Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности изменения фосфолипидов головного мозга и печени мышей при действии 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина и парентеральной фосфолипидной нагрузки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности изменения фосфолипидов головного мозга и печени мышей при действии 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина и парентеральной фосфолипидной нагрузки"

од

• ■ О V-

; 1 .... . О- I-

ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЙ ШОШПИДОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ПЕЧЕНИ МЬИЕЙ ПРИ ДЕЙСТВИЙ 1-МШ1-4-ФЕНИЛ-1,2,3,б-ТЕТРАГИДРОПИРИДИПА И ПАРЕНТЕРАЛЬНОЙ ШОЛИПИДНШ НАГРУЗКИ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени Кандидата биолог ических наук

>

Тверь, 1996

Работа выполнена в научно-исследовательском центре Тверской государственной медицинской академии

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Слюсарь Н. Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Падьмина Н, П.

кандидат биологических наук, доцент Карцова С. В.

Ведущая организация: Российская медицинская академия

последипломного образования

Зашита состоится "9. а4ар> ( с? 1995 г. в .

оо

на васедании диссертационного совета К 063.97.09 в Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70 "а", корп. 4, ауд. 34.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук,

доцент А. Н. Панкрушина

О б Ц А Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы определяется тем, что фосфолипиды, являясь универсальным компонентом биологических мембран, играют важную роль в реализации основных функций клетки: пролифератив-ной, энергетической, транспортной, реигпторной, разграничительной. Фосфолипиды, входя в состав мембган внутриклеточных орга-нелл, участвуют в компартментализации обменных процессов. Лущест-вует множество методов изучения обмена фосфолипвдов (Финдлей Дж. с ооавт., 1990; Кейтс М., 1975). Одним из важнейших биохимических показателей является их. количественное содержание в различных биологических объектах. Приводимые в литературе данные о количестве фосфолипидов • в одних и тех же структурах достаточно разноречивы (Крепе Е. М., 1981; Котик А. С соавт., 1980; АпэеП б. В. е1 а1., 1964). . Объяснить это можно тем, что использухлся различные методики выделение разделения и определения.этих молекул, которые адаптированы к конкретным исследованиям и не всегда могут быть применимы к .анализу других биологических структур. При оформлении окончательных результатов исследования наиболее распространенным способом выражения концентрации фосфолипидов является отношение массы фосфолипидов к массе.ткани, в которой они определялись. В исследованиях клеточных суспензий используется отношение массы фосфолипидвв.к числу клеток (Слюсарь Н. Н., 1933). Но при этом может возникнуть погрешность, так как масса ткани существенно зависит от ее влажности, а количество клеток в пробе, взятой для подсчета, может отличаться от их числа в образце, взятом для определения фосфолипидов. Другим . способом выражения концентрации фосфолипидов является отношение массы фосфолипидов к массе тканевого белка (РесЙсоп! М. Р. а1., 1990 ). Однако, ткань или ее

гомогенат не являются однородными средами и поэтому фрагмент ткани, взятий для определения бедка, может несколько отличаться по его содержанию от образца, в котором исследуются дилиды. Предполагаем, что определение йелка в осадке, остающемся после экстракции липидов, позволит более точно рассчитать концентрацию фосфо-липидов в различных биологических объектах.

Имеются работы об использовании фосфолипидов как лекарственных препаратов (Слюсарь Н. Н., 1993), а также о применении их для приготовления липосом с целью транспорта различных лекарственных веществ ((Зге£ог1ас11з В., 1983). Показано, что использование фосфолипидов позволяет' стабилизировать мембраны, оказывать влияние на функцию клеток и осуществлять .'транспорт лекарственных препаратов. Однако, недостаточно изучены изменения тканевых фосфолипидов под влиянием парентеральной фосфолипидной нагрузки нз фоне действия 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МЭТП). МФТП применяется для создания экспериментального паркинсонизма у животных, а кроме того, его аналоги встречаются в продуктах и отходах химической промышленности.

Делыо настоящего исследования явилась разработка нового рпо-соба анализа содержания фосфолипидов в тканях головного мозга и печени мышей и изучение особенностей обмена фосфолипидов под влиянием МЭТП и парентеральной.фосфолипидной нагрузки.

Задачи исследования;

1. Разработать новый способ анализа содержания тканевых фосфолипидов путем использования солюбилизации тканевого осадка, образующегося при экстракции липидов.

2. Исследовать изменения содержания фосфолипидов стриатума, коры головного мозга и печени мышей под влиянием МЭТП.

3. Изучить изменения содержания фосфолипидов стриатума, коры головного мозга и печени мышей при парентеральной фосфолипид..ой нагрузке.

4. Выяснить особенности изменений фосфолипидного спектра стриатума, корн головного мозга и печени мышей под влиянием МВТП и при пзр?'п?~рзлы;ок фосфолипидной нагрук-э.

Новизна исследования. Предложен оригинальный способ анализа содержания фосфолипидов в коре головного мозга и печени мышей с использованием при этом солюбклизацию тканевого осадка, образующегося при экстракции липидов. Показано, что при растворении тканевого осадка не прийО.*одит 'потери количества белка, а это дает возможность определить его известными ягодами.

Впервые изучено влияние КЮТП на содержание фсхзфслипидов в стриатуме, коре головного мезга и печени мышей. Установлено, что иод действием М8ТП в стриатуме увеличено суммарное количество фосфатидных кислот и кардиолипинов в сравнении с контрольными животными, в то время как в коре головного мозга увеличено содержание фосфатидилинозитов; в печени обнаружено уменьшение содержания фосфатидилэтаноламинов и увеличение количества фосфатидилинозитов по сравнению с контролем. Следовательно, МЭТП способен оказывать влияние на обмен фосфолипидов 6 исследуемых биологических объектах.

Установлены изменения основных фосфолипидных фракций стриатума, коры головного мозга и печени мышей при парентеральной фос-фолипидной нагрузке кз фоне действия ШТП . Предполагается, что парентеральная фосфолипидная нагрузка способна оказывать влияние на фосфолипидный обмен в исследуемых тканях, изменяя при этом их содержание.. Показано, что парентеральная фосфолипидная нагрузка

меняет количество не только соответствующих фракций фосфсшшидов, но и других групп фосфосодержащих липвдов.

Теоретическое и практическое значение работы. Разработанный способ анализа фосфолипидов может быть использован в различных областях медико-биологических исследований: биохимии, клинической биохимии, биотехнологии, биомембранологии. Результаты исследований представляют интерес для патофизиологов, использующих МФТП для создания экспериментального паркинсонизма. Кроме того, они могут быть использованы в исследованиях биомембран, тералии фос-фолипидами и лилосомального лечения, в профпатологии.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о необходимости исследований новых путей модификации фосфолипидного состава тканей головного мозга и печени. %

Апробация работы. Основные положения диссертации и отдельные фрагменты работы докладывались и обсуждались на научной конференции Тверского государственного медицинского института.- Тверь, 1992; научной конференции Тверской государственной медицинской академии "Современные вопросы диагностики и лечения".- Тверь, 1994; международной конференции по изучению липосом.- Фрайбург, Германия, 1995; международном симпозиуме "Восстановительная нев-рология-3".- Иркутск, 1995; межкафедрадьном заседании сотрудников ТГМА.- 1996.

Публикации. По теме' диссертации опубликовано 5 научных работ и 2 рационализаторских предложения.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выво-

дов и описка литературы, включающего 163 источника, из которых 100 иностранных. Работа иллюстрирована 28 таблицами, 20 рисунками, 37 диаграммами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве адсорбента для ТСХ испсчьзовался силикагель марки L 5/40 ц ("Chemapol1', Чехия). Адсорбент наносили на пластинки методом осаждения его из хлороформенных суспензий (Грибанов Г. А., 1980). Фракционирование фосфолипидов осуществляли в камере, изготовленной на основе чашки Петри в системе хлороформ-метанол-концентрированная уксусная кислота-водь 25:15:4:2 (Финдлей Дж. с со-авт., 1990; Кейтс М., 1975; Молочкина Е. М., 1992). Количественное определение фосфора фосфолипидов проводили по методу Тёльга (Тёльг, 1973). Определение концентрации белка проводили микробиу-ретовым методом.

Маше одноламеллярные везикулы получали методом озвучивания дисперсии мультиламеллярных липссом из смеси яичного фосфатидил-холина и. холестерина (мольное соотношение соответственно 7:3) в растворено L-ДОФА 2,5 мг/мл или без него. Озйучивание проводили на аппарате УЗДН-2Т.

В исследованиях использовали беспородных белых мышей-самцов и мышей-самцов линии C57BL/6N 5-месячного возраста (всего 112). Животных умерщвляли дислокацией шейных поз: энков. Животные были разделены на 4 группы: I группа - контрольные животные; II группа - мыши, которым вводился 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропири-дин (МФТИ); III группа - мыши которым вводился МФТП и суспензия липссом, содержащих L-ДОФА; IV. группа - мыши, которым вводился МФТП и суспензия лгагосом без L-ДОФА. I и II группы без ПФН. III н IV группы с ПФН. Контрольной группе животных во время Есех инъек-

Г 8 -

ций опытным мышам вводили 0,9Х NaCl.

Для экстракции липидов иг тканей мозга и печени использовали метод Фолча (Folch J. et al., 1957).

Результаты обрабатывали статистически с использованием критерия Стыодента (Плохинский Н, А., 1970; Лакин Г. Ф., 1900). Для расчета исследуемых биохимических показателей и статистической обработки испольвовались оригинальные компьютерные программы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Усовершенствование ряда параметров анализа фосфолипидов, При изучении обмена фосфолипидов используются методики выделения фосфолипидов, разделения их на фракции с последующим количественным определением и выражением концентрации различными способами. Однако, существует множество факторов, оказывающих негативное влияние на процессы анализа, что приводит к низкой воспроизводимости и точнооти результатов, а это снижает их информативную ценность. .

В настоящей работе для повышения качества результатов исследования был использован ряд методических разработок:

• * * '

Предложен способ оценки'активнооти силикагеля, позволяющий быстро осуществить этот процесс и заключающийся в том, что определяют подвижность по тонкому слою силикагеля одного из азокраси-телей: судана II (желтый), Судана III (оранжево-красный), Судана IV (красный) или их.смеси в токе хлороформа, рассчитывая показатели Rf, характеризующие степень активности адсорбента. При использовании силикагеля марки L 5/40 ц "Chemapol" и других видов силикагеля полученные результаты свидетельствуют о том, что различные условия:

а) когда разделение фосфолипидов происходит неудовлетворительно (большинство фракций мигрируют к линии фронта);

б) когда разделение фосфолипидов происходит хорошо без предварительной активации тонкого слоя силикагеля;

в) после предварительной активации тонкого слоя силикагеля в течение 30 «ттн при температуре 100-120°С;

г) пластинку с тонким слоем силикагеля помещали на стеклянные палочки в чашку Петри с фильтровальной бумагой, обильно смоченной дистиллированной водой и выдерживали в термостате при 37°С и течение 3х часов;

в значительной степени отличаются величинами х 100 для азокра-сителей (диаграмма 1). Предложенный способ оценки активности силикагеля позволяет быстро дать ее количественную характеристику в виде величин И аэокрасителей и экспериментально подобрать оптимальные условия (границы значений И") для разделения фракций ли-пидов методом ТСХ.

Диагоамма 1 . Диаграмма 2

ВЛИЯНИЕ « ШИШИИ НА КМ 00

ЫрШгШ

90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00

0 12 3 ВРПЮ АШВАЦИЦ ЧАСН

Разработанный способ "мягкой" активации (выдерживание пластинок с тонким слоем сшшкагеля в камере с кристаллическими СаШе и ИаОН) позволяет получать слои с различной степенью активности. О том, как происходит активация сшшкагеля, можно судить, по изменению подвижности азокрасителей в токе хлороформа после того, как пластины о тонким слоем сшшкагеля выдерживались в чайках Петри со смоченной водой фильтровальной бумагой в термостате при 38" С в течение 3-х часов и подвергались "мягкой" активации различное количество времени (диаграмма 2).

Можно ааыетить,.что наиболее быстро процеоо активации происходит в течение первого к третьего часов.

Использование наиболее распространенного способа активации (15-30 мин, 100-120*) приводило к ухудшению выделения фракции фосфатидилсеринов. При "мягкой" активаций такого явления не наблюдалось. По-видимому, при термическом воздействии может происходить нарушение структуры силикателя, что, возможно, и приводит к ухудшению выделения фракции фосфатидилсеринов.

Определение содержания белка в тканевом осадке,' образующемся ' при экстракции липидов, позволяет при минимальном количестве биологического материала получить максимальное количество биохимических показателей. При атом дипиды, присутствующие в исследуемом объекте, не мешают определению белка.

В литературе имеются данные о том, что в соотаве биологичео--ких мембран присутствуют белки, обладающие гидрофобными свойствами, которые при экстракции липидов переходят в липидный экстракт.-Однако, есть информация и о том, что содержание таких белков очень невелико (Финдлей Дж. с соавт., 1990; СэегЬаи. Т. е1 а1., 1994).

- и -

С другой стороны, если измерять концентрацию белка широко распространенными методами (биуретовый метод, метод Лоури) непосредственно в образце, без предварительной экстракции липидов, то возникает сомнение в том, что бедки с гидрофобными свойствами будут при этом количественно обнаруживаться. Так, для определения концентрации гидрофобных белков предложена специальная процедура (Qanbar R. et al., 1994), причем данные, получаемые этим способом оказываются примерно в 2 раза выше, чем при использовании метода Лоури.

Таким образом, измерение концентрации белка в тканевом осадке позволяет количественно определить практически весь белок, содержащийся в конкретном исследуемом образце.

. В литературе имеются данные о растворении белковых осадков с использованием щелочей . и детергентов (Северин С. Е. и соавт., 1989). Brooks S. Р. et al., 1995 указывают на то, что растворение тканевых белков в 57. додецилсульфзте натрия в 0,5 н NaOH с последующим количественным определением биуретовым методом является наиболее оптимальным по сравнению с другими применявшимися процедурами. Достичь растворения тканевого осадка, образующегося при экстракции липидов можно различными способами, иолользуя щелочи, детергенты и нагревание. Но, эти способы оказываются неравноценными с точки зрения сохранения количества белча в образце, а этот параметр имеет в данном случае решающее значение. Так, нагревание при темперзтурэ 95±5 ° С приводит к уменьшению концентрации белка (диаграмма 3), по-видимому, причиной этого является щелочной про-теоллз. Вместе о тем, нагревание при температуре 38е С не оказывает влияния на концентрацию белка (диаграмму 4). Таким образом, возможно использование растворения тканевого' осадка, образующего-

Диаграмма 3

Диаграмма 4

ВЛИЯНИЕ 1.40 1.20 1.00 <о.ао 3 0.60 0.40 0.20 0.00

L00ЩЮг

тот опит

0 2 4 fi В 10 НРЙЯ НАГРЕВАНИЯ 1ИНУШ

wem

1.40 1.20 1.00 |о.во

"(1.40 0.30 В.00

1 2 ji в i Ii)

»аИНАПШВД. киот

ся при экстракции липидов, для определения концентрации белка, что, в свои очередь, делает возможный выразить концентрата) фос-фолипидов отношением; фосфалипиды / белок тканевого осадка.

Все методические разработки применялись в дальнейшем для анализа содержания фосфолипидов в тканях мышей при действии Ш>ТП и парентеральной фосфолипидной нагрузки.

2. Содержание фосфолипидов в тканях мышей в корме, при действии М&ТП и парентеральной фосфолипидной-нагрузки. . На основании получений результатов можно сделать в а: сличение о том, что содержание фосфолипидов стриатума подвержено существенным изменениям при дейстзии МФТП и парентеральной фосфолипидной нагрузки (ПФН).

Происходит снижение относительного уровня сфингомиелкнов на фоне введения >ЧШ1 под влиянием липосом, содержащих L-ДОФА по сравнению с действием только МФТП на 17,6Х (p<C,ül). Одновременно абсолютное содержание сфингомиелинов оказывается ниже в группах животных с ПФН (III и IV) на 23,3% (р<0,001) и 24,8% (р<0,05),

соответственно, по сравнению с животными, которым вводился только МИП (II). Абсолютный уровень сфингомиелинов снижается под вгчя-нием парентеральной фосфолипидной нагрузки на 29.37. (р<0,05). Уменьшение уровня сфингомиединов может происходить под действием некоторых ферментов, например сфингомиелиназы или фосфолипазы D (Брокерхоф X. и соавт., 1978)

Аналогичный тип изменений характерен также для фосфа.идили-нозитов. Так, под влиянием липосом различного состава на фоне дейстзяя М5ТП происходит снижение как относительного на 18,IX (III, р<0,01) и 14,2% (IV, р<0,05), так й абсолютного на 22,АХ (III, р<0,05) и 25,07. (IV-, р<0,01) содержания этих фосфолнпидов по сравнению с;действием только МФТП (II). Результаты влияния ПФН на абсолютное содержание фосфолипидов позволяют обнаружить уменьшение фосфатидшгинозитов под влиянием парентеральной фосфолипид-ной нагрузки на 1Б,8Я (р<0,05). Изменения в содержании ФИ можно объяснить, о одной стороны, уменьшением их синтеза, а, с другой стороны, усилением их распада, особенно под влиянием фосфолипаз С и D. Еще один процесс, приводящий к снижению уровня ФИ - это фос-форшшрование фосфатидилинозитов под действием ферментов киназ. Известно также, что активация фосфатидилиноэиткиназ происходит Тогда, когда запускается фосфатидилннозитольный механизм реакции клетки на определенные, внешние воздействия.' Имеются данные, что дофаминовые рецепторы участвуют в активации фосфолипазы С, запускающей фосфатидилннозитольный каскад (Болдырев А. .А., 1990; Felder Christian С. et al., 1989)

Анализ биохимических данных позволяет сделать вывод о различии между группами животных с ПТН, обусловленном, по-видимому, содержимым липидных везикул. Так, при введении на. фоне действия

МФТП "пустых" липосоы (IV) относительное содержание фосфатидилсе-ринов оказывалось выше на 17,ЗХ (р<0,05), чем при введении липо-сом с L-ДОФА (III).

Особенно заметны изменения и в относительном, и в абсолютном суммарном содержании кардиолипинов и фосфатидных кислот. Под влиянием МФТП+липосом с L-ДОФА и МФТП+липосом без L-ДОФА происходит увеличение относительного содержания этих фосфолипидов по сравнению с контролем на 86,32 (р<0,001) и 44,2%. (р<0,001), соответственно, при действии лшосом с L-ДОФА и МФТП также увеличивается содержание КЛ+ФК по сравнению с действием только МФТП на БО.1% (р<0,05). Все эти данные подтверждаются исследованием абсолютного содержания фосфолипидов. При атом, в абсолютных данных обнаруживается также различия в содержании кардиолипинов , и фосфатидных кислот между группами I и II, а кроме того, и между группами III и IV. Так, под влиянием МФТИ происходит увеличение этих фосфолипидов на 23,4% (р<0,001) по сравнению о контролем, а у животных, которым вводились липидные везикулы без L-ДОФА, уровень этих ли-пидов был выше на 27,БХ (р<0,0Б), чем у животных,' которым вводились липосомы С L-ДОФА.

Анализ абсолютного содержания позволил обнаружить изменения в содержании фосфатидилхолинов и фосфаткдилзтаноламинов. Так, на фоне действия МФТП "пустые" липосомы уменьшали уровень ФХ как по сравнению с контролем (на 19,07., р<0,05), так и по сравнению о действием только МФТП (на 16,9£, р<0,01); Фосфатидлэтаноламинов содержится меньш у животных под влиянием введения ККТП и различных липосом (III и IV) на 32,0% (р<0,001) и 18,6% (р<0,001), соответственно, чем при действии только МФТП (II). Кроме того, МФТП

нМ липил.нпгр «юоьора / иг влажной пшни

о о о

№ О

о

ГО M

О CT

о о

о о

vv\\v\v\\\\\\v\\v\\\w\\\\\4\\\4wv

НИШ' llllllillinnillllllll--

s ®

o i 1 1 1

iiiimiwitmiawuimiiimTimui

ПЕзь-

e _ = e

% липилнпгр eoccopa

№ N U

о W о С71 О СЛ о

о о о о о О ь

о • о о о о о о

ш

ИЩНЦг*

14\v\\\\v\\\\\\\\\\v\4\\\\\\\\\\\\\\\\\\

uitititiiiimiiiiiiiiiiniiitiii

и липосомы с L-ДОФА уменьшают уровень ФЭА по сравнению о контролем на 40,0% (р<0,05). Имеются различия и между группами, которым вводились различные липосомы. Так, у животных IV группы фосфгси-дилэтаноламинов содержится больше, чем у животных группы III па 19,72 (р<0,05). Изучение влияния парентеральной фосфоляпидной нагрузки также позволило обнаружить уменьшение относительного на 15.1% (р<0,05) и абсолютного на 30 % (р<0,05) содержания фосфати-дилэтаноламинов и снижение абсолютного уровня фосфатидилхолинов на 14,9% (р<0,05). Все статистически достоверные изменения, обнаруженные в стриатуме, представлены на диаграммах 5 и 6.

По сравнению со стриатумом в коре головного мозга обнаруживается меньше изменений. Данное явление можно объяснить, по-видимому, различным строением гематоэнцефалического барьера или же неодинаковым набором ферментов.

Биохимические данные, полученные при исследовании коры головного мозга, позволили обнаружить, что йод влиянием МФТП происходит увеличение процентного содержания фракции фосфатидилинозитов на 7,5% (р<0,05). Введение же на фоне МФТП липосом о L-ДОФА привело к еще большему приросту содержания этих фосфолипидов' на 11,43% (рс0,001). Однако, у животных, которым вводили "пустые" липосомы, уровень фосфатидшшнозитов оказался значительно ниже, чем у животных III группы на 18,51% (р<0.05) и не отличался ог контроля. "

Данные абсолютного содержания фосфолипидов свидетельствуют о более низком уровне' фосфатидилинозитов после введения МФТП и "пустых" липосом на 20,4% (р<0,05) по сравнению с действием МФТП я липосом с L-ДОФА. Кроме того, данные в нМ липидного фосфора / мг белка тканевого осадка обнаруживают более низкое содержание

фосфатидилинозитов у животных IV группы и по сравнению с действием только МФТП на 21,5% (р<0,01), и по сравнению с действием МФТП и липосом с Ь-ДОФА на 23,2% (р<0,01). В то же время, следует сказать о том, что введение "пустых" липосом на фоне действия МФТП приводило к увеличению относительного содержания фосфатидилсери-нов на 16,32 (р<0,05), а под влиянием парентеральной фосфолипид-ной нагрузки прирост составил 12,3% (р<0,05).

Относительное содержание фосфатидилэтаноламинов при инъекции на фоне действия МФТП липосом с Ц-ДОФА оказалось ниже, чем при введении только МФТП (на 8,362, р<0,05) или МФТП + "пустых" липосом (на 4,6%, р<0,05).

Все статистически достоверные изменения, обнаруженные в коре головного мозга, представлены на диаграммах 7 и 8.

Происходили перемены количественного содержания фосфолипидов и в печени. Так, под влиянием парентеральной фосфолипидной нагрузки происходит уменьшение относительного содержания лиэофосфо-липидов на 27,7% (р<0,05). Но это, однако, не подтверждается данными в абсолютных единицах. В то же время, обращает на сбя внимание тот факт, что относительный уровень лизофосфолипидов (на 40,8%, р<0,05) и их содержание в нМ липидного фосфора / мг влажной ткани (на 41,9%, р<0,05) под действием липосом с Ь-ДОФЛ на фоне введения М5ТП значительно ниже, чем при влиянии только МФТП, а это косвенно может свидетельствовать о снижении активности фос-фолипаз. Известно, что фосфолипиды и Ь-ДОФА, нейтрализуя свободные радикалы в реакциях перекисного окисления липидов, препятствуют разрушению фосфолипидов фосфолипааой Аг и уменьшают генез лизофосфатидилхолина (Венгеровский А. И. и соавт., 198").

Наибольшие иамеьения обнаружены как в относительном, тыс и в

Диаграмма 8. Содержание фооштидил-иноэитов в коре головного нбэга мышей

г50.00

Ж 0.00 №

III IV II III группы животных

Р/М №

7 19 -

абсолютном содержании фосфатидилхолинов. Анализируя эти данные, можно с уверенностью сказать, что под влиянием парентеральной фосфолипидной нагрузки происходит увеличение содержания фосфатидилхолинов в печени. Поскольку фосфатидилхолин является основным материалом в составе липидныи вевикул, это соответствует данным о том, что значительная часть липосом поглощается печенью (бге^оП-асНБ в., 1933; ЗсЬегроГ в., 1983; Бородин Е. А. и соавт.,. 1985; Исанин Н. А. и соавт., 1984; Торчилин В. П. и соавт., 1979; Саа-тов Т. С. и соавт., 1990).

Так, относительное содержание ФХ в печени оказалось больше у животных, которым на фоне введения МФТП инъецировались липосомы с Ь-ДОФА по сравнению с контрольными животными (на 4,9%, р<0,01) и * животными, которым вводился только МФТП (на 6,2%, р<0,001). Кроме того, относительное содержание ФХ под влиянием МФТП и "пустых" рпосом стало выше на 4,9% (р<0,05), чем при действии только МФТП. Данные абсолютного содержания в нМ РЛИп / мг белка тканевого осадка свидетельствуют об увеличении содержания ФХ у животных, которым вводились липосомы (III и IV) по сравнению с животными, которым липосомы не вводились (I и II) (р<0,05).

Кроме того, под влиянием МФТП происходит снижение относительного уровня фосфатидилэтаноламинов на 8,Б% (р<0,05) по сравнению с контролем. Введение липосом с Ь-ДОФА возвращает его к исходному. "Пустые" же липосомы не оказывают, такого действия. У животных IV группы содержание ФЗА на 4,5% (р<0,01) ниже, чем у ' контрольных. Обращает на себя внимание увеличение на 17,9% (р<0,05) уровня фосфатидилиновитой под влиянием МФТП при анализе данных в нМ Рлип / мг влажной ткани.

При анализе данных в нМ РЛИп ./ мг белка привлекает к србе

Диаграмма 9, Содержание фосфолипидов в печени мышей

ЛФЛ ФХ фэа

фракции фосфолипидов

Диаграмма 10. Содержание фосфолипидов

в печейи ИЕшгй

J 250.00

¡g 200.00 \

§•150.00

100.00

В 50.00 ^ 0.00

•Я"

СМ ФХ

Фракции фосфолипидов

CZD

IV

»gga

баз ПФН

ES

с ПФН

внимание увеличение содержания сфингомиелинов под влиянием липо-сом с Ь-ЦОФА по сравнен™ как о животными, которым не проводилась парентеральная фосфолипидная нагрузка (I и II) на 74,27» (р<0,001) и 64,3% (р<0,01), соответственно, так и с животными которым вводились "пустые" липосомы (IV) на 27,3% (р<0,05). Этим фактом, возможно, объясняется отсутствие большого количества изменений в содержании других фосфолипидов, поскольку имеются данные о снижении активности фосфолипааы С в печени при .увеличении концентрации сфингомиелинов (МотсЫ^а-Рапкоуа А.В. еЬ а1., 1994). Все статистически достоверные изменения, обнаруженные в печени, представлены на диаграммах 9 и 10.

Результаты исследования свидетельствуют, что изменения ;<нт рагивают в той или иной степени большинство классов фосфолипидоь. Обращает на себя внимание неполное соответствие данных относительного и абсолютного содержания фосфолипидов. Так, в некоторых случаях обнаруживаются изменения или только относительной, или только абсолютной их концентрации. Однако, если изменения обнаруживаются и в относительном, и в абсолютном количестве, то они имеют одну и ту же направленность. Большее количество изменений обнаруживается в абсолютном, чем в относительном содержании фос-. фолипидов..

Таким образом, полученные в исследовании данные свидетельствуют о влиянии .ШТП, липосом "пустых" и липосом с Ь-ДОФА на обмен фосфолипидов в различных тканях животных. Каждая фракция фосфолипидов в клетке может быть отнесена к различным метаболическим пулам. Тем не менее, полученные данные позволяют сделать вывод, что парентерально вводимые фосфолипидные везикулы оказывают влияние на липидньш состав клеток и, в частности, их меи^рянны;:

структур, что необходимо учитывать при проведении исследований, а также в ходе применения лгагасомальных препаратов на практике. Возможно, что модификация фосфолипидного состава мембран даже при действии липосом, не несущих какого-либо действующего начала, может приводить к изменению функционального состояния клетки.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован рйд параметров (определение активности и активация силикагеля на пластинах), позволяющих' более эффективно выделять различные классы фосфолипидов методом ТСХ.

2. Для выражения концентрации фосфолипидов в различных биологических объектах может быть использовано отношение массы фосфолипидов к количеству белка солгабилизированного тканевого осадка, образующегося после экстракции липидов. При растворении осадка определяется практически весь белок, содержащийся в конкретном исследуемом образце.

3. Обнаружено, что МФТП оказывает'влияние на количественное содержание некоторых фосфолипидных фракций стриатума (увеличение КЛ+ФК б 1,2 раза), коры головного мозга (увеличение ФИ в 1,08 раза) и печени (уменьшение ФЭА в 0,9 раза и увеличение ФИ в 1,2 раза) в сравнении с их показателями в соответствующих биологических объектах у мышей контрольной группы.

4. Установлено, что при парентерачьной фосфолипидной нагрузке на фене действия МФТП происходят количественны* изменения таких фракций липидсв как ЛФЛ, СМ, ФИ, ФХ, ФЭА. а это свидетельствует о том, что влияние ПФН затрагивает не тольга фракции фосфолипидов , входящих в состав липосом.

Б. Установлено падшие разлтий влияния на фон? действия МФТП липосом с Ь-ДОФА и без него на количественное содержание

фосфолипидов в стриатуме (SC на 17,3%, ФЭА на 19,7%, К Л iФК на 27,6%), корё головного мозга (ФИ на 20% , ФЭА на 4,6%) и печени (СМ на 27,3%) мышей.

6. Парентеральная фосфолипидная нагрузка оказывает влияние на количественное содержание фосфолипидов в стриатуме, коре головного мозга и печени, затрагивая различные биохимические механизмы (синтетазные, гидролитические, трансферазные реакции и взаимодействие липосом с клетками).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЭШ ДИССЕРТАЦИИ

1. Динамика'быстрых изменений липидов у больных с сердеч-■ но-сосудистой патологией / Тезисы докладов научной конференции

"Ученые института практическому здравоохранению".- Тверь, 1992.Т. 1.- С. 78.

2. Сравнение режимов минерализации при определении органического фосфора / Материалы научной конференции "Современные вопросы диагностики и лечения".- Тверь, 1994.- С. 70. (соавт. На-местникова И. В.)

3. The influence of liposome-encapsulated L-DOPA on striatum in mice with experimental parkinsonian syndrome / Fourth liposome research days conference.- Albert-Ludwigs-University, Freiburg, Germany, 199§.~ P. P10. (соавт: Юрасов В. В., Кудрин В. С., Куче-ряну В. Г., Никушкин Е. В., Каплун А. П., Швец В. И., Крыжановс-кий Г. Н.)

4. Изменение фосфолипидов, фосфоинозитидов в кропи больных инфарктом миокарда /, Сб. научн. трудов: "Клиническая и экспериментальная кардиология".- Тверь/ 1996.- С. 34-38. (соавт. Слюсарь Н. Н., Каргаполов А. В., Лопина Н. П.)

5. Липосомы, нагруженные L-ДОФА как средство для коррекции

двигательных расстройств при паркинсоническом синдроме / Тезисы докладов международного симпозиума: "Восстановительная неврсцо-гиг-З".- Москва, 1995.- С. 95-96. (соавт. Юрасов В. В., Кучеряяу В. Г., Крыжановский Г. Н., Никушкин Е. В., Сакдалов Ю. Г., Каплун А. П., Швец В.' И.)

6. Способ количественного определения белка в тканевом осадке, образующемся после экстракции липидов. Удостоверение на рационализаторское предложение N 1765, выданное 26.10.95 в Тверской государственной медицинской академии.

7. Способ анализа содержания фосфолипидов в тканях животных. Удостоверение на рационализаторское предложение N 1764, выданное 26.10.95 в Тверской государственной медицинской академии.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

ЛФЛ - лизофосфолипиды, КЛ - кардиолипины, .

МФТП - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин,

Ш'Н - парентеральная фосфолипидная нагрузка,

Рлип - "липидный" фосфор,

СМ - сфингомиелины,

ТСК - тонкослойная хроматография,

ФИ - фосфатидилинозиты,

ФК - фосфатидные кислоты,

ФЛ - фосфолипиды,

ФС - фосфатидилсерины,

ФХ - фосфатидилхолины,

ФЭА - фосфатидилэтаноламины,

Р/М - нМ Рл„п ' мг влажной ткани,

Р/Б - нМ Рдип / мг белка тканевого осадка.