Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности использования и накопления нитрата в онтогенезе хлопчатника (Gossypium hirsutum L.)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности использования и накопления нитрата в онтогенезе хлопчатника (Gossypium hirsutum L.)"

MHO РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН

Таджикский Государственный Университет

fTu од

На правах рукописи

ОБУА Уче Герард

ОСОБЕННОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ И НАКОПЛЕНИЯ НИТРАТА В ОНТОГЕНЕЗЕ ХЛОПЧАТНИКА (Gossypium hlrsutum L)

(03.00.04. - биохимия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ДУШАНБЕ - 1995

Работа выполнена на кафедре биохимии Таджикского Государственного университета.

Научные руководители: член-кор АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук, профессор М.М. Якубова

и кандидат биологических наук, доцент Т.Д. Гиясов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор М.А. Бабаджанова кандидат химических наук Р.Н. Валиев

Ведущее учреждение - институт физиологии и биофизики растений АН Республики Таджикистан,. . .

Защита диссертации состоится "¿А"__ 1996 г.

в час на заседании специализированного совета К065.01.07

по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Таджикском Государственном университете (734025, г. Душанбе. Пр. Рудакй , д. 17).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Таджикского Государственного университета.'

¿ваяема* „ " ^

Ученый секретарь Специализированного совета

1995Г.

кандидат б.юлогическич наук- / З.М. Хамрабаева.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность трнц: В настоящее время проблема обмена нитрата у растений составляет самостоятельную главу физиологии минерального и азотного питания.. Эвопюция фототрофных растительных организмов проходила на фоне лимитированного снабжения минеральным азотом, и высшие растения приспособились к его запасанию. Нитрат является основным источником азотного питания для растительных организмов п триродной среде, Он, з отличие от аммония, не токсичен для растения и может накапливаться в тканях в больших количествах (Прянии-'ников, 1945; Измайлов,1986; Крастина и др., 1986; Вееуегэ, Надетап, 1980;Яаупеэ, 1986.

Способность, различающаяся у разных видов, либо эффективно усваивать нитрат, либо накапливать его е тканях, связана с решением ряда проблем, в частности, таких как: эф^кгявкость использования нитрата почвы и улучшение качестза сельскохозяйственной продукции.

Знание закономерностей распределения нитрата в ¡тетках, тканях и органах растений является ключом к раскрытию систем эффективного использования из среды, перерас ределенип и запасания нитрата, и выяснению механизмов регуляции этих процессов. В свою очередь это позволит разработать достоверные мегоды диагностики азотного питания растений (Измайлов, 1981, 1986; Соколов, Бубнова, 1989).

В общем круговороте азотосодержащих веществ в растении листья являются не только акцептором изота, но и его донором для репродуктивных органов. .Листья непосредственно влияют на многие стороны жизнедеятельности растений и во многом определяют рост, развитие, формативные процессы, накопление отдельных продуктов м урожай растений (Ничепорович, 1972; Андреева, 198В).

Азе/, поглощенней растением, не перешедшим еще о релродук-гиЕНуо фазу, мигрирует преимущественно в молодые органы и, прежде всего, в листья и аккумулируется в них (Вгаг, 1982; Клвйко-т, Алехина, 1992). Судьба азота, поглощенного растениями, ь'есьиа различна и тесно связана с ключевым ферментом - нитрат-редуктазой и с функционированием ГС-ГСТ-циклом. В растущих органах происходит активная переработка поступающего азота, благодаря чему устанавливается взаимосвязь между ростом, притоком азота и его ассимиляцией (Измайлов, Смирнов, 1965).

Изучение азотного обмена-в онтогенезе растений хлопчатника и его взаимосвязь с углеродным обменом все больше привпекает внимание исследователей (Усманов, 1981; Якубова, Гиясов, 1990). В процессе развития хлопчатника появление новых листьев продолжается до конца онтогенеза растений. По мере роста и развития от проростка до взрослого плодоносящего растения у хлопчатника и перераспределение азота в органах очевидно имеет определенные особенности. Роль листа в этом процессе будет определяться не только онтогенезом самого листа, но возрастом растения и остается малоисследованным.

Нитратредуктаза (НР) всесторонне исследуется не только эн-зинопогами, но и физиологами растений. Это, прежде всего, связано с ее ключевыми позициями в цепи реакций утилизации нитрата и активность НР используют для оценки интенсивности этого процесса н растениях (ВсеуегБ, Надешап, 1980; Зг1уаз1а-уа. '1980). Однако, по многим чажныи физиолого-биохимическим аспектам изучение Э1ого фермента мнения авторов часто противоречивы, что вероятно свиано с вгсской лабильностью НР (Ьпойкова, Алехина, 1Г91).

В лигерлимелся сведения. что активность НР, поток «итр?.*ов г- лил ;, их нлчоппетш в зеленых тканях меняются в за-

висимости от стадии развития листа и растения (Darwinkel, 1975; Хавкин, 1976; Back, Renner, 1989 и т.д.). Однако исследования этих показателей азотного обмена и анализ взаимосвязи между поступлением, восстановлением и накоплением N0$ параллельно в онтогенезе листа и растения в целом практически не проводились

i

, (Клюйкова, Алехина, 1992).

Цель и зппачи исслепованид: Целью нашей работы явилось выявление степени координации между, ростом и ключезыми показателями азотного обмена в онтогенезе отдельного листа и в зависимости от роста и развития растения.

В связи с этим решались следующие задачи:

- изучить темпы формирования листьев (скорость роста листовой пластинки, накопление сырой и сухой массы чиста) в зависимости от фаза развития растений у различных форм хлопчатника;

- оптимизировать условия выделения и определения активности нитратредуктазк из листьев хлопчатника и амаранта in vitro;

- исследовать динамику изменений в онтогенезе листа и растений активности нитратредуктазы и содержания разных ферм азота в тканях различных форм хлопчатника;

- выявить зависимость НРА листьев хлопчатника и амаранта от светового режима дня;

- сопоставить изменения активности нитратредуктази - кпа-«евого Фермента азотного обмена с динамикой изменения содпр^л-ния окисленной (нитраты) и восстановленной формы а .юга ь онтогенезе листа и растений.

Научнля койизцд. Огпичительной чертой данной работ« является комплексное изучение показателей роста и азоп.эго сскпнг. а также анализ взаимосвязи между поступлением, встстачовл^сие* и накоплением нитратов в процессе онтогенеза листа v ойстчсш-.: хлопчатника.

Установлено, что наибольшая скорость формирования листовой пластинки .1 УППЛ наблюдается . у молодых листьев 6-8-дневного возраста в фазе бутонизации растений. Между динамикой НРА, содержанием нитрата и восстановленного азота в онтогенезе хлопчатника существует определенная скоординированность, которая зависит от интенсивности роста фотосинтезирующего органа и стадии развития растений. Результаты проведенных исследований вносят вклад в расширение представлений об онтогенетическом аспекте азотного обмена на уровне восстановления нитрата.

Оптимизированы условия выделения активных ферментных препаратов. ВР из листьев хлопчатника и показано, что для хлопчатника характерно наличие ух максимумов НРА в зависимости от светового режима дня.

Прзктинеакая -Значимость., работы. Выявленная сортовая специфика в ростовых параметрах и НРА может служить как база для разработки физиолого-биохимвческих тестов при оценке исходного селекционного материала с цельо получения наиболее перспективных фори хлопчатника.

Методические приемы изучения показателей азотного обмена используются в большой практикуме, а также при выполнении курсовых и дипломных работ студентов кафедры биохимии Таджикского Госуниверситета.

Апробация. .работа. Материалы диссертации докладывались на первой научной конференции биохимического общества Республики Таджикистан "Проблемы биохимии" (сентябрь, 1993); традиционных апрельских конференциях профессорско-преподавательского состава Таджикского Госунивэрситета (Душанбе, 1994, 1995 гг.); семинаре группы азотного обмена кафедры физиологии растений ИГУ (Москва, 1995 г.); расширенном заседании семинара кафедры биохимии биологического факультета ТГУ ^Душанбе, 1995г.).

Структура.,и^абьенлиссертацни.. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (четырех глав), заключения, выводов. .Рабата изложена на <35 страницах машинописного текста, содержит "И таблиц и 24 рисунка. Список цитируемой литературы включает 163 источника (работ огечгстоен-^ных и зарубежных авторов).

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве обьекта исследования были использованы различные сорта и линии наиболее перспективных форм средневолокни-стого хлопчатника (0оБзур1ит (игзишт I..), а также амаранта (Атагапт сатМиз).

Растения различных форм хлопчатника выращивали з полевых условиях Гпссарской опытной станции НПО "Земледелие" Академии сельхознаук республики Таджикистан с соблюдением вссх агротехнических приемов.

Для изучения необходимых параметров в онтогенезе растений, всегда брались листья 3-4 яруса с апекса, достигшие 40-50* максимального размера листовой пластинки. Также в каждой фазе развития растений определенное количество листьев (50-80 штук) анкетировались и в возрасте 8-10 дней не зависимо от размера брались для проведения необходимых анализов. Перед опытом листья промывали холодной проточной еодой, а ззгем ополаскивали предварительно охлажденной дистиллированной водой и промокали.

^ Мы сердечно благодарны сотр^дшнлм кафедры физиологи« растении МГУ им. М. В. Ломоносова и особенно профессору П. Д. Алехиной за любезна предоставленную нал» возможность и всяческую помощь во время освоения .методов, выполнении работы и обсуждения результатов.

Для того, чтгбы знать его возраст, в начале фазы бутонизации у все^ трех исследованных форм хлопчатника появившиеся листочки с зоне ростг, (270-300 растений) подвергали анкетированию. Пробы брали через каждые 2-3 дня у помеченных листьев до полного их формирования (40-50 дней).

В исследованиях также использовали листья растений различных форм хлопчатника и амаранта, выращенные на опытном участке кафедры биохимии Таджикского госуниверситета.

Активность., .нитратреду стазы _J.n_ . уМЕ_определяли методом Яворского (Jworsky, 1971).

Активы 0С1Ь-_ямтратре ду.кха it со определяли по методу

Хагемана (Hageman, Huck! у, 1971) с некоторыми модификациями, внесенными Клюйковой и Алехиной (Клюйкова, Алехина, 1991).

Выпеденк? нитоатредуктазы для определения ее активности методом in vitro проводилось на основе методики Лилло (Lillo, 1983), модифицированной Клюйковой и Алехиной (Клюйкова, Алехина, 1991). Ферментный препарат получали при растирании на холоду мелко нарезанных листьев со средой выделения, содержащей: 50 мм трис-HCI буфер, pH 7,8; 10 мм цистеин; 10 мм ЕДТА; 0,001% тритон Х-ЮО и 0,5-3% казеин. Соотношение среды выделения и массы листьев составляло (4 мл 6y;jpa: 0,5 г листьев). Полученную массу после растирания быстро фильтровали через два слоя капроновой ткани и в грубом фильтрате определяли активность НР(1). Часть гомогената центрифугировали при ' 8000 об/мин при 0+4 "С в течение 20 минут. В полученном супернатанте после центрифугирования также определяли АНП (II).

риале потенциометрическим методом 'при помощи ион-селективного электрода (Разумова и др., 1978).

Содержание восстановл"нногп язотя определяли по методу

определяли в сухом растительном мате-

Любошинского и Зальта (Мернавина и др., 197В).Этим методом можно определить NH4*, образующийся неппсредагаейнА после сжигания растительного материала, не отгоняя аммоний.

.3. ЕЕЗУЛЬТАТЫ_ИССЯЕД0МИ11Й_И_]1К_1)Б.СУВД[:ИИ1

3.1. Рост листьев различных форм хлопчатника в онтогенезе .

При физиогого-биохичических исследованиях периодизация возраста писта очень важна, так как дает об1.активные критерии оценки его роста (Мокроносов, 1981; Stoddart, Thomas, 1982) и для хлопчатника такого рода результаты практически отсутствовали до начала наших исследований (Гиясоа, 1992),

Показано, что лист хлопчатника проходит три основные фазы роста: фазу возрастания скорости и соответственно ускорения роста в период от заложения листа до возраста максимального ускорения (Tj), что для всех трех форм хлопчатника соответствовало 0-4-дневному листу (рис. 1); фазу максимальной скорости I „о га и снижения ускорения от Г^ до возраста максимального отрицательного ускорения роста (Т3) (4-14-дневные, з для Киргиз-ский-3 - 4-19-дневные листья), когда у хлопчатника скгристь роста листа возрастает до максимальной с 4 по 8-11 дни, а затем с 8 по 14-19 дни скорость уменьшается, а ускорение приобретает отрицательный знак; фазу уменьшения скорости и увеличения отрицательного ускорения - от 7j до остановки роста листа. Продолжительность третьего периода для изученных форм хлопчатника несколько отличается, что, по-видимому, связано с разнецеи между исследованными формами в максимальной площади гистсчой пластинки, а также скорости роста листьев (рис. 1).

%

«г, /1«

Т„

£

А I ! 1

8 ' 21 31 47 2 8 Н 21 31

/2.03 Л-оу^Ч- ^¿ьс-гп^-,

Рис.1. Анализ роста листа хлопчатника. Т1 - возраст максимального ускорения роста

Т2 - возраст наибольшей скорости роста и нулевого ускорении,

72 - возраст максимального отрицательного ускорения I - Киргизский-3; II - Иехргон:

Исследования ростовых параметров листа 8-дневного возраста (3-4 яруса от точки роста) различных форм хлопчатника в онтогенезе растений показало (рис. 2), что начало динамики всех исследованных нами параметров (скорость роста ли, га (см2/сутк(), сырая и сухая масса единицы площади листа (г/см2). площадь одной листовой пластинки и его сырая и сухая масса) от фазы 5-6 настоящих листочков.до бутониззции имеет нарастающий характер, а в фазе цвэтения наблюдается заметное снижение перечисленных параметров, далее в фазах ллодообразования м созревания коробочек падение приобретает плавный характер. Такая динамика изученных параметров характерна для всех трех исследованных объектов. Листья 6-дневного возраста и одинакового расположения в кусте (3-4 ярус с точки рос,а) в разных фенофазах ортогенеза

3 ч

s2

i' fjjJ?t^i^^-i г.- мл-о

S-MAxplObL.

I] jp 'У Y t I] III iy Y .

Рис.2; Некоторые параметры роста 8-дневного листа различных форм хлопчатника в онтогенезе (I - вегетация, II - бутонизация, III - цветение, IV - плодообраэование, V - созревание) pcLcrFitHJJ-u..

растения имеот ра личные размеры листовой пластинки, и наибольшая ее вепчина наблюдается в фазе бутонизации, что соответствует для сорта Кизгизский-3 - С7.6 см2, МЛ-9 - 28,4 см2 и Мехргон - 21,6 см2 (рис.2). Листья в этой фазе по размеру превосходят идентичные листья в других фенофазах. .

Результаты, представленные в рис. 2, также показывают, что наибольшая УПП листа (г/см2) у всех трех форм хлопчатника соответствует фазе бутонизации, чго в 1,5-2 раза больше, чем □ других фазах роста растений. При сравнении различных форм хлопчатника, нетрудно заметить, что хотя динамика изученных ростовых параметров листа для всех трех форм имеет одинаковый характер, однако скороспелый сорт ^гизский-З превосходит своего мутанта МЛ-9 и сорт Мехргон в фазе бутонизации по скорости роста листа в см2/сутки на 40-70%, а по размеру листозой пластинки на 3565%, в остальных же фазах существенных различий не наблюдается.

Анализ полученных результатов свидетельствует, что скорость и продолжительность фазы роста, динамика формирования листовой пластинки, накопление сырой массы единицы площади листа и УПП Л для исследованных нами 3 форм растений хлопчатника в онтогенезе листа и растений имеет сортовую специфику. В наибольшей степени формы хлопчатника различаются по таким показателям, как скорость роста листа и продолжительность ее фаз,

*

массы одного листа 8-дневного возраста и УППЛ.

3.2. Содержание различных форм азота в онтогенезе листа и растений

Определение содержания М03- ионов и восстановленного азота по мере роста листа было проведено на параллельно зафиксированное материале в дни определения нитратредуктазной активности потенциометрическим методом. Полученные результаты представлены

на рис. 3.

В начале динамика содержания ионов нитрата в расчете мкмоль N03 * г сухой массы (рис З.А.) имеет нарастающий характер и достигает своего максимального значения для всех изученных форм хлопчатника' у листьев 8-днесного возраста. Однако таксе высокое со.пержание нитрата (80-95 мкмоль М0}*г сухой массы) сохраняется лишь несколько дней и у 14-дневнчх листьев резко снижается до уровня 30-40 дневного возрасга) или имеет очень плавно снижающийся характер. При сравнении различных форм хлопчатника по этому показателю достоверная разница между ними не наблюдается (рис. З.А.).

Рис. 3. Динамика содержания нитрата в очтгииезо листа (А) и растений (Б) различных ф"»рм (а - Киргизскии-3, б - йехргси, в - МЛ-9) хлопчатника ро$Ь- рлхт.:

Динамика содержания НОз в листьях 13-14 дневнрго возраста в онтогенезе растений показала, что в начальных фазах роста (рис. 3.5.) этот параметр имеет нарастающий характер и достигает своего максимального значения в фазах образования младоэле-ментов - бутонизации и цветения. В дальнейшем по мере перехода растений к фазе плодообразования содержание нитрата постепенно снижается и продолжает снижаться до фазы созревания, однако, несмотря на это уровень содержания МОз в более поздних фазах роста растений остается сравнительно выше, чем в фазу вегетации.

Рис. 4. Динамика содержания восстановительного азота в онтогенезе листа (А) и растений (Б) различны* "форм хлопчатника',, (а - Киргизский-3; 5- '

Изучение изменения содержания восстановленного азота Fi онтогенезе листа и растения показало (рис. 4.А.), чго наибольшее содержание этой формы азота j онтогенезе листа наблюдается у листьев 4-8 дневного возраста, а в дальнейшем кривые имеют плавно снижающийся характер до прекращения роста листа. Такая ,картина характерна всем 3-м изучаемым нами формам хлопчатника. Сорт Нехргон почти в течение всего онтогенеза листа от 2 до 30 дневного возраста превосходит две остальные формы на "0-25%. Содержание восстановленного азота в расчете на г сухого веса листа наблюдается о начальных фенофззах онтогенеза при переходе растений на фазы интенсивного образования плодоэпементов достаточно резко снижается. Такая же картина наблюдается и при пересчете содержания восстановленного 'азота в Икг N х Г сухого веса листьев (рис. 4.Б), однако при этом случае снижение начинается более позже, в фазе начала плодообразования и наибольшее ее содержание соответствует фазе цветения. При сравнении различных форм существенных отличий не наблюдается. Такая динамика содержания восстановленной формы азота вероятно связана с тем, что в более поздних фазах онтогенеза растений по мере возрастания количества ллодоэлементов в кусте хлопчатника возрастает отток ассимилятов (в том числе азотосодержацих) к зтич плодоэлементам. Эти результаты (рис. 4.Б.) также хорошо согласуется с результатами наших исследований (Бободханова, Гитсоз, 1984; Гиясов, 1992), где было показано, что наибольшее содержание водорастворимых белков в листе в онтогенезе различных форм растений хлопчатника"! фазах бутонизации и цветения.

3.3. Оптимизация условий выделения и определения активности HP.

Известно, что HP рсесторорне исследуется т гог.ьто онзк

мологами, но и фи-лологами растений. Однако по многим важным физиолого-б'.'охимическим аспектам изучения этого фермента мнения авторов часто противоречивы. Это ясляегся следствием того, что -штратредуктаза очень лабильна и ее активность зависит от многих факторов, действующих на нативный фермент, а также на фермент в процесса его выделения и инкубации (Клюйкова, Алехина, 1991).

Оптимизация условий выделения и определения активности ключевого фермента восстановления нитратов - нитратредуктазы, показало, что HP является не только очень лабильным, но и ви-доспецифичным ферментом. Это выражается в том, что оптимальные условия выделения и олрег чния активности HP in vitro из листьев хлопчатника и амаранта существенно различаются: среда выделения по методу Яилло (Lillo, 1983) была оптимальной для получения активных ферментных препаратов из листьев амаранта (табл. 1), однако для хлопчатника оказалось необходимым наличие высокой концентрации казеина в среде выделения (18-20 мг/мл).

Оптимальное значение рН среды выделения для HP хлопчатника смещено в щелочную сторону (рис. 5) и равно 8,0. и даже при рН, 8,2 значение АИР сохраняется на сравнительно высоком уровне. Это связано, видимо, с тем, что хлопчатник с энзимологической точки зрения является сложным объектом и его листья отличаются большим содержанием фенольных соединений, которые при экстракции листьев в буфере намного снижают значение рН среды выделения (Бабаджанова, Гиясов, 1984). Кроме того, неочищенные ферментные препараты HP из листьев хлопчатника в среде определения активности in vitro (табл.1) оказались более термолабильными (с оптим. t=37"C), чем из листьев амаранта {27"С).

По другим условиям выделения и определения ее активности • HP из листьев хлопчатника и "маранта не различались (табл.1).

Таблица 1

Сводная таблица оценки оптимальных условий при выделении и определении активности нитратредуктази

УслоЬии б&омения. и est^-e^izs/ejisj- Л Я/-/Р

cPu^pta-H-m-

рИ сре-с>&- 7Г» 8,0- 8,1

рН реешуиснмой qpeBu Ф .7,2

Содержав/г ' меыеижг. /5 среде. 4,5- 2,0 is-го

ЙлнЦ- rfWs бреамц. среде (atJi) 10-16 Ю-45

tioHU t/J/A-H i/?еа*4. среде (JUJV) 0,2 . 0,2

i QyrnuM. (°C) Ц-П 30 ■ ъ°

27 .35 - Ъ7

Рис 5. Влияние рН среды выделения на определяемую методом in vitro активность HP из листьев хлопчатника (1) и амаранта (2)

Таблица 2

Активность нитратредуктазы из листьев хлопчатника в зависимости от условий выделения ферментного экстракта (метод in vitro), %

1 Супернатант 1 1 Среды выделения без 1

1 казеина 1 ЕДТА 1 цистеина 1 1 тритона 1

1 75 1 - Г 70 I 80 1 ! 90 1

Примечание: За 100 % принята активность 4,8 Н0^«ч-1-г-1 с ферментным препаратом, выделенным по модифицированному (Среда выделения содержала 20 мг/мл казеина) мендоЛилло (Ш1о, 1983)

После выяснения оптимальной концентрации казеина в среде выделения для НР хлопчатника мы сравнивали активность нитратредуктазы, выделенной по методике Хагемана и др. с ценрифугирова-нием 8000 об 15 минут (Надетап, Ниск1езЬу, 1971), и по процедуре без центрифугирования грубого фильтрата (Ш1о, 1983), АНР из листьев хлопчатника оказалась на 25% выше в грубом фильтрате чем в супернатанте (табл. 2). Важно отметить, еще и то, исключение центрифугирования из процедуры выделении позволило существенно сократить время получения ферментного препарата.. Активность нитратредуктазы падала на 10-30%, если из среды выделения исключали отдельные стабилизирующие добавки (табл.2) и полностью отсутствовала при использовании среды выделения б?а. казеина

3.4. Суточный ритм АНР листьев хлопчатника и амаранта

Нами также изучалось - суточный ритм нитратредуктазной активности листьев хлопчатника и амаранта, выращенных в полевых условиях методом ln vivo. Полученные результаты представленные на рис.. 6., показали, что ход кривых динамики НРА листьев хлопчатника и амаранта в течение фотопериода имеет некоторую видовую специфику: нитратредуктазная активность листьев амаранта постепенно растет и достигает своего наибольшего значения 14-1Ь часам дня, и далее к 18 часам наблюдается заметное снижение уровня активности^ ИР. Нитратредуктазная активность листьев хлопчатника также в начале фотопериода имеет нарастающую динамику, которая продолжается не долго, до 9-10 часов утра. В дальнейшем, к 12-13 часам дня наблюдается некоторое падение уровня АНР. После полудня АНР резко возрастает и достигает 3Í

2 \

\

A \

7 ж / \

Л

\

ч

' " л / 4

/ / V

ж

g00 goo ю,0 iZoo l33» ,5«» {6,о

Ьре-к-А-. СуЛокс* С «""О

Рис.6. Ритм изменений AHR листьев хлопчатника (1) и амаранта (2), определяемый методом in vivo в течение светового периода. (начало фотопериода - 6:45, конец - 20:00)

своего максимального значения к 15-16 часам.

При сравнении кривых АНР листьев хлопчатника и амаранта (рис.6) нетрудно заметить, что для хлопчатника в отличие от амаранта, характерно два пика (первый маленький - 9-10 часов, второй большой - 15-16 часов) высокой АНР в течение фотоперио- ■ да. Эти результаты хорошо согласуются с вышеприведенными литературными сведениями, которые утверждают, что динамика изменения нитратредуктазной активности во времени в течение суток у растений, растущих в разных физиологических условиях (Кондратьев и др., 1983; Клюйкова'. и Алехина, 1991) или у растений разного возраста и таксономических групп (Macduff Trim, 1986) может иметь разный характер.

Таким образом, анализ полученных результатов и сведений литературы указывают на изменчивость уровня АНР в течение фотопериода в зависимости от обьекта и физиологических условий выращивания растений, что необходимо учитывать при проведении сравнительных физиолого-биохимических исследований ключевого эщт восстановления нитратов - HP.

3.5. Активность нитратредуктазы и усвоение азота в онтогенезе листа и растения у различных форм хлопчатника.

Активность ключевого фермента азотного обмена - нитратредуктазы (HP) широко используют для оценки интенсивности процесса восстановления нитратов в растениях (Srivastave 1980; Beevers, Hageman, 1980). Однако не мало и публикаций где.указывается, что сдвиги в АНР не отражают изменений в процессе восстановления нитратного азота (Reílly, 1976, Beevers, Наде«ш,1980; Клюйкова, Алехина, 1983; 1991, 1992).

Определение АНР прямым методом (in vivo) показало, что в

первой фазе роста листа хлопчатника (рис. 7) она возрастает и наибольшая активность IIP наблюдается в 8-10 дневном возрасте, у 13-15-дневных листьев несколько снижается (перед первым поливом), а затеи постепенно повышается и сохраняется на этом уровне до 30-35 дневного возраста. Такая динамика АНР 'характерна для всех трех изученных нами форм хлопчатника и хорошо согласуется с результатами ранее проведенных нами исследований (Гиясов, 1992) у шести различных генотипов хлопчатника.

Сходная динамика АНР и снижение активности фермента по мере роста листьев сои (Beth М. Nelson-Schreiber et al, 1986) и пшеницы (Клюйкова,^ Алехина, 1992) наблюдалась другими исследователями. Авторы полагают, что ограничивающими факторами активности HP в ста реющих листьях является ослаблением притока N03 из корнгй. Вторая причина снижения АНР - замедление скорости обновления и сдвига з сторону распада белка под синтезом в стареющих тканях (Beth М. Nelson-Schreiber et al, 1986).

При сопоставлении кривых изменение АИР и содержания различных форм азота (рис. 7) нетрудно заметить, что начал'1 динамики АНР, содержание N03 ионов и восстановленной формы азота в молодом быстрорастущем листе имеют одинаковый характер и достиг,- г своих наибольших величин в фазе интенси.. ого роста листа Тх у 8-10 дневных листьев. В дальнейшем по мере, роста до 40-днсчного возраста листа уровень восстановленного азота имеет плавно снижающийся характер. Содержание N03, как и АНР достаточно резко снижается в 13-14-дневных листьях перед первым поливом, а в дальнейшем кривые содержания N03 и АНР имеют противоположный характер: АНР экспонсиально возрастает, содержание ПОз плавно снижается до конца роста листьев (рис. 7).

Падение активности HP и содержание N03 наблюдаемое перед первым поливом растений (рис. 7 (1)), видимо связано с недос-

cxoHObJttMHOiH ;азота (3) в тканях листа хлопчатника в онтогенезе (Л-АНР, мкмоль Шг-Г"1 сыр.массы ч"1; Б - NO3 , мкмоль*Г сыр. массы; Б - мкг. вост. азота-Г сыр. массы листа)

татком воды, который может влиять: а) на содержание самого НР-белка, что подтверждается снижением восстановленной формы азота (рис. 7 (3)), а также динамикой содержания водорастворимых белков (Гиясов, Якубова, 1991); б) на содержание НОз в связи с уменьшением притока аниона из корней в листья.

Непрерывное увеличение содержания окисленного азота в молодом ювенильном' листе хлопчатника свидетельствует о том, что приток нитратов постоянно превышает объем их восстановления. Поступающие в лист нитраты не только служат источником азота ("осле ;ix восстановления) для синтеза органических соединений.

но и выполняют и некоторые другие функции: участвуют в регуляции осмотического потенциала (Veen, Kleinckdorst, I985), играют определенную роль в поддержании катионно-анионного баланса тканей (Kirkly, 1986), служат запасом азота, который расходуется в период стресса (Chapin et al, 1988). Полифункциональность нитратов определяет, очевидно, необходимость их более высокой аккумуляции в быстрорастущем листе (Клюйкова, Алехина, 1991).

Результаты исследования АИР в онтогенезе растенич хлопчатника, начиная с фазы 6-7 настоящих листьев до созревания коробочек, представлены на рис.23. Активность HP была наибольшей в

фазе бутонизации как для листьев 13-14 дневного возраста (рис. *

8 А), гак и для листьев 8-дневного возраста (Б), но одинакового положения в кусте растений (3-4 ярус с апекса). По мере роста растений и перехода его к фазе массового цветения наблюдается резкое падение (3-4 кратное) уровня ЛИР, который достаточно стабильно сохраняется до фазы созревания у 13-14-дневных листьев (рис. 8 А) всех трех изученных форм хлопчатника. Это видимо связано со снижением скорости роста листа в более поздних фазах онтогенеза (гл. 3.1.) и листья, имеющие приблизительно одинаковые размеры и местоположение с листьями начальных фаз онтогенеза, являются более зрелыми, что хорошо подтверждается результатами определения АНР в онтогенезе растений у 8-дневных листьев (рис. 8 Б). Пистья 8-дневнсго возраста во всех фазах онтогенеза растений (рис. 8 Б) превосходят 13-14-дневные листья (рис. 8 А), особенно в более поздних фазах (цветение-созревание).

Если в начальных фазах онтогенеза это превосходство составляло 40-50%, то в фазах цветения-созревания оно равнялось 300-500%.

. При сопоставлении динамики изменений АНР с изменением содержания различных форм азота в онтогенезе растений (рис. 8) у

1.0

0,6

3 1?'

0,2-7 4

/1

5--0,2

I

n

in

ш

1У

W V I l]

efb-a,*-1- pa-^bL+muA

Рис. 8, Изменение активности HP (1-мкмоль N02.i"~1 сыр. мае' cu-v"'), содержание восстановленного азота (2-мкг N-Г сыр. массы)

и. ««»i1 £рлсмлъм! лу/^ягл««-

иикЯ' 9Ь'зи развития: I - вегетация; II - бутонизация; III -

цветение; IV - плодообразование; V - созревание). (А - /3 -/4 J/UCWj Б - & jMef. листа*)

13-14-дпеиных листьев и 8-дневных листьев (Б) получается следующая картина: начало динамики АИР, содержание N03 и восста-нов) енноги азо>а имеют одинаково нарастающий характер до фазы бутонизации, далее по мере перехода растений к фазе цветения наблюдается падение активности HP и содержания восстановленного азота, однако уровень содержания N03 продолжает оставаться высоким до фазы плодообразования (рис. 8 А). Если сравнить АИР с динамикой содержания восстановленной формы азота у 8-дневных листьев (рис. 8 Б), то нетрудно заметить, что наибольшая величина этой формы азота наблюдается в начальной фазе роста и снижается по мере перехода растений к фазе образования плодозле-иенгов, а уровень активности фермента сохраняется на достаточно

стабильном уровне и в более поздних фазах онтогенеза растений.

Обобщая результаты исследования, можно заключить, что ростовые параметры листа хлопчатника в процессе онтогенеза зависят не только от фазы роста самого листа, но и от стадии развития растений: более того, главным регулятором накопления и ассимиляции азота в фотосинтезирующем органе является интенсивность его роста, но процесс накопления азота также связан с фенофазами развития растений в онтогенезе. Наибольшая координация между ростовыми параметрами и ключевыми показателями азотного обмена наблюдается в период интенсивного роста листа (Т2) и в фазе перехода растений хлопчатника к образованию генеративных органов (бутонизации). В это время содержание восстановленного азота достигает наивысшего уровня, а активность НР становится максимальной. Но и содержание N03 , который накапли-в тотся в вакуолях, и который является запасной формой азота также достигает максимума. Очевидно позднее при старении листа начинается перераспределение окисленного и восстановленного азота из листа в растущие органы (молодые листья и формирующиеся коробочки).

Такая динамика накопления и асскмямции нитрата хорошо согласуется с результатами изучения динамики интенсивности фотосинтеза (Якубова и др., 1983; 1990) и активностью ее ключевого фермента - РБФКО (Бабаджанова, Гиясов, 1984 и др.), наибольшее значение которых также достигается в начальных фазах образования генеративных органов хлопчатника.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что в онтогенезе листа и растения скорость роста и продолжительность ее отдельных последовательных фаз у исследованных форм хлопчатника имеют сортовую специфику, В наибольшей степени формы хлопчатника различаются по таким показателям, как скорость роста листа, продолжительность фазы максимальной скорости роста и уменьшения ускорения от Т, до Т3, а также УППЛ и срокам достижения максимальной ее величины. Наибольшая скорость формирования листовой пластинки и УППЛ у листьев одинакового (8-дневного) возраста и месторасположения в кусте наблюдается в фазе бутонизации онтогенеза растений.

2. Показано, что динамика изменения в содержании окисленной и восстановленной формы азота, а также АНР в начале онтогенеза листа хлопчатника имеет одинаково нарастающий характер и наибольшая величина этих показателей достигается у листьев 710-дневного возраста. Молодые листья (4-8 дн.), которые растут с наибольшей скоростью, содержали в 3-4 раза больше нитрата (в расиете на единицу массы листа), чем зрелые и полностью сформировавшиеся листья.

3. Установлено, что в 3-м листе от центральной точки роста наибольшее содержание нитрата и восстановленной формы азота наблюдается в начальных фазах образования генеративных органов -бутонизации и цветения. Активность HP у всех трех форм хлопчатника наивысшая в фазу бутонизации.

4. Выявлено, что для АНР листьев хлопчатника характерно наличие 2-х максимумов активности в световой период: первый ьебольшой подъем соответствует 3-4 часам и второй - большой, соответствует 8 часам после начала фотопэриода в полевых уело-

виях и зависит от температурных условий выращивания.

5. Оптимизированы условия выделения активных ферментных препаратов НР из листьев хлопчатника и определения ее активности методом 1.п у)«о. Показано, что для НР листьев хлопчатника необходима более кислая среда выделения (рН 8,0-8,2) и наличие в ней больших концентраций казеина (18-20 мг/мл),

6. Установлено, что между динамикой изменения НРА и содержанием восстановленного азота в онтогенезе листа и растений хлопчатника наблюдается достаточно выраженная положительная корреляция. Кривые НРА и содержания нитрата в третьей фазе- роста листа и более поздних фазах онтогенеза растений отрицательно коррелируют, однако в период интенсивного роста листа в фазе Т.|-Т2*в начальных фазах вегетативного роста онтогенеза растений аккумуляция нитратов продолжает увеличиваться, хотя уровень НРА также возрастает и достигает своего наивысшего значения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Гиясов Т.Д., Якубова М.М., Уге Обуа Герард, Алехина Н.Д. Ни-тратредуктазная активность корней и листьев хлопчатника//Тру-ды первой научной конференции биох. общества Республики Таджикистан "Проблемы биохимии", Душанбе, 1993, с. 20.

2. Якубова М. М., Уге Обуа . Герард, Гиясов Т.Д. Регуляторные свойства нитратредуктазы (1п уШо) растениях хлопчатника и амаранта.// Труды первой научной конференции биох. общества РТ "Проблемы биохимии", Душанбе, 1С93, с. 50.

3. Гиясов Т.Д., Уее Обуа Герард, Якубова М.М. Нитратредуктаза листьев хлопчатника и амаранта.// Тезисы докл. апрельской конференции Проф.-преп. состава ТГУ, Душанбе, 1994, с. 82.

4. Уге Обуа Герард, Гиясов Т.Д., Алехина Н.Д., Якубова М.М. Ак-

тивность нитратредуктазы и усвоение азета в онтогенезе листа и растений хлопчатника - 8 с - в печати.

5. Giasov Т.О.,0bua Uche Gerard, Yakubova M.M. Growth and absorbtion of nitrogen in the ontogenesis of leaf and plants of cotton - 1 с - в печати.

Thj most difficult part of the job isover, thanks to the almighty GOD throuyh whom everything is possible.

Special thanks goes to my major adviser Prof. M.M. Yakubova on whose initiative this job was started and on whose constant advise, the production of this manuscript became a reality. Prof. N.D. Aliokhina provided both the environment and materials with which most of the experiments wero carried out. I salute you and would ever remain grateful. To Dr. T.J. Giasov I would forever remain indepted for his selfless assistance.

My gratitude also goes to the members of the department of biochemistry, Tajik state university and those of the department of plant physiology, Moscow state university for all the help they rendered to me.

To my brothers Chidi and Okey, Thank you for your moral support aiu. goodluck wishes. Same thanks to my cousin Afam for his patience, understanding and support during most of my trying periods.

Finally may the Almighty continue to guide, guard and protect my loving mother, Mr... A.N. Obua, whose greatest dream has always been a better luture for us her kids. "Miss" thank You.

THANK YOU MESSAGE

Obua Uche Gerard

6.12.95