Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности иммунного ответа на протективный антиген и летальный фактор B. anthracis: подходы к созданию вакцины нового поколения

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Белова, Елена Валентиновна

Список сокращений и условных обозначений.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Введение.

2.2. Эпидемиология сибирской язвы.

2.3. Клинические проявления сибирской язвы у людей.

2.4. Морфология возбудителя сибирской язвы.

2.5. Биохимические свойства.

2.6. Антигенная структура.

2.7. Патогенность возбудителя сибирской язвы.

2.8. Токсин.

2.8.1. Отечный фактор.

2.8.2. Летальный фактор.

2.8.3. Протективный антиген.

2.8.4. Механизм действия сибиреязвенного токсина.

2.9. Лечение сибиреязвенной инфекции.

2.10. Противосибиреязвенные вакцины.

2.10. 1. Живые сибиреязвенные вакцины.

2.10.2. Химические вакцины.

2.10.3. Комбинированные вакцины.

2.10.4. Проблемы совершенствования сибиреязвенных вакцин.

2.11. Моноклональные антитела - инструменты исследования и препараты медицинского назначения.

2.11.1. Получение моноклональных антител.

2.11.2. Свойства моноклональных антител.

2.11.3. Области применения моноклональных антител.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Бактериальные штаммы и генно-инжинерные конструкции.

3.2. Экспрессия и продукция рекомбинантных ПА и ЛФ в Е. coli.

3.3. Получение отдельных доменов ПА и ЛФ.

3.4. Выделение нативных ПА и ЛФ.

3.5. Получение нетоксичного комплекса (ПА63)7:ЛФн и комплекса (ПА63)7:ЛФ.

3.6. Получение антисывороток к олигомеру ПАбЗЛФн.

3.7. Определение уровня специфичности антител у иммунизированных мышей.

3.8. Получение гибридом.

3.8.1. Культивирование миеломной клеточной линии.

3.8.2. Подготовка макрофагального фидерного слоя.

3.8.3. Выделение спленоцитов гипериммунных мышей.

3.8.4. Гибридизация.

3.8.5. Селекция гибридных клеток.

3.8.6. Скрининг гибридных клеток - продуцентов mAb.

3.8.7. Клонирование гибридных клеток.

3.8.8. Масштабирование гибридом.

3.8.9. Культивирование гибридом in vivo.

3.8.10. Криоконсервация.

3.9. Выделение и очистка моноклональных антител из асцитов.

ЗЛО. Определение специфичности МАТ.

3.11. Определение индекса аддитивности.

3.12. Оценка токсин-нейтрализующей активности in vitro.

3.13. Анализ нейтрализующей активности антител in vivo.

3.14. Анализ протективной активности отдельных доменов ПА in vivo.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Клонирование генов ПА и ЛФ и приготовление конструкций

4.2. Экспрессия и продукция рекомбинантных ПА и ЛФ в Е. coli.

4.3. Продукция и характеристика антигенов возбудителя сибирской язвы.

4.4. Получение олигомерного комплекса.

4.5. Иммунизация мышей и получение mAb.

4.6. Получение и характеристика моноклональных антител к летальному токсину В. anthracis.

4.6.1. Анализ специфичности моноклональных антител к компонентам сибиреязвенного токсина.

4.6.2. Определение подклассовой принадлежности.

4.7. Оценка токсин-нейтрализующей активности на клетках линии J 774 А. 1 in vitro.

4.7.1. Исследования нейтрализации токсина моноклональными антителами против компонента токсического комплекса возбудителя сибирской язвы.

4.8. Определение доменной специфичности моноклональных антител к сибиреязвенному токсину.

4.8.1. Идентификация доменов протективного антигена взаимодействующих с моноклональными антителами.

4.8.2. Идентификация доменов летального фактора взаимодействующих с моноклональными антителами.

4.9. Исследование роли Fc-фрагмента mAb в усилении токсического эффекта летального токсина на макрофагоподобную клеточную линию.

4.10. Определение сайтов связывания моноклональных антител к протективному антигену В. anthracis.ИЗ

4.11. Нейтрализующая активность mAb к протективному антигену in vivo.

4.12. Исследование протективной активности отдельных доменов ПА

4.13. Изучение структуры иммунного ответа у животных, иммунизированных вакцинным штаммом сибирской язвы СТИ

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности иммунного ответа на протективный антиген и летальный фактор B. anthracis: подходы к созданию вакцины нового поколения"

Актуальность темы

Сибирская язва является особо опасным острым инфекционным заболеванием, поражающим животных и людей. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире ежегодно регистрируется от 2000 до 20000 случаев заболеваний сибирской язвой. Высокая заболеваемость обусловлена тем, что возбудитель сибирской язвы способен больше 100 лет сохраняться в почве в виде спор и образовывать стойкие очаги инфекции. Существование таких очагов в разных регионах мира создает постоянную угрозу эпизоотий и эпидемических вспышек среди людей и животных. В России известно около 72 тысяч пунктов, в которых регистрировались случаи сибирской язвы [16]. В настоящее время отмечается активизация многих очагов и Государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора оценивает эпидемическую обстановку по сибирской язве как напряженную [15]. Bacillus anthracis является одним из вероятных патогенов, используемых для создания высокоэффективного бактериологического оружия. Особую актуальность эта инфекция приобрела после применения спор этого микроорганизма в качестве бактериологического оружия в США осенью 2001 года. По оценкам экспертов, на сегодняшний день как минимум 17 стран или уже располагают готовым биологическим оружием, или завершают разработки в этой области [44]. Применение спор сибирской язвы в качестве биологического оружия обусловлено относительной легкостью получения большого количества биологического материала, возможностью его скрытного применения, высокой эффективностью [67]. Наиболее вероятный способ применения сибирской язвы в виде бактериологического оружия - распыление аэрозоля, содержащего жизнеспособные споры возбудителя. В связи с этим среди пораженных будут преобладать пациенты с легочной формой болезни, сопровождающейся высокой летальностью [53]. Кроме того, в последние годы в природных условиях обнаружены штаммы возбудителя сибирской язвы с признаками, не свойственными типичным штаммам, способные преодолевать специфический иммунитет и вызывающие заболевание у привитых людей и животных, а также штаммы Bacillus anthracis, устойчивые к применяемым в настоящее время антибиотикам.

Доступные в настоящий момент сибиреязвенные вакцины, одобренные для использования в России и странах Запада, были разработаны десятилетия назад. Кроме того, вакцины могут быть неприменимы в определенных случаях, например для детей, для пожилых и некоторых других категорий населения, в силу их реактогенности и побочных эффектов [90] Стандартизация защиты, обеспечиваемой этими вакцинами, затруднена. В частности, уровень протек-тивного антигена (ПА) в этих вакцинах не определяется и стандартный анализ на нейтрализующую активность антител, вырабатываемых после вакцинации, отсутствует [113]. Следовательно, разработка новых эффективных средств профилактики, диагностики и терапии сибирской язвы, основанных на тщательных исследованиях молекулярных характеристик и механизмов действия антигенов возбудителя, крайне важна для защиты населения.

Клетки Bacillus anthracis в вегетативном состоянии вырабатывают тройной комплекс токсина, который состоит из рецептор-связывающего компонента, также известного как протективный антиген (ПА) и двух эффекторов, летального фактора (ЛФ) и эдема-фактора [44]. Летальный фактор является единственным токсическим компонентом, который напрямую отвечает за летальный исход сибирской язвы. Поэтому ранняя детекция и или нейтрализация активного ЛФ либо в образцах, полученных от пораженных людей или в бактериальных образцах, выращенных для анализа, имеет первостепенное значение для успешного предотвращения и лечения сибирской язвы. Единственный известный компонент токсина, защитный эффект которого доказан - это ПА. Таким образом, логично использовать ПА в качестве принципиального компонента новых вакцин.

Несовершенство используемых на данный момент вакцин и возросшая потребность в быстром и мощном терапевтическом средстве, способном нейтрализовать сибиреязвенное поражение, выводят на первый план значение эффективной пассивной иммунотерапии. Пассивная терапия антиген-специфическими антителами и сейчас является значимым дополнением к вакцинации и терапии антибиотиками.

Цель исследования

Изучить особенности гуморального иммунного ответа на сибиреязвенную инфекцию на модели животных и провести картирование моноклональных антител на летальный токсин В. anthracis, обладающих защитным действием как in vitro так и in vivo, для конструирования иммунологически эффективных препаратов протективного антигена и летального фактора для создания химической вакцины нового поколения.

Задачи исследования

1. Сконструировать рекомбинантные штаммы Е. coli - продуценты полноразмерных белков и отдельных доменов протективного антигена и летального фактора В. anthracis.

2. Получить и охарактеризовать панель моноклональных мышиных антител к протективному антигену В. anthracis.

3. Получить и охарактеризовать панель моноклональных мышиных антител к летальному фактору В. anthracis.

4. Изучить молекулярный механизм, детерминирующий потенцирующее действие мышиных моноклональных антител к протективному антигену В. anthracis in vitro.

5. Определить антигенные детерминанты потенцирующих и блокирующих мо-ноклональных мышиных антител к компонентам сибиреязвенного токсина.

6. Провести изучение действия полученных антител in vivo при экспериментальной сибиреязвенной инфекции.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Мышиные моноклональные антитела к протективному антигену могут как блокировать, так и потенцировать действие летального токсина В. anthracis in vitro в культуре мышиных макрофагов линии J774.

2. Моноклональные антитела к протективному антигену, блокирующие действие летального токсина В. anthracis in vitro, специфичны к IV домену ПА.

3. Моноклональные антитела к протективному антигену, потенцирующие действие летального токсина В. anthracis in vitro, специфичны к III домену ПА.

4. Механизм потенцирования действия состоит в Fc-рецепторном усилении эн-доцитоза комплекса летального токсина в чувствительную клетку-мишень.

5. Моноклональные антитела к летальному фактору, блокирующие действие летального токсина В. anthracis in vitro, специфичны к I домену ЛФ.

6. Пассивная иммунизация мышей блокирующими антителами спасает животных при экспериментальной сибиреязвенной инфекции.

Научная новизна

• Показан механизм потенцирования действия летального токсина В. anthracis in vitro мышиными моноклональными антителами к протективному антигену.

• Впервые установлено, что блокирующие и потенцирующие действия летального токсина В. anthracis моноклональные антитела к ПА имеют разную эпитопную специфичность.

• Впервые установлена тонкая структура антигенных детерминант полученных моноклональных антител к 3 домену протективного антигена.

• Выявлено, что механизм потенцирования действия состоит в Fc-рецепторном усилении эндоцитоза комплекса летального токсина в чувствительную клетку-мишень.

Теоретическая значимость

Основные теоретические итоги проделанной работы заключаются в определении особенностей иммунного ответа на протективный антиген и летальный фактор В. anthracis на модели животных и биологического действия, полученных моноклональных антител совместно с летальным токсином in vitro. Полученные данные свидетельствуют о том, что моноклональные антитела к про-тективному антигену могут, как блокировать, так и потенцировать действие летального токсина В. anthracis in vitro в культуре мышиных макрофагов линии J774. Установлен механизм потенцирования действия летального токсина В. anthracis.

Практическая значимость работы

Полученные данные о тонкой антигенной специфичности моноклональных антител, обладающих протективным действием как in vitro, так и in vivo, являются базой для разработки вакцин нового поколения против сибирской язвы в плане создания современных иммунологически эффективных препаратов рекомбинантных компонентов протективного антигена и летального фактора. Структура антиген-связывающих фрагментов (CDR1-CDR3) полученных блокирующих антител может быть использована для создания гуманизированных антител для пассивной иммунизации определенных групп населения против сибирской язвы.

Апробация материалов диссертации

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на международных научных конференциях: 11th European Conference on Bacterial Protein Toxins, June 28-July 2003, Celacovice, Czech Republic; IX European Multicolloquium of Parasitology, Valencia, Spain, July 18-23, 2004; 7th JOHN HUMPHREY AD

VANCED SUMMER PROGRAMME IN IMMUNOLOGY, September 5-9, 2005; II Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 20-21 октября 2005г.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Shemyakin I.G., Belova E.V., Kravtchenko Т.В. Study of inhibitory antitoxin activity of monoclonal antibodies obtained against non-toxic PA63+LFn antrax toxin complex using in vitro and in vivo models. 11th European Conference on Bacterial Protein Toxins, June 28-July 2003, Celacovice, Czech Republic, Poster Abstract-number: P84.

2. E.B. Белова, C.A. Дубилей, Т.Б. Кравченко, A.B. Колесников, И.Г. Шемякин. Антитела к разным эпитопам протективного антигена способны как нейтрализовать, так и потенцировать действие сибиреязвенного токсина in vitro. //Журнал молекулярной генетики, микробиологии, вирусологии. - 2004. - №3. -С. 21-26.

3. Belova E.V., Smolkina А.Е., Kravchenko Т.В., Zakharova M. Yu., Shemyakin I.G. Monoclonal Antibodies against Protective Antigen of Bacillus anthracis Toxin. 7th JOHN HUMPHREY ADVANCED SUMMER PROGRAMME IN IMMUNOLOGY. September 5-9,2005. Moscow. Abstract number: P5.

4. Smolkina A.E., Belova E.V., Kravchenko T.B., Shemyakin I.G. Monoclonal Antibodies against Lethal Factor of Bacillus anthracis Toxin. 7th JOHN HUMPHREY ADVANCED SUMMER PROGRAMME IN IMMUNOLOGY. September 5-9, 2005. Moscow. Abstract number: P44.

5. Белова Е.В., Смолкина А.Е., Кравченко Т.Б., Захарова М.Ю., Шемякин И.Г. Изучение роли отдельных доменов протективного антигена Bacillus anthracis в формировании защитного иммунитета. II Международная конференция Молекулярная медицина и биобезопасность. 20-21 октября 2005г. Тезисы, с.76.

6. Смолкина А.Е., Белова Е.В., Кравченко Т.Б., Шемякин И.Г. Различная степень нейтрализующего действия моноклональных антител к летальному фактору сибиреязвенного токсина. II Международная конференция Молекулярная медицина и биобезопасность. 20-21 октября 2005г. Тезисы, с.254.

2. Обзор литературы

2.1. Введение

Сибирская язва является острым инфекционным заболеванием человека и животных. Ежегодно в мире регистрировалось от 2000 до 20 ООО случаев заболеваний сибирской язвой [65]. Болезнь широко распространена во многих странах Африки, Азии, Южной и Центральной Америки, Среднего Востока и Карибского бассейна; в США и странах Европы наблюдаются единичные случаи. Вместе с тем сообщения о вспышках сибирской язвы появляются регулярно во всех частях мира, в том числе и в европейских странах [43,126, 40]. В 95% спорадических случаев сибирской язвы, регистрирующихся в том числе и в эндемичных регионах, наблюдается кожная форма болезни. Под различными названиями сибирская язва известна еще со времен Гиппократа. Русский врач Н. Ножевщиков в 1762 г. описал кожную форму болезни. Русское название болезни дал С.С. Андриевский в связи с крупной эпидемией на Урале в конце XVIII века. В 1788г. героическим опытом самозаражения он доказал идентичность сибирской язвы человека и животных и окончательно подтвердил ее нозологическую самостоятельность. Возбудитель - Bacillus anthracis - был неоднократно описан разными авторами (А. Поллендер, 1849г.; К. Давен, 1850г.; Ф. Браун, 1854г.). Чистую культуру возбудителя получил Р. Кох (1876г.), а в 1881г. Л. Пастер предложил живую вакцину для иммунопрофилактики заболевания.

Bacillus anthracis является одним из наиболее вероятных патогенов, используемых для создания высокоэффективного бактериологического оружия [67]. Особую актуальность сибиреязвенная инфекция приобрела после применения спор микроорганизма в качестве средства биотерроризма в США осенью 2001 г. По данным Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC) по состоянию на 5 декабря 2001 г., в США зарегистрированы 22 случая сибирской язвы. У 18 пациентов диагноз был подтвержден, у 4 установлен предварительный диагноз. Были зарегистрированы 11 случаев кожной и 11 случаев легочной формы болезни; из них 5 пациентов с ингаляционной формой сибирской язвы умерли [40].

Научный и практический интерес к проблемам, связанным с сибирской язвой, достаточно высок. Только на изучение генома В.anthracis одним из научных центров США в 2001 г. было выделено 200 тыс. долларов США [47].

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Белова, Елена Валентиновна

выводы.

1. Клонированы гены протективного антигена и летального фактора и созданы экспрессионные конструкции, продуцирующие полноразмерные белки ПА и ЛФ, а также отдельные домены ПА и ЛФ.

2. Получена панель мышиных моноклональных антител к протективному антигену и летальному фактору сибиреязвенного токсина. Антитела к протективному антигену Bacillus anthracis, нейтрализующие действие летального токсина in vitro, специфичны к IV домену протективного антигена. Антитела к летальному фактору блокирующие действие летального токсина В. anthracis in vitro, специфичны к 1 домену летального фактора.

3. Обнаружен феномен потенцирования сибиреязвенного токсина моноклональными антителами. Впервые показано, что антитела усиливающие действие сибиреязвенного токсина специфичны к III домену протективного антигена.

4. Механизм потенцирования действия летального токсина моноклональными антителами 1F2 и 1D6 состоит в Fc-рецепторном усилении эндоцитоза комплекса летального токсина в чувствительную клетку-мишень.

5. Пассивная иммунизация мышей нейтрализующими антителами 6G8 полностью защищает животных при экспериментальной сибиреязвенной инфекции.

6. При иммунизации животных вакцинным штаммом сибирской язвы СТИ-1 образуются антитела ко всем компонентам летального токсина, включая III домен протективного антигена. Целесообразно удалить или изменить III домен протективного антигена, ответственный за индукцию потенцирующих антител при создании иммунологически эффективных препаратов против сибирской язвы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Белова, Елена Валентиновна, Оболенск

1. Абалакин В.А., Сергеева JI.B. Иммунологические аспекты надзора за сибирской язвой // Сб. науч. тр. "Эпидемиол. надзор за инфекц. болезнями". -М., 1987. С. 151-156.

2. Абалакин В.А., Сергеева JI.B., Черкасский Б.Л. Выявление специфических антигенов при экспериментальной сибирской язве. -Журн. микробиол., эпидемиол. иммунобиол. -1989.-№12.-С. 63-68.

3. Авилов В.М., Седов В.А. // Ветеринария. 1994. - № 6. - С. 3-6.

4. Безносов М.В. Выделение и изучение специфических антигенов Bacillus anthracis с целью конструирования диагностических и профилактических препаратов: Дис. канд. биол. наук. — Саратов, 1997. -171 с.

5. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. М., 1984. 212с.

6. Дербин М.И., Садовой Н.В., Тарумов B.C., Гарин Н.С. Сравнительное изучение гуморального противосибиреязвенного иммунитета у привитых живой и химической вакцинами. -Иммунология. -1982. № 3. - С. 49-52.

7. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев В.В., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа // М.; Высш. шк., 1991.- 288 с.

8. Ипатенко Н.Г., Гаврилов В.А., Маничев А.А. и др. Опыт профилактики сибирской язвы сельскохозяйственных животных в России II Ветеринария 1995. - № 5. - С. 27-30.

9. Коротич А.С., Погребняк Л.И. Сибирская язва. Киев, 19-157 с.(116)

10. Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р., Гордон Д., Арвие Ж., Уильяме А.Ф. Антитела. Методы: Кн. 1: Пер. с англ./Под ред. Д.Кэтти.-М.: Мир, 1991.-287с.

11. Мазур Н.И. Современные методы ветеринарно-санитарной экспертизы мяса при сибирской язве и туберкулезе убойных животных. — Киев, 1988.- 42 с.

12. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов А.В., Старицин Н.А., Померанцев А.П., Алешкин В.А., Афанасьев С.С. Микробиологическая диагностика сибирской язвы. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 224с.

13. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В., Харечко А.Т., Васильев П.Г., Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: Актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 448с.

14. Родзиковский А.В., Соркин Ю.И., Найманов П.И. и др. Возможность жизнедеятельности сибиреязвенного микроба при пониженных температурах // Сб. науч. тр. "Психрофильность патогенных микроорганизмов". Новосибирск, 1986. - С. 24-27.

15. Сибирская язва // Под ред. Колесова С.Г. М., 1976. - 288 с.

16. Усилить профилактику сибирской язвы. Ветеринария. - 1980. - №10 -С.3-5.

17. Ahuja N., Kumar P., Bhatnagar R. Hydrophobic residues Phe552, Phe554, Ile562, Leu566, and Ile574 are required for oligomerization of anthrax protective antigen. Biochem Biophys Res Commun 2001; 287:542-549.

18. Ann. N. Y. Acad. Sci. DNA vaccines. A new era in vaccinology. Ed. Lin M. A., Hilleman M.R ., Kurth R. 1995. V. 772.

19. Anthrax. Winchester (England), 1995.

20. Army R et D Achievement awards recognize 109 in house personell. -Army Res. Dev. Acquis. Mag. -1983. - V. 24, № 5. -P. 10.

21. Benson EL, Huynh PD, Finkelstein A, Collier RJ. Identification of residues lining the anthrax protective antigen channel. Biochemistry 1998. 37: 3941-48

22. Berthier M., Fauchere J.-L., Perrin J., Grignon В., Oriot D. Fulminant meningites due to Bacillus anthracis in 11-year-old girl during Ramadan. -Lancet. -1996. V. 347. - P. 828.

23. Bhat P.D., Nagamani M.D., Srinivasa H. Intestinal anthrax with bacteriological investigations. J. Infect. Dis.- 1985. -V. 152. №6. -P. 1357- 1358.

24. Bhatnagar R., Singh J., Leppla S.H., Friedlander A.M. Calcium is required for the expression of anthrax lethal toxin activity in the macrophagelike cell line J774A.1. Infec. Immun. -1989. - V.57. № 7. -P. 2107-2114.

25. Bhatnagar R., Batra S. Anthrax toxin. Crit. Rev. Microbiol 2001. - V.27. -P.167 200.

26. Blaustein R.O., Koehler T.M., Collier R.J., Finkelstein A. Anthrax toxin: Channel-forming activity of protective antigen in plana phospholipidbilayers. Proc. Nat. Acad. Sci. -1989. V.86. - №7.- P. 2209-2213.

27. Borio L, Frank D, Mani V, Chiriboga C, Pollanen M, Ripple M, Ali S, DiAngelo C, Lee J, Arden J, Titus J, Fowler D, O'Toole T, Masur H, BartlettJ, Inglesby T. JAMA 2001 Nov 28;286(20):2554-9

28. Brachman P.S., Kaufmann A.F. Anthrax. In: Evans A.S., Brachman P.S., et al. Bacterial infections of humans. New York: Plenum Medical Book Company; 1998. p. 95-111.

29. Brachman Ph. S. Anthrax. In: Infectious Disease, Edited by Hoeprich P.D., New York, Harper and Row, 1977, p. 807-812.

30. Bradley KA, Mogridge J, Mourez M, Collier RJ, Young JA. 2001 .Identification of the cellular receptor for anthrax toxin. Nature 414:225-29

31. Bragg T.S., Robertson D.L. Nucleotide sequence and analysis of the lethal factor gene (lef) from Bacillus anthracis. Gene. -1989. -V.81,№ l.-P. 4554.

32. Brossier F, Weber-Levy, M, Mock, M, Sirard, J-C Role of Toxin Functional Domains in Anthrax Pathogenesis Infect. Immun. 2000 68: 1781-1786

33. Brossier F., Levy M., Landier A., Lafaye P., and Mock M. Functional analysis of Bacillus anthracis protective antigen by using neutralizing monoclonal antibodies. Immun. 2004. V.72, № 11. - P. 6313-6317.

34. Caksen H., Arabaci F., Abuhandan M., Tuncer O., Cesur Y. Cutaneous anthrax in eastern Turkey. Cutis 2001; 67:488-92.

35. Centers for Disease Control and Prevention. Update: Investigation of Bioterrorism-Related Inhalational. Anthrax Connecticut. 2001 MMWR 2001; 50:1077-9.

36. Cieslak T.J., Eitzen E.M. Jr. Clinical and Epidemiologic Principles of Anthrax. Emerg Infect Dis 1999; 5:552-5.

37. Collier RJ, Young JA. Anthrax toxin. Annu Rev Cell Dev Biol. 2003; 19:45-70

38. Davies J.C. A major epidemic of anthrax in Zimbabve. Centr Afr J Med 1982; 28: 291-8.

39. Dhawan В., Desikan-Trivedi P., Chaudhry R., Narang P. Bioterrorism: a threat for which we are ill prepared. J. Natl. Med. - 2001.- V.14, P.225-230.

40. Dixon B. The third vaccine revolution. Bio. Technol. - 1995. -V. 13.-P. 420.

41. Dixon, Terry C., Meselson, Matthew, Guillemin, Jeanne, Hanna, Philip C. Anthrax. N. Engl. J. Med. 1999 341: 815-826

42. Duesbery NS, Webb CP, Leppla SH, Gordon VM, Klimpel KR, et al. 1998. Proteolytic inactivation of MAP-kinase-kinase by anthrax lethal factor. Science 280:734-37

43. Eckert N.J., Bonventre P.F. In vivo effects of Bacillus anthracis culture filtrates. J. Inf. Dis. - 1963.

44. Enserink M. ANTHRAX: A Second Anthrax Genome Project. Science 2001; 294:1812.

45. Escuyer V., Duflot E., Sezer O. e. a. Structural homology between virulence associated bacterial adenylate cyclases. - Gene.-1988. - V.71, №2. - P. 293-298.

46. Ezzel J.W., Ivins B.E., Leppla S.H. Immunoelectrophoretic analysis, toxicity, and kinetics of in vitro production of the protective antigen and lethal factor components of Bacillus anthracis toxin. Jnfect. Jmmun. -1984. - V. 45, № 3. -P. 761-767.

47. Ezzell J.W., Mikesell P., Ivins B.E., Leppla S.H. The genetic basis of pasteur's attenuation of Bacillus anthracis cultures. World's Debt to Pasteur. -1985, Liss A.RInc, p. 107-116.

48. Fiskum G., Lehninger A.L. Mitochondrial regulation of intracellular calcium. In: Cheung W.Y. Calcium and cell function. Academic Press, Inc., New York, 1982, p. 39-80.

49. Friedlander A.M. Anthrax. In: Sidell F.R., Takafuji E.T., Franz D.R., editors. Textbook of Military Medicine: Medical Aspects of Chemical and Biological Warfare. Washington, DC: Office of the Surgeon General, US Dept of the Army; 1997:467-78.

50. Friedlander A.M. Macrophages are sensitive to anthrax lethal toxin through an acid-dependent process. J.Biol.Chemistry. -1986. - V.261, № 16. - .71237126.

51. Friedlander A.M. The anthrax toxins. In: Trafficking of Bacterial Toxins. Ed. Saelinder C.B.CRC Press, Boca Raton. 1990, p.121-128.

52. Friedlander A.M., Novak J., Bhatnagar R., Middebrook J.K., Hines H.B., Naseem S.M. Exploratory studies for the development of medical defesike meaures to toxins of biological origin. Annual. Report. -1989, p. 47-48.

53. Gao-Sheridan S, Zhang SF, Collier RJ. 2003. Exchange characteristics of calcium ions bound to anthrax protective antigen. Biochem. Biophys. Res.Commun. 300:61-64

54. Gordon V.M., Leppla S.H., Hewleff E.L. Inhibitors of receptor mediated endocytosis block the entry of Bacillus anthracis adenylate cyclase toxin but not that of Bordetella pertussis. -Infect. Immun. -1988. V. 56, № 5. - P. 1066-1069.

55. Green BD, Battisti L, Koehler TM, Thorne CB, Ivins BE. 1985. Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis. Infect. Immun. 49:291-97

56. Hanna P. J Appl Microbiol 1999 Aug; 87(2): 285-7

57. Hanna PC, Acosta D, Collier RJ. 1993. On the role of macrophages in anthrax. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10198-201

58. Hanna PC, Kochi S, Collier RJ. 1992. Biochemical and physiological changes induced by anthrax lethal toxin in J774 macrophage-like cells. Mol. Biol. Cell 3:1269-77

59. Hanna PC, Kruskal В A, Ezekowitz RAB, Bloom BR, Collier RJ. 1994. Role of macrophage oxidative burst in the action of anthrax lethal toxin. Mol. Med. 1:7— 18

60. Hanter P. In response to Recent Events: Update on Bacillus anthracis. ESCMID News 2001; 3:23-6.

61. Harrison L.H., Ezzell J.W. Evaluation of serologic tests for diagnosis of anthrax after an outbreak of cutaneous anthrax in Paraguay. J Infect Dis 1989; 160:70610.

62. Heyninqen van S. Bacterial toxins and cyclic AMP. Nature. - 1982. - V.299, № 5886. - P.782.

63. Inglesby T.V., Henderson D.A., Bartlett J.G., et al. Anthrax as a biological weapon: medical and public health management. JAMA 1999; 281:1735-45.

64. Ivins В., Fellows P., Pitt L. et al. // Vaccine. 1995. V.13. №8. P.1779—1784.

65. Ivins B.E., Welkos S.L. Cloning and expression of the Bacillus anthracis protective antigen in Bacillus subtilis. Infect. Immun. -1986. - V.54, № 2.-P. 537-542.

66. Kaspar R.L., Robertson D.L. // Bioch. Bioph. Res. Communic 1987. V. 14 №2.-P. 362-363

67. Keim P, Smith KL. 2002. Bacillus anthracis evolution and epidemiology. Curr. Top. Microbiol Curr. Top. Microbiol. Immunol. 271:21—32

68. Khajehdehi P. Toxemic shock, hematuria, hypokalemia, and hypoproteinemia in a case of cutaneous anthrax. Mt Sinai J Med 2001; 68:215

69. Kim S., Park Y., Hong H. Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies. J. Mol. Cells. - 2005 - V.20, № 1 P. 17-29.

70. Klimpel K.R., Molloy S.S., Thomas G., Leppla S.H. Anthrax toxin protective antigen is activated by a cell surface protease with the sequence specificity and catalytic properties of furin. Proc. Natl. Acad. Sci. - 1992. -V. 89, №21. - P. 10277 -10281.

71. Klimpel KR, Arora N, Leppla SH. 1993. Anthrax toxin lethal factor has homology to the thermolysin-like proteases and displays protease activity. Abstr. Am. Soc. Microbiol. Annu. Meet. p. 45

72. Kohler G. and Milstein C. Derivation of specific Staantibodi-producing tissue culture and tumor lunes by cell fusion ill// Eur. J. Immunol.- 1976.- N6.- P.511-519.

73. Kumar A., Kanungo R., Bhattacharya S., Badrinath S., Dutta Т.К., Swaminathan R.P. Human anthrax in India: urgent need for effective prevention. J Commun Dis 2000; 32:240-6.

74. Kutluc M.T. Cutaneous anthrax. Cutis. - 1987 - V. 40. № 2. - P. 117-118.

75. Lacy DB, Collier RJ. 2002. Structure and function of anthrax toxin. Curr.Top. Microbiol. Immunol. 271:61—85

76. Lacy DB, Mourez M, Fouassier A, Collier RJ. 2002. Mapping the anthrax protective antigen binding site on the lethal and edema factors. J. Biol. Chem. 277:3006-10

77. Lalitha M.K., Anandi V., Walter N., Devadatta J.O., Pulimood B.M. Primary anthrax presinting as an injection "abscess". Indian J. Pathol, and Microbiol. - 1988. - V.3 №3. -P. 254-256.

78. Leppla S.H. Bacillus anthracis calmodulin dependent adenylate cyclase: chemical and enzymatic properties and interactions with eucaryotic cells. In: 5 Internat. Conference on Cyclic Nucleotides and Protein Phosphorylation. 1984. P. 189-198.

79. Leppla S. H. The bifactorial Bacillus anthracis lethal and edema toxins. In: Alouf JE, Freer JH, eds. The comprehensive sourcebook of bacterial protein toxins. 2nd ed. London: Academic Press, 1999: 243-263.

80. Leppla S.H. Anthrax toxin edema factor: A bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations in eucaryotic cells. Proc. Nat. Acad. Sci. - 1982. - V. 79, № 10. - P. 3162 -3166.

81. Leppla S.H., Klimpel K.R., Gordon V.M., Arora N., Singh Y. Binding and uptace of anthrax toxin components and fusion proteins by eucaryotic cells. Toxicon. - 1996. - V. 34, № 3. -P.296.

82. Leppla SH. 1991. The anthrax toxin complex. In Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, ed. J Alouf, pp. 277-302. New York: Academic.

83. Leppla SH. 1995. Anthrax toxins. Handb. Nat. Toxins 8: 543-572.

84. Leppla, Stephen H., Robbins, John В., Schneerson, Rachel, Shiloach, Joseph Development of an improved vaccine for anthrax J. Clin. Invest. 2002 110:141144

85. Little S. F., Knudson G. B. // Infec. And Immun. 1986. -V. 52. -№ 2. -P. 509-512.

86. Little S.F., Leppla S.H., Cora E. Production and characterization of monoclonal antibodies to the protective antigen component of Bacillus anthracis toxin. Infect. Immun. -1988. - V.56, № 7. - P. 1807-1813

87. Little SF, Ivins BE, Fellows PF, Pitt ML, Norris SL, Andrews GP. Defining a serological correlate of protection in rabbits for a recombinant anthrax vaccine. Vaccine. 2004 22:422-30.

88. Meselson M., Guillemin J., Hugh-Jones M., Langmuir A., Popova I., Shelokov A., Yampolskaya O., et al. The Sverdlovsk anthrax outbreak of 1979. Science 1994; 266:1202-7.

89. Mikesell P., Jvins B.E., Ristroph J.D., Dreier T.M. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis. Infect. Immun. -1983. -V.39, № 1.-P. 371-376.

90. Milne J.C., Collier R.J. hY dependent permeabilization of the plasma membrana of mammalian cells by anthrax protective antigen. Mol. Microbiol. -1993. - V. 10, № 3. - P.647-653.

91. Moayeri, Mahtab, Haines, Diana, Young, Howard A., Leppla, Stephen H. Bacillus anthracis lethal toxin induces TNF-alpha-independent hypoxia-mediated toxicity in mice J. Clin. Invest. 2003 112: 670-682

92. Mock M, Fouet A. 2001. Anthrax. Annu. Rev. Microbiol. 55:647-71

93. Mogridge J, Cunningham K, Collier RJ. 2002a. Stoichiometry of anthrax toxin complexes. Biochemistry 41:1079-82

94. Molnar D.M., Altenbern R.A. Alterations in the biological activity of protective antigen of Bacillus anthracis toxin. -Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. -1963. V.l 14, № 2. - P. 294-297.

95. Myenye KS, Siziya S, Peterson D. Factors associated with human anthrax outbreak in the Chikupo a Ngandu villages of Murewa district in Mashonaland East Province, Zimbabwe. Cenf^/r J Med. 1996; 42: 312-315.

96. Ndyabahinduka D.G.K., Chu I.H., Abdou A.H., Gaifuba J.K. An outbreak of human gastrointestinal anthrax. Ann 1st Super Sanita 1984; 20:205

97. Novak J.M., Stein M.P., Little S.F., Leppla S.H., Friedlander A.M. Functional characterization of protease-treated Bacillus anthracis protective antigen.-J. Biol. Chem. 1992. - V. 267, №24. -P. 3215-3221.

98. Novoa I, Cotten M, Carrasco L. 1996. Hybrid proteins between Pseudomonas aeruginosa exotoxin A and poliovirus 2Apro cleave p220 in HeLa cells. J.Virol. 70:3319-24

99. O'Brien J., Friedlander A., Dreier Т., Ezzel J., Leppla S. Effects of anthrax toxin components on human neutrophies. Jnfect. Immun. - 1985 . -V. 47, № 1.-P. 306-310.

100. Pannifer AD, Wong TY, Schwarzenbacher R, Renatus M, Petosa C, et al. 2001. Crystal structure of the anthrax lethal factor. Nature 414:229-33

101. Pellizzari R, Guidi-Rontani C, Vitale G, Mock M, Montecucco C. 1999. Anthrax lethal factor cleaves MKK3 in macrophages and inhibits the LPS/IFNgamma-induced release of NO and TNFalpha. FEES Lett. 462:199-204

102. Petosa C, Collier RJ, Klimpel KR, Leppla SH, Liddington RC. 1997. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen. Nature 385:833-38

103. Pile JC, Malone JD, Eitzen EM. Friedlander A. Anthrax as a potential biological warfare agent. Arch Intern Med. 1998; 158:429-434.

104. Robertson D. L., Tippetts M. Т., Leppla S. H. Nucleotide sequence of the Bacillus anthracis edema factor gene (cya): a calmodulin dependent adenylate cyclase. - Gene. - 1988. -V. 73, №2.-P. 363-371.

105. Robertson D.L. and Leppla S. H.1986. Molecular cloning and expression in Escirerichia coli of the lethal factor gene Bacillus anthracis. Gene 44, 71-78

106. Sang Jick Kim, Youngwoo Park, and Hyo Jeong Hong. Antibody Engineering for the Development of Therapeutic Antibodies// Mol Cells.- 2005.- Vol. 20, No. l,pp. 17-29

107. Sellman BR, Nassi S, Collier RJ. 2001b.Point mutations in anthrax protective antigen that block translocation. J. Biol Chem. 276:8371-76

108. Singh Y, Klimpel KR, Goel S, Swain PK, Leppla SH. 1999. Oligomerization of anthrax toxin protective antigen and binding of lethal factor during endocytic uptake into mammalian cells. Infect. Immun. 67:1853-59

109. Singh Y, Klimpel KR, Quinn CP, Chaudhary VK,Leppla SH. 1991. The carboxyl-terminal end of protective antigen is required for receptor binding and anthrax toxin activity. J. Biol. Chem. 266:15493-97

110. Singh Y., Klimpel K.R., Arora N., Sharma M., Leppla S.H. The chymotrypsin -sensitive site, FFD315, in anthrax toxin protective antigen is required for translocation of lethal factor. J. Biol. Chem. - 1994. - V. 269, № 46. - P. 29039 -29046.

111. Sirard J.C., Mock M., Fouet A. The three Bacillus anthracis toxin genes are coordinately regulated by bicarbonate and temperature. J Bacteriol 1994; 176:5188.

112. Sirisanthana Т., Navachareon N., Tharavichitkul P., SirisanthanaV., Brown A.E. Ontbreak of oral-oropharyngeal anthrax: An unusual manifestation of human infection withBacillus anthracis. Am.J.Trop. Med. Hyg. - 1984. - V. 33, N1. -P. 144-150.

113. Sirisanthana T, Nelson KE, Ezzell JW, Abshire TG. Serological studies of patients with cutaneous and oral- pharyngeal anthrax from northern Thailand. Am J Trop MedHyg. 1988:39:575-581.

114. Smego R.A. Jr, Gebrian В., Desmangels G. Cutaneous Manifestation of Anthrax in Rural Haiti. Clin Infect Dis 1998; 26:97-102.

115. Smith H. 2000. Discovery of the anthrax toxin: the beginning of in vivo studies on pathogenic bacteria. Trends Microbiol 8: 199-200

116. Smith H., Keppie J., Stanley J.L., Harris-Smith P.W. The chemical basis of the virulence of B. anthracis. IV. Secondaryshock as the major factor in death of quinea pigs from anthrax. Brit. J. Exp. Path. -1955. - V.36, № 4. -P.323-325.

117. Stanley JL, Smith H. 1961. Purification of factor I and recognition of a third factor of the anthrax toxin. J. Gen. Microbiol. 26:49-66)

118. Tang D.C., Devit M., Jonston S.A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.-Nature. -1992. -V. 356. -P. 152-54.

119. Tang G, Leppla SH. Infect Immun 1999 Jun; 67(6): 3055-60

120. Tippets M.T. and Robertson D.L. 1988. Molecular cloning and expression of the Bacillus anthracis edema factor toxin gene: A calmodulin- dependent adenylate cyclase. J. Bacteriol. 170, 2263-2266.

121. Titball R.W., Turnbull P.C.B., Hutson R.A. // J. Appl. Bact. Symp. Suppl. 1991.-V. 70.-P. 9- 18.

122. Turnbull P.C.B., Kramer J.M. Bacillus. In: Balows A., Hausler W.J.Jr., Herrmann K.L., et al. Manual of Clinical Microbiology, 5th ed. Washington, DC, American Society for Microbiology; 1991. p. 296-303.

123. Turnbull PC. 2002. Introduction: anthrax history, disease and ecology. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 271:1-19

124. Uchida I., Hashimoto K., Makino S., Sasakawa C, Joshikawa M., Terakado N. Restruction map of a capsule plasmid of Bacillus anthracis. Plasmid. -1987. - V.18,№2.-P. 178-181.

125. Uchida I., Sekizaki Т., Hashimoto K., Terakado N. Associatio of the enkapsulation of Bacillus anthracis with a 60 megadalton plasmid. J. Gen. Microbiol. - 1985. - V. 131, № 2. P.363-367.

126. UK gives guidance on anthrax editorial. Scrip 2001; 2689:5.

127. Ulmer J.В., Donnelly J.J., Parker S.F. et al. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science. -1993. -V. 259.-P. 1745-1748.

128. Vodkin M. N. and Leppla S. H. 1983. Cloning of protective antigen gene of Bacillus anthracis. Cell 34, 693-697.

129. Watson A., Keir D. Information on Which to base assessments of risk from environments contaminated with anthrax spores. Epidemiol. Infect. - 1994. -V.I 13, №3.-P. 479-490.

130. Watters JW, Dewar K, Lehoczky J, Boyartchuk V, Dietrich WF. KiflC, a kinesin-like motor protein, mediates mouse macrophage resistance to anthrax lethal factor.Curr Biol. 2001 Oct 2;11(19):1503-11.

131. Winter G., Milstein C. Man-made antibodies//Nature. 1991/ Vol. 349. P.293-299.

132. Wolff J.A., Malone R.W., Williams P. et al. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science. - 1990. - V. 247. -P. 1465-1468.

133. Working Group on Civilian Biodefense. JAMA 1999 May 12;281(18):1735-45

134. Xia Zhengui, Storm D.R. A type ATP binding consensus sequences are critical for the catalytic activity of the calmodulin-sensitive adenylyl cyclase from Bacillus anthracis. J. Biol. Chem. -1990. - V.265, № 12. -P.6517-6520.