Особенности механизма действия протонофоров с высоким сродством к мембране

Еремеев, Сергей Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности механизма действия протонофоров с высоким сродством к мембране
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности механизма действия протонофоров с высоким сродством к мембране"

005047655

Еремеев Сергей Андреевич

На правах рукописи

Особенности механизма действия иротонофоров с высоким сродством к мембране

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 О ДЕК 2012

Москва 2012

005047655

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций биологических мембран НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского и на факультете биоинженерии и биоинформатики. МГУ .им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Ягужииский Лев Сергеевич

Официальные оппоненты: Зинченко Валерий Петрович

доктор биологических наук, профессор, институт биофизики клетки РАН, г. Пущино, зав. лабораторией

Кобляков Валерий Александрович

доктор биологических наук, профессор, Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина, зав. лабораторией

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха

Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится 24 декабря 2012 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д. 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы д.1 стр. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в научной Библиотеке ■ Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «24» ноября 2012 г. Ученый секретарь

диссертационного совета ' Медведева Марина Валерьена

Актуальность работы

К настоящему времени достигнут значительный прогресс в понимании механизмов функционирования системы окислительного фосфорилирования митохондрий. Согласно П. Митчеллу эта система способна функционировать в режиме так называемого делокализованного сопряжения, при котором дыхательные протонные помпы и система синтеза АТФ функционируют как независимые структурно-функциональные единицы. В таких условиях протонные помпы трансформируют энергию окислительных реакций в электрохимический потенциал ионов водорода на митохондриальной мембране, а АТФ-синтетаза преобразует энергию потенциала в энергию пирофосфатной связи АТФ. Эта модель в настоящее время является общепринятой. В том же 1961 году Р. Вильяме предложил модель локального сопряжения, согласно которой система окислительного фосфорилирования представляет собой единый мембранный комплекс, где перенос энергии (перенос ионов водорода) и система синтеза АТФ жестко объединены в структуру суперкомплекса. Основная особенность этой модели состоит в том, что переносчик энергии (ион водорода) включен в работу протонных помп и АТФ-синтетазы как структурная единица. Вторая модель, таким образом, предполагает не только функциональное, но и структурное сопряжение работы протонных помп, системы транспорта энергии и АТФ-синтетазы.

мембраносвязанных ионов водорода, выполняющих роль переносчика энергии на АТФ-синтетазу. Ранее формирование фракции неравновесно связанных кислот Бренстеда на поверхности мембраны митохондрий в условиях работы протонных помп было обнаружено в нашей лаборатории с помощью катализаторов, которые ускоряют диссоциацию этих кислот, усиливая отрыв неравновесно связанных протонов с поверхности мембран функционирующих митохондрий. Катализаторы снижают активность ионов водорода на поверхности мембраны, увеличивая тем самым отрицательный заряд поверхности. Оба параметра регистрировали либо с помощью ковалентно пришитого к мембранам рН-зонда (Юрков В.И. и др., 2005), либо по изменению ^-потенциала мембран митопластов (Моисеева B.C. и др., 2011) и митохондрий (Ерошенко Л.В. и др., 2012). В последнем случае эффект образования фракции неравновесно связанных ионов водорода при включении протонных помп удается наблюдать без использования катализатора.

В настоящей работе исследован новый класс поверхностно активных протонофоров, специфически взаимодействующих с фракцией неравновесно связанных с мембраной ионов водорода.

Для исследования было синтезировано производное фенола - 2,4,6-трихлор-З-пентадецилфенол (ТХФ-Сп) (Рис. 1), обладающее на 7,5 порядков большим сродством к мембране, чем его структурный аналог 2,4,6-трихлорфенол (ТХФ) и на 6 порядков больше, чем известный классический разобщитель - пентахлорфенол (Мотовилов К.А. и др., 2009).

Изучение этого соединения

проводилось параллельно с

изучением классических

разобщителей ТХФ и ПХФ. Рис. 1. Структура ТХФ-Сц (2,4,6-трихпор-З-пентадецилфенол).

Свойства этого соединения

были сопоставлены со свойствами потенциально физиологически активного мембранотропного гидрохинона SkQ3, который обладает высоким сродством к мембране.

Из приведенной структуры ТХФ-Cis видно, что эта молекула может двумя принципиально разными способами воздействовать на ионную проницаемость мембран. Во-первых - присутствие фенольной группировки, определяющей протонофорные свойства этого соединения. Во-вторых - высокая поверхностная активность вещества, которая определяется сочетанием в структуре молекулы полярной гидроксильной группы и длинного углеводородного гидрофобного фрагмента. Первый этап изучения этого соединения как

вещества, стимулирующего дыхание митохондрий, был проведен в лаборатории на высоких концентрациях (10-320 мкМ), при которых может проявляться свойство ТХФ-Си как детергента. В настоящей работе систематически исследована концентрационная зависимость действия ТХФ-С15. Основное внимание уделено изучению действия низких и очень низких концентраций ТХФ-С|5 (1 мкМ - 1 нМ), при которых вероятность проявления детергентных свойств данного соединения сведена к минимуму. Протонофорные свойства ТХФ-С15 были продемонстрированы в экспериментах на модели БЛМ.

Цель работы

Получить строгое экспериментальное обоснование действия ТХФ-С15 - как протонофора, специфически взаимодействующего с фракцией неравновесно связанных с мембраной протонов, которая образуется на поверхности внутренней митохондриальной мембраны в условиях работы дыхательных протонных помп. Установить особенности его активности по сравнению с классическими разобщителями.

Задачи работы:

1. Различить протонофорный и детергентный эффекты ТХФ-С15 в условиях воздействия этого соединения на дыхание митохондрии. Для этого показать способность ТХФ-С15 стимулировать дыхание митохондрий в диапазоне низких и сверхнизких концентраций (1 мкМ - 1 нМ).

2. Продемонстрировать протонофорные свойства ТХФ-С15 на БЛМ.

3. На митохондриях подтвердить специфическое сродство ТХФ-С15 к поверхностно связанным протонам, обладающим избытком свободной энергии.

4. Продемонстрировать различие механизма стимуляции дыхания митохондрий ТХФ-Си и классическим разобщителем пентахлорфенолом.

5. Сопоставить действие ТХФ-Си и БкрЗ на митохондрии.

Научная новизна работы

На примере поверхностно активного фенола ТХФ-Си описан новый класс протонофоров, сродство которых к мембранам митохондрий на несколько порядков выше, чем сродство классических разобщителей. Было доказано, что эти соединения обладают способностью в микромолярном и наномолярном диапазоне концентраций избирательно взаимодействовать с фракцией неравновесно связанных ионов водорода, возникающей на поверхности при включении работы протонных помп. В независимых опытах на модельной

системе (БЛМ) доказаны протонофорные свойства этого соединения. Полученные данные рассмотрены в работе как независимое доказательство эффекта неравновесного связывания ионов водорода на мембранах митохондрий в условиях работы протонных помп (опыты проводились при тесной стыковке внешней и внутренней мембран митохондрий в условиях низкоамплитудного набухания митохондрий в гипотонических условиях).

Практическое значение работы

Обнаружение нового типа протонофоров открывает принципиально новые подходы для разработки лекарственных препаратов и создания средств, направленно регулирующих механизмы трансформации и запасания энергии в митохондриях.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на международном форуме по нанотехнологиям "Rusnanotech-08" (Москва, Россия, 2008); на XX Симпозиуме "Современная химическая физика" (Туапсе, Россия, 2008); на Всероссийском школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, Россия, 2008); на 34-м Конгрессе FEBS (Прага, Чешская Республика, 2009); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009); на 15-ой европейской конференции биоэнергетиков "ЕВЕС" (Варшава, Польша, 2010); на 53-ей научной конференции МФТИ (Долгопрудный, 2010); на 36-м Конгрессе FEBS (Турин, Италия, 2011); на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2011), на международной конференции «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), на международной конференции «Ломоносов-2012» (Москва, 2012), на 4 съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012), на 16-ой европейской конференции биоэнергетиков "ЕВЕС" (Фрайбург, Германия, 2012).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация написана на 124 страницах, содержит 82 рисунка и 6 таблиц и состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и их обсуждение», «Выводы», и «Список литературы». Список литературы включает в себя 150 источников.

Объекты н методы исследования

Объектом исследования в данной работе является фракция протонов неравновесно связанных с поверхностью мембран. В данной работе исследовался представитель нового класса протонофоров (ТХФ-Сп), избирательно взаимодействующий с рассматриваемой фракцией протонов. Для исследования взаимодействия ТХФ-С15 с фракцией протонов, неравновесно связанных с мембраной, мы использовали катализатор, ускоряющий отрыв рассматриваемой фракции от поверхности мембран (HEPES), обнаруженный в предыдущих работах нашей лаборатории.

Митохондрии печени крысы выделялись на основе частично модифицированной методики, изложенной в (,Johnson D. et al., 1967). Для выделения использовались самки взрослых белых беспородных крыс (150-200 г) и среды тоничностью 300 мОсм (изотония).

Скорость дыхания митохондрий измеряли в условиях термостатирования полярографическим методом с помощью кислородного электрода Кларка (рабочее напряжение U = 450-500 мВ) на полярографе Record4 (Пущино, Россия). Концентрация белка митохондрий в опытах составляла 0,8-1,0 мг/мл. Определение концентрации белка проводилось биуретовым методом. Время записи одной полярографической пробы варьировалось от 5 до 30 минут в зависимости от требований эксперимента. Все эксперименты проводились в гипотонических средах (120 мОсм).

Активацию сукцинатдегидрогеназы проводили по модифицированной методике (Kotlyar А.В., Vinogradov A.D., 1984). Густую суспензию свежевыделенных митохондрий (60100 мг белка/мл) инкубировали при комнатной температуре с сукцинатом в концентрации 1 мМ в течение 15 мин в закрытой пробирке, после чего пробирку помещали в лед и хранили в холодильнике при +4°С. Этот метод применен на митохондриях впервые, до этого он использовался только на СМЧ.

Проницаемость плоских бнслониых мембран (БЛМ) измеряли в тефлоновой ячейке, разделенной на два отсека (объемом по 3 мл) перегородкой с отверстием (диаметр 0,5 мм), на котором формировали БЛМ. Мембрана формировалась из дифитаноилфосфатидилхолина, выделенного из Е. coli, или азолектина из вытяжки соевых бобов (фосфатидилхолина 45,7%, фосфатидилэтаноламина 22,1%, фосфатидилинозитола 18,4%, фасфатидная кислота 6,9%, другие липиды 6,9%), растворенных в декане (20 мг/мл). Оба отсека содержали исследуемое вещество в равных концентрациях. Ток регистрировался

с помощью усилителя Keithley 428 (Keithley Instruments). Преобразование аналогового сигнала в цифровой производилось с помощью АЦР LabPC 1200 (National Instruments, США), цифровые данные подавались на ЭВМ, где визуализировались и обрабатывались с помощью программы WinWCP (Strathclyde Electrophysiology Software), разработанной J. Dempster (University of Strathclyde, UK). В установке использовались Ag-AgCl электроды помещенные непосредственно в измерительную ячейку.

Личный вклад автора

Автор лично принимал участие в выполнении исследований по всем разделам диссертации: Его заслугой является разработка и отладка методики предварительного встраивания гидрофобного реагента ТХФ-С15 в мембраны митохондрий и БЛМ. Разработка методических подходов при изучении действия малых и сверхмалых концентраций веществ на дыхание митохондрий. Автор впервые применил на митохондриях метод активации СДГ, что позволило надежно регистрировать увеличение скорости дыхания митохондрий при медленном встраивании протонофора в мембрану.

Результаты и их обсуждение

Как отмечалось во введении, соединение ТХФ-Си может воздействовать на протонную проницаемость митохондриальной мембраны двумя способами - как детергент, путем «разрыхления» липидного бислоя, ослабления белково-липидных взаимодействий, а также как протонофор - переносчик ионов водорода. Согласно нашему предположению, поверхностно активное соединение, обладающее огромным сродством к мембранам, должно преимущественно взаимодействовать с фракцией протонов, неравновесно связанных с внешней поверхностью внутренней митохондриальной мембраны. Образование этой фракции, наблюдающееся при работе протонных помп митохондрий, было описано нами в предыдущих работах. Мы ожидали, что ТХФ-Си, в силу высокого сродства к межфазной границе, будет преимущественно взаимодействовать с R-протонами, которые в этом случае следует рассматривать как специфический субстрат протонного переносчика ТХФ-С15. Требовалось доказать, что это соединение действительно является протонофором; что оно действует в низких концентрациях (не более 1 мкМ), которые не разрушают мембрану; прямо показать на модели БЛМ его протонофорные свойства.

Первые исследования, начатые в нашей лаборатории, были проведены с высокими расчетными концентрациями ТХФ-С15. В этих экспериментах мы наблюдали быстрое

возрастание скорости дыхания митохондрий после внесения 10-50 мкМ ТХФ-С15. В таких концентрациях соединение ТХФ-С15 может выступать как в роли протонофора, так и в роли детергента.

Изучение протонофорных свойств низких концентраций ТХФ-Сц на митохондриях.

Чтобы в явном виде выделить протонофорный эффект ТХФ-С15, представлялось необходимым исследовать на митохондриях гораздо более низкие концентрации этого соединения, которые заведомо не могут проявлять детергентные свойства. Мы планировали

также продемонстрировать протонофорные свойства ТХФ-С15 на модельной системе БЛМ. В настоящей работе мы исследовали диапазон концентраций от 1 мкМ до 1 нМ, при таких концентрациях эффект ТХФ-С15 как детергента должен отсутствовать.

При изучении действия низких концентраций ТХФ-С15 на митохондрии были выявлены важные особенности этого соединения по сравнению с классическими разобщителями. Это соединение проявляет способность стимулировать дыхание митохондрий в очень широком диапазоне концентраций (от 10 нМ до 60 мкМ). Мы предположили, что в спиртовом растворе ТХФ-С15, при концентрации этого соединения 1 мМ и выше, образуются относительно устойчивые неактивные мицеллы, однако только мономер обладает протонофорными свойствами. После добавления такой смеси к водной суспензии митохондрий большая часть вещества сохраняется в виде мицелл, которые почти не переходят в форму мономера и не проявляют при этом протонофорной активности. В тоже время при использовании более разбавленных стоковых спиртовых раствором (100 мкМ и ниже), ТХФ-С15 вызывает стимуляцию дыхания митохондрий в очень низких 10"6 — 10"" М (см. рис 3). В таких условиях проявляется вторая особенность ТХФ-С15 - медленное встраивание этого соединения в митохондриальную мембрану.

сукшшш 5 чМ

Рис. 2. Эффект стимуляции дыхания митохондрий 1 мкМ ТХФ-Сц. Среда инкубации содержит 1 мкМротенона, 2 мкМ циклоспорина, НЕРЕБ 3 мМ.

801 7060-.о 50-

о4

is40

3020 10 0

п = 6

п = б

I иМ + 10 иМ

Оказалось, что при низких концентрациях скорость

встраивания ТХФ-С15 в мембрану мала, вследствие чего после добавления ТХФ-С15 скорость дыхания митохондрий медленно нарастает во времени (15-20 минут) (рис. 2), в отличие от классических разобщителей, у которых максимальная скорость достигается очень быстро (20-40 сек после добавления соединения в среду инкубации, содержащую суспензию митохондрий). В связи с этим нами была модифицирована методика специальной предобработки

митохондрий (по методике: Kotlyar А.В., Vinogradov A.D., 1984), которая включает в себя предварительную активацию сукцинатдегидрогеназы. Благодаря этому скорость дыхания в контрольных опытах никогда не нарастает во времени и остается постоянной на протяжении эксперимента. В указанных условиях нам удалось достоверно регистрировать медленное нарастание эффекта стимуляции дыхания в присутствии очень низких концентраций ТХФ-С15. Для подтверждения данных рисунка 2, на следующем этапе были проведены серийные эксперименты по титрованию дыхания митохондрий низкими концентрациями ТХФ-С15 (рис. 3), показавшие существование концентрационной зависимости эффекта стимуляции дыхания (в диапазоне очень низких концентраций ТХФ-Сн). Из данных рисунка 3 видно, что эффект стимуляции дыхания зависит от концентрации этого вещества. Проведенный статистический анализ (с применением критерия Стьюдента) показал, что средние значения ускорения дыхания митохондрий различными концентрациями ТХФ-С15 достоверно различаются (для следующих диапазонов концентраций 1 мкМ/100 нМ pi = 0,0089; 100нМ/10 нМ рг = 0,0229; 100 нМ/(10 нМ+1 нМ) рз = 0,0084). То обстоятельство, что наномолярные концентрации

1 мкМ 100 нМ 10 нМ 1 нМ

[ТХФ-С,,]

Рисунок 3. Ускорение дыхания низкими концентрациями ТХФ-Сц. Время измерения 15-20 минут, концентрация белка 1мг/мл. Среда содержала НЕРЕБ 3 мМ, сукцинат 5 мМ, ротенон 1 мкМ, тоничность ИОмОсм.

ТХФ-С15 вызывают достоверную стимуляцию дыхания митохондрий, делает вероятность «детергентного механизма» предельно низкой.

Существенное различие в степени стимуляции дыхания митохондрий классическими разобщителями и ТХФ-Сн может быть объяснено несколькими факторами. Это локализация ТХФ-Си в мембране и достаточно затрудненная рециркуляция этого протонофора через мембрану. Кроме того, классические разобщители имеют значительно больший пул «субстрата», нежели ТХФ-Си, «субстратом» которого являются протоны, неравновесно связанные с мембраной. Также важно указать, что ТХФ-С15 достоверно не снижает АДФ/О, следовательно, конкуренцию за протон между АТФ-синтетазой и ТХФ-Си выигрывает первая.

Установление протонофорных свойств ТХФ-Сц на модели БЛМ

На следующем этапе работы были поставлены эксперименты, в которых было показано, что при определенных условиях ТХФ-С15 на бислойной липидной мембране обладает протонофорной активностью. Для этого на БЛМ были сняты вольт-амперные характеристики для вышеуказанного соединения при равных значениях рН в обоих отсеках ячейки (см. кривые с черными точками на рисунке 4). Затем, путем добавления щелочи в один из отсеков ячейки (на той же мембране) был создан ДрН = 1 (см. кривые со светлыми точками на рисунке 4) и снова снята вольт-амперная характеристика. Согласно закону Нернсга, мы должны были увидеть для нулевого тока сдвиг напряжения = 59 мВ, при создании на мембране ДрН = 1:

НО

Д цН= <р - КГ1д —

Рис.4. Зависимость силы тока

от напряжения. АрН = 1 (светлые точки), АрН = О (черные точки). Мембрана

-80

сформирована га азолектина, среда содержит ТХФ-Сц 10

мкМ, ЗмМ НЕРЕБ и 81мМКС1. Заранее оттитрованное

количество КОН добавлялось с

одной стороны мембраны

Как можно видеть из рисунка 4, на вольт-амперной кривой, в случае ТХФ-С15 был зарегистрирован сдвиг напряжения равный 47 мВ.

Для контроля на мембране сформированной из азолектина, был поставлен такой же эксперимент с классическим протонофором трихлорфенолом (рис. 5). При ДрН = 1 (на мембране) сдвиг потенциала для нулевого тока составил 55 мВ. Относительно небольшие

различия экспериментальных значений потенциала от теории обусловлены, очевидно,

эндогенными утечками

мембраны по другим ионам.

Как видно из полученных данных (рис. 4), ТХФ-С15 в опытах на БЛМ, качественно проявляет себя также как протонофор.

Участие транслокатора нуклеотидов в переносе через мембрану митохондрий ТХФ-Сц в низких и высоких концентрациях

Было показано, что в транспорте ТХФ-С 15 через митохондриальную мембрану принимает участие транслокатор нуклеотидов. Результаты экспериментов, приведенные на рисунке 6, показывают, что ингибитор транслокатора нуклеотидов (карбоксиатрактилазид) достоверно снижает эффект стимуляции дыхания митохондрий, индуцированный ТХФ-С 15. Эти опыты показали, что от половины до двух третей аниона ТХФ-С15 транспортируется через мембрану митохондрий в условиях эксперимента путем связывания с транслокатором.

Рис. 5. Зависимость силы тока от напряжения. АрН =

О (черные точки), АрН = 1 (светлые точки). Липид мембраны - азолектин, среда содержит ТХФ 10 мкМ, HEPES 20мМ и КС1 70 мМ.

Рис. 6. Участие транслокатора нуклеотидов в траснмембранном переносе ТХФ-Сц через

мембрану митохондрий. Ингибитор транслокатора нуклеотидов снижает степень ускорения дыхания митохондрий под действием высоких (левый рисунок) и низких (1 мкМ) концентраций (правыйрисунок) ТХФ-Сц.

Обнаружение существования неактивной формы ТХФ-Сц в экспериментах на митохондриях

Для обнаружения существования «неактивной формы» ТХФ-С15 нами были поставлены две серии экспериментов по стимуляции дыхания митохондрий одинаковыми количествами ТХФ-С15, когда расчетная концентрация вещества в суспензии митохондрий составляла 1 мкМ. В первой серии в среду инкубации митохондрий вещество вносилось из стокового раствора концентрации 1 мМ, во второй серии стоковый раствор имел концентрацию 100 мкМ. Из рисунка 7 можно увидеть, что максимальная скорость дыхания митохондрий (измерения проведены через 20 минут после добавки соединения) под влиянием разбавленного раствора увеличивается в 4 раза сильнее по сравнению с концентрированным раствором. Эти опыты подтвердили наше предположение об образовании относительно устойчивых неактивных мицелл в спиртовых растворах ТХФ-С15

ТХФ-Сц как протонофор, избирательно взаимодействующий с фракцией ионов водорода, неравновесно

связанных с мембраной.

В настоящем разделе работы было установлено, что катализатор (НЕРЕЭ), который ускоряет реакцию отрыва неравновесно связанных протонов от поверхности мембраны, приводит к существенному снижению эффекта стимуляции дыхания митохондрий под действием ТХФ-С15. Эти результаты приведены на рисунке 8, из которого следует, что повышение концентрации

инкубации из разных стоковых растворов: а- 1 мМ, катализатора (НЕРЕЭ) с 3 до 20 мМ в б-100мкМ. Среда инкубации: 3мМНЕРЕ8, I мкМ среде инкубации митохондрий ротенона, 2 мкМ циклоспорина А. снижает эффект стимуляции дыхания

митохондрий почти до нулевых значений. В то же время необходимо отметить, что классические разобщители (ПХФ, ТТФБ, ИССР) могут значительно увеличивать максимальную скорость разобщенного дыхания (Юрков В.И. и др., 2005). Пример усиления стимуляции дыхания митохондрий под действием классического разобщителя ПХФ при повышении концентрации НЕРЕЭ в среде инкубации приведен на рисунке 10.

Установление специфичности взаимодействия ТХФ-Сц с фракцией ионов водорода, неравновесно связанных с мембраной (Я-протонов), которая образуется в условиях работы дыхательных протонных помп

В настоящем разделе проведена экспериментальная проверка модели специфического взаимодействия ТХФ-С15 с фракцией Я-протонов.

Нам представлялось логичным рассматривать фракцию мембраносвязанных протонов как «специфический субстрат» ТХФ-С15, который, согласно нашему предположению, избирательно взаимодействует с данной фракцией. Следовало ожидать, что удаление субстрата приведет к снятию или значительному уменьшению эффекта стимуляции дыханиях под действием ТХФ-С15.

с>кщш;гт

5 мМ

Рис. 7. Влияние эффекта мицеллообразования на усиление скорости дыхания митохондрий под действием 1 мкМ ТХФ-Сц внесенного в среду

время,

Рис. 8. Примеры снижения ускорения дыхания митохондрий под действием 1 мкМ ТХФ-Сц при внесении в среду катализатора (НЕРЕБ 20 мМ). Среда инкубации содержит I мкМ ротенона, 2 мкМ циклоспорина А.

Снижение объема фракции достигалось путем внесения в суспензию митохондрий высоких концентраций катализатора (НЕРЕБ), увеличивающего скорость реакции отрыва мембраносвязанных протонов от поверхности мембраны. На рисунках 8 и 9 приведены примеры экспериментов, результаты которых подтверждают правильность

предложенной модели о снижении стимуляции дыхания митохондрий под действием ТХФ-Си (на всем исследуемом интервале

концентраций) при внесении в среду инкубации высокой концентрации НЕРЕБ. Опыты с низкими концентрациями ТХФ-Си были выполнены в присутствии 1мкМ, 100 нМ, 10 нМ и 1 нМ, во всех случаях прирост скорости дыхания в 2-4 раза снижался при внесении в среду инкубации катализатора (НЕРЕЭ). Всего было выполнено 22 независимых эксперимента на образцах взятых из разных животных с использованием разных концентраций катализатора (НЕРЕБ),

примеры приведены на рисунках 8 и 9. В контрольном опыте с классическим разобщителем катализатор повышает максимальную скорость разобщенного дыхания митохондрий (рис. 10) (Юрков В.И. и др., 2005) (рисунок 10).

1 160-1

х 2

<=С

140

я о

о. §

>,120-

НЕРЕ8 3 мМ

100

концентрация ТХФ-С15, мкМ

Рис. 9. Высокие концентрации катализатора НЕРЕБ снижают эффект ускорения дыхания митохондрий индуцированный ТХФ-Сц на всем интервале концентраций соединения.

350

5 300 Ч

_й щ

ф 250 Н о.

о ^

200

¡° -в-НЕРЕЗ 20 мМ

| —о-НЕРЕЄ 3 мМ

-|,IIII

2 3 4 5 ПХФ, мкМ

Рис. 10. Эффект катализатора НЕРЕЗ на ускорение дыхания по действие пентахлорфенола, обратный по сравнению с эффектом на ТХФ-Сц (см. рис. 7).

Классические разобщители эффективно взаимодействуют со свободными протонами в объеме водной фазы. Максимальная скорость разобщенного дыхания лимитирована реакцией отрыва протонов от поверхности мембраны. Катализатор (НЕРЕЭ) ускоряет эту реакцию, увеличивая тем самым максимальную скорость разобщенного дыхания митохондрий. Следует подчеркнуть то обстоятельство, что НЕРЕЭ в роли буфера (но не катализатора) должен оказывать одинаковое влияние на разобщающую активность ПХФ и ТХФ-С15. Тогда как из сравнения данных (рис. 8, 9 и 10) следует, что знак эффекта НЕРЕв на стимуляцию дыхания митохондрий под действием ПХФ и ТХФ-С15 прямо противоположен (объяснение этого различия связано с разными лимитирующими стадиями протонного транспорта для этих протонофоров (см. рис. 11)).

Наблюдаемый эффект снижения стимуляции дыхания под действием ТХФ-С15, которое возникает при внесении в систему катализатора (НЕРЕ8 20 мМ) (рис. 8), говорит о том, что данный протонофор избирательно

взаимодействует непосредственно с мембраносвязанными протонами,

согласно схеме (рис. 11 б), которые

фактически являются «субстратом» этого протонофора и перестает стимулировать дыхание в

отсутствие этого субстрата. Классические разобщители преимущественно взаимодействуют с протонами в объеме водной фазы. Следует принять во внимание то обстоятельство, что НЕРЕЭ является не только катализатором, но также обладает свойствами буфера и может снижать трансмембранный рН градиент на мембране функционирующих митохондрий. Однако, согласно теории, при работе протонных помп такое снижение химического потенциала иона водорода (учитывая малую емкость внутренней мембраны митохондрий) быстро компенсируется ростом Ду, при этом ДцН не снижается. В то же время скорость дыхания, несмотря на снижение ДрН, должна оставаться постоянной в силу постоянства ДцН. Поэтому возникновение эффекта стимуляции дыхания под действием НЕРЕв в разобщенных митохондриях является однозначным доказательством каталитических свойств этого соединения в условиях нашего эксперимента.

магрикс

водная фаза

....І... іг

ч ІҐ

матрикс

мембрана

межфазпая водная граница фаза

TII

\1т:-н*|ч-......."*

! TU "*

Рис. ILA- схема транспорта протона через мембрану с участием классического разобщителя ТХФ; неравновесное состояние кислоты Бренстеда на

поверхности мембраны. Медленная стадия цикла - реакция отрыва протона от поверхности мембраны (1), катализатор повышает максимальную скорость дыхания. Б-схема транспорта протона через мембрану с участием ТХФ-Сц. Медленная стадия цикла реакция (2) перенос протона с кислоты Бренстеда [Xі • ■ • •Н>*] на анион ТХФ-Сц (Т~на схеме); катализатор снижает ускорение дыхания. Таким образом, как видно из рисунка 11 (схемы А и Б), нам удалось получить экспериментальное обоснование повышенного сродства бифильного поверхностно активного протонофора ТХФ-С15 с мембраносвязанными протонами, обладающими избытком свободной энергии.

Переносчик фосфата в митохондриях - эндогенный регулятор объема фращии мембраносвязанных протонов

Считается, что транспорт фосфата связан с реакциями фосфат/ОН- обмена или с реакцией симпорта фосфата и протона обмен (см. рис. 12).

матрикс мембрана

А / ОН •

межфазная | граница

ОН А

С^-Н ——►Н*

х-нт

« 140

Р, +н ■

р-ч,..-

ОПЫТ

■ ^

/1 о Н.рог+^М

/ о

/і - #

1 —І- Н,РО, -1-1-1

10 20 30 40 50

концентрация ТХФ-СІ5, мкМ

II.РО,

Рис. 12. Схема работы фосфатного переносчика. Фосфатный переносчик может функционировать в нескольких режимах: 1 - фосфат-анионный обмен (частный случай фосфат-ОН~ обмен), 2 - симпорт фосфата и протона, фосфат-фосфатный обмен (не показан). Слева: снятие эффекта стимуляции дыхания митохондрий высокими концентрациями ТХФ-Сц при включении фосфатного переносчика. НЕМ (20 мкМ) существенно блокирует эффект фосфата. В связи с этим можно было ожидать, что в присутствии фосфата протекание реакции,

представленной на рисунке 12, приведет к снижению фракции мембраносвязанных протонов. Это действительно удалось наблюдать в эксперименте на низких и высоких концентрациях ТХФ-С15 (см. рис. 13 и 12 соответственно).

На рисунках 12 и 13 можно видеть, что добавление фосфата, так же как и внесение в среду инкубации НЕРЕ8 (20 мМ), приводит к резкому снижению степени стимуляции дыхания митохондрий под действием низких (рис. 13) и высоких (рис. 12) концентраций ТХФ-С15.

О 200 время, сек

Рис. 13. Снятие эффекта стимуляции дыхания

митохондрий индуцированного ТХФ-Сц при включении фосфатного переносчика (а - 100 нМ ТХФ-Сц, 6-60 мкМ ТХФ-С,¡). ИЕМ (20 мкМ) -снижает эффект фосфата.

Эффект фосфата, как и следовало ожидать, значительно блокируется добавлением ингибитора фосфатного переносчика Ы-этилмалеимида (рис. 13). В присутствии

классических разобщителей КЕМ в этих концентрациях не блокирует стимуляцию дыхания. Этот результат представляется нам особо интересным, поскольку в этом случае можно сделать вывод, что эндогенная система транспорта фосфата в митохондриях может участвовать в регуляции объема фракции неравновесно связанных ионов водорода.

Сравнение действия ТХФ-С15 н 8к(}3 на дыхание митохондрий.

Проведенные эксперименты показали, что в концентрациях 1 мкМ и 100 нМ 8к(23 (восстановленная форма 8к(33) стимулируют дыхание митохондрий (рис. 14). Степень этой стимуляции достаточно велика. Также важно подчеркнуть, что, как и в случае с ТХФ-С15, эффект стимуляции дыхания возрастает во времени (рис. 14). Из приведенных данных можно видеть, что внесение в среду инкубации катализатора НЕРЕ8, также как и в случае ТХФ-С[5 приводит к существенному ослаблению действия ЭкОЗ как стимулятора дыхания митохондрий.

ОЩИИП

? \|\[ СТКШ1НЙГ

Рис. 14. SkQ3 в концентрациях! мкм (левый рисунок) и 100 нМ (правый рисунок) стимулирует дыхание митохондрий. Повышение концентрации катализатора HEPES (20 мМ) в среде инкубации резко снижает эффект стимуляции дыхания под действием SkQ3.

Также как катализатор (HEPES 20 мМ) в концентрации 20 мМ, фосфат снижает эффект стимуляции дыхания митохондрий под действием SkQ3. Как можно видеть на рисунке 15, внесение в среду инкубации неорганического фосфата, также как и в случае с ТХФ-С15 приводит к достоверному снижению эффекта ускорения дыхания. Использование NEM, в свою очередь, частично обращает эффект фосфата.

Обсуждая приведенные данные, следует указать, что, в отличие от электронейтрального ТХФ-Сн, в случае катиона SkQ3 ускорение дыхания митохондрий может частично быть обусловлено связыванием жирных кислот, присутствующих в мембране, с положительно

заряженной фосфониевой

группировкой (Severin F.F. et al„ 2010).

H.PO, ^ i "

О проблеме транспорта ионов водорода через мембрану положительно заряженными

переносчиками ряда SkQ.

Обнаружение эффекта

стимуляции дыхания митохондрий

соединениями ряда SkQ

рассматривается нами как следствие

образования гидрохинонов ряда

SkQ. Одним из вариантов

объяснения наблюдаемого

феномена является предположение

об образовании циклической формы

мономера SkQ3H_ или его димера.

Такая схема представляется нам

весьма вероятной. Однако, значения

рК бензогидрохинонов существенно

превышают значение рК известных

классических разобщителей

окислительного фосфорилирования. Такое расхождение требует специального обсуждения,

которое было дано в одной из наших статей (Еремеев С.А. и др. 2009). Следует подчеркнуть,

что образование электронейтральной формы гидрохинонов ряда SkQ может происходить без

специфических конформационных изменений молекул этих веществ, связанных с

образованием циклических форм гидрохинонов. Такая ситуация возникает в том случае, если

происходит одноэлектронное окисление гидрохинонов (или восстановление хинонов) с

образованием семихинонов (или одноэлектронное восстановление хинонов), которые

являются более сильными кислотами, чем соответствующие хиноны. Для примера укажем,

Рис. 15. Включение фосфатного переносчика снимает эффект ускорения дыхания митохондрий

под действием SkQЗ. а - стимуляция дыхания митохондрий при внесении 1 мкМ SkQЗ; Ъ - снятие эффекта стимуляции дыхания внесением в среду 2 мМ неорганического фосфата; с-снятие эффекта фосфата добавлением ингибитора-фосфатного переносчика - ИЕМ (20 мкМ). Состав сред: 3 мМ НЕРЕБ, 1 мкМротенона, 2 мкМ циклоспорина А, 5 мМ сукцината.

что семихинон CoQ имеет рК равное 6,0 (Blaikie F.H. et а!., 2006). При этом цвитгерионы включающие остаток семихинона и трифенилфосфониевую группировку имеют суммарный нулевой заряд, как в замкнутой, так и в линейной форме.

Согласно альтернативной гипотезе (Severin F.F. et а!., 2010), нейтральная форма соединений ряда SkQ и их аналогов может возникать в результате комплексообразования положительно заряженных гидрохинонов и хинонов с жирными кислотами, карбоксильные группы которых обеспечивают протонофорные свойства таких комплексов. В заключение следует отметить, что вышеуказанные варианты механизма протонного транспорта с участием соединения ряда SkQ в целом не являются альтернативными, поэтому в митохондриях наблюдаемый транспорт протонов может протекать с участием обоих механизмов. В то же время соединение ряда SkQ - SkQ3, также как и производное ТХФ -ТХФ-Сн, обладает специфическим свойством - эффективно взаимодействовать с фракцией R-протонов, возникающей при работе дыхательных протонных помп на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны. Особенность механизма протонного транспорта описывается схемой на рисунке 10.

Общее заключение

Работа направлена на изучение механизма транспорта энергии окислительных реакций в условиях образования мембранного фосфорилирующего суперкомплекса. В работе детально исследованы протонофорные свойства поверхностно-активного соединения 2,4,6-трихлор-3-пентадецилфенол (ТХФ-С15). Получены экспериментальные данные, показывающие, что на БЛМ это соединение обладает полноценной протонофорной активностью. В условиях работы дыхательных протонных помп ТХФ-С15 стимулирует дыхание митохондрий, но, в отличие от классических разобщителей, преимущественно взаимодействует с фракцией ионов водорода, связанных с поверхностью мембран и обладающих избытком свободной энергии. Показано, что на 60-75% циклический трансмембранный транспорт ТХФ-С15 в митохондриях осуществляется при участии транслокатора адениновых нуклеотидов. Обнаружение нового типа протонофоров, избирательно взаимодействующих с протонами, неравновесно связанными с поверхностью мембран, обсуждено в работе как новое, независимое подтверждение модели «локального» транспорта энергии окислительных реакций на АТФ-синтетазу. Проведено сопоставление протонофорной активности ТХФ-С15 и потенциально физиологически активного соединения

ряда БкО - ЭкСЗЗ. Показано качественно сходство протонофорной активности этих соединений на митохондриях.

В работе показано, что система транспорта фосфата в митохондриях включена в регуляцию объема фракции мембраносвязанных ионов водорода, обладающих избытком свободной энергии.

Выводы

1. На модели плоской бислойной мембраны (БЛМ) показано, что поверхностно активное соединение 2,4,6-трихлор-З-пентадецилфенол (ТХФ-С15) обладает свойствами протонофора.

2. На митохондриях показано, что ТХФ-С15 стимулирует дыхание митохондрий в состоянии два по Чансу.

3. Найдены условия, при которых на митохондриях наблюдается резкое качественное различие между протонофорной активностью классических разобщителей и поверхностно активным ТХФ-С15.

4. Показано, что, в отличие от классических разобщителей, ТХФ-С15 преимущественно взаимодействует с мембраносвязанной неравновесной фракцией ионов водорода, которая образуется в условиях низкоамплитудного набухания митохондрий на поверхности митохондриальной мембраны при включении дыхательных протонных помп:

Таким образом, получено независимое подтверждение образования фракции мембраносвязанных протонов, обладающих избытком свободной энергии, возникающей при работе протонных помп митохондрий.

5. Показано, что транспорт ТХФ-Си в митохондриях на 60-75% осуществляет переносчик адениновых нуклеотидов.

6. Обнаружено, что система транспорта фосфата в функционирующих митохондриях является эндогенным регулятором объема фракции неравновесно связанных с мембраной протонов.

7. Проведено сопоставление разобщающих свойств ТХФ-С15 и гидрохинона ряда БкС} (ЗкСЗЗНг). На митохондриях установлено качественное сходство этих соединений как протонофоров.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Еремеев СЛ.. |Каргин В.И.|, Мотовилов К.А., Ташлицкий В.Н., Марков В.Ю., Коршунова Г.А., Сумбатян Н.В., Высоких М.Ю., Ягужинский JI.C. Молекулярные механизмы превращения митотропных хинонов ряда SkQ и поиск путей создания избирательно действующих "ловушек" свободных радикалов. Биохимия. Том 74, 10, стр. 1368-1379.

2. Еремеев С.А.. Мотовилов К.А., Волков Е.М., Ягужинский Л.С. Новый представитель класса мембранотропных разобщителей — SkQ3. Биологические мембраны. 2011, Том 28, 5, стр. 339-345.

3. Ягужинский Л. С., Мотовилов К. А., Волков Е. М., Еремеев С. А. О взаимодействии поверхностно активного основания с фракцией мембраносвязанных протонов Вильямса. Биофизика. 2013 (принята в печать).

4. Еремеев С.А.. ^аргин В.И.|, Мотовилов К.А., Тышлицкий В.М., Коршунова Г.А., Сумбатян Н.В., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С. Митотропные бензохиноны ряда SkQ как потенциальные регуляторы уровня свободных радикалов в клетке. XX Симпозиум "Современная химическая физика". Туапсе, Россия, 15-26 сентября, 2008.

5. Еремеев С.А.. [Каргин В.И.|, Мотовилов К.А., Тышлицкий В.М., Коршунова Г.А., Марков В.Ю., Сумбатян Н.В., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С. Молекулярные механизмы превращения митотропных хинонов ряда SkQ и поиск путей создания избирательно действующих «ловушек» свободных радикалов. Всероссийская школа-семинар для студентов, аспирантов н молодых ученых «Нанобиотехнологни: проблемы и перспективы», Белгород, Россия, 9-11 декабря 2008, с.53-56.

6. Еремеев С.А.. Каргин В.И., Мотовилов К.А., Ташлицкий В.Н., Коршунова Г.А., Сумбатян Н.В., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С. Митотропные хиноны ряда SkQ как потенциальные регуляторы уровня свободных радикалов в клетке. Nanotechnology International Forum "Rusnanotech-08". Moscow, Russia, 3-5 декабря, 2008, с. 583-584

7. Еремеев С.А.. Костава В.Т., Ягужинский Л.С. Механизм действия противоопухолевых алкилирующих соединений на митохондрии: эффект открывания неспецифической поры. Международная концефереиция «Рецепция н внутриклеточная сигнализация», Пущино, Россия, 2009, стр. 586-590.

8. S. Eremeev. |V. Karginj К. Motovilov, V. Tashlitsky, VMarkov, М. Vyssokikh, G. Korshunova, N. Sumbatyan, L, Yaguzhinsky. Investigation of chemical properties of group of mitotropic antioxidants of benzoquinone series. 34th FEBS Congress, Prague, Czech Republic, 2009,p. 44.

9. S.A. Eremeev. K.A. Motovilov, L.S. Yaguzhinsky. 77ге new type of uncouplers whitch selectively interact with non-equilibrium membrane bounded protons. 16<h European Bioenergetics Conference, Warsaw, Poland, 2010, p. 43.

10. JI.B. Ерошенко, А.С. Мараховская, K.A. Мотовилов, C.A. Еремеев. JI.C. Ягужинский. Изучение механизма терминальной стадии переноса протона через внутреннюю мембрану митозондрий в условиях синтеза АТФ. 53-янаучная конференция МФТИ. «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук», Долгопрудный, Россия, 2010, стр. 18-10

11. ЕремеевС.А.. МотовиловК.А., КоршуноваГ.А., СумбатянН.В., ВолковЕ.М., ЯгужинскийЛ.С. Новый класс разобщителей дыхания и фосфорилирования митохондрий - мембранотропные разобщители. Международная коицефереицня «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущино, Россия, 2011, стр. 654-658.

12. S.A. Eremeev and L.S. Yaguzhinsky. New class of membranotropic uncouplers of oxidative phosphorylation in mitochondria. 34th FEBS Congress, Prague, Czech Republic, 2011,p. 372

13. Еремеев С.А.Регуляиия активности мембранотропных разобщителей. Тезисы XVIII Международной конференции «Ломоносов-2011», Москва, 2011.

14. Еремеев С.А. Изучение свойств неравновесной фракции ионов водорода возникающей на поверхности внутренней мембраны митохондрий при работе протонных помп. Тезисы XIX Международной конференции «Ломоносов-2012», Москва, 2012.

15. Eremeev S.A.. Motovilov К.A., Yaguzhinsky L.S. The new class of surface-actyve phenols selectively interact with membrane-bound protons fraction with an excess of free energy. 17th European Bioenergetics Conference, Frieburg, Germany, 2012, p. 132.

16. Еремеев С.А.. Мотовилов K.A., Ягужинский JI.C. Новый класс поверхностно активных фенолов избирательно взаимодействующих с фракцией мембраносвязанных протонов Вильямса. 4 съезд бнофнзнков России, Нижний Новгород, 2012, Т.2, стр. 50.

Заказ № 89-П/11/2012 Подписано в печать 23.11.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л.1

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.rii; е-тай:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Еремеев, Сергей Андреевич

Оглавление.

1.Список сокращений.

2. Введение.

2.1 Актуальность работы.

2.3 Задачи исследования.

2.4 Научная новизна работы.

2.5 Практическое значение работы.

3. Обзор литературы.

3.1 Строение и функции митохондрий.

3.2 Структура комплексов дыхательной цепи.

3.2.1 Первый дыхательный комплекс.

3.2.2 Второй дыхательный комплекс.

3.2.3 Третий дыхательный комплекс.

3.2.4 Четвертый дыхательный комплекс.

3.2.5 АТФ-синтетаза.

3.3 Сопряжение процессов дыхания и фосфорилирования.

3.3.1 Химическая схема сопряжения.

3.3.2 Хемиосмотическая гипотеза Митчелла.

3.3.3 Теория Вильямса.

3.3.4 Схема Бойера.

3.3.5. Фракция неравновесно связанных с поверхностью мембран протонов и ее идентификация.

3.3.6 Два режима системы сопряжения.

3.3.7 Трансмембранный градиент протонов, локальный градиент активности ионов водорода на БЛМ.

3.3.8 Разобщители и разобщение.

3.4 Активные формы кислорода.

3.4.1 Общие сведения.

3.4.2 АФК - регуляторные молекулы.

3.5 Хиноны ряда 8кС> и Мко(3.

4. Материалы и методы.

4.1 Реактивы.

4.2 Буферные растворы.

4.2.1 Среды для экспериментов с митохондриями.

4.2.2 Среды для экспериментов на БЛМ.

4.2.3 Среды для спектрофотометрических экспериментов.

4.3 Выделение митохондрий печени.

4.4 Измерение скорости дыхания митохондрий.

4.5 Измерение степени стимуляции дыхания митохондрий низкими концентрациями поверхностно активных протонофоров.

4.6 Активация сукцинатдегидрогеназы.

4.7 Восстановление ТРР+-конъюгированных хинонов и измерение спектральных характеристик восстановленных форм.

4.8 Расчет теоретических значений.

4.9 MALDI спектроскопия.

4.9.1 Механизм ионизации.

4.10 Эксперименты на модели бислойной липидной мембраны (БЛМ).

5. Результаты и обсуждение.

Раздел I. Поверхностно активные и протонофорные свойства ТХФ-С15.

5.1.1 ТХФ-С15 детергент или протонофор (определение условий эксперимента).

5.1.2 Низкие концентрации ТХФ-С15 (1 мкМ) стимулируют дыхание митохондрий в состоянии 2 по Чансу.

5.1.3 Доказательство протонофорных свойств ТХФ-С15 на модели БЛМ.

5.1.4 Избирательность взаимодействия ТХФ-С15 с фракцией R-протонов в митохондриях.

5.1.5 Влияние ТХФ-С15 на величину параметра АДФ/О.

5.1.6 Попытка измерения ТХФ-С15 на величину мембранного потенциала митохондрий.

Раздел II. Эндогенные транспортные системы, контролирующие функционирование ТХФ-С15 (как протонофора) в митохондриях.

5.2.1 Транслокатор нуклеотидов принимает участие в транспорте ТХФ-С15 через мембрану митохондрий.

5.2.2 Переносчик фосфата в митохондриях - эндогенный регулятор объема фракции мембраносвязанных протонов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности механизма действия протонофоров с высоким сродством к мембране"

5.3.2 Механизмы стимуляции дыхания митохондрий индуцированного SkQ3.86

5.3.3 Модель ускорения дыхания митохондрий под действием SkQ3.89

5.3.4 SkQ3, также как ТХФ-С15, избирательно взаимодействует с R-протонами в митохондриях.96

5.3.5. Фосфат (также как и в случае ТХФ-С15) резко снижает ускорение дыхания митохондрий под действием SkQ3.98

5.3.6 Заключение.100

Раздел VI. Дополнительные исследования (сопоставление специфических свойств ТХФ-С15 и SkQ3).101

5.4.1 Изучение эффекта ускорения дыхания митохондрий под действием наномолярных концентраций ТХФ-С15.101

5.4.1.1 Введение.101

5.4.1.2 Разобщающее действие ТХФ-С15 в наномолярном диапазоне концентраций 101

5.4.2 Изучение эффекта ускорения дыхания митохондрий под действием наномолярных концентраций SkQ3.106

5.4.3 Заключение.110

5.4.4 Доказательство отсутствия стерических запретов для образования внутирмолекулярных циклических цвиттерионов.111

6. Выводы.115

7. Список литературы.116

1.Список сокращений

DNP ЕС

EDTA

FAD FeS

FMN

FCCP

GTP HEPES

I комплекс

II комплекс

III комплекс

IV комплекс MES

MitoQ

NAD

NPA PCP PDB

ДНФ, C6H4N2O5, 2,4-динитрофенол, 2,4-dinitrophenol Enzyme Commission number, код фермента по международной иерархической классификации

ЭДТУ,С 1 оНJ6N208, этилендиаминтетрауксусная кислота, ethylenediaminetetraacetic acid, 2,2',2",2"'-(ethane-l ,2-diyldinitrilo)-tetraacetic acid

ФАД, C27H33N9O15P2, флавинадениндинуклеотид, flavin adenine dinucleotide FeS кластер, Fe2S2, Fe3S4 или Fe4S4, железо Риске, железо-серный кластер, Rieske cluster, iron-sulfur center

ФМН, C17H21N4O9P, флавинмононуклеотид, flavin mononucleotide, riboflavin-5 '-phosphate

C10H5F3N4O, пара-трифторометокисикарбонил-цианидфенилгидразон, carbonyl cyanide-trifluoromethoxy carbonyl cyanide phenyl hydrazone ГТФ, C10H16N5O14P3, гуанозинтрифосфат, guanosine-5'-triphosphate C8H18N2O4S, ^2-гидроксиэтилпиперазин-ГчГ-2-этансульфоновая кислота, 4-(2-hydroxyethyl)-1 -piperazineethanesulfonic acid EC 1.6.5.3, NADH-дегидрогеназа, NADH убихиноноксидоредуктаза, NADH-dehydrogenase, NADH ubiquinone oxidoreductase EC 1.3.5.1, СДГ, SQR, сукцинатдегидрогеназа, сукцинат убихинон оксидоредуктаза, succinate dehydrogenase, succinate coenzyme Q reductase EC 1.10.2.2, bci-комплеке, убихинол цитохром С оксидоредуктаза, coenzyme Q cytochrome С reductase, cytochrome be 1-complex EC 1.9.3.1, цитохром С оксидаза, cytochrome С oxidase C6H13NO4S, 2-(Тч[-морфолино)-этансульфокислота, 2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid

Сз7Н4бС>4Р+, [ 10-(4,5-диметокси-2-метил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1 -ил)децил]трифенилфосфоний бромид

НАД, C21H27N7O14P2, никотинамидадениндинуклеотид, nicotinamide adenine dinucleotide

3-NPA, C3H5NO4, 3-нитропропионат, 3-nitropropionate ПХФ, C6HC150, пентахлорфенол, pentachlorophenol Protein Data Bank, база данных X-Ray структур, www.rcsb.org

Q CoQ, C59H90O4, кофермент Q, убихинон, ubiquinone, coenzyme Q

Q-цикл Q cycle, реакции, осуществляемые комплексом III ЭТЦ

SkQ ряд производные пластохинона, содержащие положительно заряженную ТРР+ группировку

SkQ 1 СзбН440гР+, [ 10-(4,5 -диметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1 ил)децил]трифенилфосфоний бромид SkQ3 Сз7Н4б02Р+, [ 10-(2,4,5-триметил-3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1 ил)децил]трифенилфосфоний бромид TCP ТХФ, СбНзСЬО, трихлорфенол, 2,4,6-trichlorophenol

ТХФ-С15 C21H33CI3O, трихлорфенол-С15, 2,4,6-трихлор-З-пентадецилфенол, 2,4,6trichloro-3 -pentadecyl-phenol ТРР+ ТФФ+, С18Н15Р+, катион трифенилфосфония, triphenylphosphonium cation

V комплекс ЕС 3.6.3.14, АТФ-синтетаза, FoFi-АТФ-синтетаза, АТФ-synthase С12ТРР катион додецилтрифенилфосфония

БЛМ бислойная липидная мембрана, lipid bilayer

БСА BSA, бычий сывороточный альбумин, bovine serum albnumin

Да Da, Дальтон, а.е.м., атомная единица массы, Dalton дитионит Na2S2C>4, натрия гидросульфит, sodiumdithionite, sodiumhydrosulfite натрия

ДТД ЕС 1.6.5.2, ДТ-диафораза, NADH хинон оксидоредуктаза 1, NQOl, DTdiaphorase, NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 пора пора временной активности, permeability transition pore цикл Кребса Krebs cycle, цикл трикарбоновых кислот, цитратный цикл, цикл лимонной кислоты, tricarboxylic acid cycle, citric acid cycle, TCA cycle ЭТЦ ETC, дыхательная электрон-транспортная цепь, electron transport chain

NEM N-этилмалеимид

АФК активированные формы кислорода

ФИТЦ флуоресцеина изотиоцианат

2. Введение

2.1 Актуальность работы

К настоящему времени достигнут значительный прогресс в понимании механизмов функционирования системы окислительного фосфорилирования митохондрий. Согласно П. Митчеллу (1) эта система способна функционировать в режиме так называемого делокализованного сопряжения, при котором дыхательные протонные помпы и система синтеза АТФ функционируют как независимые структурно-функциональные единицы. В таких условиях протонные помпы трансформируют энергию окислительных реакций в электрохимический потенциал ионов водорода на митохондриальной мембране, а АТФ-синтетаза преобразует энергию потенциала в энергию пирофосфатной связи АТФ. Эта модель в настоящее время является общепринятой. В том же 1961 году Р. Вильяме предложил модель локального сопряжения (2), согласно которой система окислительного фосфорилирования представляет собой единый мембранный комплекс, где перенос энергии (перенос ионов водорода) и система синтеза АТФ жестко объединены в структуру суперкомплекса. Основная особенность этой модели состоит в том, что переносчик энергии (ион водорода) включен в работу протонных помп и АТФ-синтетазы как структурная единица. Вторая модель, таким образом, предполагает не только функциональное, но и структурное сопряжение работы протонных помп, системы транспорта энергии и АТФ-синтетазы. Таким образом, протон, связываясь с поверхностью мембраны, образует электронейтральную кислоту Бренстеда.

В течение последних 30 лет в нашей лаборатории ведутся исследования, направленные на поиск условий, при которых реализуется механизм локального сопряжения. К настоящему времени нами было показано существование двух структурно-функциональных состояний системы окислительного фосфорилирования, одно из которых соответствует критериям механизма локального сопряжения (модели суперкомплекса), другое - модели Митчелла (3), (4). При этом было установлено, что переход между указанными состояниями регулируется системой объемной регуляции, обнаруженной в митохондриях Халестрапом (5). Этот результат показал, что модели Митчелла и Вильямса не являются абсолютно взаимоисключающими, но могут реализовываться в митохондриях при различных внешних условиях, в частности под влиянием факторов, вызывающих значительное изменение объема митохондриального матрикса. Модель Вильямса предполагает существование суперкомплекса, в составе которого транспорт энергии окислительных реакций на АТФ-синтетазный комплекс осуществляется мембраносвязанными ионами водорода, обладающими избытком свободной энергии. В наших исследованиях использовался качественно новый путь идентификации фракции мембраносвязанных ионов водорода, выполняющих роль переносчика энергии на АТФ-синтетазу. Ранее формирование фракции неравновесно связанных кислот Бренстеда на поверхности мембраны митохондрий в условиях работы протонных помп было обнаружено в нашей лаборатории с помощью катализаторов, которые ускоряют диссоциацию этих кислот, усиливая отрыв неравновесно связанных протонов с поверхности мембран функционирующих митохондрий. Катализаторы снижают активность ионов водорода на поверхности мембраны, увеличивая тем самым отрицательный заряд поверхности. Оба параметра регистрировали либо с помощью ковалентно пришитого к мембранам рН-зонда (6), (7), либо по изменению ^-потенциала мембран митопластов (4) и митохондрий (8). В последнем случае эффект образования фракции неравновесно связанных ионов водорода при включении протонных помп удается наблюдать без использования катализатора.

Для исследования было синтезировано производное фенола - 2,4,6-трихлор-З-пентадецилфенол (ТХФ-С15) (Рис. 1), обладающее (на 7,5 порядков) большим сродством к мембране, чем его структурный аналог 2,4,6-трихлорфенол (ТХФ) и на 6 порядков больше чем известный классический разобщитель - пентахлорфенол (схему синтеза и доказательство строения можно посмотреть в работе (9)). свойствами потенциально физиологически активного мембранотропного гидрохинона БкС)3, который обладает высоким сродством к мембране.

Из приведенной структуры ТХФ-С15 видно, что эта молекула может двумя принципиально разными способами воздействовать на ионную проницаемость мембран. Во-первых - присутствие фенольной группировки, определяющей протонофорные свойства этого соединения. Во-вторых - высокая поверхностная активность вещества, которая он

Изучение этого соединения проводилось параллельно с изучением классических разобщителей ТХФ и ПХФ. Свойства этого соединения были сопоставлены со классических

Рис. 1. Структура ТХФ-Сц (2,4,6-трихлор-З-пентадецилфенол). определяется сочетанием в структуре молекулы полярной гидроксильной группы и длинного углеводородного гидрофобного фрагмента. Первый этап изучения этого соединения как вещества, стимулирующего дыхание митохондрий, был проведен в лаборатории на высоких концентрациях (10-320 мкМ), при которых может проявляться свойство ТХФ-С15 как детергента. В настоящей работе систематически исследована концентрационная зависимость действия ТХФ-С15. Основное внимание уделено изучению действия низких и очень низких концентраций ТХФ-С15 (1 мкМ - 1 нМ), при которых вероятность проявления детергентных свойств данного соединения сведена к минимуму. Протонофорные свойства ТХФ-С15 были продемонстрированы в экспериментах на модели БЛМ.

2.2 Цель данной работы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Еремеев, Сергей Андреевич

6. Выводы

2. На митохондриях показано, что ТХФ-С15 стимулирует дыхание митохондрий в состоянии два по Чансу.

5. Показано, что транспорт ТХФ-С15 в митохондриях на 60-75% осуществляет переносчик адениновых нуклеотидов.

7. Проведено сопоставление разобщающих свойств ТХФ-С15 и гидрохинона ряда 8к<3 (БкдЗНг). На митохондриях установлено качественное сходство этих соединений как протонофоров.

5.4.3 Заключение

Также в этой главе мы проверили возможность ускорения дыхания митохондрий под действием наномолярных концентраций SkQ3. На проведение этих экспериментов нас натолкнула схожесть эффектов ТХФ-С15 и SkQ3 в микромолярном диапазоне концентраций, вследствие чего можно было ожидати схожести эффектов и в наномолярном диапазоне концентраций. Кроме того, как уже было сказано в пункте 3.5 данной работы SkQl оказывает биологически активное действие в наномолярных концентрациях ( (108), (109), (110), (111), (112), (100)), а в некоторых случаях даже и в пикомолярных (99), (101). Отсюда встал логичный вопрос, может ли в какой-то степени это действие объясняться разобщающей активностью данных соединений, даже в столь низких концентрациях.

Ускорения дыхание митохондрий под действиемБкОЗ удалось зарегистрировать на всем диапазоне наномолярных концентраций. В частности, было показано, что внесение в среду инкубации катализатора HEPES резко снижает эффект SkQ3. Также показано, что, как и в случае с ТХФ-С)5, внесение в среду неорганического фосфата приводит к значительному снижению эффекта ускорения дыхания SkQ3. После сравнения данных экспериментов, проведенных в нано- и микромолярных диапазонах, стало ясно, что механизм разобщающего действия SkQ3 при различных концентрациях один и тот же.

5.4.4 Доказательство отсутствия стерических запретов для образования внутирмолекулярных циклических цвиттерионов

На первых этапах работы нам было необходимо показать отсутствие серьезных стерических запретов, препятствующих превращению анионов гидрохинонов соединений ряда SkQ в циклические цвиттерионы. Для этой цели была проведена MALDI спектрометрия хлоридов гидрохинонов рассматриваемых соединений. Для удобства дальнейшего описания введем ряд обозначений. MitoQ обозначим как соединение I, SiQl - II, SkQ3 - III, гидрохиноны соответственно 1а, Па и Illa. В MALDI спектрах хлоридов гидрохинонов Ia-IIIa (для каждого вещества) были обнаружены четыре группы производных с одинаковым скелетом молекулы, которые представлены в Таблица. 7. Структуры в группах 1 и 4 были определены в рамках принципа минимальности гипотез и предположения, согласно которому в реакцию вступают в первую очередь наименее прочные О-Н связи в группах гидрохинонов, а также Р+ -CF связи. Как видно из таблицы (Таблица. 7), соединения в группах 1 и 4 не содержат массы атома хлора, они имеют положительный заряд. Молекулярные массы соединений в группе 4 соответствуют массам гидрохинонов (Ia-IIIa), а в группе 1 - массам хинонов (I—III), которые, очевидно, образуются при изомеризации бирадикала гидрохинона. Фракции катионов (группы 1 и 4), в которых ион фосфония экранирован ионом хлора, не имеют заряда и не видны в спектрах. С другой стороны, нейтральные моноанион радикалы (Таблица. 7, группа 2) видны на спектрах только в виде хлоридов, которые придают молекулам избыточный отрицательный заряд. Теоретически казалось возможным обнаружить в MALDI спектрах отрицательно заряженные циклические цвиттерионы, образованные дианионами гидрохинонов Ia-IIIa, в которых, в отличие от соединений группы 2, положительный заряд фосфоний катиона экранирован одним из отрицательных зарядов дианиона гидрохинона; в таких молекулах должна отсутствовать масса аниона хлора. 2

Рис. 85. MALDI спектры соединений, которым приписана структура циклических форм цвиттерионов, образовавшихся из гидрохинонов la, Illa. Спектр 1 - производное SkQ3 т=550,7; производное MitoQ, т=582, 7. Пики 1а, 2а массы соответствующих изотопов

Однако нам не удалось достоверно установить образование отрицательно заряженных молекул, массы которых соответствовали бы таким структурам. Это, скорее всего, связано с крайне низкой вероятностью образования дианионов гидрохинонов в условиях MALDI эксперимента. В то же время в эксперименте были обнаружены отрицательно заряженные соединения, которые, как и ожидалось, не содержали массы хлора (Таблица. 7 группа 3 и Рис. 85).

Однако у этих веществ масса молекулы была не на две, а на три единицы меньше масс соответствующих гидрохинонов. Это говорит о том, что предполагаемый циклический цвиттерион должен быть образован не дианионом гидрохинона, а дианионом семихинона (см. группу 3). Плодотворной оказалась схема (Рис. 86), согласно которой наблюдаемый цвиттерион образуется при циклизации таутомерных форм (б и в), возникающих из анион-радикала (а). Такая схема позволила с единой точки зрения объяснить образование и соединений группы 3, и соединений группы 2 (см. Таблица. 7), основываясь на эффекте таутомерии соответствующих семихиноиов (а-г). Согласно этой схеме, образование соединений группы 2 и группы 3 (Таблица. 7) происходит, по-видимому, в процессе конкуренции между анионом хлора и дианионом радикала (Рис. 86, г) за взаимодействие с катионом фосфония. Кроме того, можно видеть, что данная схема основана на реакции таутомеризации семихинонов и поясняет путь образования циклического дианион-радикала (таблица 1, группа 3).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Еремеев, Сергей Андреевич, Москва

1. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 1961, Vol. 191, pp. 144-148.

2. R.J., Williams. Possible functions of chain of catalysists. Journal of theoretical biology. 1961, Vol. 1, l,pp. 1-17.

3. Yaguzhinsky L.S., Boguslavsky L.I., Volkov A.G., Rakhmaninova A.B. Synthesis of ATP coupled with action of membrane protonic pumps at the octane-water interface. Nature. 1976, Vol. 259, 5543, pp. 494-496.

4. Моисеева B.C., Мотовилов K.A., Лобышева H.B., Орлов B.H., Ягужинский JI.C.

5. Образование метастабильной связи ионов водорода с поверхностью митопластов. Доклады академии наук. 2011, Vol. 438, 4, pp. 555-558 .

6. Halestrap А.Р., Quinlan P.T., Whipps D.E., Armst A.E. Regulation of the mitochondrial matrix volume in vivo and in vitro. The role of calcium. Biochem J. 1986, Vol. 236, pp. 779-787.

7. Yurkov V.I., Fadeeva M.S., Yaguzhinsky L.S. Proton transfer through the membrane-water interfaces in uncoupled mitochondria. Biochemistry (Moscow). 2005, Vol. 70, 2, pp. 195-199.

8. Yaguzhinsky L.S., Yurkov V.I., Krasinskaya I.P. On the localized coupling of respiration and phosphorylation in mitochondria. Biochimica et biophysica acta. 2006, Vol. 1757, (5-6), pp. 408414.

9. Ченцов, Ю.С. Введение в клеточную биологию. Четвертое издание. Москва : ИКЦ «Академкнига», 2005.

10. Геннис, Р. Биомембраны. Молекулярная структура и функции. Москва : Мир, 1997.

11. Halestrap, А.Р. The regulation of the matrix volume of mammalian mitochondria in vivo and in vitro and its role in the control of mitochondrial metabolism. Biochimica et biophysica acta. 1989, Vol. 973, 3, pp. 355-382.

12. Lehninger, A. Principles of biochemistry. 4th ed. s.l. : Oxford: Freeman, 2004.

13. Кольман Я., Рем К-Г. Наглядная биохимия. Второе издание, s.l. : Москва: Мир, 2004.

14. Bushnell G.W., Louie G.V., Brayer G.D. High-resolution three-dimensional structure of horse heart cytochrome c. Journal of molecular biology. 1990, Vol. 214, 2, pp. 585-595.

15. Sun F., Huo X., Zhai Y., Wang A., Xu J., Su D., Bartlam M., Rao Z. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 2005, Vol. 121, 7, pp. 1043-1057.

16. Belevich I., Wikstrom M. Complexes I and IV of respiratory chain. http://www. biocenter. helsinki.fi/bi/hbg/hbgresearch. html. Online.

17. Lind C., Cadenas E., Hochstein P., Ernster L. DT-diaphorase: Purification, properties, and function. Methods in enzymology. . 1990, Vol. 186, pp. 287-301.

18. Yaguzhinsky L.S., Smirnova E.G., Ratnikova L.A., Kolesova G.M., Krasinskaya I.P.

19. Hydrophobic sites of the mitochondrial electron transfer system. Journal of bioenergetics and biomemebranes. 1973, Vol. 5, 3, pp. 163-174.

20. Asher G., Dym O., Tsvetkov P., Adler J., Shaul Y. The crystal structure of NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 in complex with its potent inhibitor dicoumarol. Biochemistry. 2006, Vol. 45, 20, pp. 6372-6378.

21. Chance В., Williams G.R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation. . Advances in enzymology and related subjects of biochemistry. 1956, Vol. 17, pp. 65-134.

22. Green D.E., Tzagoloff A. The mitochondrial electron transfer chain. Archives of biochemistry and biophysics. 1966, Vol. 116, pp. 293-304.

23. Walker J.E. The NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) of respiratory chains. Quarterly reviews of biophysics. 1992, Vol. 25, 3, pp. 253-324.

24. Yagi T.,Matsuno-Yagi A. The proton-translocating NADH-quinone oxidoreductase in the respiratory chain: the secret unlocked. Biochemistry. 2003, Vol. 42, pp. 2266-2274.

25. Carroll J., Fearnley I.M., Skehel J.M., Shannon R.J., Hirst J., Walker J.E. . Bovine complex I is a complex of 45 different subunit. The Journal of biological chemistry. 2006, Vol. 281, 43, pp. 32724-32727.

26. Sazanov L.A., Hinchliffe P. Structure of the hydrophilic domain of respiratory complex I from Thermus thermophilus. Science. 2006, Vol. 311, 5766, pp. 1430-1436.

27. Ohnishi T. Iron-sulfur clusters/semiquinones in complex I. Biochimica et biophysica acta. 1998, Vol. 1364, 2, pp. 186-206.

28. Balaban R.S., Nemoto S., Finkel T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 2005, Vol. 120, 4, pp. 483-495.

29. Kudin A.P., Bimpong-Buta N.Y., Vielhaber S., Elger C.E., Kunz W.S. Characterization of superoxide-producing sites in isolated brain mitochondria. The Journal of biological chemistry. 2004, Vol. 279, 6, pp. 4127-4135.

30. Schapira, A.H. Human complex I defects in neurodegenerative diseases. Biochimica et biophysica acta. 1998, Vol. 1364, 2, pp. 261-270.

31. Lancaster C.R., Kroger A. Succinate: quinone oxidoreductases: new insights from X-ray crystal structures. Biochimica et biophysica acta. 2000, Vol. 1459, 2-3, pp. 422-431.

32. Hagerhall, C. Succinate: quinone oxidoreductases. Variations on a conserved theme. Biochimica et biophysica acta. 1997, Vol. 1320, 2, pp. 107-141.

33. Lemire B.D., Oyedotun K.S. . The Saccharomyces cerevisiae mitochondrial succinate:ubiquinone oxidoreductase. Biochim Biophys Acta. 2002, Vol. 1553, pp. 102-116.

34. Oyedotun K.S., Lemire B.D. The Saccharomyces cerevisiae succinate dehydrogenase anchor subunit, Sdh4p: mutations at the C-terminal lys-132 perturb the hydrophobic domain. Biochim Biophys Acta. 1999, Vol. 1411, pp. 170-179.

35. Yankovskaya V., Sablin S.O., Ramsay R.R., Singer T.P., Ackrell B.A., Cecchini G., Miyoshi H. . Inhibitor probes of the quinone binding sites of mammalian complex II and Escherichia coli fumarate reductase. J Biol Chem . 1996, Vol. 271, pp. 21020-21024.

36. Ohnishi T., Trumpower B.L. . Differential effects of antimycin on ubisemiquinone bound in different environments in isolated succinate . cytochrome c reductase complex. J Biol Chem . 1980, Vol. 255, pp. 3278-3284.

37. Rich, P.R. Electron and proton transfers through quinones and cytochrome be complexes. Biochimica et biophysica acta. 1984, Vol. 768, 1, pp. 53-79.

38. Mitchell, P. The protonmotive Q cycle: a general formulation. FEBS letters. 1975, Vol. 59, 2, pp. 137-139.

39. Robertson D.E., Prince R.C., Bowyer J.R., Matsuura K., Dutton P.L., Ohnishi T.

40. Thermodynamic properties of the semiquinone and its binding site in the ubiquinol-cytochrome с (c2) oxidoreductase of respiratory and photosynthetic systems. J Biol Chem. 1984, Vol. 259, pp. 1758-1763.

41. Covian R., Trumpower B.L. Regulatory interactions in the dimeric cytochrome bc(l) complex: the advantages of being a twin. Biochim Biophys Acta. 2008, Vol. 1777, pp. 1079-1091.

42. Brzezinski P., Adelroth P. Pathways of proton transfer in cytochrome с oxidase. Journal of bioenergetics and biomembranes. 1998, Vol. 30, 1, pp. 99-107.

43. LaNoue K.F., Duszynski J. Kinetic studies of ATP synthase: the case for the positional change mechanism. Journal of bioenergetics and biomembranes. 1992, Vol. 24, 5, pp. 499-506.

44. Rubinstein J.L., Walker J.E., Henderson R. Structure of the mitochondrial ATP synthase by electron cryomicroscopy. The EMBO journal. 2003, Vol. 22, 23, pp. 6182-6192.

45. Северин E.C. Биохимия. Второе издание. Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2004.

46. Rastogi V.K., Girvin М.Е. . Structural changes linked to proton translocation by subunit с of the ATP synthase. Nature. 1999, Vol. 402, 6759, pp. 263-268.

47. Gibbons C., Montgomery M.G., Leslie A.G., Walker J.E. The structure of the central stalk in bovine F(l)-ATPase at 2.4 A resolution. Nature structural biology. 2000, Vol. 7, 11, pp. 10551061.

48. Wilkens S., Borchardt D., Weber J., Senior A.E. . Structural characterization of the interaction of the delta and alpha subunits of the Escherichia coli F1F0-ATP synthase by NMR spectroscopy. Biochemistry. 2005, Vol. 44, 35, pp. 11786-11794.

49. Del Rizzo P.A., Bi Y., Dunn S.D., Shilton B.H. The "second stalk" of Escherichia coli ATP synthase: structure of the isolated dimerization domain. Biochemistry. 2002, Vol. 41, 21, pp. 68756884.

50. Lipmann F. Currents in Biochemical Research, ed. Green D.E. New York : Wiley (Intersciens), 1946. p. 137.

51. Slater, E.C. Mechanism of phosphorylation in the respiratory chain. Nature. 1953, Vol. 172, pp. 975-978.

52. Mitchell P., Moyle J. Group-translocation: a consequence of enzyme-catalysed group-transfer. Nature. 1958, Vol. 182, pp. 372-373.

53. Neumann J., Jagendorf A.T. Light-Induced Ph Changes Related Phosphorylation by Chloroplasts. Arch Biochem Biophys. 1964, Vol. 107, pp. 109-119.

54. Mitchell P, Moyle J. Respiration-driven proton translocation in rat liver mitochondria. The Biochemical journal. 1967, Vol. 105, 3, pp. 1147-1162.

55. Mitchell P., Moyle J. Evidence discriminating between the chemical and the chemiosmotic mechanisms of electron transport phosphorylation. Nature. 1965, Vol. 208, 5016, pp. 1205-1206.

56. Mitchell P., Moyle J. . Stoichiometry of proton translocation through the respiratory chain and adenosine triphosphatase systems of rat liver mitochondria. Nature. 1965, Vol. 208, pp. 147-151.

57. Levitskii D.O., Skulachev V.P. Effects of penetrating synthetic ions on the respiration of mitochondria and submitochondrial particles. Mol Biol. 1972, Vol. 6, pp. 267-272.

58. Mitchell P., Moyle J. Proton translocation coupled to ATP hydrolysis in rat liver mitochondria. Eur J Biochem . 1968, Vol. 4, pp. 530-539.

59. Kagawa Y., Kandrach A., Racker E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XXVI. Specificity of phospholipids required for energy transfer reactions. J Biol Chem . 1973, Vol. 248, pp. 676-684.

60. Nicholls D.G. The influence of respiration and ATP hydrolysis on the proton-electrochemical gradient across the inner membrane of rat-liver mitochondria as determined by ion distribution. Eur J Biochem. 1974, Vol. 50, pp. 305-315.

61. Jagendorf A.T., Uribe E. . ATP formation caused by acid-base transition of spinach chloroplasts. Proc Natl Acad Sci USA . 1966, Vol. 55, pp. 170-177.

62. Moyle J., Mitchell P. . Active/inactive state transitions of mitochondrial ATPase molecules influenced by Mg2+, anions and aurovertin. FEBS Lett. 1975, Vol. 56, pp. 55-61.

63. Chappell J.B. Systems used for the transport of substrates into mitochondria. Br Med Bull. 1968, Vol. 24, pp. 150-157.

64. Mitchell P.,Moyle J. Translocation of some anions cations and acids in rat liver mitochondria. Eur J Biochem. 1969, Vol. 9, pp. 149-155.

65. Liberman E.A., Skulachev V.P. Conversion of biomembrane-produced energy into electric form. IV. General discussion. Biochim Biophys Acta. 1970, Vol. 216, pp. 30-42.

66. Drachev L.A., Jasaitis A.A., Mikelsaar H., Nemecek I.B., Semenov A.Y., Semenova E.G., Severina II, Skulachev V.P. Reconstitution of biological molecular generators of electric current. H+-ATPase. J Biol Chem. 1976, Vol. 251, pp. 7077-7082.

67. Massari S., Azzone G.F. The mechanism of ion translocation in mitochondria. 2. Active transport and proton pump. Eur JBiochem. 1970, Vol. 12, pp. 310-318.

68. Racker E., Kandrach A. Reconstitution of the third site of oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 1971, Vol. 246, pp. 7069-7071.

69. Mitchell, P. Chemiosmotic Coupling in Oxidative and Photosynthetic Phosphorylation. Bodmin : Glynn Research Ltd., 1966.

70. Kell D.B. On the functional proton current pathway of electron transport phosphorylation. An electrodic view. Biochim Biophys Acta. 1979, Vol. 549, pp. 55-99.

71. Rottenberg H. The measurement of transmembrane electrochemical proton gradients. J Bioenerg. 1975, Vol. 7, pp. 61-74.

72. Mitchell, P. A chemiosmotic molecular mechanism for proton-translocating adenosine triphosphatases. FEBS Lett. 1974, Vol. 43, 2, pp. 189-94.

73. Бойер П.Д. Новые гипотезы о механизмах фосфорилирования и передачи энергии в мышцах и митохондриях. Сб. Молекулярная биология. 1964, р. 227.

74. Николе Д. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. Москва : Мир, 1985.

75. Sokolov V. S., Kuzmin V.G. Measurement of differences in the surface potentials of bilayer membranes according to the second harmonic of a capacitance current. Biofizika. 1980, Vol. 25, 1, pp. 170-172.

76. Antonenko Y.N., Kovbasnjuk O.N., Yaguzhinsky L.S. Evidence in favor of the existence of a kinetic barrier for proton transfer from a surface of bilayer phospholipid membrane to bulk water. Biochimica et biophysica acta. 1993, Vol. 1150, 1, pp. 45-50.

77. Krasinskaya I.P., Lapin M.V., Yaguzhinsky L.S. Detection of the local H+ gradients on the internal mitochondrial membrane. FEBS letters. 1998, Vol. 440, 1-2, pp. 223-225.

78. Solodovnikova I.M., Iurkov V.I., Ton'shin A.A., Iaguzhinskiï L.S. Local coupling of respiration processes and phosphorylation in rat liver mitochondria. Biofizika. 2004, Vol. 49, 1, pp. 47-56.

79. Kovbasnjuk O.N., Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S. Proton dissociation from nigerisin at the membrane-water interface, the rate-limiting step of K'/W exchange on the bilayer lipid membrane. FEBS Lett. 1991, Vol. 289, 2, pp. 176-178.

80. Андреев А.Ю., Кушнарева Ю.Е., Старков A.A. Метаболизм активных форм кислорода в митохондриях. Биохимия. 2005, Vol. 70, 2, pp. 246-264.

81. Shimizu К., Wu G.S., Sultana С., Kalra V.K., Rao N.A. Stimulation of macrophages by retinal proteins: production of reactive nitrogen and oxygen metabolites. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1999, Vol. 40, 13, pp. 3215-3223.

82. Skulachev, V.P. A biochemical approach to the problem of aging: "megaproject" on membrane-penetrating ions. The first results and prospects. Biochemistry (Moscow). 2007, Vol. 72, 12, pp.1385-1396.

83. Chen Q., Vazquez E.J., Moghaddas S., Hoppel C.L., Lesnefsky E.J. Production of reactive oxygen species by mitochondria. J. Biol. Chem. 2003, Vol. 278, 38, pp. 36027-36031.

84. Fluery C., Mignotte В., Vayssiere J.L. Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling. Biochimie. 2002, Vol. 84, 2-3, pp. 131-141.

85. Forman H.J., Fukuto J.M., Torres M. Redox signaling: thiol chemistry defines which reactive oxygen and nitrogen species can act as second messengers. Am. J.Physiol. Cell. Physiol. 2004, Vol. 287, pp. 246-256.

86. Moskovitz J., Berlett B.S., Poston J.M., Stadtman E.R. The yeast peptide-methionine sulfoxide reductase functions as an antioxidant in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997, Vol. 94, pp. 9585-9589.

87. C.K., Sen. Redox signaling and the emerging therapeutic potential of thiol antioxidants. Biochem Pharmacol. 1998, Vol. 55, 11, pp. 1747-1758.

88. Быстрова М.Ф., Буданова E.H. Перекись водорода и пероксиредоксины в редокс-регуляции внутриклеточной сигнализации . Биологические мембраны. 207, Vol. 24, 2, pp. 115125.

89. Ohba М., Shibanuma М., Kuroki Т., Nose К. Production of hydrogen peroxide by transforming growth factor-beta 1 and its involvement in induction of egr-1 in mouse osteoblastic cells. J. Cell. Biol. 1994, Vol. 126, 4, pp. 1079-1088.

90. Murphy M.P., Smith R.A. Targeting antioxidants to mitochondria by conjugation to lipophilic cations. Annual review of pharmacology and toxicology. 2007, Vol. 47, pp. 629-656.

91. Asin-Cayuela J., Manas A.R., James A.M., Smith R.A., Murphy M.P. Fine-tuning the hydrophobicity of a mitochondria-targeted antioxidant. FEBS letters. 2004, Vol. 571, (1-3), pp. 916.

92. Кравченко Д.В., Усков А.И., Замятнин А.А. . Оптимизация процесса получения оздоровленных микрорастений картофеля из меристематических эксплантов с использованием препарата SkQl. Москва : s.n., 2008. pp. 330-337.

93. Рейвн П., Эверт Р., Айкхорн С. Современная ботаника. Москва : Мир, 1990. Vol. 2.

94. Kotlyar А.В., Vinogradov A.D. . Interaction of the membrane-bound succinate dehydrogenase with substrate and competitive inhibitors. Biochim. Biophys. Acta. 1984, Vol. 784, pp. 24-34.

95. Peshenko I.V., Shichi H. Oxidation of active center cysteine of bovine 1-Cys peroxiredoxin to the cysteine sulfenic acid form by peroxide and peroxynitrite. Free. Radic. Biol. Med. . 2001, Vol. 31,3, pp. 292-303.

96. Kramer, R. . Mitochondrial carrier proteins can reversibly change their transport mode: the cases of the aspartate/glutamate and the phosphate carrier. Exp. Physiol. . 1998, Vol. 83, pp. 259265.

97. Еремеев С.А., Мотовилов К.А., Волков E.M., Ягужинский JI.С. Новый представитель класса мембранотропных разобщителей SkQ3. Биологические мембраны. 2011, Vol. 28, 5, pp. 339-345.

98. Каргин В.И., Мотовилов К.А., Высоких М.Ю., Ягужинский Л.С. Взаимодействие положительно заряженного аналога убихинона (MitoQIO) с ДТ-диафоразой митохондрий печени. . Биологические мембраны. 2008, Vol. 25, pp. 34-40.

99. Skulachev V.P. et. al. . An attempt to prevent senescence: a mitochondrial approach. Biochimica et biophysica acta. 2009, Vol. 1787, (5), pp. 437-461.

100. Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives as tools to interrupt execution of the aging program. 4. Age-related eye disease. SkQl returns vision to blind animals. Neroev VV. 12, 2008, Biochemistry (Moscow), Vol. 73, pp. 1317-1328.

101. Антоненко Ю.Н. и др. Производное пластохинона, адресованное в митохондрии, как средство, прерывающее программу старения. 1. Катионные производные пластохинона: синтез и исследование in vitro. . Биохимия (Моска). . 2008, Vol. 73, 12, pp. 1589-1606.

102. Murugova T.N., Gordeliy V.I., Islamov A.K., Kovalev Y.S., Kuklin A.I., Vinogradov A.D., Yaguzhinsky L.S. Structure of membrane of submitochondrial particles studied by small angle neutron scattering. Materials structure. 2006, Vol. 2, pp. 68-70.

103. Mulkidjanian A.Y., Heberle J., Cherepanov D.A. . Protons and interfaces: implications for biological energy conversion. Biochimica et biophysica acta. 2006, Vol. 1757, (8), pp. 913-930.

104. Haberer G., Kieber J.J. Cytokinins. New insights into a classic phytohormone. Plant physiology. 2002, Vol. 128, 2, pp. 354-362.

105. Johnson D., Lardy H. Isolation of liver or kidney mitochondria. Methods in enzymology. 1967, Vol. 10, pp. 94-96.

106. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of biological chemistry. 1951, Vol. 193, 1, pp. 265-275.

107. R.W., Estabrook. Mitochondrial respiratory control and the polarographic measurement of ADP.O ratios. Methods in enzymology. 1967, Vol. 10, pp. 41-47.

108. Ryrie I.J., Jagendorf A.T. Correlation between a conformational change in the coupling factor protein and the high energy state in chloroplasts. J Biol Chem. 1972, Vol. 247, 14, pp. 44539.

109. Moroney J.V., McCarty R.E. Reversible uncoupling of photophosphorylation by a new bifunctional maleimide. J Biol Chem. 1979, Vol. 254, 18, pp. 8951-5.

110. Gasch A.P., Spellman P.T., Kao C.M., Carmel-Harel O., Eisen M.B., Storz G., Botstein D., Brown P.O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 2000, Vol. 11, 12, pp. 4241-4257.

111. Zheng M., Aslund F., Storz G. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation. Science. 1998, Vol. 279, 5357, pp. 1718-1721.

112. Na H.K., Surh Y.J. Transcriptional regulation via cysteine thiol modification: a novel molecular strategy for chemoprevention and cytoprotection. Mol Carcinog. 2006, Vol. 45, 6, pp. 368-380.

113. Wu R.F., Terada L.S. Oxidative modification of protein tyrosine phosphatases. Sci STKE. 2006, Vol. 2006, 332.

114. Werner E. GTPases and reactive oxygen species: switches for killing and signaling. J. Cell. Sci. 2004, Vol. 117, 2, pp. 143-153.

115. Wood Z.A., Poole L.B., Karplus P.A. Peroxiredoxin evolution and the regulation of hydrogen peroxide signaling. Science. 2003, Vol. 300, 5619, pp. 650-653.

116. Butterfield L.H., Merino A., Golub S.H., Shau H. From cytoprotection to tumor suppression: the multifactorial role of peroxiredoxins. Antioxid. Redox. Signal. 1999, Vol. 1, 4, pp. 385-402.

117. Bae Y.S., Kang S.W., Seo M.S., Baines I.C., Tekle E., Chock P.B., Rhee S.G. Epidermal growth factor (EGF)-induced generation of hydrogen peroxide. Role in EGF receptor-mediated tyrosine phosphorylation. J. Biol. Chem. 1997, Vol. 272, 1, pp. 217-221.

118. Lee S.R., Kwon K.S., Kim S.R., Rhee S.G. Reversible inactivation of protein-tyrosine phosphatase IB in A431 cells stimulated with epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 1998, Vol. 273, 25, pp. 15366-15372.

119. Sattler M., Winkler T., Verma S., Byrne C.H., Shrikhande G., Salgia R., Griffin J.D.

120. Hematopoietic growth factors signal through the formation of reactive oxygen species. Blood. 1999, Vol. 93,9, pp. 2928-2935.

121. Belmonte M.A., Santos M.F., Kihara A.H., Yan C.Y., Hamassaki D.E. Light-Induced photoreceptor degeneration in the mouse involves activation of the small GTPase Racl. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006, Vol. 47, 3, pp. 1193-1200.

122. Deshpande S.S., Qi B., Park Y.C., Irani K. Constitutive activation of racl results in mitochondrial oxidative stress and induces premature endothelial cell senescence. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2003, Vol. 23, 1, pp. 1-6.

123. Hordijk, P.L. Regulation of NADPH oxidases: the role of Rac proteins. Circ. Res. 2006, Vol. 98, 4, pp. 453-462.

124. Puceat, M. Role of Rac-GTPase and reactive oxygen species in cardiac differentiation of stem cells. Antioxid. Redox. Signal. 2005, Vol. 7, 11-12, pp. 1435-1439.

125. Kulinsky VI, Kolesnichenko LS. Regulation of metabolic and energetic functions of mitochondria by hormones and signal transduction systems. Biochemestry (Moscow) Supplemental series B: Biomedical chemistry. 2007, Vol. 1, 2, pp. 95-113.

126. Krasinskaya I.P., Marshansky V.N., Dragunova S.F., Yaguzhinsky L.S. Relationships of respiratory chain and ATP-synthetase in energized mitochondria. FEBS Lett. 1984, Vol. 167, 1, pp. 176-180.

127. Yaguzhinsky L.S., Yurkov V.I., Krasinskaya I.P. On the localized coupling of respiration and phosphorylation in mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta. 2006, Vol. 1757, pp. 408414.

128. Neroev V.V. Mitochondria-targeted plastoquinone derivatives as tools to interrupt execution of the aging program. 4. Age-related eye disease. SkQl returns vision to blind animals. Biochemistry (Moscow). 2008, Vol. 73, 12, pp. 1317-1328.

Информация о работе

Еремеев, Сергей Андреевич
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Особенности механизма действия протонофоров с высоким сродством к мембране - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы