Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных металлов

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Особенности комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных металлов"



На правах рукописи

Грошева Валентина Ивановна

ОСОБЕННОСТИ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ

ТЕТРАЦИКЛИНА С ИОНАМИ РЕДКОЗЕМЕЛЬНЫХ МЕТАЛЛОВ

Специальность 03.00.02 Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 2006

Работа выполнена в Институте радиотехники и электроники РАН.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Золин Владислав Фёдорович

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор Петрова Галина Петровна

доктор физико-математических наук, старший научный сотрудник Нечипуренко Юрий Дмитриевич

Ведущая организация:

Центр фотохимии РАН

Защита состоится « // » РЛ/яМрЛЪЪЬ г. в /Р.00 ч. на заседании Специализированного Совета К 501.001.08 в Московском государственном университете им.М.В. Ломоносова по адресу: 119992, ГСП-2, г.Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова, физический факультет, аудитория №519.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «_ // » сентября 2006 г.

Ученый секретарь Специализированного, при МГУ им. М.В.Л"^ доктор физико-мат!

Г.Б.Хомутов

г> моси«^-..-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Исследование специфичности связывания ионов металлов с биоорганическими молекулами является актуальным направлением современной биофизики и ряда смежных наук. Комплексные соединения ионов металлов являются непосредственными участниками целого ряда процессов, протекающих в живых организмах. Они играют центральную роль в переносе кислорода и углекислого газа, участвуют в процессе электронного транспорта в хлоропластах и в митохондриях, в ферментативном катализе и во множестве других процессов. Присутствие катионов металлов в водной фазе влияет на физико-химические свойства, фазовое состояние биомембран и их компонент, сказывается на регуляции работы ферментов. Научное обоснование селективности связывания ионов металлов с биологическими молекулами важно для более глубокого понимания закономерностей организации живой материи, разгадки молекулярных механизмов процессов самосборки, самоорганизации и самовоспроизведения структур, характерных для разнообразных биосистем. С другой стороны, результаты исследования селективности связывания биоорганических молекул с ионами металлов в перспективе могли бы быть использованы для разработки чувствительных биосенсоров.

Особый научный и практический интерес представляет исследование молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов.

Фармакологическая активность лекарственных препаратов определяется не только их химической структурой, но и состоянием функциональных групп, определяемым как взаимодействием молекул препарата с растворителем, так и друг с другом. При специфическом связывании этих молекул с клетками-мишенями, особую роль играет копформация молекул, которая может изменяться, например, при взаимодействии молекул препарата с двух и трёхзарядными ионами металлов. Одним из традиционных методов исследования конформации молекул является метод кругового дихроизма,

1

который позволяет следить за кинетикой конформационных перестроек молекул в растворе (при наличии полос поглощения в видимой или ультрафиолетовой областях спектра).

Объест исследования

Междисциплинарным объектом нашего исследования является молекула тетрациклина. С одной стороны — это биомолекула, оказывающая воздействие на биосинтез белка в бактериальных клетках, и поэтому представляющая интерес для биологов, медиков и фармацевтов. С другой -это достаточно стабильная мезомолекула, имеющая молекулярный размер, промежуточный между размерами малых органических молекул и макромолекул, и уникальное химическое строение, благодаря которому её можно использовать, например, в качестве биосенсора.

Предмет исследования

Предметом исследования диссертационной работы является изучение особенностей комплексообразования тетрациклина с ионами лантанидов. Интерес к комплексным соединениям тетрациклина с ионами редкоземельных металлов связан с тем обстоятельством, что эти катионы обладают сродством к кальций-связывающим центрам белков, мембран, протеолипидов, причём константы связывания с лантанидами намного выше, чем с кальцием. Это свойство редкоземельных катионов послужило основанием для разработки ныне широко применяемого на практике метода редкоземельного спектроскопического зондирования биомолекул, базирующегося на гипотезе эквивалентности мест связывания лантанидов и кальция. По изменениям спектральных характеристик комплексных соединений, активированных лантанидами, делаются соответствующие выводы о строении мест связывания с ионами кальция или магния. Ионы редкоземельных металлов, несмотря на то, что являются абиотичными, находят применение в медицине в качестве диагностических средств, благодаря своим уникальным оптическим и магнитным свойствам. Катионы европия успешно используются в качестве

2

люминесцентных зондов, катионы гадолиния применяют при магнитно-резононансной рентгенографии в качестве контрастных агентов. Изучается влияние катионов гадолиния на пролиферацию и подвижность некоторых опухолевых клеток. Таким образом, исследование комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных элементов имеет важное научное и прикладное значение.

Степень научной разработанности проблемы

Тетрациклин и его производные успешно применяются в медицинской практике в качестве лекарственных препаратов. Тетрациклин хорошо проникает сквозь клеточные мембраны бактерий, связывается с рибосомами, оказывая ингибирующий эффект на синтез бактериальных белков. Установлено, что он может взаимодействовать и с митохондриями бактериальных клеток. Максимум антибактериальной активности гидрохлорид тетрациклина проявляет при слабокислом значении pH, равном 5,5. Остается открытым вопрос - чем всё-таки обусловлена селективность действия тетрациклина на клетки микроорганизмов, почему происходит увеличение проницаемости

бактериальных мембран для тетрациклина по сравнению с мембранами клеток млекопитающих? По этому поводу существует две точки зрения. Некоторые учёные считают, что проницаемость мембран для тетрациклина напрямую связана с изменением его заряда и конформационных свойств при комплексообразовании с ионами металлов (он становится электрически нейтральным и легче растворяется в липидах). Другие полагают, что перенос тетрациклина через мембраны осуществляется специальными белками-переносчиками. Так или иначе, фармакокинетические исследования плазмы крови показали, что 95% тетрациклина, несвязанного с белками, находится в форме комплексных соединений с кальцием и магнием. Поэтому выяснение особенностей комплексообразования тетрациклина с металлами играет большую роль для дальнейшего понимания механизмов транспорта тетрациклина в живых организмах.

В литературе имеются сведения, полученные методами рентгеноструктурного анализа, кругового дихроизма и ЯМР, о том, что связывание тетрациклина с ионами металлов способно изменять конформационное состояние молекул тетрациклина. В результате рентгеноструктурных исследований были получены структурные данные (значения длин ковалентных и водородных связей, валентных и пространственных углов) для многих известных производных тетрациклина, широко применяемых в медицине. Это позволило рассчитать пространственную структуру антибиотика. Потенциометрическим методом было установлено, что константы диссоциации протонов гидрохлорида тетрациклина в водных растворах при 25°С составляют рКа!=3,33; рКа2=7,75; рКа3=9,68.

Однако, результаты спектральных исследований комплексных соединений тетрациклина с ионами металлов, полученные с помощью метода кругового дихроизма, противоречивы. Расхождения результатов связаны как с различиями условий проведения экспериментов (рН, ионная сила, концентрации реактивов, состав используемой щёлочи, вид аниона соли комплексообразующего катиона), так и с полным отсутствием информации о кинетических аспектах связывания тетрациклина с ионами металлов.

Кроме того, ряд исследований проводился при физиологически неприемлемых условиях (в диметилсульфоксиде, при крайне высоких рН и т.д). Работ, посвященных изучению комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных элементов, крайне мало - они были сделаны методом ЯМР. Методом кругового дихроизма таких исследований не проводилось.

Цель и задачи исследования

Целью нашей работы является выяснение молекулярных механизмов связывания кальция и лантанидов с тетрациклином при физиологически приемлемых условиях (концентрациях тетрациклина ~ 10"4 М, оптимального рН~5,2).

Исходя из общей цели, в диссертации решались следующие задачи:

1. Выявление особенностей комплексообразования тетрациклина с рядом одно, двух и трёхзарядных ионов металлов в воде методом кругового дихроизма.

2. Проверка гипотезы об изоморфизме мест связывания кальция и лантанидов (иа примере комплексных соединений тетрациклина с кальцием и самарием).

3. Изучение влияния фактора pH на процесс комплексообразования тетрациклина с кальцием и самарием в водных растворах.

4. Кинетическое исследование процесса комплексообразования самария с тетрациклином в водных растворах в изоэлектрической точке (при рН=5,2).

5. Исследование влияния одновалентных катионов на процесс комплексообразования тетрациклина с ионами самария.

6. Регистрация и анализ оптических и ПМР спектров комплексных соединений тетрациклина с ионами лантанидов (для выяснения строения мест связывания ионов металлов).

7. Конформационный анализ пространственной структуры молекул тетрациклина в комплексных соединениях с ионами металлов с помощью ЭВМ и сопоставление результатов расчетов с данными, полученными при исследованиях взаимодействия тетрациклина с ионами металлов методами КД и ЯМР спектроскопии.

Научная новизна работы

1. Обнаружено различие мест связывания ионов кальция и лантанидов молекулой тетрациклина в воде при рН=5,2 (в изоэлектрической точке) в комплексах состава 1:1.

2. В водных растворах при рН=5,2 связывание ионов металлов с молекулами тетрациклина происходит в Л-хромофоре при участии трикарбонилметановой группировки.

Дня доказательства этих выводов, существенных для выявления

механизмов биологического действия антибиотиков ряда тетрациклина,

использовались следующие экспериментальные результаты, полученные впервые методами КД, ЯМР и оптической спектроскопии:

1) обнаружены различия спектров кругового дихроизма комплексов тетрациклина с ионами скандия и тяжёлых металлов (стронция, кадмия, лантанидов) и с ионами лёгких металлов (магния, кальция, алюминия) в области длин волн >.~380-420нм в комплексных соединениях состава 1:1 при рН=5,2 в воде;

2) получены кинетические кривые образования комплексных соединений тетрациклина с самарием в воде, свидетельствующие о зависимости кинетики комплексообразования при рН=5,2 от типа катиона щелочи (КОН, НаОН, 1ЛОН);

3) продемонстрировано влияние ионной силы и рН на кинетику образования комплексных соединений тетрациклина с самарием в воде в области слабокислых рН (рК]<рН<рК2);

4) получены и проанализированы электронно-колебательные спектры люминесценции и возбуждения Еи3+ в комплексных соединениях тетрациклина с кальцием, стронцием, иттрием, лантаном, гадолинием, лютецием, активированных европием, которые свидетельствуют о низкой симметрии центров связывания с металлами.

Кроме того, произведён расчёт и анализ конформационных состояний тетрациклина на ЭВМ и предложены практические методы оценки чистоты препаратов тетрациклина и определения тяжёлых металлов в природных водоёмах при помощи метода кругового дихроизма.

Научно-практическая значимость исследования

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, важны, поскольку иллюстрируют фундаментальные механизмы образования комплексных соединений полидентатных лигандов в электролитах, содержащих многозарядные ионы металлов. Они могут найти применение в биофизике, координационной химии и медицинской биологии, позволяют

6

приблизиться к пониманию механизмов действия тетрациклина на молекулярном уровне и стимулировать дальнейшие изыскания в этой области. Исследована кинетика и выявлены физико-химические факторы, влияющие на процесс связывания тетрациклина с ионами лантанидов, проведён анализ конформаций тетрациклина в комплексных соединениях лантанидов на ЭВМ. Кинетические исследования процесса комплексообразования показали, что при создании новых комплексонов важную роль играют сольватационные факторы: рН, ионная сила, полярность растворителя. Открытый нами эффект замедления процесса комплексообразования тетрациклина с самарием при замене гидроксида калия на гидроксиды натрия или лития, возможно, является частным проявлением общей тенденции взаимодействия одновалентных катионов с хелатами биологических мезо- и макромолекул и многозарядных ионов металлов, и требует дальнейших исследований.

Результаты диссертационной работы имеют важное практическое значение. На их основе предложены спектральные экспресс-методы измерения содержания тяжёлых металлов в природных водоёмах и определения чистоты препаратов антибиотиков тетрациклинового ряда, что делает эту работу интересной не только для биофизиков, но и для экологов, а также специалистов в области медицинской промышленности.

Результаты работы также представляют практический интерес для специалистов, разрабатывающих новые биосенсоры.

Защищаемые положения

1. Введение многозарядных ионов металлов в водные растворы гидрохлорида тетрациклина при рН= 5,2 сопровождается появлением в спектрах кругового дихроизма новой консервативной полосы КД в области длин волн X,—370-420нм. Порядок чередования знаков КД компонентов консервативной полосы Х,~370-420нм зависит от типа катионов металлов, взаимодействующих с молекулой тетрациклина:

а) связывание ионов натрия, калия, цезия, а также цинка, железа, гадолиния не приводит к существенным изменениям величины эллиптичности в этой области спектра КД;

б) связывание ионов лёгких металлов: магния, алюминия, кальция сопровождается появлением новой консервативной полосы КД с отрицательным экстремумом при X — 410 нм;

в) связывание ионов тяжёлых металлов (иттрия, стронция и лантанидов) приводит к появлению новой консервативной полосы КД с положительным экстремумом при А. = 415 нм.

2. В группе комплексных соединений тетрациклина с ионами ряда металлов, исследованных нами в воде при рН = 5,2, наибольшие амплитуды эллиптичности наблюдаются в случае взаимодействия с ионами самария (полоса КД положительного знака, А-тах — 415 нм) и ионами кальция (полоса КД отрицательного знака, 1та= 410 нм). Места связывания кальция и лантанидов в А-кольце молекулы тетрациклина различны.

3. Ионная сила водных растворов, рН, а также состав щелочи, используемой для депротонирования гидрохлорида тетрациклина, оказывают воздействие на кинетику комплексообразования гидрохлорида тетрациклина с самарием в воде (1,5-10"4М). Повышение рН в слабокислой области (рК1<рН<рК2) не изменяет амплитуду полосы эллиптичности в комплексах тетрациклина с кальцием (при Хщт= 410 нм), но оказывает воздействие в случае комплексов с самарием (при Хтах= 415 нм): наибольшие значения эллиптичности достигаются в изоэлектрической точке при рН~5,2.

4. Наблюдаемые эффекты открывают возможность создания датчиков для регистрации концентраций кальция и тяжёлых металлов в водных растворах с помощью дихрографического метода.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на следующих конференциях, симпозиумах и совещаниях:

1) X Всесоюзное совещание "Физические методы в координационной химии". (Кишинев, 1990);

2) VIII Всесоюзный симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул. (Новосибирск, 1990);

3) VI Всесоюзное Совещание "Спектроскопия координационных соединений",- (Краснодар, 1990);

4) Всесоюзная конференция "Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ". (Москва, 1990);

5) V Всесоюзное Совещание "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах". ( Иваново, 1991).

Публикации

Результаты диссертации опубликованы в шести статьях и пяти докладах на Всесоюзных конференциях, симпозиумах и совещаниях. Список работ прилагается в конце автореферата (стр. 19).

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 127 страницах, иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами. Список литературы содержит 100 источников.

Во введении дана общая характеристика работы, обоснована актуальность темы, сформулированы цели и определены основные задачи исследования, кратко изложены научная новизна и практическая ценность работы.

Первая глава посвящена обзору литературы по исследованиям взаимодействия тетрациклина с ионами металлов. Проанализированы исследования комплексных соединений лантанидов с тетрациклином методами ЯМР и рентгеноструктурного анализа. Установлено, что систематических исследований спектров КД тетрациклина с ионами редкоземельных металлов в растворах не проводилось. В связи с этим была выбрана цель данной работы: проведение детальных исследований взаимодействий тетрациклина с ионами металлов с помощью спектров кругового дихроизма, спектров люминесценции и спектров ПМР.

Во второй главе описаны материалы, методы синтеза комплексных соединений тетрациклина с ионами металлов, а также методы исследования, использованные в работе. В нашей работе изучалось комплексообразование гидрохлорида тетрациклина с солями натрия, калия, цезия, магния, кальция, стронция, бария, кадмия, меди, цинка, алюминия, железа, скандия, иттрия и лантанидов в воде, этиловом спирте, диметилсульфоксиде и ацетоне.

Спектры поглощения получали на спектрофотометре ЦУ-УК "БресогсГ (ГДР) при температуре 300°С. Спектры кругового дихроизма растворов комплексных соединений регистрировались на дихрографе СО 185 фирмы 1оиап (Франция) при температуре ЗООК0. Образование комплексных соединений регистрировалось по изменению кругового дихроизма в области длин волн А. ~ 245-470 нм. Спектры люминесценции ионов европия (Еи3+) записывали на спектрометре ИСП-51 с длиннофокусной камерой УФ-90 в области 5О0,],2 - ^о,! переходов люминесценции ионов Еи3+ с последующей денситографией. Для этого готовили комплексные соединения тетрациклина с ионами металлов, активированные Еи3+. Спектры ПМР получали на спектрометре \VM-250 в дейтерированной воде относительно эталона ДСС (диметилсилоксан силапентан натриевая соль сульфокислоты). Математическое моделирование пространственной структуры комплексных соединений тетрациклина с металлами осуществлялось на ЭВМ ЕС 1055М методами молекулярной механики с помощью модифицированной программы В.Г.Дашевского, написанной на Фортране.

10

В третьей главе описаны результаты исследования спектров кругового дихроизма (КД) гидрохлорида тетрациклина (ТЦ) и его комплексных соединений с ионами металлов.

Связывание молекул ТЦ с ионами ряда металлов в воде сопровождается появлением в длинноволновой области спектра КД (X ~ 360-420нм) дополнительной консервативной полосы. В спектрах растворов свободного тетрациклина такая полоса не наблюдается. С помощью спектров КД было выяснено, что максимальные амплитуды дихроизма консервативной полосы достигаются в случае связывания ТЦ с ионами самария или кальция в водных растворах при рН =5,2. При этом длинноволновые полосы КД для растворов комплексов ТЦ с самарием и кальцием инверсны по отношению друг к другу. В области полосы дихроизма Х—410-415 нм наблюдается положительный пик дихроизма для комплекса с самарием и отрицательный -для комплекса с кальцием. Установлено, что депротонирование молекулы ТЦ сопровождается конформационными

переходами: в нейтральной и слабокислой области области рН тетрациклин находится в конформации, приближающейся к планарной, а в кислой и слабощелочной области — в «свёрнутой» конформации.

Рис.1. Спектры КД водных растворов гидрохлорида тетрациклина (6) при рН=2,0 и его комплексов с хлоридами металлов [1:1] при рН=5,2: ЕиС13(1), УС13 (2), СаС12 (3),МВС12(4),ЫаС1(5).

При образовании комплексов ТЦ с ионами многозарядных металлов [1:1] в воде при рН=5,2 на фоне КОН в спектрах поглощения происходит батохромное смещение наиболее низкочастотной полосы поглощения с Хтю^ЗбОнм до Хтанг^ОО нм, а в спектрах КД наблюдается появление новой консервативной полосы в области длин волн X ~370-420нм (рис.1). Порядок чередования знаков КД компонентов консервативной полосы Х,~370-420нм, наблюдаемой в указанном диапазоне, зависит от типа катионов металлов, взаимодействующих с молекулой тетрациклина:

1) связывание с ионами натрия, калия, цезия, а также цинка, железа, гадолиния не приводят к существенным изменениям спектра КД тетрациклина в этой области;

2) связывание с ионами лёгких металлов: магнием, алюминием, кальцием приводит к появлению новой полосы КД с существенным отрицательным пиком дихроизма при \ =410 нм — амплитуда дихроизма максимальна для комплексов тетрациклина с ионами кальция;

3) связывание с ионами скандия и ионами тяжёлых металлов (иттрия, стронция и лантанидов) приводит к появлению новой полосы КД с положительным пиком дихроизма при X, = 415 нм. По ряду лантанидов дихроизм велик в комплексах ионов, у которых число 4£-электронов меньше с© Ни (цериевая подгруппа) и большее координационное число.

Наибольшие значения амплитуды эллиптичности наблюдаются в растворах комплексов ТЦ с самарием (положительный КД )^11ах= 415 нм) и с кальцием (отрицательный КД >™п= 410 нм) (рис.3).

Инверсия длинноволновой полосы КД Для комплексов с кальцием и самарием связана с различием мест связывания катионов этих металлов в А-кольце молекулы тетрациклина (рис.2).

Рис.3. Зависимость амплитуды экстремумов КД комплексов гидрохлорида тетрациклина с кальцием и самарием в воде при рН=5,2 от стехиометрии комплексов.

[М] - концентрация ионов металла, [ТЩ - концентрация гидрохлорида тетрациклина, п м= [М]/[ТЦ], п тц= [ТЦ] / [М].

а) многоядерные комплексы тетрациклина: 1-е ацетатом самария (Х= 415 нм),

2-е хлоридом самария на фоне одноядерных комплексов с хлоридом кальция (Х= 410 нм), 3-е хлоридом самария (Х= 415 нм), 4-е хлоридом кальция (X — 410 нм); "ТЦ] = и-КГ'М);

б) многолигандные комплексы тетрациклина: 1-е ацетатом самария (А. = 410 нм), 2-е хлоридом самария (X = 410 нм), ([М] =1,5-10"4М).

Наибольшие значения дихроизма (^11ах= 415 нм) для растворов комплексов ТЦ с самарием в области слабокислых рН: (рК1<рН<рК2)

13

достигаются в изоэлектрической точке при рН~5,2. Повышение рН не влияет на изменение амплитуды эллиптичности 0тах полосы КД (Хш|„= 410 нм) в комплексах с кальцием. Ионная сила водных растворов, рН, а также тип щелочи, используемой для депротонирования гидрохлорида тетрациклина, оказывают существенное влияние на кинетику комплексообразования ТЦ с самарием в воде (ЬбЛО^М). По мере увеличения величины ионных радиусов однозарядных катионов (от лития к калию), присутствующих в водной среде, наблюдается возрастание скорости реакции комплексообразования ТЦ с самарием (рис.4).

Рис.4. Кинетика образования комплексов тетрациклина с самарием [1:1] при рН = 5.2 (X - 415 нм) на фоне различных щелочей: 1- КОН, 2- ИаОН, 3- 1ЛОН.

^час.

Время образования многолигандных комплексов ТЦ с самарием при рН=5,2 зависит от условий проведения эксперимента и растёт в случае поэтапного титрования лигандом вследствие образования промежуточных комплексов. Соотношение амплитуд эллиптичности б38о (^ = 380 нм) и 6 320 (^ = 320 нм) в спектрах КД меняется по ряду лантанидов. В начале ряда бз80< 9 32о, в середине О380 ~ Эио, а к концу ряда 038о <<: 6 320. • В комплексах конца ряда лантанидов исчезает консервативный характер полосы длинноволнового перехода. Интенсивность консервативной полосы КД, соответствующей длинноволновому переходу, находится в прямой зависимости от диэлектрической проницаемости среды и протонодонорной способности молекул растворителя. По мере уменьшения диэлектрической проницаемости (уменьшения полярности растворителя) максимум длинноволновой полосы

14

в спектрах поглощения комплексов тетрациклина с самарием смещается к коротковолновому краю спектра, а в спектрах КД происходит уширение консервативной полосы (рис.5):

4-

Рис.5. Длинноволновая область спектров КД растворов комплексов тетрациклина с ацетатом самария (1,5-10'4М) [1:1]:

1 - в этиловом спирте,

2 — в диметилсульфоксиде, 3 — в ацетоне.

400 450 к, нм главе кратко

350

В четвёртой

рассмотрены результаты взаимодействия

тетрациклина с ионами лантанидов и

кальция, полученные по спектрам

люминесценции и спектрам ПМР.

Установлено, что для спектров

люминесценции комплексов ТЦ с

металлами (с кальцием, стронцием,

иттрием, лантаном, гадолинием, лютецием),

активированных ионами европия,

характерны большие Штарковские

расщепления 7Fi и 7F2 - уровней европия, а

также высокая относительная

............. интенсивность 5Do - 7Fo,2 переходов (рис.6).

580 600 620 640 660 680 X, НМ

Рис.6. Денситограммы электронно-колебательных спектров люминесценции комплексного соединения тетрациклина с ионами европия: 1 - в воде; 2 — при связывании с лецитиновыми липосомами.

Эти особенности говорят о низкой симметрии комплексов. Спектр кальциевой соли ТЦ, меченной европием, имеет наиболее четкую структуру и напоминает спектры р-дикетонатов европия. Спектры ПМР (протонного магнитного резонанса) комплексных соединений тетрациклина с диамагнитным ионом Ьа3+ и парамагнитным ионом УЬ3+ приведены на рис.7 и рис.8.

Н(СН3)2

О I аром.

¡АЛ—М

+5 4\

Химические сдвиги, м.д.

«

й и

ё 5 1 I

й О

снз Ы(СН3)2

аром,

АлШ

ГЬк

+20 +10 0 -10 Химические сдвиги, м.д.

Рис.7. Спектр ПМР раствора комплекса лантана с тетрациклином в 020.

Рис.8. Спектр ПМР раствора комплекса иттербия с тетрациклином в В20.

Данные ПМР качественно согласуются с данными, полученными по спектрам КД, свидетельствующими о том, что при рН=5,2 ионы лантаноидов, а также кальция, стронция, иттрия взаимодействуют с трикарбонилметзновой группировкой А-кольца молекулы тетрациклина.

Математическое моделирование пространственной структуры комплексных соединений ТЦ производилось с целью оценки относительной стабильности различных конформаций ТЦ при учёте Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий и внутримолекулярных водородных связей. Оно осуществлялось на ЭВМ ЕС-1055М методами молекулярной механики с помощью модифицированной программы В.Г.Дашевского, написанной на

16

Фортране. Сложность построения структурной модели ТЦ на компьютере состоит в том, что в состав молекулы входят четыре замкнутых углеводородных кольца. При построении моделей за основу брали плоское кольцо О, а затем последовательно замыкали оставшиеся В, С, Л кольца, варьируя значения пространственных углов (через 1°) и сохраняя неизменными величины валентных углов и длим связей для атомов, находящихся в эрз гибритизации. Таким способом было получено 14 потенциально возможных конформаций остова молекулы ТЦ, различающихся по степени «свёрнутости-развёрнутости» молекулы. Для каждой из полученных конформаций суммировались вклады Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий атомов в потенциальную энергию системы и производился расчет расстояний для внутримолекулярных водородных связей. Оптимальной конформации тетрациклина соответствовал минимум потенциальной энергии. Обнаружена прямая связь между степенью развернутости молекулы и энергией Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий, а также выяснены условия существования «развёрнутых» и «свёрнутых» конформаций молекулы тетрациклина.

В пятой главе обсуждаются возможности применения полученных результатов в медицине, фармакологии и экологии. Наблюдаемые эффекты открывают возможность создания биодатчиков для регистрации концентраций кальция и тяжёлых металлов в водных растворах с помощью переносных дихрографов. Дихрографический метод позволяет определять содержание тяжёлых и легких двухзарядных катионов металлов в воде и может применяться как для проверки жесткости водопроводной питьевой воды, так и для проведения экологического мониторинга содержания концентрации кальция и тяжёлых металлов в пресноводных водоёмах, природных карстовых источниках, а также сливах и стоках промышленных предприятий. Этот метод может быть также использован в фармацевтической промышленности для определения чистоты препаратов тетрациклина на основе анализа спектров КД водных растворов антибиотика.

В заключении сформулированы результаты диссертационной работы и подчеркнуто её практическое значение.

выводы

При физиологически активных рН (рН=5,2) образование эквимолярных комплексных соединений гидрохлорида тетрациклина с ионами многозарядных металлов (кальция, магния, алюминия, стронция, иттрия и лантанидов) в воде происходит с участием трикарбонилметановой группировки А-кольца молекулы тетрациклина. При переходе от кальция к лантанидам меняется ориентация карбамидной группы относительно остова молекулы тетрациклина, объясняемая разницей мест связывания кальция и катионов цериевой подгруппы ряда лантанидов.

Эти выводы сделаны на основании установленных нами экспериментальных фактов и математического моделирования конформаций тетрациклина, а именно:

1. Комплексообразование гидрохлорида тетрациклина с многозарядными ионами металлов сопровождается появлением в спектрах кругового дихроизма новой консервативной полосы в области длин волн Х~370-420 нм. Порядок чередования знаков компонент этой консервативной полосы КД зависит от типа катионов, взаимодействующих с молекулой тетрациклина:

1) отрицательный пик дихроизма при /Ч1];п= 410 нм (в комплексах с лёгкими металлами: магнием, алюминием, кальцием);

2) положительный пик дихроизма при А™^ 415 нм (в комплексах со скандием и тяжёлыми металлами: иттрием, стронцием и лантанидами).

Связывание ионов однозарядных катионов, а также ионов цинка, железа, гадолиния не приводит к появлению длинноволновой полосы КД.

2. В изоэлектрической точке (рН=5,2) наибольшие значения амплитуды эллиптичности наблюдаются в растворах комплексов тетрациклина с самарием (положительный КД, )ч1ШХ= 415 нм) и с кальцием (отрицательный КД, Л„,т= 410 нм). Различие знаков дихроизма связано с различием мест связывания кальция и лантанидов в А-кольце молекулы тетрациклина. По ряду лантанидов дихроизм велик в спектрах

комплексов ионов цериевой подгруппы (число 4£-электронов меньше Свми и велико координационное число).

3. Ионная сила, рН, а также тип щелочи, используемой для депротонирования гидрохлорида тетрациклина, влияют на скорость образования комплексов тетрациклина с самарием, возрастающую по мере увеличения радиусов однозарядных катионов (от 1л+ к К+), присутствующих в водном растворе.

4. Спектры люминесценции примеси Еи3+ в комплексах кальция, стронция, иттрия, лантана, гадолиния и лютеция с тетрациклином, также, как и спектры ПМР, говорят о низкой симметрии центров связывания с многозарядными металлами.

5. На основе анализа моделей конформационных состояний молекулы тетрациклина, полученных в результате машинного эксперимента на ЭВМ ЕС-1055М, обнаружена прямая связь между степенью свёрнутости молекулы и энергией Ван-дер-Ваапьсовых взаимодействий. Проведенная работа открывает возможность создания фотохемодатчиков

для регистрации концентраций кальция и тяжёлых металлов в водных

растворах с помощью дихрографического метода, в частности, для определения

жесткости питьевой воды, для определения чистоты препаратов тетрациклина

и для определения наличия ионов тяжёлых металлов в воде.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ СОИСКАТЕЛЯ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Грошева В.И. Влияние одновалентных катионов на процесс комплексообразования тетрациклина с ионами самария.// Антибиотики и химиотерапия.- 2005,- Т.50 .- №10-11.- С.3-7 .

2. Грошева В.И. Спектральный контроль содержания примесей металлов в препаратах тетрациклина.//Антибиотики и химиотерапия.- 2006.- Т.51,-№2.-С.3-7.

3. Бабушкина Т.А., Грошева В.И., Золин В.Ф., Коренева Л.Г. Изучение комплексообразования тетрациклина с ионами лантаноидов методами

19

оптической и ЯМР-спектроскопии.// Координационная химия.- 1997.- Т.23,-№9.- С.709-711.

4. Грошева В.И., Золин В.Ф. Спектры кругового дихроизма комплексов тетрациклина с ионами металлов.//Координационная химия.- 1994. - Т.20,-№5,- С.397-400.

5. Грошева В.И. Влияние депротонирования на конформационное состояние молекулы тетрациклина.//Антибиотики и химиотерапия,- 1992.- Т.37.- № I.-С. 11-14.

6. Грошева В.И. Применение метода кругового дихроизма для оценки чистоты препаратов тетрациклина.// Успехи в области изучения и производства антибиотиков. - М.: Труды ВНИИА, 1992.- С.148-154.

7. Грошева В.И. О влиянии природы растворителя на формирование комплексов тетрациклин: самарий.// Тезисы докладов V Всесоюзного Совещания "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах".-Иваново, 1991.- С.62.

8. Грошева В. И., Золин В.Ф. Кинетические исследования процесса комплексообразования тетрациклина с ионами РЗЭ методом кругового дихроизма.//Тезисы докладов X Всесоюзного совещания "Физические методы в координационной химии".- Кишинев, 1990,- С.42.

9. Золин В.Ф., Грошева В.И., Бабушкина Т.А.. ЯМР и оптическая спектроскопия комплексов лантанидов с тетрациклином.// Тезисы докладов VI Всесоюзного Совещания "Спектроскопия координационных соединений".- Краснодар, 1990,-С. 157.

Ю.Грошева В.И. Конформационный анализ структуры молекулы тетрациклинаУ/Тезисы докладов VIII Всесоюзного симпозиума по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул.-Новосибирск, 1990.- Ч.1.- C.II7.

11.Грошева В.И. Применение метода КД для оценки чистоты препаратов тетрациклина.//Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ",- М., 1990.- С.50.

20

Подписано к печати 45.09 Об Тираж 400 Заказ 140

Отпечатано в отделе оперативной печати физического факультета МГУ

Содержание диссертации, кандидата физико-математических наук, Грошева, Валентина Ивановна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Взаимодействие тетрациклина с ионами металлов обзор литературы).

Глава 2. Материалы и методы исследования.

Глава 3. Результаты исследования спектров кругового дихроизма тетрациклина с ионами металлов.

3.1. Влияние депротонирования на конформацию молекулы тетрациклина.

3.2. Спектры КД водных растворов комплексных соединений тетрациклина с ионами металлов.

3.3. Особенности образования комплексов тетрациклина с кальцием и самарием.

3.4. Влияние одновалентных катионов на процесс образования комплексов тетрациклина с ионами самария

3.5. Влияние растворителя на образование комплексов тетрациклина с ионами лантанидов.

Глава 4. Оптическая и ЯМР-спектроскопия соединений тетрациклина с лантанидами.

4.1. Оптическая спектроскопия комплексных соединений тетрациклина с европием.

4.2. Изучение образования комплексов тетрациклина с ионами лантанидов методами ЯМР спектроскопии.

4.3. Математические моделирование конформаций тетрациклина на ЭВМ.

Глава 5. Применение результатов исследований комплексообразования тетрациклина в экологии, фармакологии и медицине.

5.1. Применение метода кругового дихроизма для оценки чистоты препаратов тетрациклина.

5.2. Возможность определения тяжёлых металлов в природных водоёмах.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных металлов"

Актульность проблемы

Исследование специфичности связывания ионов металлов с биоорганическими молекулами является актуальным направлением современной биофизики и ряда смежных наук. Комплексные соединения ионов металлов являются непосредственными участниками целого ряда процессов, протекающих в живых организмах. Они играют центральную роль в переносе кислорода и углекислого газа, участвуют в процессе электронного транспорта в хлоропластах и в митохондриях, в ферментативном катализе и во множестве других процессов. Присутствие катионов металлов в водной фазе влияет на физико-химические свойства, фазовое состояние биомембран и их компонент, сказывается на регуляции работы ферментов. Научное обоснование селективности связывания ионов металлов биологическими молекулами важно для более глубокого понимания закономерностей организации живой материи, разгадки молекулярных механизмов процессов самосборки, самоорганизации и самовоспроизведения структур, характерных для разнообразных биосистем. С другой стороны, результаты исследования селективности связывания биоорганических молекул с ионами металлов в перспективе могли бы быть использованы для разработки чувствительных биосенсоров.

Особый научный и практический интерес представляет исследование молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов. Фармакологическая активность лекарственных препаратов определяется не только их химической структурой, но и состоянием функциональных групп, определяемым как взаимодействием молекул препарата с растворителем, так и друг с другом. При специфическом связывании этих молекул с клетками-мишенями, особую роль играет конформация молекул, которая может изменяться, например, при взаимодействии молекул препарата с двух и трёхзарядными ионами металлов. Одним из традиционных методов исследования конформации молекул является метод кругового дихроизма, который позволяет следить за кинетикой конформационных перестроек молекул в растворе (при наличии полос поглощения в видимой или ультрафиолетовой областях спектра).

Объект исследования

Междисциплинарным объектом нашего исследования является молекула тетрациклина. С одной стороны - это биомолекула, оказывающая воздействие на биосинтез белка в бактериальных клетках, и поэтому представляющая интерес для биологов, медиков и фармацевтов. С другой -это достаточно стабильная мезомолекула, имеющая молекулярный размер, промежуточный между размерами малых органических молекул и макромолекул, и уникальное химическое строение, благодаря которому её можно использовать, например, в качестве биосенсора.

Предметом исследования в нашей диссертационной работе является изучение особенностей взаимодействия тетрациклина с ионами лантанидов, приводящего к комплексообразованию.

Интерес к комплексным соединениям тетрациклина с ионами редкоземельных металлов связан с тем обстоятельством, что эти катионы обладают сродством к кальций-связывающим центрам белков, мембран, протеолипидов, причём константы связывания с лантанидами намного выше, чем с кальцием.

Это свойство редкоземельных катионов послужило основанием для разработки ныне широко применяемого на практике метода редкоземельного спектроскопического зондирования биомолекул, базирующегося на гипотезе эквивалентности мест связывания лантанидов и кальция. По изменениям спектральных характеристик комплексных соединений, активированных лантанидами, делаются соответствующие выводы о строении мест связывания с ионами кальция или магния.

Ионы лантанидов, несмотря на то, что являются абиотичными, находят применение в медицине в качестве диагностических средств, благодаря своим уникальным оптическим и магнитным свойствам. Катионы европия успешно используются в качестве люминесцентных зондов, катионы гадолиния применяют при магнитно-резононансной томографии в качестве контрастных агентов. Изучается влияние катионов гадолиния на пролиферацию и подвижность некоторых опухолевых клеток.

Таким образом, исследование комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных элементов имеет важное научное и прикладное значение.

Степень разработанности научной проблемы

Тетрациклин и его производные успешно применяются в медицинской практике в качестве лекарственных препаратов. Тетрациклин хорошо проникает сквозь клеточные мембраны бактерий, связывается с рибосомами, оказывая ингибирующий эффект на синтез бактериальных белков. Установлено, что он может взаимодействовать и с митохондриями бактериальных клеток.

Максимум антибактериальной активности гидрохлорид тетрациклина проявляет при слабокислом значении рН, равном 5,5.

Остается открытым вопрос - чем всё-таки обусловлена селективность действия тетрациклина на клетки микроорганизмов, почему происходит увеличение проницаемости бактериальных мембран для тетрациклина по сравнению с мембранами клеток млекопитающих?

По этому поводу существует две точки зрения. Некоторые учёные считают, что проницаемость мембран для тетрациклина напрямую связана с изменением его заряда и конформационных свойств при комплексообразовании с ионами металлов (он становится электрически нейтральным и легче растворяется в липидах). Другие полагают, что перенос тетрациклина через мембраны осуществляется специальными белками-переносчиками. Так или иначе, фармакокинетические исследования плазмы крови показали, что 95% тетрациклина, несвязанного с белками, находится в форме комплексных соединений кальция и магния. Поэтому выяснение особенностей комплексообразования тетрациклина с катионами металлов играет большую роль для дальнейшего понимания механизмов транспорта тетрациклина в живых организмах.

В литературе имеются сведения, полученные методами рентгеноструктурного анализа, кругового дихроизма и ЯМР, о том, что связывание тетрациклина с ионами металлов способно изменять конформационное состояние молекул тетрациклина.

В результате рентгеноструктурных исследований были получены структурные данные (значения длин ковалентных и водородных связей, валентных и пространственных углов) для многих известных производных тетрациклина, широко применяемых в медицине. Это позволило рассчитать пространственную структуру антибиотика. Потенциометрическим методом было установлено, что константы диссоциации протонов гидрохлорида тетрациклина в водных растворах при 25°С составляют pKai=3,33; рКа2=7,75; рКа3=9,68.

Однако, результаты спектральных исследований комплексных соединений тетрациклина с ионами металлов, полученные с помощью метода кругового дихроизма, противоречивы. Расхождения результатов связаны как с различиями условий проведения экспериментов (рН, ионная сила, концентрации реактивов, состав используемой щёлочи, вид аниона соли комплексообразующего катиона), так и с полным отсутствием информации о кинетических аспектах связывания тетрациклина с ионами металлов.

Кроме того, ряд исследований проводился при физиологически неприемлемых условиях (в диметилсульфоксиде, при крайне высоких рН и т.д).

Работ, посвященных изучению комплексообразования тетрациклина с ионами редкоземельных элементов, крайне мало - они были сделаны методом ЯМР. Методом кругового дихроизма таких исследований не проводилось.

Цель и задачи исследования

Целью нашей работы является выяснение молекулярных механизмов связывания кальция и лантанидов тетрациклином при физиологически приемлемых условиях (концентрациях тетрациклина ~ 10*4 М, при оптимальном рН~5,5).

Исходя из общей цели, в диссертации решались следующие задачи:

1. Выявление особенностей комплексообразования тетрациклина с рядом одно, двух трёхзарядных ионов металлов в воде методом кругового дихроизма.

2. Проверка гипотезы об изоморфизме мест связывания кальция и лантанидов (на примере комплексных соединений тетрациклина с кальцием и самарием).

3. Изучение влияния фактора рН на процесс комплексообразования тетрациклина с кальцием и самарием в водных растворах.

4. Кинетическое исследование процесса комплексообразования самария с тетрациклином в водных растворах в изоэлектрической точке (при рН=5,2).

5. Исследование влияния одновалентных катионов на процесс комплексообразования тетрациклина с ионами самария.

6. Регистрация и анализ оптических и ПМР спектров комплексных соединений тетрациклина с ионами лантанидов (для выяснения строения мест связывания ионов металлов).

7. Конформационный анализ пространственной структуры молекул тетрациклина в комплексных соединениях с ионами металлов с помощью ЭВМ и сопоставление результатов расчетов с данными, полученными при исследованиях взаимодействия тетрациклина с ионами металлов методами КД и ЯМР спектроскопии.

Научная новизна работы

Впервые были получены следующие результаты:

1. Обнаружено различие мест связывания ионов кальция и лантанидов молекулой тетрациклина в воде при рН=5,2 (в изоэлектрической точке) в комплексах состава 1:1.

2. В водных растворах при рН=5,2 связывание ионов металлов с молекулами тетрациклина происходит на А-хромофоре при участии трикарбонилметановой группировки.

Для доказательства этих выводов, существенных для выявления механизмов биологического действия антибиотиков ряда тетрациклина, использовались следующие экспериментальные результаты, полученные впервые методами КД, ЯМР и оптической спектроскопии: a. обнаружены различия спектров кругового дихроизма комплексов тетрациклина с ионами скандия и тяжёлых металлов (стронция, кадмия, лантанидов) и с ионами лёгких металлов (магния, кальция, алюминия) в области длин волн А,~380-420нм в комплексных соединениях состава 1:1 при рН=5,2 в воде; b. получены кинетические кривые образования комплексных соединений тетрациклина с самарием в воде, свидетельствующие о зависимости кинетики комплексообразования при рН=5,2 от типа катиона щелочи (КОН, NaOH, LiOH); c. продемонстрировано влияние ионной силы и рН на кинетику образования комплексных соединений тетрациклина с самарием в воде в области слабокислых рН (pKi<pH<pK2); d. получены и проанализированы электронно-колебательные спектры люминесценции и возбуждения Еи3+ в комплексных соединениях тетрациклина с кальцием, стронцием, иттрием, лантаном, гадолинием, лютецием, активированных европием, которые свидетельствуют о низкой симметрии центров связывания катионов металлов.

Кроме того, произведён расчёт и анализ конформационных состояний тетрациклина на ЭВМ и предложены практические методы оценки чистоты препаратов тетрациклина и определения тяжёлых металлов в природных водоёмах при помощи метода кругового дихроизма. V

Научно-практическая значимость исследования

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, t'; важны, поскольку иллюстрируют фундаментальные механизмы образования комплексных соединений полидентатных лигандов в электролитах, содержащих многозарядные ионы металлов. I

Они могут найти применение в биофизике, координационной химии и^' медицинской биологии, позволяют приблизиться к пониманию механизмов ; действия тетрациклина на молекулярном уровне и стимулировать дальнейшие ; изыскания в этой области.

Исследована кинетика и выявлены физико-химические факторы, влияющие на процесс связывания тетрациклина с ионами лантанидов, проведён анализ конформаций тетрациклина в комплексных соединениях лантанидов на ЭВМ.

Кинетические исследования процесса комплексообразования показали, что при создании новых комплексонов важную роль играют сольватационные факторы: рН, ионная сила, полярность растворителя.

Открытый нами эффект замедления процесса комплексообразования тетрациклина с самарием при замене гидроксида калия на гидроксиды натрия или лития, возможно, является частным проявлением общей тенденции взаимодействия одновалентных катионов с хелатами биологических мезо- и макромолекул и многозарядных ионов металлов, и требует дальнейших исследований.

Результаты диссертационной работы имеют важное практическое значение. На их основе предложены спектральные экспресс-методы измерения содержания катионов тяжёлых металлов в природных водоёмах и определения чистоты препаратов антибиотиков тетрациклинового ряда, что делает эту работу интересной не только для биофизиков, но и для экологов, а также специалистов в области медицинской промышленности.

Результаты работы также представляют практический интерес для специалистов, разрабатывающих новые биосенсоры.

Защищаемые положения:

1. Введение многозарядных ионов металлов в водные растворы гидрохлорида тетрациклина при рН= 5,2 сопровождается появлением в спектрах кругового дихроизма новой консервативной полосы КД в области длин волн Х,~370-420нм. Порядок чередования знаков КД компонент консервативной полосы А.~370-420нм зависит от типа катионов металлов, взаимодействующих с молекулой тетрациклина: а) связывание ионов натрия, калия, цезия, а также цинка," железа, гадолиния не приводит к существенным изменениям величины эллиптичности в этой области спектра КД; б) связывание ионов лёгких металлов: магния, алюминия, кальция сопровождается появлением новой полосы КД с отрицательным экстремумом при Х=410 нм; в) связывание ионов скандия и тяжёлых металлов (бария, стронция и лантанидов) приводит к появлению новой полосы КД с положительным экстремумом при А,=415 нм.

2. В группе комплексных соединений тетрациклина с ионами ряда металлов, исследованных нами в воде при рН = 5,2, наибольшие амплитуды эллиптичности наблюдаются в случае взаимодействия с ионами самария (полоса КД положительного знака, А^ = 415 нм) и ионами кальция (полоса

КД отрицательного знака, Amjn= 410 нм). Места связывания кальция и лантанидов на А-кольце молекулы тетрациклина различны.

3. Ионная сила водных растворов, рН, а также состав щелочи, используемой для депротонирования гидрохлорида тетрациклина, оказывают воздействие на кинетику комплексообразования гидрохлорида тетрациклина с самарием в воде (1,5* Ю^М). Повышение рН в слабокислой области (pKi<pH<pK2) не изменяет амплитуду полосы эллиптичности в комплексах тетрациклина с кальцием (при 410 нм), но влияет на нее в случае комплексов с самарием (при Х™п= 415 нм): наибольшие значения эллиптичности достигаются в изоэлектрической точке при рН~5,2.

4. Наблюдаемые эффекты открывают возможность создания датчиков концентраций катионов кальция и тяжёлых металлов в водных растворах с помощью портативных дихрографов.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на следующих конференциях, симпозиумах и совещаниях:

1. X Всесоюзное совещание "Физические методы в координационной химии". (Кишинев, 1990);

2. VIII Всесоюзный симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул. (Новосибирск, 1990);

3. VI Всесоюзное Совещание "Спектроскопия координационных соединений".-(Краснодар, 1990);

4. Всесоюзная конференция "Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ". (Москва, 1990);

5. V Всесоюзное Совещание "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах". (Иваново, 1991).

Публикации

Результаты работы, описанной в диссертации, опубликованы в шести статьях и пяти докладах на Всесоюзных конференциях, симпозиумах и совещаниях. Список работ прилагается в конце диссертации (стр.114).

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 127 страницах, иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами. Список литературы содержит 100 источников.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Грошева, Валентина Ивановна

Эти выводы сделаны на основании установленных нами экспериментальных фактов и математического моделирования конформаций тетрациклина, а именно:

1. Комплексообразование гидрохлорида тетрациклина с многозарядными ионами металлов сопровождается появлением в спектрах кругового дихроизма новой консервативной полосы в области длин волн Х~370-420 нм. Порядок чередования знаков компонент этой консервативной полосы КД зависит от типа катионов, взаимодействующих с молекулой тетрациклина: 1) отрицательный пик дихроизма при 7^= 410 нм (в комплексах с лёгкими металлами: магнием, алюминием, кальцием);

-1122) положительный пик дихроизма при ^^ 415 нм (в комплексах со скандием и тяжёлыми металлами: иттрием, стронцием и лантанидами).

Связывание ионов однозарядных катионов, а также ионов цинка, железа, гадолиния не приводит к появлению длинноволновой полосы КД. В изоэлектрической точке (рН=5,2) наибольшие значения амплитуды эллиптичности наблюдаются в растворах комплексов тетрациклина с самарием (положительный КД, Хтах= 415 нм) и с кальцием (отрицательный КД, Х^ 410 нм). Различие знаков дихроизма связано с различием мест связывания кальция и лантанидов на А-кольце молекулы тетрациклина. По ряду лантанидов дихроизм велик в спектрах комплексов ионов цериевой подгруппы (число 4£электронов меньше семи и большое координационное число).

Ионная сила, рН, а также тип щелочи, используемой для депротонирования гидрохлорида тетрациклина, влияют на скорость образования комплексов тетрациклина с самарием, возрастающую по мере увеличения радиусов однозарядных катионов (от Li+ к К+), присутствующих в водном растворе. Спектры люминесценции примеси Еи3+ в комплексах кальция, стронция, иттрия, лантана, гадолиния и лютеция с тетрациклином, также, как и спектры ПМР, говорят о низкой симметрии центров связывания многозарядных катионов металлов.

-1135. На основе анализа моделей конформационных состояний молекулы тетрациклина, полученных в результате машинного эксперимента на ЭВМ ЕС-1055М, обнаружена прямая связь между степенью свёрнутости молекулы и энергией Ван-дер

Ваальсовых взаимодействий.

Проведенная работа открывает возможность создания фотохемодатчиков для регистрации концентраций катионов кальция и тяжёлых металлов в водных растворах с помощью дихрографического метода, в частности, для определения жесткости питьевой воды, для определения чистоты препаратов тетрациклина и для определения наличия ионов тяжёлых металлов в воде.

- 114

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ СОИСКАТЕЛЯ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Трошева В.И. Влияние одновалентных катионов на процесс комплексообразования тетрациклина с ионами самария.// Антибиотики и химиотерапия.- 2005.- Т.50 .- №10-11.- С.3-7 .

2. Трошева В.И. Спектральный контроль содержания примесей металлов в препаратах тетрациклина.//Антибиотики и химиотерапия.- 2006.- Т.51.-№2.- С.3-7.

3. Бабушкина Т.А., Трошева В.И., Золин В.Ф., Коренева Л.Г. Изучение комплексообразования тетрациклина с ионами лантаноидов методами оптической и ЯМР-спектроскопии.// Координационная химия.- 1997.- Т.23.-№9.- С.709-711.

4. Трошева В.И., Золин В.Ф. Спектры кругового дихроизма комплексов тетрациклина с ионами металлов.//Координационная химия.- 1994. - Т.20.-№5.- С.397-400.

5. Трошева В.И. Влияние депротонирования на конформационное состояние молекулы тетрациклина.//Антибиотики и химиотерапия.- 1992,- Т.37,- № I.-С. 11-14.

6. Трошева В.И. Применение метода кругового дихроизма для оценки чистоты препаратов тетрациклина.// Успехи в области изучения и производства антибиотиков. -М.: Труды ВНИИА, 1992.- С. 148-154.

7. Трошева В.И. О влиянии природы растворителя на формирование комплексов тетрациклин: самарий.// Тезисы докладов V Всесоюзного Совещания "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах".-Иваново, I99L- С.62.

8. Трошева В. И., Золин В.Ф. Кинетические исследования процесса комплексообразования тетрациклина с ионами РЗЭ методом кругового дихроизма.//Тезисы докладов X Всесоюзного совещания "Физические методы в координационной химии".- Кишинев, 1990.- С.42.

9. Золин В.Ф., Трошева В.И., Бабушкина Т.А. ЯМР и оптическая спектроскопия комплексов лантанидов с тетрациклином.// Тезисы докладов

VI Всесоюзного Совещания "Спектроскопия координационных соединений".- Краснодар, 1990,- С. 157.

Ю.Грошева В.И. Конформационный анализ структуры молекулы тетрациклина.//Тезисы докладов VIII Всесоюзного симпозиума по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул.-Новосибирск, 1990.- Ч.1.- C.II7.

П.Грошева В.И. Применение метода КД для оценки чистоты препаратов тетрациклина.//Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Современные направления создания и оценки качества готовых лекарственных препаратов антибиотиков и антимикробных веществ".- М., 1990.- С.50.

-116

- Ill -ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате работы установлено, что при физиологически активных рН (рН=5,2) образование эквимолярных комплексных соединений гидрохлорида тетрациклина с ионами многозарядных металлов (кальция, магния, алюминия, стронция, иттрия и лантанидов) в воде происходит с участием трикарбонилметановой группировки А-кольца молекулы тетрациклина. При переходе от кальция к лантанидам меняется ориентация карбамидной группы относительно остова молекулы тетрациклина, связанная с различием мест связывания кальция и катионов цериевой подгруппы ряда лантанидов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата физико-математических наук, Грошева, Валентина Ивановна, Москва

1. Франклин Т., Сноу Д. Биохимия антимикробного действия. Пер.с англ./Под ред. Панова М.А. М.: Мир, 1984. - 23 8С.

2. Ласкин А.// Механизм действия антибиотиков, ред. Гаузе Г.Ф. -М.: Мир, 1969.-С.314.

3. Albert A. Avidity of Terramycin and Aureomycin for Metallic Cations. //Nature.-1953.- Vol.172. -P.201-202.

4. Albert A., Rees C.W. Avidity of tetracyclines for the cations of metals.//Nature.-1956.-Vol.177.-P.433-434.

5. Saz K., Slie R.B. Manganese reversal of aureomycin inhibition of bacterial cell-free nitroreductase//J. of the Amer. Chem.Soc.-1953.- Vol.75.- P.4626- 4627.

6. Doluisio J.T., Martin A.N. Metal Complexation of the Tetracycline Hydrochlorides. //J.med.Chem.-1963.- Vol.6. P. 16-20.

7. Doluisio J.T., Martin A.N. The Binding of Tetracycline Analogs to Conalbumin in the Absence and Presence of Cupric Ions. //J.med.Chem.-1963.- Vol.6, P.20-23.

8. Colaizzi J.L., Knevel A.M., Martin A.N.//J. Pharm.Sci.-1965.- Vol.54.- P.1425.

9. Hochstein F.A., Stephens C.R., Conover L.H., Regna P.P., Pasternack R., Gordon P.N., Pilgrim F.J., Brunings K.J., Woodward R.B. The structure of terramycin//J. of the Amer. Chem.Soc.-1953.- Vol.75.- P.5455-5475.

10. Hochstein F.A., Wittenau M.S., Tanner F.W. J., Murai K. 2-Acetyl-2-decarboxamidooxytetracycline//J. of the Amer. Chem.Soc.-1960.- Vol.82.-P.5934-5937.

11. Stephens C.R., Beereboom J.J., Rennhard H.H., Gordon P.N., Murai K., Blackwood R.K., Wittenau M.S. 6-Deoxytetracyclines. IV. Preparation, C-6 stereochemistry and reactions.// J. of the Amer. Chem.Soc.-1963.- Vol.85.-P.2643-2652.

12. Baker Jr.W.F., Patrick M.B. Metal Binding in Tetracycine. Cobalt(II) and Nickel(II) complexes// J. of the Amer. Chem.Soc.- 1966.- Vol.88.- P.1314-1317.

13. Mitscher L.A., Bonacci A.C., Sokoloski T.D. Circular dichroism and solution conformation of the tetracycline antibiotics.// Tetrahedron Letters.-1968. -Vol.51.-P.5361-5364.

14. Mitscher L.A., Bonacci A.C., Sokoloski T.D. Circular dichroism and solution conformation of the tetracycline antibiotics.// Antimicrobial Agents and Chemotherapy-1968/ ed. Holly G.L. Bethesda: Maryland, 1969.-P.78-86.

15. Mitscher L.A., Juvarkar J.V. Structure of chelocardin, a novel tetracycline antibiotic// J. of the Amer. Chem.Soc.- 1970.- Vol.92.- P.6070-6071.

16. Mitscher L.A., Slater -Eng В., Sokoloski T.D.// Circular dichroism measurements of the tetracyclines.// Antimicrobial Agents and Chemotherapy.-1972.-Vol.2.-P.66-72.

17. Leeson L.J., Krueger J.E., Nash R.N. Concerning the structural assignment of the second and third acidity constants of the tetracycline antibiotics//Tetrahedron Letters.-1963. V0I.I8.-P.1155-1160.

18. Rigler N.E., Bag S.P., Leyden D.E., Sudmeier J.L., Reilley C.N. Determination of protonatione scheme of tetracycline using nuclear magnetic resonance.// Analitical Chemistry.- 1965.- Vol.37.- P.872-875.

19. Kesselring U.W., Benet L.Z. Determination of protonatione scheme for isochlortetracycline using nuclear magnetic resonance.// Analitical Chemistry.-1969.- Vol.41.- P.1535-1539.

20. Hughes R.E., Muxfeldt H., Dreele R.B. Conformation of tetracycline ring systems of 5,12a-diacetyloxytetracycline// J. of the Amer. Chem.Soc.- 1971.-Vol.93.- P. 103 7-103 8.

21. Stezowski J.J. Chemical-structual properties of tetracycline derivatives. 1. Molecular structure and conformation of the free base derivatives// J. of the Amer. Chem.Soc.- 1976.- Vol.98.- P.6012-6018.

22. Jogan K.H., Stezowski J.J. Chemical-structual properties of tetracycline derivatives. 2. Coordination and conformational aspects of oxytetracycline metal ion complexation // J. of the Amer. Chem.Soc.- 1976.- Vol.98.- P.6018-6026.

23. Prewo R., Stezowski J.J. Chemical-structual properties of tetracycline derivatives. 3. The integrity of the conformation of the nonionized free base // J. of the Amer. Chem.Soc.- 1977.- Vol.99.- P.l 117-1121.

24. Prewo R., Stezowski J.J. Chemical-structual properties of tetracycline derivatives. 9. 7-chlorotetracycline derivatives with modified stereochemistry// J. of the Amer. Chem.Soc.- 1980.- Vol.102.- P.7015-7020.

25. Prewo R., Stezowski J.J., Kirchlechner R. Chemical-structual properties of tetracycline derivatives. 10. The 6-thiatetracyclines.// J. of the Amer. Chem.Soc.-1980.-Vol.102.- P.7021-7026.

26. Palenik G.J., Mathew M., Restivo R. Structural studies of tetracyclines. Crystal and molecular structure of tetracycline-urea tetrahydrate// J. of the Amer. Chem.Soc.- 1978.- Vol.100.- P.4464-4469.

27. Newman E.C., Frank C.W. Circular dichroism spectra of tetracycline Complexes with Mg+2 and Ca+2// J. of Pharmaceutical Sciences.- 1976.- Vol.65.- P.1728-1732.

28. Fourtillan J.B., Lefebvre M.A. Correlations structure-activite dans la famille des tetracyclines.//La Nouvelle Presse Medicale.-1980.- Vol.9.-L.64-70.

29. Kunin C.M., Finland M. Clinical pharmacology of the tetracycline antbiiotics. // Clin. Pharmacol. Ther. -1961.-Vol.2.- P.51-69.

30. Asleson G.L., Frank C.W. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectral analysis of tetracycline hydrochloride and related antibiotics.// J. of the Amer. Chem.Soc.- 1975.- Vol.97.- P.6246- 6248.

31. Asleson G.L., Frank C.W. pH-dependence of carbon-13 nuclear magnetic resonance shifts of tetracycline. Microscopic dissociation constants.// J. of the Amer. Chem.Soc.- 1976.- Vol.98.- P4745- 4749.

32. Gulbis J., Everett G.W. A 13C nuclear magnetic resonance analysis of the metal binding site in tetracycline.// J. of the Amer. Chem.Soc.- 1975.- Vol.97.- P.6248-6249.

33. Shaw J., Everett G.W. Comparison of the effects of calciume and magnesium on the conformation of tetracycline in Me2SO solution.//J. Inorg. Biochem.-1982.-Vol. 17.-305-311.

34. Everett G.W., Gulbis J., Shaw J. Effects of Mg(II) on the conformation of tetracycline in Me2SO solution. // J. of the Amer. Chem.Soc.- 1982.- Vol. 104.-P.445-447.

35. Gulbis J., Everett G.W. Effect of added electrolyte on the binding of tetracycline to paramagnetic ion probes. A 13C nuclear magnetic resonance study.// J. of the Amer. Chem.Soc.-1976.- Vol.98.- P.1280-1281.

36. Jezowska-Trzebiatowska В., Dziegielewski J.O.,Glowacki P. The coordination sites and bonding in Ni(II) and Co(II) complexes of tetracycline./ZBulletin de Г academic Polonaise des sciences.-1979.-Vol.27.- P.223-238.

37. Celotti M., Fazakerley G.V. Conformation of various tetracycline species determined with the aid of a nuclear magnetic resonance relaxation probe.// J. of the Chemical Society. Perkin Transactions II- 1977.- Vol.10.- P.1319-1322.

38. Reuben J. Deuterium/protium fractionation factors for polyfunctional organic molecules: direct determination by carbon-13 NMR spectroscopy.// J. of the Amer. Chem.Soc. 1986.- Vol.108.- P.l082-1083.

39. Reuben J. Intramolecular hydrogen bonding as reflected in the deuterium isotope effects on carbon-13 chemical shifts. Correlation with hydrogen bond energies.// J. of the Amer. Chem.Soc. 1986.- Vol.108.- P.1735-1738.

40. Myers H.M., Tochon-Danguy H.J., Baud C.A. IR absorption spectrophotometric analysis of the complex formed by tetracycline and synthetic hydroxyapatite.// Calcified tissue international.-1983.-Vol.35.-P.745-749.

41. Mikulski C.M, Fleming J., Fleming D., Karayannis N.M. Tetracycline adducts with 3d metal perchlorates.//Inorganica Chemica Acta.-1987.-Vol. 135. L.9-11.

42. Mikulski C.M, Fleming J., Fleming D. Chelates of tetracycline with first row transition metal perchlorates. /Дnorg. Chem. Acta. 1988.- Vol.144.- L.9-16.

43. Chen Y., Lin C. Migration behavior and separation of tetracycline antibiotics by micellar electrokinetic chromatography.// J. Chromatogr. A. 1998.- Vol.802. -P.95-105.

44. Hirsch R., Ternes T.A., Haberer K., Mehlich A., Ballwanz F., Kratz K. Determination of antibiotics in different water compartments via liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry.// J. Chromatogr. A. -1998.- Vol.815.-P.213-223.

45. Liang Y., Denton M.B., Bates R.B. Stability studies of tetracycline in methanol solution.//! Chromatogr. A. 1998.- Vol.827. - P.45-55.

46. Pacheco T.R., Maxwell F., Wu M., Na S., Maxwell I.H. Use of recombinant parvoviruse to facilitate screening for human melanoma cell clones expressing tetracycline-responsive transactivatoros.// Gene.- 1999.- Vol.229. P.125-129.

47. B.C. Шаров, Т.Б. Суслова, A.H. Деев, Ю.А. Владимиров. Активация хемилюминесценции при перекисиом окислении липидов комплексными соединениями европия с тетрациклином.// Биофизика.- 1980.- т.25.- №5,- С. 923 924.

48. Wang Y., Liu W., Wang К., Shen G., Yu R. Fluorescence optical fiber sensor for tetracycline.// Talanta.- 1998.- Vol.47. P.33-42.

49. Pena A., Palilis L.P., Lino C.M., Silveira M.I., Calokerinos A.C. Determination of tetracycline and its major degradation products by chemiluminescence.// Anal. Chem.Acta.- 2000.- Vol.405. P.51-56.

50. Hirsch R., Ternes Т., Haberer K., Kratz K. Occurrence of antibiotics in the aquatic environment.// The Science of the Total Environment.-1999.- Vol.225. -P.109-118.

51. Figueroa R. A., Leonard A., MacKay A. A. Modeling Tetracycline Antibiotic Sorption to Clays.// Environ. Sci. Technol.- 2004.-Vol. 38.- P.476 -483.

52. Charest M.G., Siegel D.R., Myers A.G. Synthesis of (-) tetracycline.//!, of the Amer. Chem.Soc.- 2005.- Vol.127.- P.8292-8293.

53. Дашевский В.Г. Конформационный анализ органических молекул. -М.:Химия, 1982.-272 С.

54. Дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм в органической химии. Пер.с англ. /под ред. Снатцке Г. М.: Мир, 1970.

55. Джерасси К. Дисперсия оптического вращения. Применение в органической химии. Пер.с англ./Под ред. В.М.Потапова М.: Издинлит, 1962. - 397 С.

56. Свердлова О.В. Электронные спектры в органической химии.- JL, 1985.-248С.

57. Грошева В. И., Золин В.Ф. Кинетические исследования процесса комплексообразования тетрациклина с ионами РЗЭ методом кругового дихроизма.//Тезисы докладов X Всесоюзного совещания "Физические методы в координационной химии".- Кишинев, 1990.- С.42.

58. Грошева В.И., Золин В.Ф. Спектры кругового дихроизма комплексов тетрациклина с ионами металлов.//Координационная химия.- 1994. Т.20,-№5.- С.397-400.

59. Яцимирский К.Б., Костромина Н.А., Шека З.А. и др. Химия комплексных соединений редкоземельных элементов.- Киев: Наукова думка, 1966.- 493С.

60. Грошева В.И. Влияние одновалентных катионов на процесс комплексообразования тетрациклина с ионами самария.//Антибиотики и химиотерапия.- 2005.- Т.50 .- № 10-11.- С.3-7. *

61. Гороновский И.Т., Назаренко Ю.П., Некряч Е.Ф. Краткий справочник по химии. Киев: Наукова Думка, 1974. - С.24-25.

62. Самойлов О.Я. Структура водных растворов электролитов и гидратация ионов,- М.: Издательство АН СССР, 1957. 179 С.

63. Грошева В.И. О влиянии природы растворителя на формирование комплексов тетрациклин: самарий.// Тезисы докладов V Всесоюзного Совещания "Проблемы сольватации и комплексообразования в растворах".-Иваново, I99L- С.62.

64. Золин В.Ф., Коренева Л.Г. Редкоземельный зонд в химии и биологии.- М.: Наука, 1980.-349 С.

65. Бабушкина Т.А., Трошева В.И., Золин В.Ф., Коренева Л.Г. Изучение комплексообразования тетрациклина с ионами лантаноидов методами оптической и ЯМР-спектроскопии.// Координационная химия.- 1997.- Т.23.-№9.- С.709-711.

66. Золин В.Ф., Трошева В.И., Бабушкина Т.А. ЯМР и оптическая спектроскопия комплексов лантанидов с тетрациклином.// Тезисы докладов VI Всесоюзного Совещания "Спектроскопия координационных соединений".- Краснодар, 1990.- С. 157.

67. Золин В.Ф., Коренева Л.Г. Применение математического моделирования электронных спектров для исследования строения комплексов лантанидов в растворе.// Журн. Структ. Химии. 1983. - Т.24. - №5. - С.60-66.

68. Лен Ж.-М. Супрамолекулярная химия. Концепции и перспективы. Пер. с англ./Под ред. В.В.Власова, А.А. Варнека.- Новосибирск: Наука, 1998-ЗЗЗС.

69. Drachev V.P., Thoreson M.D., Khaliullin E.N., Davisson V.Jo., Shalaev V.M. Surface-Enhanced Raman Difference between Human Insulin and Insulin Lispro Detected with Adaptive Nanostructures. // J. Phys. Chem. 2004.- Vol.108. - P. 18046-18052.

70. Drachev V.P., Nashine V.C., Thoreson M.D., Ben-Amotz D., Davisson V.Jo., Shalaev V.M. Adaptive Silver Films for Detection of Antibody-Antigen Binding. Langmuir, 2006, in press.

71. Петрова Т.П., Петрусевич Ю.М., Тен Д.И. Образование дипольных комплексов в растворах белков с малой концентрацией ионов тяжелых металлов: диагностика методом лазерного светорассеяния.// Квантовая электроника. 2002.- Т. 32.- С. 897-901.

72. Петрова Т.П. Анизотропные жидкости. Биологические структуры. -М.:Физфак МГУ, 2005. 111 С.-12594. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран.- М.: Наука, 1980. 320 С.

73. Трошева В.И. Применение метода кругового дихроизма для оценки чистоты препаратов тетрациклина.// Успехи в области изучения и производства антибиотиков. -М.: Труды ВНИИА, 1992.- С.148-154.

74. Трошева В.И. Спектральный контроль содержания примесей металлов в препаратах тетрациклина.//Антибиотики и химиотерапия.- 2006.- Т.51.-№2.- С.3-7.