Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности метаболизма бактерии THIOTHRIX RAMOSA NOV.SP.

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности метаболизма бактерии THIOTHRIX RAMOSA NOV.SP."

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

ОДИНЦОВА Елена Владимировна

УД{ 579.822.42

ЮЕЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА БШЕИЙ IHIOEHRIX RAMOSA NOV.SP.

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

¡к

Работа выполнена в Институте микробиологии АН СССР. Научный руководитель: доктор биологических наук

Г. А.. Дубинина

Официальные оппоненты: член-корреспондент АН СССР,

профессор Е.Н.Кондратьева \

доктор биологических каук В.И. Дуда

Ведущая организация - Ленинградский государственный университет

Защита состоится ".-16 " Л^свчр^__1991 г. в час,

на заседании специализированного совета Д 002.64.01 в Институте микробиологии АН СССР по адресу: 117312, г. Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

Автореферат разослан " \ Н « С^ЦЛДЩ9> _ 1990 г.

Ученый секретарь специали-зованного совета, к.б.н.

Л.Е.Никитин

ВВЕДЕНИЕ.

'■'áí^f&SMifi.c'íbjIE.Q^sesmL Бесцветные серкыэ бактерии включают в себя обпирнуп группу микроорганизмов, различанзяхся по морфологии и типам метаболизма. Они привлекают внимание исследователей уяе в течение ICO лет. Этому способствуют массовое развитие их в природе, крупные размеры, необычная морфология, исторические предпосылки, связанные с развитием С.Н.Виноградсним концепции хемосинтеза.

Бесцветные серные бактерии занимают в природе экологическую нишу, характеризующуюся совместным присутствием двух компонентов -сероводорода и кислорода. Существуя в пограничных областях между аэробной и анаэробной зонами, эти бактерии играют ванную роль в биогеохимическом цикле серы. Принимая участие в окислении сульфида, они способствуют регенерации окислительного потенциала в водной толще, где сульфат играет важную роль в анаэробной минерализации. Биологическое окисление сульфида ответственно за образование определенных типов кислых почв. Бесцветные серобактерии являются ваяннм компонентом микробной популяции очистных сооружений, где способствуют освобождению сточных вод о? сульфида. В связи с развернутыми исследованиями сообществ гидротермальных вентов выявилась важная роль бесцветных серобактерий как хемолитоавтотрофных первичных про-, доцентов в данных экосистемах.

Состояние вопроса, цели н задачи. В связи с трудностями" -выделения большинства этих бактерий в чистую культуру, "наши знания о них часто ограничиваются лишь данными, полученнши из наблюдений за природными популяциями и накопительными культурами в лаборатории. 3 последнее время "¡Кчиетую кулмуру удалось вццелкть лишь отдельных представителей родов Beggiatoa, Eíiiothrix, líacroncmas п Ehtospixa.

Не подвергается сомнению участие бесцветных серобактерий в

окислении восстановленных соединений серы. Однако, до сих пор не-' ясна роль серных соединений в метаболизме этих бактерий. Имеющиеся данные неоднозначны, различия в метаболизме бесцветных серобактерий проявляются на уровне штаммов. По-видимому, большое значение имеет место выделения бактерий, условия их существования в природе.

Долгое время наименее изученными из этой группы бактерий оставались бактерии рода тмс^ьпх. Только в последние годы в ряде зарубежных лабораторий стали проводиться углубленные исследования этих бактерий, ставшие возможными в связи с наделением чистых культур нескольких штаммов !ГЬ1о1:Ьг1х. Однако, вопрос о механизме окисления восстановленных серных соединений у бактерий рода тыо1:11х1х оставался открытым. Несыотря на въщвинутые предположения о способности ?ыо«1г1х п1теа, типового вида рода, к хемолитогетеротрофному росту, убедительных доказательств этого предположения не было получено-

Конкретные задачи работы состояли в следующем:

1. Выделение чистых культур бесцветных нитчатых серобактерий рода ТЫо<:1гг±х.

2. Изучение морфологических, физиолого-биохимических и ультра- . структурных особенностей выделенных штаммов ТЫо-ььг1х.

3. Выяснение функциональной роли соединений серы в метаболизме вьщеленных нитчатых серобактерий.

Научная новизна и практическая значимость работы. Выделены тке культуры двух итаимов нитчатых бесцветных серобактерий рода ' ТЫогьг1х. Дано таксономическое описание нового вида ТЫоЪЬПх гатогг Впервые обнаружен новый тип размножения у этих бактерий с помощью гормогониев, исследованы на ультраструктурном уровне изменения, происходящие в трихомах при образовании гонидай и гормогониев.

Исследованы процессы окисления восстановленных соединений серы

оделенными штаммами бактерий. Впервые показано для данных организ-юв.что использование сульфида и тиосульфата происходит с участием йзных механизмов. Окисление сульфида происходит га перекискому ме-:анизму, продуктом окисления является сера. Тиосульфат принимает 'частие в энергетическом метаболизме, продуктами его окисления являйся сера и сульфат. Впервые показано для бактерий рода ТМс^ыЬс об-1эование АТФ при окислении тиосульфата по механизм? субстратного фос-рорилирования. У описанного вида Т.гашоэа не выявлено автотрофных хутей фиксации СС^, что свидетельствует об'отсутствии способности к семолитоавтотрофии. Однако, при использовании тиосульфата как дополнительного источника энергии выделенные штаммы способны осуществлять хемолитогетеротрофный. метаболизм.

Изучение особенностей метаболизма малоизученных нитчатых серобактерий важно для понимания их роли в глобальном биогеохимическом цикле серы, а таете способствует определению доли участия этих микроорганизмов в процессах удаления сероводорода из водоёмов." Эти процессы являются чрезвычайно ванными для сохранения окружающей среды от загрязнения.

Полученные в работе результаты могут быть использованы для чтения курсов лекций по микробиологии в высших учебных заведениях.

'Апробацкя. работы.' Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции, посвященной 100-летию открытия хемосинтеза С.Н.Вино-градским /Москва, 1986 г./, на Международной симпозиуме "Литоавто-трофия" /Гёттинген, 1958/, на школе-конференции молодых ученых "Эволюция и систематика прокариот" УПупшно, 1988/, на конференции молодых ' ученых.ИНШ АН СССР/Москва, 1989 г./. -•

Публикации. По материалам диссертации опубликованы три работы и одна сдана в печать^

Объем'и структура работы. Диссертация состоит из нзедения, обзора

литературы, описания материалов и методов, экспериментальной'части, заключения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 130 страницах машинописного текста, включая 14 таблиц и 13 рисунков. Список литературы содержит 19 отечественных--« 137 иностранных наименований работ. ^

Место_ проведения работы. Работа' выполнена в Институте микробиологии АН СССР в лаборатории экологии и геохимической деятельности микроорганизмов /заведующий лабораторией - доктор биологических наук В.М.Горяенко/. .

ОНЬШЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа проводилась с двумя штаммами нитчатых бесцветных серобактерий родаihiothrix , выделенных вами совместно с Г.А.Дубининой. Согласно проведенным исследованиям морфологических, физиолого-биохимических свойств, цикла развития и сравнения их с типовым видом рода Г.nivea ввделенные штаммы отнесены к новому виду Ihiothrix ramosa.

Для выделения и культивирования данных нитчатых серобактерий использовали среду Вильямса и Унза /v/illians, Unz, 1985/, в которую вносили в качестве источника углерода ацетат или лактат в концентрации 0,25-0,5 г/л. Во все среды вносили микроэлементы и витамины. •Изучение физиолого-биохимических свойств выделенных штаммов проводили согласно Ларкину и Шинабаргер /Xarkin, Shlnabarger, 198-3/. '

Ыорфологию бактерий исследовали в разово-контрастном микроскопе ■ 1Ш -2 фирмы "Цейсс". Жизненный цикл птаымов Tbiothrix изучали в микрокультуре на предметном стекле в Ш-образной камере по Пешкову'/Ро-даненко, Кузнецов, 1974/. Ультратонкуо структуру клеток исследовали на срезах, изготовленных по методу Ритер-Келенбергер /Eyter, Kelen-tergerj .1958/, в электронном микроскопе GEM -1000 при ускоряющем на ярянэнии 60 кВт.

Физико-химические метода анализа. Биомассу бактерий определяли по белку методом Брэдфорда с кумасси синим /Bradford, 1976/. Суспензию клеток получали путем центрифугирования культуры при 5000х g при 4°С в течение 70 минут. Грубые клеточные экстракты получали разрушением клеток на прессе Хьюза под давлением в 150 ати. Для биохимических исследований использовали клеточные экстракты разной степени очистки: экстракт, полученный после центрифугирования грубого клеточного экстракта при 12 000 об/мин в течении 30 шнут при 4°С ; растворимая фракция, полученная после центрифугирования экстракта при 100 ООО xg . в течение I часа при 4°С. Скорость потребления кислорода клетками измеряли в отмытой суспензии клеток в сосудах Варбурга при температуре 28°С. Концентрация белка в суспензии составляла 0,5-1,0 -мг/мл. Количество выделяемой клетками перекиси водорода определяли флуоресцентным методом со скояолетином /Andrea, 1955/ на фяуориметре "Hitachi". Экстракцию цитохрошв из лиофилизированнои биомассы проводили кислым ацетоном по методу Петерсона /Peterson, 1970/, количество и состав цитохромов определяли спектрофотометрически на спектрофотометре "Unicom". Определение активности терминально Ei ци-тохром с-оксидазы проводили в суспензии клеток по реакции с "ШБД-HGI / Suxtoh.uk; Jang-Kanglin, . 1983/. Концентрации сероводорода определяли методом иодометрического титрования /Резников- и др., 1963/ и спектрофотометрически /Maakereth,et al., 1978/. Тиосульфат, те-тратиокат и тритионат при совместном присутствии определяли цианат- ■ ныл методом /Kelly et al.. 1969/. Динамику и продукты окисления. . тиосульфата определяли в опытах с меченым ira^^^g^s* Пробы отбирали в течение 8 суток и анализировали распределение метки в продуктах окисления тиосульфата. Исследование влияния восстановленных соединений серы на процесс фиксации углекислоты проводили в опытах .с С, -определяли* включение ^С в биомассу в динамике в течение трех суток,

использовали варианты сред с тиосульфатом и в отсутствии восстановленных соединений серы.

Определение ферментативной активности. Для определения активности ферментов использовали суспензию бактериальных клеток, экстракт клеток и растворимую фракции. Ферменты'"серного метаболизма определяли спектрофотометричес'кими методами и по потреблению кислорода. Активность роданазы .учитывали в суспензии клеток, в экстран-те и в растворимой фракции по скорости образования тиоционата /Bowen et al., 1965/, спектрофотометрическши методом. Активность сероокси-дазы определяли в суспензии, экстракте клеток и в растворимой фракции по скорости образования тиосульфата из серы и сульфита, который образуется при энзшатическом окислении серы У Suzuki, silver, 1966, Silrer, tindgren, 3968/. Активности сульфидоксидазы, сульфитоксидаз! и АеС-редуктазы определяли по потреблению кислорода суспензией клеток в сосудах Варбурга в присутствии субстратов ферментативных реакций. Тиосульфатредуктазу определяли в экстракте по скорости образования сероводорода из тиосульфата в присутствии глутатиона /Петушкова, Ивановский, 1976/. Выделившийся сульфид определяли спектрофотометриче спим методом /Mackereth et al., 1978/. Активность тиосульфат-окисля-одего фермента определяли в экстракте епектрофотометрически по восстановлению феррицианида в присутствии окисляемого субстрата /Петушкова, Ивановский, 1976/. АТФ определяли биолюминесцентным методом на люыинометре фирмы "1KB" /Угарова и др., 1987/. Активность рибуло-зодифосфаткарбоксилазы измеряли в экстрактах клеток как скорость зависимого от РДЖ включения M аН^СОд в кислотоустойчивые продукты /Романова, 1980/. Эту работу проводили совместно с сотрудником лаборатории микробной биогеохиыии к.б.н. Пиыеновым Н.В.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Выделение, культивирование и характеристика нитчатых бесцветных серобактерий рода ïMothxlx. •

1.1. Выделение чистых культур нитчатых бесцветных серобактерий рода TMothrix.

В качестве материала для выделения бактерий рода Thiothrix использовали обрастания отмирающей растительности из сероводородного ручья, в которых преобладали нитчатые бактерии, морфологически сходные с описаниями Thiothrix.Капилляром под бинокулярной лупой отбирали отдельные нити и розетки, проводили посевной материал через серию последовательных отшвок в стерильной среде, 0,001 M растворе KCN и 5%-ноы растворе Tween-80. Отмытые нити и розетки" слегка обсукивали и переносили на поверхность чашки Петри с агаризованной средой, "содержащей лактат Ma, тиосульфат и Са s. Чашки с посевным материалом ввдерхивали в термостате при 28° С. Колонии Thiothrix мелкие, вязкие, белого цвета, с неровным краем и бугристой поверхностью, с трудом отделяются от поверхности агара. Кусочек агара с частью колонии переносили в жидкую среду того ке состава, за исключением Cas. Таким образом было вьщелено два штамма чистых 'культур бактерий, морфологически сходных с TMothrlX.

1.2. Особенности морфологии, репродукции и ультраструктуры выделенных штаммов Thiothrix.

Выделенные штаммы Thiothrix характеризуются вариабельностью • клеточной морфологии, особенно в первые месяцы после выделения из природных местообитаний. В дальнейшем морфологические характеристики выравниваются.

- В зкидкой среде в экспоненциальной фазе роста Thiothrix образует трихомы различной длины, достигающей иногда 100 ыкм и более, отдельные клетки /гонидии/, гормогонии и розетки из нитей и гонидий. Ширина трихомов, как\% длина индивидуальных клеток в пределах трихома варьирует значительно: от 0,7 до 2,5 ш:м в ширину, до 2,5-5 мкм в длину.

Морфология на ультратонких срезах у тмо-ььпх типична- для три-хомных организмов. Отдельные клетки, располокенные внутри трихома, имеют циллиндрическую форму, разделены между собой перегородками, состоящими из пеггтидо г лика нового слоя и цитоплазкатической мембраны. Наружная мембрана является общей для всего^трихома. '

Трихомы выделенных штаммов окружены мощным чехлом. Его'"толщина достигает 200 кы. Штаммы II и 12 различаются по строению чехла. • Чехол штамма И имеет более гомогенную равномерную структуру, ширина не превышает 50 нм. Клетки штамма 12 заключены в мощный многослой ныл чехол, отдельные слои которого могут быть отделены друг от друга Вновь образованные гонидии и гормогонии чехла не имеют. '■"

■ Характерной особенностью бактерий рода ТЫо1Ьг1х является способность к образованию розеток. 'Розетки могут быть сформированы из нитей или гонидий. В основании розеток, а иногда на базальном конце отдельных нитей, имеется прикрепительный диск, состоящий из/аморфного материала голисахаридной природа.

У штаммов Т1 и Т2 молодые нити могут образовывать не только розетки, но и нити с ложным ветвлением, что является морфологической особенностью выделенных нами штаммов тмо-ЫипЬс. Ложное ветвление нитей формируется с участием горыогониев.

Размножение происходит двумя способами. Первый, известный для всех описанных к настоящему времени. штаммов ТЫогьг1х с помощью от-шнуровывания гонидий на апикальном конце нитей. Размеры гонидий 3-5 ыкм в длину,. 1,5-2 мхм в ширину. Отделившиеся гонидии. способны к медленному передвижению скольжением. .. . .

Второй способ размножения состоит в сегментировании всей нити на короткие отрезки - гормогонии,. которые составлены более, чем из одной клетки. Их размеры г 8-10 ыкм в длину, 2,5 шш.в ширину. Гормогонии также способны, к передвижению скольжением более медленному, чем гонидии, и быстрее теряют подвижность.

В процессе образования гонидий и горыогониев вагсным является вопрос о том, что происходит в этом случае с клеточной стенкой трихома. тЫоШ:1х имеет клеточную стенку типичную для грам-отрицатель-ных бактерий. Образование гонидий у выделенных штаммов происходит путем отшнуровывания с помощью перетяжки в месте отделения гонидий. В этом случае достраивается наружная мембрана у соседних клеток трихома.. При образовании гонидий и гормогониев происходит разрушение чехла. Формирование гормогониев у отличается от способа образо-

вания подобных структур у родственных организмов. Отделение репродуктивных структур у описываемых штаммов происходит путем отшнуровывания участка нити с одновременной достройкой наружных слоев клеточной стенки у каждой из соседних клеток, а не за счет трансцеллюляр-ного разрыва и образования некридиальных участков меяду двумя соседними отрезками нити, как это имеет место у других трихомннх организмов.

В цитоплазме исследованных штаммов имеются три типа включений: поли$фосфаты, поли-в-оксибутираг и элементная сера. Включения серы расположены в периплазме в инвагинатах цитоплазматической мембраны. Количество включений на клетку и их размер могут варьировать. В среднем в клетке обнаруживаются от I до' 8 глобул серы, размером от 80 до 500 нм, расположенных-.периферийно вблизи клеточной стенки.

1.3. Таксономическое положение выделенных штаммов

'"Систематика гЫс^ЬПх разработана слабо, по описаниям из наблюдений за природным'материалом известно II видов, различающихся по ширине трихома. Данный признак не является правомерным для выделения нового вида, поскольку ширина трихома уа:Ыо-{;Ьг1х мокет меняться в зависимости" от возраста культуры и условий культивирования. В настоящее время признанным является лгеаь типовой вид тыо1:1сг!х -

Т.nivea , помещенный в последнее издание определителя Берги. Однако, там же приведены описания еще б штаммов Thiothrix с неопределенной видовой принадлежностью.

Сравнение морфологических и физиолого-биохимических свойств выделенных наш ытаммов Thlothrix и типового вида рода~Т.nivea выявило целый ряд существенных различий между^тнми организмами. Штаммы TI и Т2 используют более широкий круг органических соединений в качестве единственного источника углерода, имеются отличия в использовании источников серы и азота. У наши штаммов"отсутствует' облигатная зависимость от наличия в среде восстановленных соединений серы, они способны расти только на органических субстратах, т.е. осуществлять органогетеротрофный метаболизм. Бактерии обладают ката-ласной активносгьв. Они отличаются от Т.nivea наличием дополнительного способа размножения с помощью горыогониев и способностью к образованию нитей с лошади ветвлением. Исходя из этого, мы сочли возможным, несмотря на близкие значения содержания Г+Ц в-составе ДНК, отнести наши штаммы к новому виду. Приведен диагноз нового вида Thiothrix ramosá.

2. Роль неорганических серных соединений в метаболизме Ihiothrix ramosa. ■

Основное внимание при исследовании нового вида Т.ramosa было уделено изучение вопроса о функциональной роли восстановленных соединений серы в метаболизме данных бактерий. Существуют два возможных пути использования серных соединений бесцветными серобактериями. Во-первых, сульфид или тиосульфат могут участвовать в процессе деток-сикации продуктов неполного восстановления кислорода,-в частности перекиси водорода. Восстановленные серные соединения, химически реагируя с перекисью водорода, могут' выполнять функцию малоактивной иди отсутствующей у этих микроорганизмов кагалазы. Во-вторых, восстанов-

энные серные соединения могут использоваться как доноры электронов яя получения энергии. Хотя предположения о способности Т.nivea к емолитогетеротрофному росту бьши вьдзкнуты в ряде зарубекных иссле-ований, убедительных доказательств этого предположения не было поучено. В задачи нашего исследования входила проверка возможности ункционированкя как одного, так и другого механизмов окисления серых соединений.

Образование перекиси водорода и использование серных соединений качестве доноров электронов связано, в конечно« итоге, с функцио-ированием дыхательной цепи. Поэтому одной из задач нашего исследова-ия было изучение процессов дыхания Т.mamosa' и связи этих процессов окислением серных соединений.

2.1. Влияние органических соединений и восстановленных-соединений серы на потребление у Т. ramosa

Источниками углерода и энергии для Т.ramosa являются:предшест-1енники и интермедиаты ЦГК, что предполагает использование данных убстратов в дыхательном метаболизме и наличие связанной с кислородом >лектрон-транспортной системы. В качестве субстратов дыхания в к-л.к шытах слупили ацетат, лактат и пируват.

Скорость потребления, зшслорода в суспензии клеток падает со вре-юнем, что мокко объяснить уменьшением концентрации субстрата либо на-, соплением метаболитов /рис.1/. Однако, при внесения тиосульфата в су'с-хензию^клеток Т. rabosa вместе с ацетатом .'.картина меняется /рис.1/. 1ервые 50 минут скорость дыхания падает, как и в варианте опыта с эдниы*ацетатом, в следующие ЗОыинут намечается небольиой подъем скорости дыхания, и далее незначительное падение. Этот факт мояно объ-íCHHTb двояким образом.чПри дыхании суспензии Т. ranosa в реакционной змеей в присутствии ацетата накапливаются продукты неполного восстановления кислорода, ингибируоцие активность бактерий. При внесении

тиосульфата, который химически реагирует с перекисью водорода, эффект ингабирования снимается. Если тиосульфат используется в качестве донора электронов для получения энергии, то он включается в метаболизм по мере потребления ацетата, как предпочитаемого субстрата.Начало использования второго субстрата вызывает рост скорости потребления кислорода.- .. \ч

Рис Л. Влияние органических * веществ и восстановленных, соединений серы на скорость потребления суспензией T.ramosa: I - лактат ; 2 - лактат -at^s/ZQß мг/л/ ; 3 - ацетат ; 4 -ацетат + тиосульфат У50 мг/2 мл/; 5 - пируват ; 6 - пируват Na2s/23,4 uvjxj ;7 -Na^s/23,4 мг/л/ ; 8 - эндогенное дыхание Реакционная смесь содержала 2 ыл суспензии в Трис-HCI буфе ре 0,1 11/рН 7,6/. Концентрация органических веществ в реакционной снеси 1,25 мг/ык.

При использовании в качестве субстратов дыхания лактата и лак-рата с сульфидом подобного эффекта не наблюдается /рис.17. Скорость дыхания постепенно падает как в случае использования лактата, так i в варианте■опыта с лактатом и сульфидом. Потребление кислорода ía лагдате с.сульфидом несколько вызе, чем на лактате, однако, это ^значительное увеличение монет идти на химическое окисление сульфида /рис.1/. Подобная закономерность наблюдается такяе при использовании суспензией Т.ramosa пнр.увата и пирувата с сульфидом /рис.1/.

Таким образом, добавление тиосульфата к реакционной смеси вызывает изменение интенсивности дыхания, подобного эффекта не наблюдается при добавлении сульфида. Данный факт вызвал предположение о возможных различиях в механизмах окисления тиосульфата и сульфида r.xamosa.

Изучение состава дыхательной цепи Т.ramosa, проведенное с помощью ингибиторного анализа и спектрофотоыетрических методов, показало, что Т.ramosa имеет укороченную дыхательную цепь. В ее состав входят НАДН-дегидрогеназный комплекс, возмояно, хинон, цитохром с и терминальная цитохром с-оксидазг. Подобный состав не исключает возшгшости хемолитотрофного роста, поскольку хемолитоавтотрофнке ытаммы морской Beggiatoa "имеют электрон-транспортную цепь такого ие состава et al., 1988/.

2.2. Окисление тиосульфата Т.ramosa.

S,

В- одном из начальных экспериментов было показано, что добавление тиосульфата в среду культивирования Т.ramosa вызывает увеличение урожая -с. клеток в среднем на 40%, но не стимулируют фиксации COg. Для выяснения роли тиосульфата в метаболизме данных бактерий определяли продукты его окисления в периодической культуре с использованием Ma235S203.

Результаты данного опыта представлены на рисунке 2. В течение

первых двух суток окисления тиосульфата не отмечалось, потребление данного субстата бактериями началось лишь на третьи сутки. За шесть суток бактерии потребили 60$ внесенного тиосульфата, продуктами окисления являлись сера и сульфат. Образование серы и сульфата происходило одновременно. Линейный прирост биомассы имел место в течение шести суток и составил 17,3. мг белка/л.

I - тиосульфат ; 2 - элементная сера ; 3 - сульфат; 4 - биомасса по белку.

Образование сульфата в качестве одного из конечных продуктов окисления тиосульфата может свидетельствовать в пользу использования данного, субстрата в энергетическом метаболизме.' •

Качало потребления тиосульфата бактериями по истечении двух суток развития культуры объясняется,по нашему мнению,концентрационным эффеи-~.... Вначале, при достаточной концентрации органического субстрата в среде, он используется как на биосинтез, так и для получен

'Нергии. Однако, по мере снижения концентрации органического веще-;тва в среде, тиосульфат включается в метаболизм как дополнительный юточник энергии, что позволяет поддерживать скорость биосинтеза на •ом ке уровне. Для подтверндешш данного предположения необходимо бы-' го 'показать образование ATS бактериями Т.ramosa с тиосульфатом в :ачестве донора электроноз.

,2.3. Связь окисления тиосульфата у Т.ramosa с синтезом АТ®.

Для выяснения вопроса об участии тиосульфата в энергетическом гетаболизме у Т. ramosa проводили краткосрочные опыты с суспензией ;леток по определению динамики образования AT3L В качестве доноров »лектронов использовали тиосульфат, ацетат и ацетат с тиосульфатом, контролем слуиили варианты опыта, в которых АТ§ синтезировался за :чет эндогенного органического вещества. Результаты данного опыта ¡редставлены на рисунке 3. Показано образование АТ5 при пспользова-1ии ацетата, тиосульфата и ацетата с тиосульфатом."Максимальное соличестЕо АТ2 накапливалось через 5 минут после начала опыта. Скорость образования данного интермедиата при использовании в качестве донора электронов тиосульфата составляла 55$ от скорости образования его в присутствии органического субстрата и в 5 раз превышала данную скорость при использовании эндогенных органических веществ /табл.1/.

Таблица I. Скорость образования АТФ в суспензии Т. ramosa при использовании различных доноров электронов ^ /нмоль ATQ/мин-мг белка/

Донор

электронов Эндогенные Ацетат органические Тиосульфат Ацетат + Варианты вещества тиосульфат опытов____________

Суспензия клеток 12* 60 НО • 100

Суспензия клеток + . jQ3 q ЛЗ

ДССД JZ, 5 mkLV

э€ - среднее, из-2-х определений.

Для подтверждения данных об образовании AT® применяли метод ингкбигордаго анализа. В ряде вариантов опыта использовали специфический ингибитор АТ2-азы - днцккдогексилкарбодкашд /ДССД/, который не влияет на функционирование дыхательной цепи. В данных вариантах опыта проводили преинкубацию суспензии клеток с ингибитором в течение 10 минут. Результаты иншбиторного анализа представлены в таблице I. Образование ATS на ацетате полностью ингибировалось ДрСД, тогда как образование ATS на тиосульфате и на ацетате с тиосульфатом не ингибировалось. Из полученных данных ыоесно сделать вывод, что при использовании з качестве донора электронов ацетата синтез АТФ идет с помощью АТФ-азы в точках сопряжения ее с дькательной цепью, т.е. осуществляется окислительное фосфорилирование. Получение энергии при окислении тиосульфата, видимо, идет другим путем. 'В данном случае мояно предположить существование субстратного фосфорилирования. Подобный механизм обнарукен у некоторых тионовых бактерий при участи АЗС-редуктаэы,'которая, как известно из литературных данных /Kelly, 1989/, не ингибируется ДССД. В связи с изложенными вьше данными, воз никло следующее предположение о механизме окисления тиосульфата. Вна чале происходит расщепление молекулы тиосульфата до сери, которая накапливается в клетке, и до сульфита, который окисляется до сульфата и кокет принимать участие в энергетическом метаболизме.

. Таким образом, результаты опыта по образованию АТФ свидетельствуют в пользу предполонения об использовании тиосульфата бактерия!. Т. ramosa как дополнительного источника энергии. Следующим этапом работы являлось определение активности ферментов, участвующих в окис лении восстановленных серных соединений у изучаемых бактерий.

2.4. Определение активности фермзк-юв серного метаболизма у т.ranosa.

Продуктами окисления тиосульфата у Т. ramosa являются сера и

I - на тиосульфате ; 2 - на ацетате; 3 - на -ацетате и тиосульфате ; 4 - на эндогенных субстратах. Реакционная смесь содержала 2 мл суспензии в 0,05 н Трис-НС1 буфере УрН 7,6/. Концентрация вносимых субстратов была следующей: ацетат - 12,5 мг/ыл, тиосульфат - -20,5 мг/мл.

ульфат, поэтому нас интересовали ферменты, способные расщеплять мо-екулу тиосульфата. Такими ферментами являются роданаза и тиосуль-атредуктаза. Реакция, катализируемая роданазой, - неэнергодающая, . родуктами данной реакции являются сера и сульфит. Тиосульфатредук-аэа принимает участие в реакции, в результате которой образуются ульфид и сульфит.

При определении активности тиосульфатредуктазы использовали кле-.'очный экстракт, контролем слуяила реакционная смесь с прокипячен-шм экстрактом. Сравнение опытных и контрольных образцов позволило :делать вывод об отсутствии данного фермента у бактерий Т.гатоБа 'табл.2/.

Активность роданазы определяли в суспензии, в клеточном экстра те и в растворимой фракции. Результаты данного опыта представлены в таблице 2. Активность роданазы у Т.гаиоэа сравнима с таковой у пур пурных серобактерий ТЬДосарга гозеорехБ1о1па.

Таблица '2. Активность роданазы и тиосульфатредуктазы у серных бактерий /нмоль/мин»мг белка/.

Организм Роданаза Суспензия Экстракт Растворимая фракция Тиосульфатредуг /экстракт/

Thiothrix 23,6 26,5 75,0 0

ramosa -

Thiocapsa 77, Ок 95,0 56,0х

roseopersiclna -

к - Петушкова, Ивановский, 1976.

О наличии АФС-редуктазы судили по потреблению кислорода cycnei зией Т.ramosa в присутствии субстратов реакции, катализируемой да; ным ферментом, - сульфита и АЩ, контролем служили варианты опыта с суспензией клеток в отсутствии AMÍ5 и с прокипяченной суспензией. Суммарная реакция, катализируемая ферментным комплексом ASC-редук-тазы, с ледащая:

2S 0§~ + АЩ + 2 Ф неорг. 2s + ATS +4 ё

• Акцептором четырех электронов, образующихся в результате реак является цитохром с, через который реакция .может быть связана с. фц

циошрованиеы дыхательной цепи / Oh, Suzuki, 1980/.

Данные по активности фермента получали, вшитая из скорости г требления кислорода суспензией клеток в присутствии АНШ скорость г требленкя кислорода в контроле, и сравнивали с литературными даши для Thiotacillus neapolitanus /Hempfling, Irudinger, 1967/, noj ченными тем же методом /табл.3/. Активность ASC-редактазы у Т. ram . более чем на порядок меньше, чем у облигатного хемолитоавтотрофа

- 19 -

'аблица 3. Активность А£С-редуктазы у серобактерий.

Организм Активность AffiC-редуктазы

/нмоль/мин-иг белка/

rbiothrlx ramosa ГМоЪаоШиз neapolitanus

35 Hempfling, Trudinger, 1967 neapolitanus. Более низкая активность объясняется тем, что данные :олучены для суспензии клеток, а не для. очищенной,- 'фракции. По этим >езультатам можно судить о наличии или отсутствии фермента, но не о юальной активности.

У выделенных штаммов Т. ramosa определяли тагске активность окси-;аз серных соединений - сульфидоксидазы, сульоитоксидазы, сарооксида-1Ы и тиосульфатокислягащего фермента. Наличия данных.ферментов у Т. ramosa не обнаружено. Результаты этих исследований указывают на отсутствие связи окисления восстановленных серных соединений с окксли-:ельньгм фосфорилированием у бактерий Т. ramosa, у выделенных бакте-)ип обнаружены ферменты, необходимые для получения энергии с помощью ¡еханизма субстратного фосфорилирования при потреблении тиосульфата.

Выделенные бактерии накапливают внутриклеточно серу при росте ia средах, содержащих сульфид. В отсутствии оксидаз серных соедине-1ий данный факт можно объяснить химической реакцией с образующейся гер^кисыо водорода. Исходя из этого предположения, следующим этапом заботы явилось исследование процессов образования перекиси водорода г Т. ramosa и связи их с окислением сульфида.

2.5. Окисление сульфида бактериями Т. ramosa.

Окисление сульфида бактериями Т. ramosa изучали в краткосрочных эпытах с суспензией клеток. Пробы отбирали в течение 30 минут. Контролем слушли варианты опыта по окислению сульфида прокипяченной суспензией и по химическому окислению в буфере. Оба контроля имели сходные значения скорости окисления сульфида и составляли 2,1 нмолъ/

19 650х

мин. В качестве вариантов опыта использовали суспензию без добавления органических субстратов, суспензию клеток, в которую вносили ацетат одновременно с сульфидом и в которую сульфид вносили после пе риода инкубации с ацетатом Уот 10 до 50 минут/. Результаты опыта прс ставлены в таблице 4. Окисление сульфида суспензией Т.ramosa в rrpi сутствии ацетата протекает с большей скоростью, чем на эндогенных субстратах. Данный факт можно объяснить большим количеством продукте неполного восстановления кислорода, образующихся при использовании суспензией экзогенных органических субстратов. - '

Для выяснения вопроса о возможной связи окисления сульфида с ф? кционированием дыхательной цепи применяли метод ингибиторного анализа. В качестве ингибиторов использовали соединения, ингибирующие дыхание Т.ramosa : KCN /ЪсТО-3«/, ашмал /2,5x10"%/, ротенон /1хЮ"31 о-фенантролин /5хЮ~%/, а такие разобщитель синтеза АТ5> - карбонил: нкдхлорофенилгидразон /СССР/. Ни один из используемых ингибиторов, за исключением цианида, не подавлял окисления сульфида. Под действ» данной концентрации КСы окисление сульфида ингибировалось на 100$, т.е. окисление ингибировалось лишь при полном подавлении дыхания. Результаты опыта свидетельствуют об отсутствии прямой связи окислен сульрда с функционированием электрон-транспортной цепи у Т. ramosa. Таблица 4. Скорость окисления сульфида в суспензии Т. ramosa.

Используемый субстрат + НагЭ Скорость окисления сульфида УнмольУмин-мг белка/

Эндогенное органическое вещество - 4,6К

Ацетат Упосле периода инкубацииУ 7,6

Ацетат 6,6

я - среднее из 3-6 определений.

- 21 -

2.6. Образование перекиси водорода бактериями Т.ramosa.

Количественное определение перекиси водорода у Т.ramosa проворчи методом, основанным на .уменьшении флуоресценции скополетина ?и окислении Н^О^ в присутствии пероксидазн. В связи с трудностями ?новенного разрушения клеток Т. ramosa все определения проводили i грубых клеточных экстрактах, полученных из культур экспоненци-1Ьной и стационарной фаз роста. Образование перекиси водорода опре-зляли при эндогенном дыхании и в присутствии ацетата. Результаты шного опыта представлены в таблице 5. Скорость образования перекиси эдорода при эндогенном дыхании в экстракте клеток экспоненциальной 1зы роста ооставляет 17,5% от скорости образования этого продукта i ацетате, а в экстрактах, полученных из клеток стационарной фазы оста, она составляет уяе 6о% от скорости образования на ацетате, корость образования Н^О.», как правило, в экстракте в 3-4 раза ниле, эй в суспензии клеток /Чеканова, неопубликованные данные/. Количе-гво образующейся перекиси водорода больше в присутствии экзоген-эго органического субстрата, чем на эндогенном органическом Ееще-гзе, что'согласуется с данными по окислению сульфида /табл.4/. Если нести поправку на сниженную интенсивность дыхания в экстракте кле-ок, то количество образующейся перекиси водорода ,ца;хе превышает, еобходимое для осуществления химической реакции:

H2S + H202-*S° + 2Н20 днако-, у Т.ramosa имеется малоактивная каталаза, которая такие может

ринкмать участие в процессе детоксикации перекиси водорода.

Скорость образования % ст ! Скорость образ. ! % от по' НоОр в экспоненц.фа- !потреб. ! Н?0о в стац. фазе ! треб.Оо в .yuoipdr £оста Ушоль/мкн" ! Ор. в ! роста /нмоль/ Í сусп.кл.

! мг белка/ « ! сусп.кЛ ыин-мг белка/ t

ндо генное 0,6 6,0 1,4 14,0 ыхание

цетат 3,42 2,9 2,12 1,8

зг - дыхание в экстракте клеток Т.ramosa не определяли.

Таким образом, данные, полученные в работе, свидетельствуют в пользу перекисного механизма окисления сульфида выделенными штаммами Т.ramosa.

В заключение следует сказать, что физиологические возможности бе цветных серобактерий многообразны. Существование их в природе в условиях несткой кошсуренции заставляет использовать" _все возможные вариан ты метаболизма. Серные соединения играют ванную роль в жизнедеятельности данных микроорганизмов( пути их использования неоднозначны. Ню;; приводим предполагаемую схему окисления восстановленных серных соединений у исследованных наш бактерий:

1. Выделены из пресноводного сероводородного источника два штамма бесцветных нитчатых серобактерий рода Thiothrix.' Проведено исследование морфологических, ультраструктурных и физиолого-биохимиче-ских свойств выделенных штаммов бактерий, что позволило описать их как новый вид. Приведен диагноз нового вида Thlothrix ramosa.

2. Впервые показано существование неописанного ранее типа размножения для бактерий рода Tbiothrix с помощью горыогониев. Ультра-^ структурное исследование образования гормогониев у. Kilothrix ramosa выявило отличие данного процесса от образования подобных структур-у других трихоыных организмов.

3. Выяснены механизмы окисления восстановленных серных соединен: у выделенных штаммов ThiothrIX ramosa. Установлено, что окисление сульфида и тиосульфата у данных бактерий происходит с участием различных механизмов.

H^s Н2°2 > S

?

s02- . АоС-редуктаза s 0¿ + А

вавода.

- 23 -

4. Впервые доказана способность бактерий рода Thiothxix к молитогетеротрофному росту при использовании тиосульфата. Показа-

образование АТЗ при окислении тиосульфата по механизму субстрат-го фосфорилирования.

5. Впервые показана для бактерий рода Thiothrix связь процесса исления сульфида с образованием перекиси водорода. Получены дока-тельства, свидетельствующие об участии сульфида в процессе дето-икации перекиси водорода, образуемой в результате гшзнедеятель-сти Ihiothrix ramosa.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Одинцова Е.В., Дубинина Г.А. Бесцветные нитчатые сернъ® бактерии да Thiothrix. "Эволюция и систематика прокариот". Тр.1 Всесоюзна школы-конференции молодых ученых, Пуцино, 1968 г. Деп. в ВИНИТИ.

Одинцова Е.В., Дубинина Г.А. Новые бесцветные нитчатые серобак-;рии Ihiothrix ramosa nov.sp. Микробиология, 1990, т.59, f,""1 4, ?р.637.

, Одинцова Е.В., Дубинина Г.А. Особенности морфологии, ультраструк-фы и репродукции Thiothrix ramosa nov.sp. Микробиология, 1991, .60, 1? Z, стр.

. Одинцова- Е.В., Дубинина Г.А. Роль восстановленных серных соеди-зний в метаболизме Thiothrix ramosa. Микробиология, в печати.