Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности изменений фосфолипидов головного мозга и печени мышей при действии 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина и парентеральной фосфолипидной нагрузки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности изменений фосфолипидов головного мозга и печени мышей при действии 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина и парентеральной фосфолипидной нагрузки"

На правах рукописи

ПОДГОРйИ Геннадий Николаевич

ш>

/,//}

осовэшлм измшдо шошвдов ГШШЮГО МОЗГА И ПЕЧЕНИ ЙЙЕЯ ПРИ ДШШ 1-МШ-4-ШЛ-1,2,316-ШАГИДР(Ш>ИДИНА И ПМШШЮА шшшдаой НА1?УЗКИ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ якссерташм на соискание ученой степени кандидата бкшюпчесгаа наук

Тверь, 1096

Работа выполнена в научно-исследовательском центре Тверской государственной медицинской академии

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Ошосарь Н. Н.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Падьмина Н. П.

кандидат биологических наук, доцент Карцова С. В.

Ведущая организация: Российская медицинская академия

последипломного образования

Защита состоится "Я6" МОрТр 1Э96 г. в

0О

на заседании диссертационного совета К 063.97.09 в Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70 "а", корп. 4, ауд. 34.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета

Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук,

доцент А. Н. Панкрушина

. 'о В Л А Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы определяется тем, что фосфолипиды, являясь универсальным компонентом биологических мембран, играют важную роль в реализации основных функций клетки: пролифератив-ной, энергетической, транспортной, реакторной, разграничительной. Фосфолипиды, входя в состав мембпай внутриклеточных орга-нелл, участвуют вкомпартменталиэации обменных процессов. Существует. множество методов, изучения обмена фосфолипндов (Финдлей Дж. с соавт., 1990; КейтсМ., 1975). Одним из важнейших биохимических показателей является их. количественное содержание в различных биологических объектах. Приводимые в литературе данные о количестве фосфр'липидов • в одних и тех же структурах достаточно разноречивы (Крепо Е. М4, 1981; Котык А. о соавт., 1980; Апзе11 Б. В. е1 а1., 1964). ^Объяснить ато можно тем, что используются различные методики выделения-, разделения и определения этих молекул, которые адаптированы к конкретным исследованиям и не всегда могут быть применимы к анализу других биологических структур. При оформлении окончательных результатов исследования наиболее распространенным способом выражения концентрации фосфолипндов является отношение массы фосфолипндов к массе.ткани, в которой они определялись. В исследованиях клеточных суспензий - используется отношение массы фосфолипндов. к числу клеток (Слюсарь Н. Н.. 1993). Но принтом может возникнуть' погрешность, так как масса ткани существенно зависит от ее влажности, а количество клеток в пробе, взятой для подсчета, может отличаться от их числа в образце, взятом для определения фосфолипндов. Другим способом выражения концентрации фосфолипндов является отношение массы фосфолипндов к массе тканевого белка- (РесИсоп! М. Р. е1 а1., 1990 ). Однако, ткань или ее

гомогенат не являются однородными средами и поэтому Фрагмент ткани, взятий для определения белка, может несколько отличаться по его содержанию от образца, в котором исследуются липиды. Предполагаем, что определение белка в осадке, остающемся после экстракции липидов, позволит более точно рассчитать концентрацию фосфо-липидов в различных биологических объектах.

Имеются работы об использовании фосфолипидов как лекарственных препаратов (Слюсарь Н. Н., 1993), а также о применении их для приготовления липосом с целью транспорта различных лекарственных веществ (ОгевопасИз 8., 1983). Показано, что использование фосфолипидов позволяет стабилизировать мембраны, оказывать влияние на функцию клеток и осуществлять .'транспорт лекарственных препаратов. Однако, недостаточно изучены изменения тканевых фосфолипидов под влиянием парентеральной фосфолипидной нагрузки ва фоне действия 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МОТ). МФТП применяется для создания экспериментального паркинсонизма у животных, а кроме того, его аналоги встречаются в продуктах и отходах химической промышленности. ' '

Дедью настоящего исследования явилась разработка нового способа анализа содержания фоьфолипидов В тканях головного мозга и печени мышей и изучение особенностей обмена фосфолипидов под влиянием МФТП и парентеральной .фосфолипидной нагрузки.

Задачи исследования;

1. Разработать новый способ анализа содержания тканевых фосфолипидов путем использования солюбилизации тканевого осадка, образующегося при экстракции липидов.

2. Исследовать изменения содержания фосфолипидов стриатума, коры головного мозга и печени мышей под влиянием МФТП,

3. Изучить изменения содержания фосфолипидов стриатума, коры головного мозга и печени мышей при парентеральной фосфолнпид..ой нагрузке. ..

4. Выяснить особенности ' изменений ' фосфодипидного спектра стриатума,: корн головного мозга и печени мышей под влиянием МФТП и при парентеральной фосфолипидной нагрузке. ' ' *

Новизна исследования. Предложен оригинальный способ анализа содержания фосфолипидов в коре головного мозга и печени мышей, с использованием при этом солюбилизацию тканевого осадка, образующегося при экстракции липидов. Показано» что при растворении тканевого осадка не происходит потери количества белка, а это дает возможность определить его известными методами.

• Впервые изучено влияние МЭТП на содержание фосфолипидов в стриатуме, коре головного мозга я печени мышей. Установлено, что под действием МВТП е стриатуме увеличена суммарное • количество фосфатидных кислот и кардиолипинов в сравнении с контрольными животными, в то время как в коре головного мозга увеличено содержание фосфатидилинозитов; в печени обнаружено уменьшение содержания фосфатидилэтаноламинов и увеличение количества фосфатидилинозитов по сравнению с контролем. Следовательно, МВТП способен оказывать влияние на обмен фосфолипидов 6 исследуемых биологических объектах, - - .

Установлены изменения основных фосфолишщных фракций стриатума, коры головного мозга и печени мышей при парентеральной фоо-Фолипидной нагрузке ез фоне действия МФТП . Предполагается, что парентеральная фосфолнпидная нагрузка способна оказывать влияние на фос-фолипндный обмен в исследуемых тканях, изменяя при этом их содержание. . Показано, что пар'-.лтеральнзл фосфолипиднзя нагрузка

- б -

меняет количество не только соответствующих фракций фосфолипидов,' но и других групп фосфосодерхащих липидов.

Теоретическое и практическое значение работы. Разработанный способ анализа фосфолипидов может быть использован в различных областях медико-биологических исследований: биохимии, клинической биохимии, биотехнологии, биомембранологии. Результаты исследований представляют интерес для патофизиологов, использующих МФТП для создания экспериментального паркинсонизма. Креме того, они могут быть использованы в исследованиях биомембран, терапии фос-фолипидами и лилосомального лечения, в профпатологии.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о необходимости исследований новых путей модификации фосфолипидного состава тканей головного мозга и печени.

Апробация работы. Основные положения диссертации и отдельные фрагменты работы докладывались и обсуждались на научной конференции Тверского государственного медицинского института.- Тверь, 1992; научной конференции Тверской государственной медицинской академии "Современные вопросы диагностики и лечения".- Тверь, 1994; международной конференции по изучение липосом,- Фрайбург, Германия, 1995; меадуиародйом симпозиуме "Восстановительная нев-рология-3".- Иркутск, 1996; межкафедралЪном заседании сотрудников ТГМА.- 1996. .

Публикации. По теме'диссертации опубликовано Б научных работ и 2 рационализаторских предложения.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собс-, твенных исследований, обсуждения результатов исследований, выво-

дав й списка литературы, включающего 163 источника, из которых 100 иностранных. Работа иллюстрирована 28 таблицами, 20 рис-нка-Ш, 37 диаграммами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДН ИССЛЕДОВАНИЯ

"В качестве адсорбента для ТСХ испсиьзовался сшшкагель марки L 5/40 ц ("Chemapol1', Чехия). Адсорбент наносили на пластинки методом осаждения его ив хлороформенных суспензий (Грибанов Г. А., 19éoj. Фракционирование фосфолипидов осуществляли в камере, изготовленной на основе чашки Петри в системе хлороформ-метанол-концентрированная уксусная кислота-водь 25:15:4:2 (Финдлей Дж. с со-авт.,: 1990; Кейтс М., 1975; МолочкИна Е. М., 1992). Количественное определение фосфора фосфолипидов проводили по методу Тёльга (Тёльг, 1973). Определение концентрации белка проводили микробиу-ретовым'методом. • .

Малые одноламеллярные везикулы получали методом озвучивания дисперсии мультиламеллярных липосом из смеси яичного фосфатидил-холина и. холестерина (мольное соотношение соответственно 7:3) в растворено L-ДОВА 2,5 мг/мл или без него. Озйучивание проводили на аппарате УЗДН-2Т.

В исследованиях использовали беспородных белых мьшей-самцов и мышей-самцов линии C57BL/6N 5-месячного возраста (всёго 112). Животных умерщвляли дислокацией шейных по?' энков. Животные были ■ разделены на 4 грумшг I группа - контрольные животные; II группа -.мыши, которым вводился 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропири-дин (NffiTII); III группа - мыши которым вводился МФТП и суспензия липосом, содержащих L-ДООА; IV группа - мыши, которым вводился МЗШ1 и суспензия липосом без L-ДОФА. I и II группы без ПФН, III и IV группы о,-ПФН...Контрольной группе животных во время всех инъек-

г 8 "

1 i.

ций опытным мышам вводили 0.9Х NaCl.

. Для экстракции липидов иг тканей мозга и печени использовали метод Фолча (Folch J. et aL, 1957).

Результаты обрабатывали статистически с использованием критерия Стыодента (Плохинский Н, А., 1970; Лакин Г. Ф., 1900). Для расчета исследуемых биохимических показателей и статистической обработки использовались оригинальные компьютерные программы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ 0БСУ1ДЕНИ8

1. Усовершенствование ряда параметров анализа фосфолипидов, При изучении обмена фосфолипидов используются методики выделения фосфолипидов, разделения их на фракции с последующим количественным определением и выражением концентрации различными способами. Однако, существует множество факторов, оказывающих негативное влияние на процессы анализа, что приводит к низкой воспроизводимости и точности результатов, а это снижает их информативную ценность. ,

В настоящей работе для повышения^качества результатов исследования был использован ряд методических разработок:

Предложен способ оценки1активнооти силикагеля, позволяющий быстро осуществить этот прппесс и заключающийся в том, что определяют подвижность по тонкому слою силикагеля одного из азокраси-телей: Судана И (желтый), судана III (оранжево-красный), Судана IV.(кратный) или их,смеси в токе хлороформа, рассчитывая показатели Rf, характеризующие степень активности адсорбента. При использовании силикагеля марки L 5/40 ц. "Chemapol" и других, видов силикагеля полученные результаты свидетельствуют о том, что различные условия:

а) когда разделение фосфолипвдов происходит неудовлетворительно (большинство фракций мигрируют к линии фронта);

б) когда разделение фосфолилидов происходит хорошо без предварительной активации тонкого слоя силикателя;

в) после.предварительной активации тонкого слоя силикагеля в течение 30 «¡ля при температуре 100-120°С;

г) пластинку с тонким слоем силикагеля помещали на стеклянные палочкй в чашку Петри с фильтровальной бумагой, обильно смоченной дистиллированной водой и выдерживали в термостате при 37°С и течение 3* часов;

в значительной степени отличаются величинами ИГ х 100 для азокра-сителей (диаграмма 1), Предложенный способ оценки активности силикагеля позволяет быстро дать ее количественную!, характеристику в виде величин И авокрасителей и экспериментально подобрать оптимальные условия (границы значений И1) для разделения фракций ли-пидов методом ТСХ.

Диагоамма 1 Диаграмма 2

ШЯВИЕ "мят**1

АЗОКР

00.00

во.оо

0 70.00

5 бо.оо

ь

50.00 40.00 30.00

НАИПОО

ОДИН

слив о сдан IV

0 1 2 3

ВГШ ШИВ/ШЖ ЧАШ

Разработанный способ "мягкой" активации (выдерживание пластинок с тонким слоем оиликагеля а камере с кристаллическими СаСДг и МаОН) позволяет получат» слои с различной степенью активности. О том, как происходит активация силикатедя, можно судить, по изменению подвижности азокрасителей в токе хлороформа после того, как пластины о тонким олоем силикат еля выдерживались в чашках Петри со смоченной водой фильтровальной бумагой в термостате при 38° С в течение 3-х часов и подвергались "мягкой" активации различное количество времени (диаграмма 2).

Можно заметить, что наиболее быстро процеоо активации происходит в течение первого к третьего часов.

Использование наиболее распространенного способа активации (15-30 мин, 100-120*) приводило к ухудшению выделения фракции фосфатидилсеринов. При "мягкой" активаций такого явления яе наблюдалось. По-видимому, при термическом вовдействии может происходить нарушение структуры сшздкагеля, что, возможно, и приводит к ухудшению выделения фракции фосфатидилсерцнов.

Определение содержания бедка в тканевом осадке,' образующемся при экстракции липидов, позволяет при минимальном количестве биологического материала получить максимальное количество биохимических показателей. При атом липиды, присутствующие в исследуемом объекте, не мешают определению белка.

В литературе имеются данные о том, что в составе бисшогичес--ких мембран присутствуют белки, обладающие гидрофобными свойствами, которые при экстракции липидов переходят в липидный экстракт. Однако, есть информация и о том, что содержание таких белков, очень невелико (Финдлей Дж. с соавт., 1990; СэегЬаН. Т. е! а1.,-1994).

_. С другой стороны, если измерять концентрацию белка широко распространенными методами (биуретовый метод, метод Лоури) непосредственно в образце, без предварительной экстракции липидов, то - ,---------

возникает сомнение в том, что белки с гидрофобными свойствами будут при этом количественно обнаруживаться. Так, для определения концентрации гидрофобных белков предложена специальная процедура (Qaribar R. et al., 1994), причем данные, получаемые этим способом оказываются примерно в 2 раза выше, чем при использовании метода Лоури.

Таким образом, измерение концентрации белка в тканевом осадке позволяет количественно определить практически весь белок, содержащийся в конкретном исследуемом образце.

. В литературе имеются данные о растворении белковых осадков с использованием щелочей,.,и детергентов (Северин С. Е. исоавт., 1989). Brooks S. Р. et al., 1995 указывают на то, что растворение тканевых белков в БХ додецилсульфзте натрия в 0,5 н NaOH с последующим количественным определением биуретовым методом является наиболее оптимальным по сравнению с другими применявшимися процедурами. Достичь растворения тканевого осадка, образующегося при экстракции липидов можно различными способами, используя щелочи, детергенты и нагревание. Но,' эти-способы оказываются неравноценными с точки зрения сохранения количества белка в образце, а этот' параметр имеет в данном случае решающее значение. Так, нагревание при температура 95±5 "С приводит к уменьшению концентрации белка iдиаграмма 3), по-видимому, причиной этого является щелочной про-теол.1з...Вместе о тем, нагревание при температуре 38* С не оказывает влияния на концентрацию белка {диаграмму. 4). Таким образом, возможно использование растворечия тканевого' осадка, образующего-

Диаграмма 3

Диаграмма 4

ВЛИЯНИЕ 1.40

1.20

(.00

0.В0

' Ü.60 !

0.40 0.20 0.00

.(Шии-

вшчш. am

о г 4 es ю тшшпшт, миетщ

1.4Q 1.20 Ш ¡0.60 'ало

фдяш-

0.40

В.00

а г

VOM

в <10 МИШ

ся при экстракции липидов, дм определения концентрации Оелка, что, в свою очередь, делает возможным выразить концентраций фосфолипидов отношением; фосфолипиды / белок тканевого осадка.

Все методические разработки применялись в дальнейшем для анализа содержания фосфолипидов в тканях мышей при действии МРГП и парентеральной фосфолипидной нагрузки.

2. Содералние фосфолипидов в тканях мыщей в норме, при действии МФТП и парентеральной фсхзфолипидиой нагрузки. .. На основании получений результатов можно сделать за:сличение о том, что содержание фосфолипидов стриатума подвержено существенным изменениям при действии МФТП и парентеральной фосфолипидной нагрузки (ПФН).

Происходит снижение относительного уровня сфингомиелинов на фоне введения "ФТП под влиянием липосом, содержащих L-ДОФА по сравнению с действием только М»ТП на 17,5% (р<0,01). Одновременно абсолютное содержание сфингомиелинов оказывается ниже в группах животных с IHM (III и IV) На 23,3% (р<0,001) и 24,8% (р<0,05),

соответственно, по сравнению с животными, которым вводился только ЩТП(П)т Абсолютный уровень сфингомиелинов снижается под веянием парентеральной фосфолипидной нагрузки на 29.2% (р<0,05). Уменьшение уровня сфингомиелинов. может происходить под действием некоторых ферментов, например сфингомиелинаэы или фосфолипазы D (Брокерхоф X. и соавт., 1978)

Аналогичный тип изменений характерен также для фосфа.идили-новиюв, Так, под влиянием липосом различного состава на фоне дейотзип W5TTI происходит снижение -как относительного на 18,IX (III, р<0,01) и 14,ЙХ (IV, р<0,05), так и абсолютного на ¿2,4% (III, р<0,05) И 23,07. (IV; р<0,01) содержания этих фосфолипидов по сравнению с, действием только ШШ (II). Результаты влияния ПФН на абсолютное содержание фосфолипидов позволяют обнаружить уменьшение фосфатидилиноэитов под влиянием парентеральной фосфолипидной нагрузки на 16,87. (р<0,05). Изменения в содержании ФИ можно объяснить, с одной стороны, уменьшением их синтеза, а, с другой стороны, усилением их распада, особенно под влиянием фоофолипаз С и D. Еще один процесс, приводящий к снижению уровня ФИ - это фос-форилированиэ фосфатидилиноэитов под действием ферментов кинаэ. Известно также, что активация фосфатидилинозиткиназ происходит тогда, когда запускается, фосфатидилннозитольный механизм реакции клетки на определенные внешние воздействия,' Имеются данные, что дофаминовые рецепторы участвуют в активации фосфолипазы С, запускающей фосфатидилинозитольный каскад (Болдырев А. А., 1990; Felder Christian С. et al., 1989)

Анализ биохимических данных позволяет сделать вывод о различии между группами животных с ПФН, обусловленном, по-видимому, содержимым лмпвдных везикул. Так, при введении на. фоне действия

г 14 -

ММП "пустых" липосом (IV) относительное содержание фосфатидилсе-ринов оказывалось выше на 17, ЗХ (р<0,05), чем при введении липо-сом с L-ДОФА (III).

Особенно гаметны изменения и в относительном, и в абсолютном суммарном содержании кардиодипинов и фосфатидных кислот. Под влиянием МЭТП+липосом с L-ДСШ и М®ТП+липосом без L-ДОФА происходит увеличение относительного содержания этих фоофолипидов по сравнению о контролем на 86,3% (р<0,001) и 44,2Х (р<0,001), соответственно, при действии липооом с L-ДМА и ШТП также увеличивается содержание КЛ+ФК по сравнению о действием только М®ТП на 60, IX (р<0,05). Все эти данные подтверждается исследованием абсолютного содержания фосфодипидов. При атом, в абсолютных данных обнаруживается также различия в содержании кардиодипинов ч и фосфатидных кислот между группами I и II, а кроме того, и между группами 111 и IV. Так, под влиянием М»ТП происходит увеличение этих фоофолипидов на 23,4% (р<0,001) по сравнению о контролем, а у животных, которым вводились липидные везикулы без L-ДОФА, уровень этих ли-пидов был выше на 2?,Б% (p<0,0S), чем у животных,' которым вводились липооомы 6 L-ДОФА.

Анализ абсолютного содержания позволил обнаружить изменения в содержании фосфатидилхолинов и фосфатидилзтаноламинов. Так, на фоке действия ШТП "пустые" дипосомы уменьшали уровень ФХ как по сравнению с контролем (на 19,0%, р<0,05), так и по сравнению с действием только МИТС (на 16,9%, р<0,01); Фосфатидлэтаноламинов содержится меньш у животных под влиянием введения ШТП и различных липосом (III и IY) на 32,0% (р<0,001) и 18,8% (р<0,001), соответственно, чем при действии только М®ТП (II). Кроме того, МЭТП

Диаграмма 5. Содержание фосфолипидов ; а стриатуме мышей

ЗС 00

СМ ' ФИ ФС ' КЛ+ФК ' ФЭА фракции фосфолипидов

25.00

20.00

-15.00

1000

5.00

0.00

Диаграмма 6. Содержание фосфолипидов в сприатупе мышей

СМ . ФХ ФИ ФЭА Фракций Оое®олипидо9

CZD I

ц

и липосомы о L-ДОФА уменьшают уровень ФЭА. по сравнению с контролем на 40,0% (р<0,05). Имеются различия и между группами, которым вводились различные липосомы. Так, у животных IV группы фосфгеи-дилзтаноламинов содержится больше, чем у животных группы III на 19,7% (р<0,05). Изучение влияния парентеральной фосфолипидной нагрузки также позволило обнаружить уменьшение относительного на 15,IX (р<0,05) и абсолютного яа 30 % (р<0,05) содержания фосфати-дилэтаноламинов и снижение абсолютного уровня фосфатидилхолинов на 14,9Х (р<0,05). Все статистически достоверные изменения, обнаруженные в отриатуме, представлены на диаграммах 5 и 6. ✓ По сравнению со стриатумом в коре головного мозга обнаруживается меньше изменений. Данное явление можно объяснить, по-видимому, различным строением гематоэнцефалического барьера или же неодинаковым набором ферментов.

Биохимические данные, полученные при исследований коры головного мозга, позволили обнаружить, что ¡!од влиянием МЭТП происходит увеличение процентного содержания фракции фосфатидя?инозитов на 7,6% (р<0,05). Введение же на фоне МФТП липосом о L-ДОФА привело к еще большему приросту содержания этих фосфолипйдов на 11,43% (р<0,001). Однако, у животных, которым вводили "пустые" липосомы, уровень фосфатиднлинозитов оказался значительно ниже, чем у животных III группы на 18,51% (р<0,05) и не отличался от контроля.

Данные абсолютного содержания фосфолипидов свидетельствуют о более низком уровне' фосфатидилинозитов после, введения МФТП и "пустых".липосом на 20,4% (р<0,05) по сравнению с действием ШБ и липосом с L-ДОФА. Кроме того, данные в нМ липидного фосфора / мг белка тканевого осадка обнаруживают более низкое содержание

фосфатидилинозитов у животных IV группы и по сравнению с действием только №ТП на 21,5% (р<0,01). и по сравнению с действием МФТП и липосом с Ь-ДОФА на 23,2% (р<0,01). В то же время, следует сказать о том, что введение "пустых" липосом на фоне действия МФТП приводило к увеличению относительного содержания фосфатидилсери-нов на 15,3% (р<0,05), а под влиянием парентеральной фосфолипид-ной нагрузки прирост составил 12, ЗХ (р<0,05).

Относительное содержание фосфатидилэтаноламинов при инъекции на фоне действия МФТП липосом с 1^-Д0ФА оказалось ниже, чем при введении только МФТП Сна 8,362, р<0,05) или МФТП + "пустых" липосом (на 4,6%, р<0,05).

Все статистически достоверные изменения, обнаруженные в коре головного мозга, представлены на диаграммах 7 и 8.

Происходили перемены количественного содержания фосфолипидов и в печени. Так, под влиянием парентеральной фосфолипидной нагрузки происходит уменьшение относительного содержания ливофосфо-липидов на 27,72 (р<0,05). Но это, однако, не подтверждается данными в абсолютных единицах. В то же время, обращает на с-бя внимание тот факт, что относительный, уровень лизофосфолипидов (на 40,3%, р<0,05) и их содержание в нМ липидного фосфора / мг влажной ткани (на 41,9%, р<0,05) под действием липосом с 1.-Д0ФА на фоне введения МФТП значительно ниже, чем при влиянии только МФТП, а зто косвенно может свидетельствовать о снижении активности фос-фолииаз. Известно, что фосфолипвды и Ь-ДОФА, нейтрализуя свободные радикалы в реакциях перекисного окисления липидов, препятствуют разрушению фосфолипидов фосфолипазой Аг и уменьшают генез лизофосфатидилхолина (Венгеровский А. И. и соавт., 1987).

Наибольшие измеьения обнаружены как в относительном, так и в

Диаграмма 7. Содержание фосфолипидов в коре головного мозга мышей

фракции фосфолипидов

Ляахрамма 0. Содержание фосфнтндил-инозитов в коре головного нбзга иышей

-50.00

III IV II ИГ группы животных

р/м

Р/В

абсолютном содержании фосфатидидходинов. Анализируя эти данные, можно с уверенностью сказать, что под влиянием парентеральной фосфолипидной нагрузки происходит увеличение содержания фосфатиг дилхолинов в печени. Поскольку фосфатидидхолин является основные) материалом в составе липидных везикул, это соответствует данрым о том, что значительная часть.дйпоссм поглощается печенью (Gregorl-adis Q., 1983; Scherpof 6., 1983; Бородин E. А. и соавт.,. 1985; Исанин Н. А. и соавт., 1984; Торчилин В. П. и соавт., 1979; Саа-тов Т, С. и соавт., 1990). ■

Так, относительное содержание ФХ в печени оказалось больше у животных, которым на фоне введения МФТП инъецировались липосомы с L-ДОФА по сравнению с контрольными животными (на 4,9%, р<0,01). и животными, которым вводился только МИЛ (на 6,2%, р<0,С01). Кроме того, относительное содержание ФХ под влиянием М$ТП и "пустых" ^ипосом стало выше на 4,9% (р<0,05), чем при действии только МФТП. Данные абсолютного содержания в кМ РЛИл / мг белка тканевого осадка свидетельствуют об увеличении содержания ФХ у животных, • которым , вводились липосомы (III и IV) по сравнению с животными, которым Липосомы не вводились (I и II) (р<0,05).

Кроме того, под влиянием МФТП происходит снижение относительного уровня фосфатидилэтаноламинов На 8,6% (р<0,05) по сравнению с контролем. Введение липосом с L-ДОФА возвращает его к исходному. "Пустые" же липосомы не оказывают такого действия. У животных IV группы содержание ФЭА на 4,5% (р<0,01) ниже, чем у ' контрольных. Обращает на. себя внимание увеличение па 17,9% (р<0,05) уровня фосфатидилинозитов под влиянием МФТП при анализе данных в нМ Рлип / мг влажной ткани.

При анализе данных в нМ РЛИп / мг белка привлекает к себе

Диаграмма 9, Содержание фосфолипидов в печени мышей

ЛФЛ ФХ ФЭА

фракции фосфолипидов

Диаграмма 10. Содержание фосфолипидов

в печейи мышей

250.00

jg 200.00

■150.00

100.00

50.00

0.00

СИЗ

СМ ФХ

Фракции фосфолипидов

внимание увеличение содержания сфингомиелинов под влиянием лшю-сом с Ь-ДОФА" по сравнению как с животными, которым не проводилась парентеральная фосфолипидная нагрузка (I и II) на 74,2% (р<0,001) и 54,3/Е (р<0,01), соответственно, так и с животными которым вводились . "пустые" -'.-липосомы С.IV) на 27,3*- (р<0,-05).' Этим фактом., возможно, объясняется отсутствие большого количества изменений в содержании других фосфолипидов, поскольку имеются данные о снижении активности фосфолипазы С в печени при увеличении концентрации сфингомиелинов (МотсЫ1оуз-Рапкоуа А.В. ейа!., 1994). Все статистически достоверные изменения, обнаруженные в печени, представлены нз диаграммах 9 и 10.•

Результаты исследования свидетельствуют, что изменения затрагивают в той или иной степени большинство классов фосфолипидов. Обращает на себя внимание неполное соответствие данных относительного и абсолютного содержания фосфолипидов. Так, в некоторых случаях обнаруживаются изменения или только относительной, или только абсолютной их концентрации. Однако, если изменения обнаруживаются и в относительном, и в абсолютном количестве, то они имеют одну и ту же направленность. Большее количество изменений обнаруживается' в абсолютном, чем в относительном содержании фос-. фолипидов..

Таким образом, полученные в исследовании данные свпдетельст: вукт о влиянии МФТП, липосом "пустых" и липосом с Ь-ДОФА на обмен фосфолипидов в различных тканях животных. Каждая фракция фосфолипидов в клетке может быть отнесена к различным метаболическим пулам. Тем не менее, полученные'данные позволяют сделать вывод, что парентерально вводимые фосфолипидные везикулы оказывают влияние на липидный состав клеток и, в частности, их мембранных

структур, что необходимо учитывать при проведении исследований, а также в ходе применения липосомаяьных препаратов на практике. Возможно, что модификация фоофолипидного состава мембран даже при действии липосом, не несущих какого-либо действующего начала, может приводить к изменению функционального состояния клетки.

ВЫВОДИ

1. Усовершенствован ряд параметров (определение активнооти и активация силикагеля на пластинах), позволяющих более эффективно выделять различные классы фосфолипидов методом ТСХ.

2. Для выражения Концентрации фосфолипидов в различных биологических объектах может быть использовано отношение маооы фосфолипидов к количеству белка солюбилизированного тканевого осадка, образующегося после экстракции липидов. При растворении осадка определяется практически весь белок, содержащийся в конкретном исследуемом образце.

3. Обнаружено, что №>ТП оказывает'влияние на количественное содержание некоторых фосфолипидных фракций стриатума (увеличение КЛ+ФК в 1,2 раза), коры головного мозга (увеличение ФИ в 1,08 раза) и печени (уменьшение ФЭА в 0,9 раза и увеличение ФИ в 1,2 раза) в сравнении с их показателями в соответствующих биологических объектах у мышей контрольной группы. 1

4. Установлено, что при парентеральной фосфолипидной нагрузке на фене действия МФТП происходят количественный изменения таких фракций липидов как ЛФЛ, СМ, ФИ, ФХ, ФЭА, а это свидетельствует о том, что влияние ПФН затрагиваем не только фракции фосфолипидов, входящих в состав липосом.

5. Установлено наличие различий влияния на фоне действия МФТИ липосом с Ь~ДС№А и без него из количественное содержание

фосфшшпидов в стриатуме (ФС на 17,3%, ФЭА на 19,7%, КД+ФК на 27,5%). коре головного мозга (ФИ на 20% , ФЭА на 4,6%) и печени (СМ на 27,3%) мышей. .

6. Парентеральная фосфолипидная нагрузка оказывает влияние на" количественное содержание фосфолипидов в стриатуме, коре го: ловного мовга и печени. затрагивая различные биохимические механизмы (синтетазнне,- Гяйрол'итические, трансферазные реакции и взаимодействие липосом с клетками).

; СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТОЙ ДИССЕРТАЦИИ

.1. Динамика'быстрых изменений липидов у больных с сердеч-• но-сосудистой патологией. / Тезисы докладов научной конференции "Ученые института практическому здравоохранению".- Тверь, 1992.Т. 1.- С. 78.

2. Сравнение режимов минерализации при определении органи г.ческого фосфора / Материалы научной конференции "Современные вопросы диагностики и лечения".- Тверь, 1994.- С. 70. (соавт. На-местникова И. В.)

3. The Influence of llposome-encapsulated L-DOPA on striatum . in mice with experimental parkinsonian syndrome / Fourth liposome

research days conference.- Albert-Ludwigs-University, Freiburg, Germany, 1996.- P. Pit), (соавт. Юрасов В. В., Кудрин. В. С., Куче-ряну В. Г., Никушкин Е. В., Каплун А. П., Швец В. И., Крыжановс-кий Г. Н.)

4. Изменение фосфолипидов, фосфоинозитидов в крови больных инфарктом миокарда /Сб. научн. трудов: "Клиническая и экспериментальная кардиология".- Тверь/ 1996.- С. 34-38. (соавт. Отосарь Н. Н., Каргаполов А. В., Лопина Н. П.)

Б. Липосомы, нагруженные L-ДОФА как средство для коррекции

двигательных расстройств при паркинсоническом синдроме / Тезисы докладов международного симпозиума: "Восстановительная неврсцо-

гиг-3".- Москва, 1995.- С. 95-96. (соавт. Юрасов В. В., Кучеряну

- - - - '

В. Г., Крыжановский Г. Н., Никушкин Е. В., Сандалов Ю. Г., Каплун А. П., Швец В.' И.)

6. Способ количественного определения белка в тканевом осадке, образующемся после экстракции липидов. Удостоверение на рационализаторское предложение N 1765, выданное 26.10.95 в Тверской государственной медицинской академии.

7. Способ анализа содержания фосфолипидов в тканях животных.. Удостоверение на рационализаторское предложение N 1764, выданное 26.10.95 в Тверской государственной медицинской академии.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ИСПОЛЬЗУШ В РАБОТЕ

ЛФЛ - лизофосфолипиды,

КЛ - кардиолипины, ; '

МФТП - 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагйдропиридин, ПФН - парентеральная фосфолипидная нагрузка," Рлип - "липидный" фосфор, СМ - сфингомиелины, ТСХ - тонкослойная хроматография, ФИ - фосфатидилинозиты, ФК - фосфатидные кислоты, ФЛ - фосфолипиды, ФС - фосфатидилсерины, ФХ - фосфатидилхолины, ' ФЭА - фосфатидилэтаноламины, Р/М - нМ РЛип / мг влажной ткани, Р/Б - нМ РЛип / мг белка тканевого осадка.