суток. За это время проводили 2-3 контрольных высева на плотные питательные среды. Для определения анаэробного компонента микрофлоры исследуемый материал засевали на полужидкие питательные среды непосредственно во время операции. Культивирование и идентификацию выделенных анаэробных микроорганизмов проводили согласно общепринятой методике (Джалашев, 1986). Идентификацию аэробных и факультативно-анаэробных бактерий осуществляли традиционно по морфологическим, культуральным, антигенным и биохимическим свойствам. Последние изучали с помощью Энтеротестов № 1 и № 2, Стафи-тестов и Неферм-тестов фирмы "Лахема".

Количественный и качественный состав микрофлоры кишечника изучали по традиционной методике (Красноголовец, 1989).

При выделении идентичных по видовым характеристикам микрорга-низмов из желчи и кишечника одних и тех же больных, кроме основных свойств изучали адгезивную активность бактерий (Брилис и др., 1986), их чувствительность к антибиотикам методом стандартных дисков (Биргер, 1982) и влияние желчи на антибиотикочувствительность бактериальных культур (Сытник, 1984).

Для изучения степени сенсибилизации организма определяли уровень общего иммуноглобулина Е в сыворотках обследуемых иммуноферментным методом, номер тест-системы по каталогу - NMS 1071.

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики (Лакин, 1990) и с помощью пакета компьютерных программ STATISTICA (версия 3.4 для Windows). Степень влияния желчи на антибиотикочувствительность бактериальных культур оценивали на основании непараметрического парного критерия Уилкоксона (Гублер, Генкин, 1969).

Результаты и их обсуждение

Из желчных путей 183 больных, оперированных по поводу различных форм калькулезного холецистита, в 91,1 % случаев высевали различную условно-патогенную микрофлору, пейзаж которой был однотипен.

При остром калькулезном холецистите (ОКХ) инфицированность пузырной желчи составила 94,8 % и была выше, чем при хроническом (87,4 %) (рис. 1). Аналогичная закономерность была установлена и при исследовании другого интраоперационного материала: протоковой желчи (68,6-55,3 %), ткани печени (37,2-20,7 %) и желчного пузыря (93,6-69,2 %). Максимальные значения микробной обсемененности пузырной желчи больных ОКХ так же значительно выше - 8,2* 1012, чем при хроническом калькулезном холецистите (ХКХ) - 5,6х 105 микробных клеток/1 мл желчи.

□ Культуры не вывалены □ Аэрсйы ■ Аэроанаэробны« ассоциации И Анаэробы

Рис. 1. Инфицированность пузырной желчи больных ХКХ и ОКХ

Кишечная палочка является наиболее часто выделяемым из желчевы-водящих путей микроорганизмом (18,5-29,1 %) (табл. 1). Выявлена связь возникновения острого воспалительного процесса в желчевыводящих путях с экспрессией вирулентных свойств эшерихий, в частности, гемолитической активности высеваемых культур. В наших исследованиях отмечена высокая частота высеваемости Klebsiella-Enterobacter-Citrobacter и НГОБ (16,911,4 %), что свидетельствует о возрастании их этиологической значимости при данной патологии. Выявили так же значительный удельный вес грампо-ложительных кокков. Тот факт, что среди стафилококков преобладали представители вида S.epidermidis как при хроническом, так и при остром процессах, согласуется с данными литературы об увеличивающейся значимости этого вида стафилококков в хирургических заболеваниях. Его роль в этиологии ЖКБ до сих пор недооценивалась. В то же время расширение этиологического спегара с вовлечением в инфекционный процесс и других видов стафилококков (S. hominis, S. capitis, S.caprae) с низким вирулентным потенциалом, свидетельствует об иммунокомпромиссном статусе обследуемых. С другой стороны, увеличение видового и внутрипопуляционного разнообра-

□ Культуры не выделены □ Аэробы

Ш Аэроеивэробные ассоциации □ Анеэробы

:зия возбудителей способствует их более длительному сохранению в очаге хирургической инфекции.

Таблица 1

Результаты бактериологического исследования желчи больных ХКХ и ОКХ в динамике

Род/вид микроорганизмов Количество штаммов выделенных из желчи

Больных ХКХ Больных ОКХ

Во время операции На 10-11 сутки после операции Во время операции На 10-11 сутки после операции

Абс. % Абс. % Абс. % Абс. %

Acinetobacter 6 4,8 2 5,7 8 3.8 3 6,7

Bacteroides 12 9,7 6 17,2 21 10,9 7 15,6

Candida 1 0,82 3 8,6 2 0.95 5 11,1

Citrobacter 2 1,6 0 0 2 0,95 2 4,4

Clostridium 2 1,6 0 0 4 1,9 3 6,7

Enterobacter 4 3,2 0 0 1 0,5 1 2,2

E .coli (hem +) 6 4,8 2 5,7 21 10,6 2 4,4

E. coli (lac +) 12 9,7 1 2,9 17 9,1 0 0

E. coli (lac -) 5 4,03 0 0 23 11,5 1 2,2

Fusobacterium 1 0,8 1 2,9 2 0,95 0 0

Klebsiella 15 12,1 2 5,7 30 14,3 4 8,9

Lactobacillus 2 1,6 1 2,9 4 1,9 1 2,2

Morganella 2 1,6 0 0 3 1,4 1 2,2

Peptococcus 3 2,4 2 5,7 5 2,4 1 2,2

Peptostreptococcus 2 1,6 0 0 2 0,95 0 0

P. melaninogenicas 3 2,4 2 5,7 4 1,9 2 4,4

Proteus 5 4,1 5 14,3 11 5,29 5 11,1

Ps. aeruginosa 1 0,8 2 5,7 2 0,95 1 2,2

Serracia 1 0,8 0 0 0 0 0 0

S. aureus 6 4,8 2 2,9 5 2,4 1 2,2

S. capitis 6 4,8 0 0 2 0,96 0 0

S. caprae 3 2,4 0 0 1 0,5 0 0

S. epidermidis 14 11,3 3 8,6 11 5,2 2 4,4

Str. faecalis 5 4,03 1 2,9 13 6,2 2 4,4

S. hominis 3 2,4 0 0 4 1,9 0 0

Str. viridans 1 0,82 0 0 6 2,9 1 2?2

Всего 124 36 210 45

Важно подчеркнуть, что в подавляющем большинстве случаев и при остром, и при хроническом калькулезном холецистите (85,7-76,9 %) выделяли идентичные культуры из пузырной желчи, ткани печени, желчного пузыря и конкрементов, что подтверждает их участие в патогенезе ЖКБ.

Изучение степени выраженности факторов патогенности и перси-стенции показало, что «билиарная» микрофлора характеризуется высокими уровнями адгезивной способности, антилизоцимной активности, полианти-биотикорезистентностью и часто - гемолитическими свойствами.

Обращает на себя внимание знач(гтельное число выделенных ассоциаций бактерий, причем при остром калькулезном холецистите преобладали ассоциации аэробных бактерий, а при хроническом в ряде образцов превалировали аэро-анаэробные (среди неклостридиальных анаэробов чаще встречались бактерии семейства Вас1его1(1асеае) (рис. 2). Ассоцианты значительно различались набором факторов пагогенности и степенью их проявления. Вероятно, «ведущими» в ассоциациях являются наиболее высокоадгезивные штаммы, которые в большинстве случаев характеризовались также выраженной АЛА и антибиотикорезистентностью. Их приоритетная роль подтверждается тем, что из всех сочленов ассоциаций именно высокоадгезивные культуры обнаруживали в тканях желчного пузыря и печени, они же преимущественно сохранялись и в послеоперационном периоде, при этом, что важно отметить, уровень их факторов вирулентности становился еще выше.

□ Культуры не выделены

□ Моноинфицирование

□ Ассоциации

О Культуры ие выделены □ Моноинфицирование В Ассоциации

Рис. 2. Инфицировашшсть пузырной желчи больных ХКХ и ОКХ

Все выделенные аэробные и факультативно-анаэробные бактериальные культуры проявляли высокую резистентность и выраженную индивидуальную чувствительность к антибактериальным препаратам. Кроме того, спектр антибиотикочувствительности биликультур менялся в присутствии желчи больного. Степень изменения зависела как от физико-химических параметров желчи, так и от индивидуальных свойств микроорганизмов. Это обстоятельство необходимо учитывать при выборе антибактериального препарата для лечения данной категории больных.

В процессе динамического наблюдения вьивили изменение структуры микробного пейзажа желчи как у больных хроническим, гак и острым калькулезным холециститом. Увеличился удельный вес представителей Proteus, Ps. aeruginosa, Citrobacter и НГОБ, что свидетельствует о реализации значительных персистенгных и патогенных характеристик этих бактерий, позволяющих им длительно сохраняться в послеоперационный период. Что касается некоторого снижения процента стафилококков и фекальных стрептококков, то оно очевидно, связано с достаточно быстрой элиминацией возбудителей с невысоким персистентным потенциалом из санируемого очага. Важно отметить, что представители именно этих видов бактерий были наиболее гетерогенными по уровню адгезивной активности при исследовании интраоперационных материалов. На 10-11 сутки после операции сохранялись только высокоадгезивные варианты, при этом они увеличивали свою адгезивную активность и антибиотикорезистентность.

В результате проведенного бактериологического исследования конкрементов мы обнаружили высокую частоту инфицирования коричневых пигментных камней, что согласуется с многочисленными данными, свидетельствующими о возможном участии микроорганизмов в процессах холе-литогенеза (Чупин, 1994; Jacyna et. al., 1986; Scar et al., 1989; Shoda et al., 1993; Rada et al., 1983).

Нами установлено, что дисбиотические нарушения в составе микрофлоры кишечника у больных ЖКБ выражены в значительной степени. Наиболее часто они проявлялись в уменьшении уровня облигатных анаэробных симбионтов - лакгобактерий у 64,6 % и бифидобактерий у 59,5 % больных. При этом у 27,8 % пациентов количество лакгобактерий было менее 1 xl()s, у 26,6 % - бифидобактерий было менее 1х107 бактериальных клеток/г испражнений. Известно, что одной из важнейших функций этих бактерий является поддержание колонизационной резистентности организма. Их метаболиты (летучие жирные кислоты - ЛЖК) оказывают выраженное действие на пролиферативную активность эпителия кишечника (Белобородова и др., 2000; Минушкин и др., 1999). По мнению Н.В. Белобородовой с соавт. (2000), бактерии смогут преодолеть эпителиальную преграду и транслоци-роваться во внутреннюю среду организма, в случае, если пролиферация будет отставать от потребностей в надежном барьере. С другой стороны, вследствие снижения уровня бифидо- и лакгобактерий увеличивается удельный вес аэробной микрофлоры. При этом создаются условия для проявления агрессивных свойств УПМ. В целом, УПМ в содержимом толстой кишки (в количестве, превосходящем норму) выявили у 92,4 % больных, при этом доминирующее развитие бактерий одного вида встречалось относительно редко - 24,1 %. В большинстве случаев (68,3 %) - изменения в микробиоценозе кишечника были более глубокими, в испражнениях обнаруживали ассоциации условно-патогенных микроорганизмов (рис. 3).

окх хкх

□ не выявлена В монокультуры

Шдвухкомпонентные ассоциации УПБ В трехкомпонентные ассоциации УПБ О 4-5ти компонентные ассоциации УПБ

Рис. 3. Условно-патогенная микрофлора в кишечнике больных ОКХ и ХКХ до операции

Представители семейства Enterobacteriaceae преобладали среди УПМ, как при ХКХ - 59,7 %, так и при ОКХ - 52,1 % (от общего числа выделенных штаммов). Атипичные эшерихии и Klebsiella превалировали при обоих формах холецистита, составляя 28 % и 9,5 % соответственно. Представители группы НГОБ и родов Enterobacter, Citrobacter, Serracia обращали на себя внимание при ХКХ, при ОКХ наряду с указанными часто выделяли представителей рода Proteus. На долю грамположигельных кокков приходилось 44,1 % от всех выделенных штаммов при ОКХ и 27,2 % - при ХКХ.

Дисбиотические нарушения углублялись в послеоперационный период. Количество штаммов НГОБ, Proteus, Klebsiella и Candida albicans увеличилось. Чаще наблюдали гемолитическую активность у эшерихий, стафило-и стрептококков (табл. 2).

Все исследованные культуры характеризовались набором факторов патогенности и персистенции, резистентностью к 4-15 антибиотикам. Анти-биотикочувствигельность копрокультур значительно изменялась под влиянием желчи больного, как правило, в сторону снижения.

Таблица 2

Частота встречаемости УПБ в микрофлоре кишечника больных ХКХ и ОКХ в различные сроки наблюдения

Род ' вид микроорганизмов Количество выделенных штаммов

ХКХ ОКХ

До операции На 10-11 сутки после операции До операции На 10-11 сулки после операции

Абс % Абс % Абс % Абс %

Acinetobacter 6 4,6 5 7,1 5 4,5 6 5,8

Candida 11 8,4 21 30,0 4 3.6 15 14,5

Citrobacter 3 2,3 1 1,4 2 1,8 2 2,0

Enterobacter 6 4,6 3 4,3 3 2,7 1 1,0

E. coli (lac -) 31 23,7 11 15,7 10 8,9 10 9,7

E. coli (hem +) 17 13,0 12 17,1 19 16,7 17 16,5

Klebsiella 10 7,6 8 11,4 16 14,3 9 8,7

Morganella 2 1,5 1 1,4 1 0,9 1 1,0

Proteus 2 1,5 3 4,3 4 3,6 8 7,1

Ps. aeruginosa 1 0,8 1 1,4 3 2,7 3 2,9

Serratia 1 0,8 0 0 1 0,9 0 0

Streptococcus 19 14,5 8 11,4 18 16,1 18 17,5

Staphylococcus 21 16,0 7 10,0 26 23,2 13 12,6

Всего 131 70 144 129

В значительном проценте случаев установили идентичность микробных культур и их ассоциаций из желчи и испражнений больных острым (73,1 %) и хроническим (61,7 %) холециститом. При этом отметили параллельное изменение одного или нескольких таксономических признаков большей части микроорганизмов, особенно выраженное у «билиарных» штаммов. Чаще всего это касалось Е. coli: и в кишечнике, и в желчи появлялись атипичные штаммы - неподвижные, слизистые, с измененными биохимическими свойствами, гемолитические. Уровни выраженности адгезивной, антилизоцимной активностей и антибиотикорезистентности были выше у "билиарных" штаммов по отношению к "кишечным". Наиболее показательными были данные в отношении адгезивности. В 29,4 % случаев цифровые значения адгезивности били- и копрокулмур были практически одинаковыми. Как в желчи, так и в содержимом толстой кишки преимущественно обнаруживали монокультуры со средней или высокой степенью адгезивности. У данных больных диагностировали дисбактериоз кишечника I -II степени.

В 70,6 % случаев адгезивность штаммов, выделенных из желчи, была на порядок выше, чем у аналогичных штаммов из испражнений. Эти пациенты страдали дисбактериозом III-IV степени. Из различного исследованного материала в основном выделяли многокомпонентные бактериальные ассоциации, представители которых в значительной степени различались по адгезивным свойствам. Разница между показателями «желчных» и «кишечных» штаммов была более выражена у высокоадгезивных культур, что под-

тверждается статистически (р<0,05). Показатели низко- и. особенно, неадгезивных билиарных и копрокультур различались незначительно (р>0,05). Данный факт свидетельствует о том, что в процессе персистенции бактерий в желчевыделительной системе, очевидно, происходит постоянный селективный отбор высокоадгезивных клонов из гетерогенной популяции. При этом формируется высокий уровень адгезивности микроорганизмов, который способствует микробной колонизации и низкоадгезивными штаммами. Формирование устойчивых, трудно разобщаемых ассоциаций, возможно, связано с прикреплением низкоадгезивных микроорганизмов на высокоадгезивных вариантах. В норме в кишечнике некоторые бактерии могут прикрепляться к рецепторам других микроорганизмов, уже локализованных в муциновом слое (опосредованная адгезия) (Положенкова, 1999).

Изучая в сравнительном аспекте представителей некоторых родов бактерий, отметили, что билиарные штаммы Е. coli проявляли более высокий уровень адгезивности, чем аналогичные «кишечные» у больных ХКХ и ОКХ, соответственно, в 84,6 - 92,3 % случаев (р<0,05). Эшерихии существуют в кишечнике в виде гетерогенной по уровню адгезивности популяции, но только варианты с более высокой адгезивностью в процессе транслокации способны закрепиться в гепатобилиарной системе. В тоже время, все выделенные штаммы родов Klebsiella, Proteus, Acinetobacter, Pseudomonas проявляли высокую адгезивность как в кишечнике, так и в желчи, но «кишечные» показатели были гак же ниже «билиарных». Вероятно, данные бактерии как представители УГОЛ изначально имеют более высокий уровень адгезивности, но процесс отбора более адгезивных в желчной среде характерен и для них. Дрожжеподобные грибы рода Candida были неадгезивными как в кишечнике, так и в желчи.

Таким образом, адгезивная активность «билиарных» бактериальных культур была выше, чем аналогичных «кишечных» штаммов (рис. 4).

Факт, что бактерии, формирующие ассоциацию, обладают различной степенью адгезивности, подтверждает синергичность их взаимоотношений. Вне ассоциации низкоадгезивные штаммы имеют весьма незначительные возможности для закрепления в патологическом очаге. При длительно текущем воспалительном процессе формируются устойчивые связи между микророрганизмами с разными адгезивными свойствами, что способствует вовлечению в инфекционный процесс и слабовирулентных штаммов с низкой адгезивной активностью.

Эффективность лечения инфекционного процесса зависит от концентрации антибактериального препарата не только в крови, но и в месте локализации возбудителя. В силу этого представляется целесообразным учитывать влияние желчи на антибиотикорезистентность микроорганизмов, пер-систирующих в гепатобилиарной системе, поскольку чувствительность к антибиотикам как билиарных, так и копрокультур изменялась под влиянием желчи больного неоднозначно.

хкх

окх

Рис. 4. средние значения СПА штатов микроортанизмо^изолированиь« из желчи и кишечника больных ХКХ и ОКА

Чувствительность к амикацину, ципрофлоксадину цефаклору, фура-и линкомицину статистически достоверно увеличилась (рис. 5).

Чувствительные культуры (%)

И с учетом влияния желчи_Рбез учета

Рис. 5. Влияние желчи на эффективность некоторых антибиотиков в отношении грамнсгатнвных билиарных культур, выделенных от больных ОКХ

В целом, снижение чувствительности наблюдали значительно чаще, чем повышение. Статистически достоверным оно было у таких антибиотиков, как гентамицин, неомицин, тетрациклин, стрептомицин, ампициллин,

левомицетин и полимиксин. Так же в большинстве случаев отметили снижение чувствительности бактериальных культур к канамицину, цефазолину, рифампицину и фурадонину, но оно было статистически недостоверно. Это в разной степени касалось как грамотрицательных, так и грамположитель-ных бактерий. Как показали исследования, проведенные на кафедре микробиологии Пермской государственной медицинской академии, одной из причин, снижающих эффективность аминогликозидов в присутствии желчи, является то, что их водные растворы преципитируют желчные пигменты. Это уменьшает активную концентрацию антибиотиков. Осаждающий эффект в наибольшей степени выражен у гентамицина, значительно меньше у кана-мицина и стрептомицина (Карпунина и др., 1998).

В то же время субингибирующие дозы антибактериальных препаратов способны изменять уровень экспрессии структур, ответственных за адгезию бактерий. В частности установлено, что терапевтический эффект ряда антибиотиков связан не только с их бактериостатическим действием, но и с тем, что они препятствуют колонизации слизистых (в экспериментах со штаммами Е. coli, P.mirabilis, K.pneumonia, Ent.aerogenes использовали субингибирующие концентрации антибиотиков) (Буянов и др., 1991, тендеров и др., 1986). Это обусловлено тем, что под влиянием определенных антибиотиков изменяются поверхностные компоненты, участвующие в адгезии, но только у чувствительных к этим препаратам бактерий (Буянов и др., 1991). Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что в присутствии антибиотиков устойчивые к ним штаммы имеют преимущества перед чувствительными при колонизации слизистых Ж KT, а в последующем -и гепатобилиарной системы. В силу этого неадекватная антибиотикотерапия является фактором, способствующим селекции из всего разнообразия микрофлоры кишечника наиболее резистентных и адгезивных вариантов бактерий.

Таким образом, культуры, выделенные из желчи и кишечника больных с различными формами холецистита, обладали выраженной антибиоти-корезистентностью. При этом желчь каждого больного или потенцировала, или ослабляла действие одного и того же антибактериального препарата, степень выраженности такого воздействия строго индивидуальна. Очевидно, что при лечении хирургических заболеваний билиарной системы наиболее целесообразно применение именно тех лекарственных средств, бактерицидную и бактериостатическую активность которых желчь потенцирует или, во всяком случае, не снижает.

Развивающаяся сенсибилизация организма к условно-патогенной микрофлоре является одним из патогенетических факторов, способствующих хронизации воспалительного процесса в желчном пузыре и неблагоприятному течению заболевания. Реакция иммунного воспаления, происходящая при этом в слизистой оболочке кишечника, по-вндимому, способст-зует транслокации УПМ из кишечника в гепатобилиарную систему.

В наших исследованиях выявлен повышенный уровень ^ Е у 38,3 % больных ХКХ и более, чем у половины пациентов с острой формой заболевания (53,2 %). Установили взаимосвязь между степенью дисбиоза кишечника, бактобилией и уровнем ^ Е у больных хроническим и острым холециститом. У пациентов с 0-1 степенью дисбактериоза, в желчи которых УПМ не обнаружили, уровень ^ Е был в пределах нормы. При Ш-Р/ степени дисбиоза кишечника и выявлении билиарной микрофлоры в значительном проценте случаев регистрировали уровень ^ Е 500 - 1000 Ед/мл.

Представляется целесообразным при хирургическом лечении больных ЖКБ наряду с проведением бактериологического мониторинга для выявления бактериохолии и дисбиоза кишечника, включать в схему лабораторного обследования и определение общего ^ Е. Это поможет клиницистам дифференцировать аллерго-зависимые и независимые механизмы в развитии патологии, скорректировать лечебную тактику, применяя в случае необходимости противоаллергическую терапию.

Таким образом, прослеживается существенная роль нарушения колонизационной резистентности организма в развитии калькулезного холецистита и его осложнений. Показано, что у больных, перенесших оперативные вмешательства на желчевыводящих путях, имеются глубокие изменения биоценоза кишечника с развитием бактериохолии и сенсибилизации к ауто-микрофлоре. При этом УПМ приобретают не свойственные им признаки вирулентности. Антибактериальная терапия в этих случаях должна проводиться исключительно на основании изучения чувствительности и с учетом влияния желчи на активность данного антибиотика. Своевременная диагностика изменений кишечного биоценоза позволит провести целенаправленную коррекцию и улучшить результаты лечения ЖКБ.

ВЫВОДЫ

1. Установлена высокая частота инфицирования желчевыводящих путей и желчи при остром (64-98 %) и хроническом (55-87 %) калькулезном холецистите. Ассоциации бактерий выделили из исследуемого материала в 58,3-68,1 и 42,5-50,1 % случаев, соответственно.

2. Грамотрицательные бактерии семейства Еп1егоЬас(епсеае доминировали при моноинфекции (78,3 %); в ассоциациях выявляли анаэробные бактерии семейства Вас1его1с1асеае (15,5-37,4 %). В ассоциациях "ведущими" являлись наиболее высокоадгезивные штаммы, именно их высевали из тканей печени, желчного пузыря и в послеоперационный период.

3. Независимо от формы течения инфекционного процесса, холецистит сопровождался развитием дисбиоза кишечника, который выявили в 91,5-100 % случаев, более выраженные изменения в биоценозе сочетались с более тяжелым течением заболевания.

4. Показано, что при желчнокаменной болезни наблюдалась кишечно-печеночная циркуляция условно-патогенных бактерий. Сравнительный анализ билиарных и копрокультур свидетельствовал об усилении персистент-

гых, вирулентных характеристик и антибиотикорезистентности штаммов, шфицирующих гепатобилиарную систему.

5. Установлено, что в присутствии желчи 92,7 % били- и 100 % ко-фокультур изменяли свою чувствительность к антибиотикам. При этом кслчь разных больных или потенцировала, или ослабляла действие одних и ех же антибактериальных препаратов.

Практические рекомендации

1. Схема обследования больных ЖКБ наряду с традиционными мето-ia.Mii должна включать анализ микробиоценоза кишечника, что позволит фоводить адекватную заместительную терапию, а в случае транслокации 5актерий более обоснованно применять антибиотики.

2. При идентификации биликультур целесообразно определять сте-тснь выраженности факторов патогенности, в частности, адгезивной актив-юсти, что позволит выявлять наиболее значимые компоненты микробных 1ссоциаций и, следовательно, даст возможность повысить эффективность доводимого лечения.

3. Выбор антибактериального препарата для лечения больных с вос-талительными процессами в желчевыделительной системе должен осущест-1ляться на основе определения антибиотикочувствителъности бактериаль-юй флоры с учетом влияния на нее желчи конкретного больного.

4. Больным, перенесшим оперативные вмешательства на желчевыво-цнцих путях, показано определение уровня сенсибилизации. Десенсибили-шрующая терапия позволит улучшить отдаленные результаты оперативного течения холелитиаза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Поспелова C.B. Характеристика микрофлоры кишечника при желчнокаменной болезни // Научно-практическая конф. молодых ученых Пермской государственной медицинской академии: Тез. докл. - Пермь, 1996. - С. 70.

I. Поспелова C.B., Зубарева H.A., Карпунина Т.И, Яхлакова Г.В. Воспалительные заболевания желчевыводящей системы и дисбакгериоз кишечника (результаты микробиологических исследований)//Приоритетные проблемы инфекционной патологии (эпидемиология, клиника, диагностика, профилактика): Матер, межрегион, науч.-практич. конфер, посвященной 55-летию каф. эпидемиологии Пермской государственной медицинской академии. - Пермь, 1996. - С. 113-115. 3. Карпунина Т.Н., Зубарева H.A., Соснин Д.Ю, Ершов О.Ю, Поспелова C.B. Углеродные сорбенты как средство детоксикации при механической желтухе // Сб. «Перспективы развития естественных наук на Западном Урале». - Труды междунар. науч. конф. - Пермь, 1996. - С. 18-21.

4. Поспелова C.B., Карпунина Т.И. Некоторые свойства микроорганизмов, выделенных из желчи и кишечника больных калькулезным холециститом II Науч. сес. Пермской государственной медицинской академии. Тез. докл. - Пермь, 1998. - № 107.

5. Поспелова C.B. Неферментирующие грамотрицательные бактерии при хирургических заболеваниях билиарной системы // Сб. труды II Международной конф., посвящ. 100-летию НПО "Биомед". - Пермь, 1998. - С. 203.

6. Карпунина Т.И., Поспелова C.B. Микробные ассоциации при воспалительных заболеваниях желчных путей // Сб. труды II Международной конф., посвящ. 100-летию НПО "Биомед". - Пермь, 1998. - с. 202-203.

7. Поспелова C.B., Карпунина Т.И., Зубарева H.A. Изучение адгезивных свойств микроорганизмов, выделенных от больных с патологией гепато-билиарной системы // Пермский мед. журнал. -1998. - Том 15, № 3. - С. 22-25.

8. Поспелова C.B., Карпунина Т.И., Соснин Д.Ю. К совершенствованию тактики лабораторного обследования больных с хроническим холецисти-том/ЛОшн. лабор. диагн. - 1999. - № 12. - С. 18.

Изд. лиц. ИД №00185 от 26.10.99

Подписано в печать 02.06.2000. Формат 60*84716. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ №24.

Техническая редакция «Пермского медицинского журнала» 614000, г. Пермь, ул. Большевистская, 85