Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ ассоциаций генов-кандидатов интерлейкинов с развитием хронического калькулезного холецистита

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Анализ ассоциаций генов-кандидатов интерлейкинов с развитием хронического калькулезного холецистита"

На правах рукописи

Черкашина Ольга Владимировна

АНАЛИЗ АССОЦИАЦИЙ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ С РАЗВИТИЕМ ХРОНИЧЕСКОГО КАЛЬКУЛЕЗНОГО ХОЛЕЦИСТИТА

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 МАР 2015

Белгород - 2015

005559757

005559757

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Чурносов Михаил Иванович

Официальные оппоненты:

Жукова Ольга Владимировна, доктор биологических наук, доцент, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, заведующая лабораторией генетики человека

Солодилова Мария Андреевна, доктор биологических наук, доцент, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры биологии, медицинской генетики и экологии

Ведущая организация:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южный федеральный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации

Защита диссертации состоится « и » 2015 года в часов

на заседании совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, Д. 85.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Минобр науки России и на сайте www.bsu.edu.ru

Автореферат разослан

И.о. ученого секретаря совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.015.13 доктор медицинских наук

С.П. Пахомов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хронический калькулезный холецистит (ХКХ) относится к обменно-воспалительным заболеваниям гепатобилиарной системы и характеризуется образованием конкрементов в просвете желчного пузыря [Вовк Е.И., 2010; Ильченко A.A., 2011]. Среди заболеваний пищеварительной системы ХКХ достаточно распространен, он составляет почти 90% всех случаев желчнокаменной болезни (ЖКБ), заболеваемость которой в мире приумножается с каждым десятилетием [Коханенко Н., 2011; Горбунов А.Ю., 2014]. Согласно данным статистики ЖКБ отмечается у 15% населения нашей планеты, а камни в желчном пузыре и желчных протоках обнаруживаются у каждого четвертого жителя [Саакян О.В., 2011; Hsi-Che Shen et al., 2014]. По количеству оперативных вмешательств, холецистэктомия занимает второе место после аппендэктомии [Яфаров А.Я., 2010; Heuman D.M. et al., 2010; Воре Е.Т. et al., 2012].

Изучению факторов, приводящих к развитию хронического калькулезного холецистита, посвящено значительное количество работ как зарубежных [Trauner M. et al., 2010; Erichsen R. et al., 2011; Kafle S.U. et al., 2013; Zamani F. et al., 2014; Bari О. et al., 2014; Hirobe-Jahn S. et al., 2014; Kwon Y.H. et al., 2014], так и отечественных исследователей [Циммерман Я.С., 2010; Вахрушев Я.М., 2011; Воротынцев A.C., 2012; Симбирцев A.C., 2013; Горбунов А.Ю., 2014; Тарасенко C.B. и др., 2014]. Согласно данным литературы значимая роль в формировании ХКХ отводится генетическим факторам. Среди полиморфизмов генов, участвующих в процессах воспаления, метаболизма холестерина и желчных кислот, а также образования конкрементов в желчном пузыре и желчных протоках, ключевое значение имеют гены интерлейкинов [Маев И.В. и др., 2010; Полунина Т.Е., 2012]. Интерлейкины, являясь медиаторами воспаления, регулируют интенсивность и продолжительность литогенных и склеротических процессов в желчном пузыре, приводящих к камнеобразованию [Царегородцева Т.М., 2009; Felipe A Castro et al., 2012; Серебренникова С.Н., 2012; Mueller M. et al., 2013; Симбирцев A.C., 2013].

Клинико-генетические исследования, посвященные молекулярно-генетическим основам этиопатогенеза ХКХ и ЖКБ в России единичные и касаются они, в основном генов факторов некроза опухолей и биотрансформации ксенобиотиков [Демин С.С., 2010; Тарасенко C.B. и др., 2014].

Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства образования и науки РФ «Изучение генетических факторов риска развития мультифакториальных заболеваний человека» (№ 511/2014).

Цель исследования: Изучить патогенетическое значение полиморфизмов генов интерлейкинов при хроническом калькулезном холецистите.

Задачи исследования: 1. Исследовать ассоциации генетических полиморфизмов интерлейкинов IL-1A -889Т>С, IL-1B -511С>Т, IL-4 -5840Т, IL-5 -7030Т, IL-6 -174G>C, IL-8

-251A>T, IL-9 Т113М, IL-10 -5920A с формированием хронического калькулезного холецистита у населения Центрального Черноземья России.

2. Проанализировать особенности вовлеченности генетических вариантов интерлейкинов и их комбинаций в предрасположенность к ХКХ в зависимости от пола.

3. Изучить влияние генетических факторов на морфологические характеристики желчного пузыря у больных ХКХ.

4. Оценить ассоциации молекулярно-генетических маркеров с клинико-лабораторными показателями больных ХКХ.

5. Выявить связи генов-кандидатов интерлейкинов с интенсивностью болевого синдрома в раннем послеоперационном периоде у больных ХКХ.

Научная новизна. Впервые установлено важное патогенетическое значение генетических полиморфизмов интерлейкинов IL-1A -889Т>С, IL-1B -51 1С>Т, IL-4 -5840Т, IL-5 -7030Т, IL-6 -174G>C, IL-8 -251А>Т, IL-9 T113М, IL-10 -5920А при формировании хронического калькулезного холецистита у населения Центрального Черноземья России. Выявлены варианты генов интерлейкинов, связанные с риском формирования ХКХ. Определены сочетания генетических полиморфизмов интерлейкинов, ассоциированные с повышенным риском развития ЖКБ. Выявлены особенности вовлеченности генов-кандидатов в формирование подверженности к ХКХ в зависимости от пола. Установлена связь генов-кандидатов интерлейкинов с морфологическими характеристиками желчного пузыря и клинико-лабораторными показателями больных ХКХ. Обнаружена вовлеченность генов-кандидатов интерлейкинов в формирование послеоперационного болевого синдрома у больных ХКХ.

Научно-практическое значение. Полученные в результате исследования данные способствуют расширению представлений о молекулярно-генетических механизмах формирования ХКХ. Разработанная модель прогнозирования интенсивности послеоперационного болевого синдрома у больных ХКХ на основе генетических и клинико-лабораторных данных может быть использована в практической деятельности врачей анестезиологов хирургических стационаров. Результаты исследования используются в учебном процессе в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» и в практической деятельности врачей анестезиологов Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.

Положения, выносимые на защиту:

1. Генетические полиморфизмы интерлейкинов и их комбинации ассоциированы с формированием ХКХ.

2. Вклад генов-кандидатов в подверженность к ХКХ у мужчин и женщин различается.

3. Морфологические характеристики желчного пузыря и клинико-лабораторные показатели больных ХКХ связаны с молекулярно-генетическими маркерами.

4. Генетические варианты интерлейкинов ассоциированы с интенсивностью болевого синдрома в раннем послеоперационном периоде у больных ХКХ.

Апробация работы. Результаты исследования представлены и обсуждены на: XIV Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье» (Санкт-Петербург,

2011), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011), 76-ой Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2011), VII Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012), 77-ой Российской научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80-летию Башкирского государственного медицинского университета «Вопросы теоретической и практической медицины» (Уфа, 2012), IV Международной научной конференции SCIENCE4HEALTH 2012 (Москва,

2012), ХШ-ой научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке», посвященной 25-летию Кировской государственной медицинской академии (Киров, 2012), 40-ой конференции молодых ученых и 64-ой студенческой научной конференции Смоленской государственной медицинской академии (с международным участием) (Смоленск, 2012), III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012), XVI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2013), VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013), X научной конференции «Генетика человека и патология: проблемы эволюционной медицины» (Томск, 2014).

Личный вклад автора. Личный вклад автора заключается во включенном участии на всех этапах исследования: формирование выборки больных ХКХ и контрольной группы, проведение молекулярно-генетического исследования, генетико-статистическая обработка, оценка и резюмирование полученных данных. Автором лично подготовлены основные публикации по материалам диссертации, проведена апробация результатов работы, написана и оформлена рукопись.

Печатные работы. По результатам исследования опубликовано 14 работ, из них 2 в журналах из перечня ВАК.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы и список литературы.

Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста и содержат 13 таблиц и 36 рисунков. Библиографический указатель содержит 260 наименований, из которых 156 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Характеристика обследованных групп

Группу исследования составили 543 человека: 249 человек с диагнозом ХКХ и 294 индивидуума контрольной группы. В выборки больных и контроля включались индивидуумы русской национальности, уроженцы Центрального Черноземья России, не связанные между собой родственными связями. Среди 249 больных ХКХ 16,80% составили мужчины (41 человек), 83,20% - женщины (208 человек). В контрольной выборке (п=294) процентное соотношение было аналогичным: мужчины - 17,00% (50 человек), женщины - 83,00% (244 человек) (р>0,05). У пациентов с ХКХ средний возраст был равен 54,74± 13,08 лет (от 23 до 85 лет), а в контрольной группе - 52,20±6,28 лет (от 18 до 79 лет) (р>0,05). Клинико-лабораторное и инструментальное обследование больных осуществлялось в отделениях анестезиологии-реанимации № 2, хирургии № 1 ОГБУЗ «Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа».

Молекулярно-генетические методы

Пациентам с хроническим калькулезным холециститом и в контрольной группе проводилось типирование восьми молекулярно-генетических маркеров: IL-1 -889Т>С, IL-1B -511С>Т, IL-4 -584С>Т, IL-5 -7030Т, IL-6 -174G>C, IL-8 -251А>Т, IL-9 Т113М, IL-10 -592С>А. Всем лицам обследуемой группы проводили забор крови из локтевой вены в вакуумные пробирки (типа «Vacuett») с 0,5 M раствором ЭДТА (рН=8,0) в количестве 5 мл. Потом кровь замораживали и хранили при - 20°С. Геномная ДНК выделялась стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew, 1985].

Анализ всех генетических полиморфизмов интерлейкинов проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. Для ПЦР использовались: ДНК-полимераза Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М», олигонуклеотидные праймеры и зонды, синтезированные фирмой «Синтол». Полимеразная цепная реакция выполнялась на амплификаторах «Терцик-МС4» (ДНК-технология) и IQ5 (Bio-Rad).

Генотипирование ДНК-маркеров производилось следующими методами:

1. Метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (локусы IL-1A -889Т>С, IL-1B -511С>Т, IL-5 -7030Т, IL-9 Т113М, IL-10 -5920А). Генотипирование производилось с помощью соответствующих эндонуклеаз. Реакция протекала в присутствии буферов и при температурных условиях, рекомендованных производителями эндонуклеаз - ООО «Сибэнзим» (Новосибирск). Продукты рестрикции фракционировались с помощью электрофореза в агарозных гелях различной концентрации и окрашивались в этидиум бромиде.

2. Метод дискриминации аллелей согласно значениям величин уровня относительной флуоресценции (RFU) каждого зонда. Проводился на амплификаторе «CFX96» (локусы IL-4 -584С>Т, IL-6 -174G>C, IL-8 -251А>Т).

Биометрические и генетико-статистические методы

Соответствие наблюдаемого распределения ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга оценивали с помощью ~/2 [Ли Ч., 1978]. Проводилось вычисление наблюдаемого (Но) и ожидаемого (Не) уровня гетерозиготности, индекса фиксации Райта (D) [Животовский Л.А., 1983]. Соотношение между ожидаемой (Н0) и наблюдаемой (Не) гетерозиготностью характеризовали индексом фиксации Райта (D) [Вейр, 1995]. Различия в концентрациях генетических вариантов между разными группами оценивали с помощью таблиц сопряженности 2x2 на основе критерия л/2 с поправкой Йетса. С целью оценки характера ассоциаций генетических вариантов с формированием ХКХ рассчитывали показатель отношения шансов (OR) [Реброва О.Ю., 2006]. 0R>1 оценивали как положительную ассоциацию признака с исследуемым генетическим вариантом (фактор риска) и OR<l - как отрицательную ассоциацию (протективный фактор). Анализ ассоциаций комбинаций изучаемых генетических вариантов с ХКХ проведен на основе метода Монте-Карло Марковскими цепями и Байесовской непараметрической статистикой с помощью программного обеспечения APSampler [Favorov А. V., et al., 2005]. С целью прогнозирования интенсивности болевого синдрома у больных ХКХ после холецистэктомии в работе использован метод математического моделирования - логистический регрессионный анализ [Реброва О.Ю., 2006].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование ассоциаций генетических вариантов интерлейкинов с развитием ХКХ

Оценка распределения генотипов анализируемых полиморфных маркеров генов показала, что для всех изученных локусов среди больных ХКХ и в контрольной группе зарегистрировано соответствие равновесию Харди-Вайнберга (р>0,05). Уровень аллельного разнообразия по данным локусам варьировал от Н0=0,23 (для локуса IL-9 Т113М) до Н0=0,52 (для локуса IL-8 -251А>Т) в группе больных ХКХ и от Н0=0,32 (IL-4 -584С>Т) до Н0=0,55 IL-8 -251 А>Т) в контроле.

При проведении сравнительного анализа распределения рассматриваемых генетических полиморфизмов в исследуемых выборках установлена более высокая частота аллеля -511Т IL-1B (43,21%), генотипа -511ТТ IL-1B (21,72%) и низкая концентрация генотипа -511СС IL-1B (35,29%) среди больных ХКХ по сравнению с контрольной группой, где анализируемые показатели составили 30,85% (3^= 14,43, р=0,001); 11,49% (х2=7,95, р=0,01, Рьо„г=0,03) и 49,79% (х2=9,19, р=0,003, рьо„1=0,009) соответственно. Наличие аллеля -511Т IL-1B (OR=l,71; 95% С1=1,29-2,26) и генотипа -511ТТ IL-1B (OR=2,14; 95% С1=1,24-3,69) повышает риск развития хронического калькулезного холецистита, а генотип -511СС IL-1B является протективным фактором при формировании данной патологии (OR=Q,55; 95% С1=0,37-0,82) (рис. 1).

Генетический вариант -5 ИТ IL-1B, как свидетельствуют данные литературы [Имангулова М.М. и др., 2005], является высокопродуктивным и выявленная связь его с развитием ХКХ согласуется с литературными материалами о медико-биологических эффектах этого интерлейкина в организме. IL-1B обладает выраженным провоспалительным действием и может играть важную роль в этиопатогенезе хронического калькулезного холецистита [Царегородцева Т.М., 2009].

При анализе вклада сочетаний генетических вариантов интерлейкинов в развитие ХКХ установлено, что значимые для ХКХ комбинации формируют пять полиморфных маркеров (.IL-1A -889Т>С, IL-1B -51 lOT, IL-5 -7030Т, IL-6 -174G>C, IL-9 T113М) из восьми изученных (рис. 1).

Аллели -889ТIL-1A, -511ТIL-1B, -113ТIL-9, -174С IL-6 и генотип -703СТ IL-5, участвуют в формировании четырех комбинаций, определяющих повышенный риск развития ХКХ (OR=l,73-2,57). Сочетание генетических вариантов -113М IL-9 и -703С IL-5 является протективным фактором развития данного заболевания (OR=0,39). Литературные данные свидетельствуют о выраженном провоспалительном действии IL-1A, IL-1B, IL-6, IL-8 в организме человека [Громова А.Ю. и др., 2005; Vishnoi M. et al., 2007] и их вовлеченности в развитие хронического калькулезного холецистита [Hsing A.W. et al., 2008; Царегородцева T.M., 2009].

OR=1.88

-511CC IL-1B

OR=Q.5S

W

-113M IL-9

-703C ILS

X

5

X

3

0 §

*

>x 2 X

n ai

1

OR=Q39( g x

OR-1.71

OR=2.14

OR-2.57

OR=1.73

OR-2.42

•8&9T IL-1A

-511T IL-1B

-51 ITT IL-IB

-703CT ILS

^ттж зава

-174C IL-6

-113T IL-9

Рис. 1. Вклад генов интерлейкинов в формирование хронического калькулезного холецистита

Сравнительный анализ распределения исследуемых генетических полиморфизмов в рассматриваемых выборках больных ХКХ и контроле в зависимости от пола, выявил ряд различий в концентрациях генотипов и аллелей генов интерлейкинов между больными ХКХ и контролем. Установлена более высокая частота генетических вариант -51 IT IL-1B (51,47%), -511ТТ IL-1B (29,41%), и низкая распространённость генотипа -511СС IL-1B (26,47%) среди мужчин больных ХКХ в сравнении с контрольной группой мужчин, где данные показатели составили 23,08% (х2=11,47, р=0,002), 5,13% ()f=6,13, р=0,01, Pbonf=0,03) и 58,97% (%2=6,5, р=0,01, РЬопг=0,03) соответственно. Таким образом, генетические варианты -511Т IL-1B и -51 ITT IL-1B обусловливают повышенный риск развития данного заболевания (OR=3,54; 95% С1=1,64-7,67 и OR=7,71; 95% С1=1,39-56,14 соответственно), тогда как генотип -511СС IL-1B является протективным фактором развития хронического калькулезного холецистита у мужчин (OR=0,25; 95% С1=0,08-0,75) (рис. 2).

В группе женщин с ХКХ также выявлена более высокая концентрация аллеля -511ТIL-1B (41,71%) по сравнению с группой контроля (32,40%, ^=6,13, р=0,01). Следовательно, наличие у женщин генетического варианта -51 IT IL-1B также определяет повышенный риск формирования ХКХ (OR=l,49; 95% 0=1,10-2,03) (рис. 3).

Исследование роли комбинаций полиморфных маркеров интерлейкинов в формировании ХКХ в зависимости от пола выявило различия в вовлеченности изученных генов-кандидатов в подверженность к ХКХ у мужчин и у женщин. В группе мужчин в формировании значимых сочетаний участвуют 4 полиморфизма (IL-1A -889Т>С, IL-1B -5110Т, IL-4 -584С>Т, IL-5 -7030Т) (рис. 2).

| е OR=4.1

Рис. 2. Роль генов интерлейкинов в развитии хронического калькулезного холецистита у мужчин

Аллели -889Т IL-1A, -511Т IL-1B, -584T IL-4, -703C IL-5 формируют четыре комбинации, которые являются факторами риска развития хронического калькулезного холецистита у мужчин (OR=4,10-6,60).

В группе женщин с ХКХ значимые комбинации аллелей и генотипов формируют 7 полиморфизмов (IL-1A -889Т>С, IL-1B -5110Т, IL-4 -5840Т, IL-5 -7030Т, IL-8 -251 А>Т, IL-9 T113М, IL-10 -592С>А) (рис. 3). Аллели -511Т IL-1B, -584С IL-4, -703Т IL-5, -251Т IL-8, -11ЗТ IL-9, -592С IL-10 и генотипы -889ТТIL-1A и -113ТТIL-9 формируют четыре сочетания, которые определяют повышенный риск развития ХКХ (OR= 1,99-3,90), а аллели -889С IL-1A, -511С IL-1B и -703С IL-5 формируют две комбинации, оказывающих протективное влияние на развитие ХКХ (СЖ=0,42-0,46).

ШЁЛ ,L-1A

ШШШ

-511Т IL-1B

.¿SA.....ЪГ

-584С IL-4 -703Т /1-5

-231Т ILS

-11 ЗТ IL -9

шяяяж

-113ТТ IL-9

JSSSSiSSk

-592С IL-10

OR=l.49

OR-1.99

OR—3,1

OR=3.9

OR=2.4

1 1

► я |

S i î ï

QR=0.42

QR-0.46

-889C IL-1A

-511С IL-1B

-703C IL-5

Рис. 3. Вклад сочетаний генов интерлейкинов в формирование хронического калькулезного холецистита у женщин

Полученные данные отличаются от результатов исследования Демина С.С. (2010). Автор изучал влияние генетических полиморфизмов факторов некроза опухоли на развитие ХКХ и не выявил достоверных различий по частотам аллелей и генотипов рассматриваемых полиморфных маркеров у больных ХКХ и в группе контроля в зависимости от пола.

2. Ассоциации генетических полиморфизмов интерлейкинов с морфологическими характеристиками желчного пузыря и клинико-лабораторными показателями больных ХКХ

При изучении связей генов-кандидатов интерлейкинов с морфологическими характеристиками желчного пузыря и клинико-лабораторными показателями больных ХКХ (в общей выборке больных и у пациентов в зависимости от пола) установлено, что полиморфизмы генов интерлейкинов ассоциированы с такими патогенетически значимыми признаками ХКХ как диаметр камня, поперечный размер и толщина стенки желчного пузыря, уровень лейкоцитов, ACT, AJIT и холестерина у больных ХКХ.

Установлено, что в формировании морфологических характеристик желчного пузыря у больных ХКХ важную роль играют полиморфные маркеры

11-1А -889Т>С и 1Ь-6 -1740С. Получено, что генотип -174СС 11-6 ассоциирован с большим поперечным размером желчного пузыря (Мс=37 мм, I <325-С>75=30-40 мм; -174СО и -1740С 1Ь-6 - Мс=34 мм, д25-(}75=27-40 мм, р=0,03), а генетические маркеры -889ТТ и -889СТ И-1А связаны с более | крупным диаметром камня у больных ХКХ (Ме=15 мм, (225-С>75=10-20 мм; -889СС И-1А - Ме=12 мм, (325-075=9-18 мм, р=0,03) (рис. 4).

во

50

£ "5

11) :=

(С

□

8 ю

□

0

■10

I 1264-76%

-889ТТи

-889CCIL-1A

-88ЭСТ !L-1 А

Рис. 4. Средний диаметр камня у пациентов с ХКХ в зависимости от генетического полиморфизма 11-1А -889Т>С

У пациенток женского пола с морфологическими характеристиками желчного пузыря связаны генетические полиморфизмы IL-1A -889Т>С, IL-4 -5840Т и IL-6 -174G>C. Генотипы -889ТТ, -889СТ IL-1A (Ме=15 мм, Q25-Q75=10-20 мм) и -174СС IL-6 (Ме=16 мм, Q25-Q75=10-20 мм) определяют более крупный диаметр камня (-889СС IL-1A - Ме=12 мм, Q25-Q75=9-18 мм, р=0,009; -174GG и -174GC IL-6 - Ме=15 мм, Q25-Q75= 10-20 мм, р=0,03). Молекулярно-генетический фактор -584СС гена IL-4 маркирует большую толщину стенки желчного пузыря (Мс=4 мм, Q25-Q75=3-4,5 мм; -584СС и -584СТ IL-4 - Ме=3,5 мм, Q25-Q75=3-4 мм, р=0,03). В группе мужчин статистически достоверных ассоциаций генов-кандидатов с морфологическими характеристиками желчного пузыря не выявлено.

Установлено, что в формировании клинико-лабораторных показателей больных ХКХ принимают участие следующие генетические полиморфизмы: IL-1A -889Т>С, IL-1B -5110Т, IL-5 -7030Т, IL-6 -174G>C, IL-9 Т113М. Генотипы -703СТ и -703ТТ гена IL-5 ассоциированы с повышенным уровнем лейкоцитов (Me=6,8xl0%, Q25-Q75=5,7-8,4x10%; -703СС IL-5 - Ме=6,7х10%, Q25-Q75=5,75-7,9x10%, p=0,03). Молекулярно-генетический маркер -889TT гена IL-1A связан с высоким содержанием ACT (Ме=24,0 ед/л, Q25-Q75= 19-37 ед/л; -889СТ и -889СС IL-1A - Ме=23,0 ед/л, Q25-Q75=l8,0-30,0 ед/л, р=0,006), а генотипы -511СТ и -511ТТ гена IL-1B - с повышенной концентрацией АЛТ (Ms=26,0 ед/л, Q25-Q75=17,0-43,0 ед/л; -511СС IL-1B

- Ме=22,0 ед/л, Q25-Q75=17,0-34 ед/л, р=0,03). Генотип -113ТТ IL-9 ассоциирован с повышенным содержанием ACT (Ме=25,0 ед/л, Q25-Q75= 19,0-38,0 ед/л) и холестерина (Ме=5,6 ммоль/л, Q25-Q75=4,67-6,5 ммоль/л). Для индивидуумов с генотипами -113ТМ и -113ММ IL-9 данные показатели составили Ме=23,0 ед/л, Q25-Q75=18,0-34,0 ед/л (р=0,009) и Ме=5,5 ммоль/л, Q25-Q75=4,2-6,82 ммоль/л (р=0,04) соответственно.

Выявлено, что среди пациентов мужского пола молекулярно-генетический фактор -511ТТ гена IL-1В маркирует высокие уровни ACT (Мс=29,0 ед/л, Q25-Q75=21,0-48,0 ед/л) и АЛТ (Ме=34,0 ед/л, Q25-Q75= 23,0-75,0 ед/л). Для индивидуумов с генотипами -511СС и -511СТIL-1B данные показатели составили Ме=26,5 ед/л, Q25-Q75=20,0-35,0 ед/л (р=0,002) и Ме= 23,0 ед/л, Q25-Q75=l7,0-44,0 ед/л (р=0,02) соответственно. Генотип -174СС гена IL-6 ассоциирован с повышенным уровнем лейкоцитов (Ме=7,5х109/л, Q25-Q75=5,7-8,4x10%; -174GG и -174GC IL-6 - Ме=6,9х109/л, Q25-Q75= 5,8-7,9x10%, р=0,01).

У женщин с ХКХ молекулярно-генетический маркер -889ТТ гена IL-1A связан с высоким содержанием ACT (Ме=24,0 ед/л, Q25-Q75=l 8,0-36,0 ед/л; -889СТ и -889СС IL-1A - Ме=23,0 ед/л, Q25-Q75=l 8,0-30,0 ед/л, р=0,05). Генотипы -511СТ и -511ТТ гена IL-1B ассоциированы с повышенной концентрацией АЛТ (Мс=25,0 ед/л, Q25-Q75=18,0-39,0 ед/л; -511СС IL-1B

- Ме=22,5 ед/л, Q25-Q75=17,6-33,0 ед/л, р=0,02). Генотип -113ТТ IL-9 связан с более высокими уровнями ACT (Ме=24,0 ед/л, Q25-Q75=19,0-37,0 ед/л; -113ТМ и -113ММ IL-9 - Ме=23,0 ед/л, Q25-Q75=17,0-34,0 ед/л, р=0,007) и холестерина

(Ме=5,66 ммоль/л, Q25-Q75=4,8-6,78 ммоль/л; -113ТМ и -113ММ IL-9 - Ме=5,51 ммоль/л, Q25-Q75=4,62-6,26 ммоль/л, р=0,05).

3. Ассоциации полиморфных маркеров интерлейкинов с интенсивностью болевого синдрома у больных ХКХ в раннем послеоперационном периоде

Установлено, что генетические полиморфизмы IL-1A -889Т>С, IL-5 -7030Т, IL-6 -174G>C ассоциированы с интенсивностью болевого синдрома после холецистэктомии у больных ХКХ. Индивидуумы, имеющие генотипы -889ТТ и -889СТ IL-1A, испытывали более выраженный послеоперационный болевой синдромом в 18 часов (Ме=6 баллов, Q25-Q75=5-7 баллов) и в 22 часа первых суток (Ме=5 баллов, Q25-Q75=4-6 баллов), по сравнению с пациентами с генотипом -889СС IL-1A (Ме=5 баллов, Q25-Q75=5-6 баллов, р=0,05 и Мс=4 балла, Q25-Q75=4-5 баллов, р=0,02 соответственно). Генотипы -703СТ и -703ТТ IL-5 ассоциированы с высоким уровнем болевых ощущений у больных ХКХ в 8 часов вторых суток после операции (Ме=4 балла, Q25-Q75=2-5 баллов; -703ССIL-5 - Мс=3 балла, Q25-Q75=2-4 балла, р=0,04).

В группе мужчин интенсивный болевой синдром в 14 часов первых суток связан с генотипами -174GG и -174GC IL-6 (Ме=7 баллов, Q25-Q75=6-8 баллов; -174GGIL-6 - Ме=6 баллов, Q25-Q75=6-7 баллов, р=0,02) (рис. 5).

Рис. 5. Связь генетических вариантов локуса IL-6 -174G>C с интенсивностью послеоперационного болевого синдрома у больных ХКХ мужского пола (время измерения: 14 ч первых суток)

У женщин с более выраженной болью в 14 часов первых суток ассоциированы генотипы -703СТ и -703ТТ IL-5 (Ме=7 баллов, Q25-Q75=6-8 баллов; -703СС IL-5 - Ме=6 баллов, Q25-Q75=5-7 баллов, р=0,05). Генотипы -889ТТ и - 889СТ IL-1A связаны с высоким уровнем болевых ощущений в 18

часов первых суток (Ме=6 баллов, Q25-Q75=5-7 баллов; -889СС IL-1A - Ме=5 баллов, Q25-Q75=5-6 баллов, р=0,05).

В основе выявленных связей полиморфных маркеров интерлейкинов с интенсивностью послеоперационного болевого синдрома у больных ХКХ могут лежать следующие медико-биологические механизмы: провоспалительные интерлейкины, являясь алгогенами, регулируют процессы воспаления и, взаимодействуя со своими рецепторами, стимулируют возбуждение в сенсорных нейронах, формируют более выраженную болевую чувствительность при хирургической агрессии [Dray А., 1995; Sheeran Р., 1997; Sommer С. et al. 2004; McMahon S.B. et al. 2006; Okuse K., 2007].

Развитию болевого синдрома сопутствует гиперактивация симпатической нервной системы, что приводит к тахикардии, гипертензии, повышению общего периферического сопротивления сосудов. Подобная клиническая картина резко увеличивает вероятность потребности миокарда в кислороде и развития острого инфаркта миокарда у пациентов группы риска. Для профилактики кардиальных осложнений необходимо своевременное лечение выраженной боли и торможение симпатической активности в пред- и послеоперационном периоде [Полушин Ю.С., 2004; Корячкин В.А., 2004]. В связи с этим, с использованием методов математического моделирования [Реброва О.Ю., 2006] был разработан способ прогнозирования интенсивности болевого синдрома в послеоперационном периоде у больных ХКХ в 18 часов и в 22 часа первых суток.

Статистически значимой для прогнозирования интенсивности болевого синдрома в 22 часа первых суток после холецистэктомии является модель со следующими предикторами: толщина стенки желчного пузыря, характер течения заболевания, уровень лейкоцитов, генетический вариант по полиморфному маркеру IL-1A -889Т>С, генетический вариант по полиморфному маркеру IL-J В -511С>Т. Показатель отношения шансов для полученной регрессионной модели составил 8,55. Параметры и предикторы данной логистической регрессионной модели представлены в таблице.

С целью проверки работоспособности модели нами в анализ были дополнительно включены двое больных ХКХ. Пациентка 3., имеет следующие показатели: содержание лейкоцитов - 5,2х109/л, толщина стенки желчного пузыря - 3 мм, характер течения заболевания - перемежающийся (2), генетический вариант по полиморфному маркеру IL-1A -889Т>С - -889СТ (1), генетический вариант по полиморфному маркеру IL-1B -511С>Т - -511СС (0).

Пациент Ц., характеризуется следующими показателями: содержание лейкоцитов - 5,03х109/л, толщина стенки желчного пузыря - 5 мм, характер течения заболевания - перемежающийся (2), генетический вариант по полиморфному маркеру IL-1A -889Т>С - -889ТТ (0), генетический вариант по полиморфному маркеру IL-1B -511С>Т - -511СТ (1).

При проведении вычислений получим для пациентки 3.:

у=-3,162-0,953*1+0,749*0-0,179*5,2+0,815*3+0,461*2=-1,879

а значение Р = 2,72"1,879/ (1+2,72"1'879) или (1/2,721,879) / 1+ (1/2,721,879) = 0,13

Таким образом, вероятность возникновения интенсивных болевых ощущений у пациентки 3. мала и составляет 13%. Для пациента Ц.:

у=-3,162-0,953*0+0,749*1-0,179*5,03+0,815*5+0,461*2=1,68

соответственно Р = 2.721'68/ (1+2,72''68) = 0,84, т.е. риск возникновения выраженных болевых ощущений высок и составляет 84%.

Таблица

Логистическая регрессионная модель прогнозирования выраженного болевого синдрома у больных ХКХ в 22 часа первых суток после холецистэктомии

Независимые (объясняемые) признаки (ХО и их градации Регрессионные коэффициенты (Ь|) и уровень значимости (р)

bi Р

Константа -3,162 0,004

Содержание лейкоцитов, х109/л -0,179 0,03

Толщина стенки желчного пузыря, мм 0,815 0,00001

Характер течения заболевания (0-латентное, 1 -рецидивирующее, 2-перемежающееся, 3-монотонное) 0,4061 0,004

Генетический вариант по полиморфному маркеру 11-1А -889Т>С ((СС+СТ) - 1; ТТ - 0) -0,953 0,009

Генетический вариант по полиморфному маркеру Я,-1В -511 С>Т ((ТТ+СТ) - 1; СС - 0) 0,749 0,03

ВЫВОДЫ

1. Генетические полиморфизмы IL-1A -889Т>С, IL-1В -511 С>Т, IL-4 -5840Т, IL-5 -703ОТ, IL-6 -174G>C, IL-8 -251А>Т, IL-9 Т113М и IL-10 -5920А определяют подверженность к формированию хронического калькулезного холецистита у населения Центрального Черноземья России.

2. Повышают риск развития ХКХ генетические варианты Т (OR=l,71) и ТТ (OR=2,14) локуса IL-1B -51 ЮТ, а генотип СС по этому полиморфизму оказывает протективное действие на формирование ХКХ (OR=0,55). Аллели -889Т IL-1A, -511Т IL-1B, -113Т IL-9, -174С IL-6 и генотип -703СТ IL-5 формируют четыре комбинации, определяющие повышенный риск развития ХКХ (OR=l,73-2,57). Сочетание генетических вариантов -113М IL-9 и -703С IL-5 является протективным фактором формирования данного заболевания (OR=0,39).

3. Вовлеченность генетических полиморфизмов интерлейкинов в подверженность к развитию ХКХ у мужчин и женщин различается. У мужчин четыре полиморфизма (IL-1A -889Т>С, IL-1B -51 ЮТ, IL-4 -5840Т, 1L-5 -703С>Т) образуют четыре комбинации, являющиеся факторами риска развития ХКХ (OR=4,10-6,60). Среди женщин семь полиморфизмов (IL-1A -889Т>С, IL-1B -5110Т, IL-4 -584С>Т, IL-5 -7030Т, IL-8 -251А>Т, IL-9 Т113М, IL-10 -592С>А) формируют четыре сочетания, определяющие повышенный риск развития хронического калькулезного холецистита (OR=1,99-3,90) и две комбинации, оказывающие протективное действие (OR=0,42-0,46) на формирование данной патологии.

4. Генотип -174СС IL-6 ассоциирован с большим поперечным размером желчного пузыря, а генетические маркеры -889ТТ и -889СТ IL-1A связаны с более крупным диаметром камня у больных ХКХ. У пациенток женского пола с морфологическими характеристиками желчного пузыря связаны генетические полиморфизмы IL-1A -889Т>С, IL-4 -5840Т и IL-6 -174G>C. У мужчин гены-кандидаты не ассоциированы с морфологическими характеристиками желчного пузыря.

5. У больных ХКХ генотипы -703СТ и -703ТТ гена IL-5 ассоциированы с повышенным уровнем лейкоцитов, молекулярно-генетический маркер -889ТТ гена IL-1A связан с высоким содержанием ACT, а генотипы -511СТ и -511ТТ гена IL-1B - с повышенной концентрацией АЛТ. Генотип -113ТТ IL-9 ассоциирован с повышенным содержанием ACT и холестерина. С клинико-лабораторными показателями у мужчин связаны генетические полиморфизмы IL-1В -511 ОТ, IL-6 -174G>C, у женщин - полиморфизмы локусов IL-1A -889Т>С, IL-1B -511С>Т, IL-9 T113М.

6. Полиморфизмы генов интерлейкинов IL-1A -889Т>С, IL-5 -703С>Т и IL-6 -174G>C ассоциированы с интенсивностью послеоперационного болевого синдрома у пациентов с ХКХ. Прогностически значимыми факторами развития выраженного болевого синдрома у пациентов с ХКХ после холецистэктомии являются: характер течения заболевания, содержание лейкоцитов в крови, показатель международного нормализованного отношения, толщина стенки желчного пузыря, генетические варианты локусов IL-IA -889Т>С, IL-1B -511 С>Т, IL-5 -703ОТ, IL-8 -251 А>Т.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

IL - интерлейкин

АЛТ - аланинаминотрансфераза

ACT - аспартатаминотрансфераза

ЖКБ - желчнокаменная болезнь

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ХКХ - хронический калькулезный холецистит

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Черкашина, О. В. Генетический полиморфизм -889Т/С 1Ь-1А среди больных хроническим калькулезным холециститом [Текст] / О. В. Черкашина, С. С. Демин // Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье : тез. XIV всерос. медико-биол. конф. молодых исследователей (с междунар. участием), Санкт-Петербург, 16 апр. 2011 г. / СПбГУ [и др.] ; гл. ред. П. К. Яблонский. - Санкт-Петербург, 2011. - С. 291-292.

2. Черкашина, О. В. Результаты генотипирования локуса -511С/Т 1Ь-1В у больных хроническим калькулезным холециститом [Текст] / О. В. Черкашина // Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии : II всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Курск, 17-19 мая 2011 г. : сб. материалов конф. / Курск.гос. мед. ун-т, Адм. Курск, обл., РАЕН [и др.] ; отв. ред. В. П. Иванов. - Курск, 2011. - С. 186.

3. Черкашина, О. В. Анализ распределения генетического маркера -584С/Т1Ь-4 среди больных хроническим калькулезным холециститом [Текст] / О. В. Черкашина // Молодежная наука и современность : материалы 76-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, Курск, 19-20 апр. 2011 г. / Курск, гос. мед. ун-т, Центр.-Чернозем. науч. центр РАМН, РАЕН ; редкол.: В. А. Лазаренко, П. В. Калуцкий, Н. И. Шевченко. - Курск, 2011.-С. 82.

4. Черкашина, О. В. Исследование частот генотипов и аллелей -889Т/С 1Ь-1 А, -551 С/Т 1Ь-1В, -584С/Т 1Ь-4 у больных хроническим калькулезным холециститом [Текст] / О. В. Черкашина // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2012. - Спец. вып. № 1. -С. 320.

5. Черкашина, О. В. Оценка роли генетических вариантов локуса -703С/Т 1Ь-5 в формировании хронического калькулезного холецистита [Текст] / О. В. Черкашина, С. С. Демин // Молодежь и медицинская наука в XXI веке : сб. тр. ХШ-ой науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых с междунар. участием, посвящ. 25-летию Киров, гос. мед. акад., Киров, 2-3 апр. 2012 г. / Киров, гос. мед. акад., Упр. по делам молодежи Киров.обл., Совет молодых ученых и специалистов при Губернаторе Киров, обл. [и др.] ; [отв. ред. Е. В. Новичков]. - Киров, 2012. - С. 72-73.

6. Черкашина, О. В. Определение роли генетического маркера -113 М/Т 1Ь-9 в формировании хронического калькулезного холецистита [Текст] / О. В. Черкашина // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. - 2012. - Спец. вып. - С. 70. - (Материалы 40-й конф. молодых ученых и 64-й студ. науч.конф. Смолен.гос. мед. акад. (с междунар. участием). Материалы V Съезда межрегион, обществ.орг. «Федерация представителей молодежных научных обществ медицинских вузов» / гл. ред. И. В. Отвагин).

7. Черкашина, О. В. Генетические особенности больных хроническим калькулезным холециститом по локусу -251 1Ь-8 [Текст] / О. В. Черкашина // Клинические и теоретические аспекты современной медицины : материалы IV

междунар. науч. конф. Science4health 2012, Москва, 18-21 апр. 2012 г. / РУДН, Ун-т Семмелвейс, Будапешт, Венгрия. - Москва, 2012. - С. 66.

8. Черкашина, О. В. К вопросу о влиянии генетического полиморфизма -174G/CIL-6 на возникновение хронического калькулезного холецистита [Текст] / О. В. Черкашина, С. С. Демин // Вопросы теоретической и практической медицины: материалы 77-й Рос.науч.конф. студентов и молодых ученых, посвящ. 80-летию БГМУ : в 2 т./ Башкир.гос. мед. ун-т, Рос. союз молодых ученых ; редкол.: В. Н. Павлов [и др.]. - Уфа, 2012. - Т. 2. - С. 251-252.

9. Черкашина, О. В. Оценка ассоциации генетических вариантов локуса -592 С/А IL-10 с формированием хронического калькулезного холецистита [Текст] / О. В. Черкашина, С. С. Демин // Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине : III междунар. науч.-практ. конф., Казань, 22-24 нояб. 2012 г. : сб. тез. / МГУ им. М. В. Ломоносова, ФМБА России, Казан. (Приволж.) федер. ун-т [и др.]. - Казань, 2012. - С. 400.

10.Черкашина, О. В. Изучение генетических детерминант хронического калькулезного холецистита [Текст] / О. В. Черкашина, С. С. Демин // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2013. - Спец. вып. № 1.-С.253.

11 .Черкашина, О. В. Исследование роли полиморфизма гена-кандидата IL-IRA в формировании хронического калькулезного холецистита [Текст] / О. В. Черкашина//Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье :тез.ХУ1 Всерос. медико-биол.конф. молодых исследователей (с междунар. участием), Санкт-Петербург, 20 апр. 2013 г. / СПбГУ [и др.];гл. ред. П. К. Яблонский - Санкт-Петербург, 2013. - С. 448.

12.Черкашина, О. В. О патогенетическом значении комбинации генетических вариантов -889С/Т IL-1A, -551 С/Т IL-1B и -113Т/М IL-9 при хроническом калькулезном холецистите [Текст] / О. В. Черкашина// Генетика человека и патология : проблемы эволюционной медицины : сб. науч. тр. / НИИ мед.генетики СО РАМН ; под ред. В. А. Степанова. - Томск, 2014. - Вып. 10. -С. 186.

13.Демин, С. С. Прогностическая значимость комбинаций генетических вариантов интерлейкинов в развитии хронического калькулезного холецистита [Электронный ресурс] / С. С.Демин, О. В. Черкашина // Современные проблемы науки и образования : электрон, науч. журн. - 2014. - № 6. - Режим flocTyna:http://www.science-education.ru/l20-15817.

14.Черкашина, О. В. Изучение ассоциаций комбинаций генетических вариантов интерлейкинов с формированием хронического калькулезного холецистита [Электронный ресурс] / О. В. Черкашина // Современные проблемы науки и образования : электрон.науч. журн. - 2014. - № 6. - Режим доступа: http://www.science-education.ru/120-15824.

i

Подписано в печать 06.02.2015. Формат 60x84/16 Гарнитура Times. Усл. п. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 23. Оригинал-макет подготовлен и тиражирован в ИД «Белгород» НИУ «БелГУ». 308015, г. Белгород, ул. Победы, 85