Особенности гуморального иммунного ответа у пациентов с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией при различных формах респираторной патологии

Кривицкая, Вера Зорьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности гуморального иммунного ответа у пациентов с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией при различных формах респираторной патологии
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Особенности гуморального иммунного ответа у пациентов с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией при различных формах респираторной патологии"

005017467

На правах рукописи

КРИВИЦКАЯ Вера Зорьевна

ОСОБЕННОСТИ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ПАЦИЕНТОВ С РЕСПИРАТОРНО-СИНЦИТИАЛЬНОЙ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ РЕСПИРАТОРНОЙ ПАТОЛОГИИ

специальность 03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 С

Санкт-Петербург - 2012

005017467

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Санкт-Петербург

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, Соминина Анна Адольфовна

руководитель лаборатории биотехнологии диагностических препаратов ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа»

Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, Найхнн Анатолий Нойевич

заведующий лаборатории иммунологии и

профилактики вирусных инфекций ФГБУ "Научно-

исследовательский институт экспериментальной

медицины" Северо-Западного отделения Российской

академии медицинских наук, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, Жилинская Ирина Николаевна

ведущий научный сотрудник лаборатории

молекулярной вирусологии и генной инженерии

ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа»

Минздравсоцразвития России, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, Ленева Ирнна Анатольевна

исполняющая обязанности заведующей лаборатории

экспериментальной вирусологии ФГБУ «Научно-

исследовательский институт вакцин и сывороток им.

И.И. Мечникова» Российской академии медицинских

наук, Москва

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение науки " Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита диссертации состоится 29 мая 2012 года в_ часов на заседании Диссертационного

совета Д 001.043.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт гриппа» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова 15/17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт гриппа» Минздравсоцразвития России (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова 15/17).

Автореферат разослан «_» апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Суховецкая Вера Федотовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Актуальность проведенного исследования определяется важной ролью, которую респираторно-синцитиальный вирус (PCB) играет в структуре инфекционной патологии дыхательного тракта. PCB является одной из основных причин госпитализации детей первых двух лет жизни (Greenough А., 2009). Смертность от РСВ-инфекции (РСВИ), регистрируемая среди госпитализированных пациентов в возрасте до 18 лет, достигает в некоторых странах 33% и составляет около 37% при осложненном анамнезе (Welliver R., et al., 2010). Несмотря на то, что РСВИ представляет наибольшую опасность в раннем возрасте, она является значимой в структуре респираторных заболеваний во всех возрастных группах (Walsh Е., 2011). Факторами риска для осложненного течения инфекции являются детский и престарелый возраст, наличие кардиопульмонологических заболеваний, иммунодефицитных состояний. Среди взрослых реципиентов трансплантатов различных органов РСВИ принимает тяжелые формы и может являться причиной смерти у 30-100% пациентов (Whimbey E.and Ghosh S., 2000). Адаптивный иммунитет, формирующийся в результате перенесенной РСВИ как у детей (с еще незрелой иммунной системой), так и у взрослых, является краткосрочным и не обеспечивает полную противовирусную защиту, что является одной из причин реинфекций, наблюдаемых на протяжении всей жизни (Murry A. and Dowell S., 1997). Материнские РСВ-специфические антитела, содержащиеся в крови новорожденных, также не гарантируют защиту от инфицирования (Vangeel I. et al., 2007). Долгосрочные наблюдения показывают, что поражение нижних дыхательных путей в результате РСВИ может повлечь за собой функциональную дыхательную недостаточность, регистрируемую в течение последующих 3-4 лет (Ogra Р., 2004). До 70% маленьких детей, госпитализированных с бронхиолитами, обусловленными PCB, подвержены рецидивирующим эпизодам бронхообструкции в течение последующих 6-12 лет (Hyvärinen М. et al., 2007) с риском развития в дальнейшем бронхиальной астмы. РСВИ способствует развитию хронических легочных заболеваний и у взрослых - хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), а также бронхиальной астмы (Чучалин А., и др., 2007; Través S. and Proud D., 2007).

ний) одни и те же иммунологические механизмы могут индуцировать как противовирусные защитные, так и патологические реакции (Oshansky С. et al., 2009). Такая двойственность присуща также гуморальному противовирусному иммунитету. В модельных опытах было показано, что наряду с противовирусным протективным действием РСВ-специфические антитела (AT) могут принимать участие в иммунопатологических механизмах, обуславливающих тяжелое течение экспериментальной РСВИ у лабораторных животных.

Большинство исследований, изучающих патогенез РСВИ, выполнено в модельных экспериментах на животных, которые не всегда адекватно отражают процессы, протекающие в организме человека. До сих пор при изучении закономерностей противовирусного иммунитета преобладают исследования, посвященные Т-клеточным реакциям. Механизмы В-клеточного иммунитета изучены в значительно меньшей степени. О характере гуморального РСВ-специфического иммунитета у инфицированных больных до сих пор можно судить главным образом на основании работ, выполненных 20-30 лет назад, что свидетельствует о недостаточной изученности проблемы на современном уровне. При этом некоторые недавно обнаруженные особенности патогенеза РСВИ указывают на необходимость изучения закономерностей именно В-клеточного иммунного ответа. Так, из двух основных поверхностных гликопротеинов (F и G) образование анти-РСВ протективных цитотоксиче-ских CD8+ Т-клеток вызывает только F-белок. При этом вируснейтрализующие антитела формируются в ответ на воздействие обоих гликопротеинов (de Waal L. et al., 2006). Для защиты от РСВ необходимы высокоаффинные AT к G-белку, что обусловлено патогенным действием на иммунную систему определенных антигенных детерминант этого гликопро-теина. Кроме того РСВ обладает уникальной для респираторных вирусов особенностью -наличием секреторной формы G-белка (sG), играющей в организме роль «антигенной ловушки» для нейтрализующих AT (Bukreyev A. et al., 2008). Эти особенности структуры РСВ должны быть учтены при создании вакцинных препаратов.

Объектом клинических исследований являются преимущественно дети до двух лет жизни с первичными РСВИ. Однако модельные эксперименты свидетельствуют о том, что механизмы противовирусной гуморальной защиты, так же как и иммунопатологии, в том числе обусловленные действием AT, различны при первичном и повторном инфицировании. Недостаточное понимание этого аспекта патогенеза РСВИ привело к трагическим последствиям при введении детям инактивированной формалином РСВ-вакцины. Этот тип вакцин без патогенных последствий был применен при вакцинации против гриппа и некоторых других ОРВИ. Однако в случае РСВ введение препарата привело к более тяжелому течению последующей РСВИ (с несколькими летальными исходами) по сравнению с непривитыми детьми грудного возраста (Kim Н. et al.,1969). Такого негативного эффекта не было зарегистрировано в группах старших детей, уже перенесших РСВИ до вакцинации (Waris М. et al., 1997). Этот пример ясно показал необходимость расширения возрастных рамок при изучении закономерностей формирования гуморального РСВ-специфического иммунного ответа у пациентов.

Изучению РСВ-специфического гуморального ответа у пациентов с точки зрения соотношения активности иммуноглобулинов различных изотипов посвящены лишь единичные работы. Тем не менее, результаты модельных экспериментов показывают значимость изучения этого вопроса. Например, показана патогенная роль анти-РСВ IgE, связь этих AT с развитием аллергических реакций, характерных для тяжелого течения РСВИ: легочной эозинофилии и повышенной гиперреактивности дыхательных путей (Dakhama A. et al., 2009).

Изотипическая структура противовирусного гуморального ответа дает определенное представление об особенностях регуляторных механизмов и патогенезе заболевания. Соотношение активности антиген-специфических IgG2a/ IgGl традиционно рассматривается как показатель баланса между протективным Thl и патогенным Th2 -типом иммунного ответа у мышей (Nurieva R., and Chung Y., 2010), в том числе при характеристике гриппозной инфекции и свойств гриппозных вакцин. Отсутствие соответствующей информации затрудняет понимание механизмов патогенеза РСВИ и той роли, которую играют при этом РСВ-специфические AT.

Решение этих вопросов может быть осуществлено с использованием иммунофер-ментного анализа. Иммуноферментные тест-системы (ИФТС) для серодиагностики РСВИ производятся целым рядом зарубежных фирм, однако спектр РСВ-специфических иммуноглобулинов (Ig), которые можно детектировать с их помощью, ограничен тремя классами - G, М и А. Нет коммерческих ИФТС для выявления анти-РСВ IgE и субклассов IgG. Все вышеизложенное определило необходимость создания отечественных иммуноферментных тест-систем, позволяющих проводить углубленный анализ изотипической и сайт-специфической структуры анти-РСВ гуморального ответа у больных. Создание чувствительных серологических тест-систем имеет также важное практическое значение. Поскольку симптомы РСВИ и гриппа сходны клинически, РСВИ в период эпидемии гриппа остаются во многих случаях нераспознанными. Необходимость дифференциальной диагностики РСВИ и назначения своевременного лечения диктуется тем, что РСВ значительно чаще, чем другие респираторные вирусы, вызывает развитие иммунопатологических проявлений в легких (Walsh Е. et al., 2007).

Цель работы состояла в сравнительной оценке структуры и особенностей РСВ-специфического гуморального иммунного ответа в зависимости от формы бронхолегочной патологии и возраста пациентов с использованием новых, разработанных нами иммуноферментных тест-систем моноклонального типа.

Задачи исследования

1. Сконструировать иммуноферментные тест-системы (ИФТС) для детекции в сыворотках крови РСВ-специфических антител различных классов и подклассов (IgG, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgE), а также выявления IgG, взаимодействующих с функционально значимыми консервативными эпитопами F- и G- белков РСВ.

2. С применением сконструированных ИФТС охарактеризовать особенности реагирования РСВ-специфических иммуноглобулинов различных изотипов в зависимости от возраста пациентов и характера заболевания.

3. Охарактеризовать вируснейтрализующую активность антител в сыворотках крови пациентов с различными клиническими формами РСВИ.

4. Оценить влияние перенесенной ранее РСВИ на течение последующих респираторных заболеваний.

5. Провести сравнительную оценку иммунного ответа, направленного к консервативным эпитопам F- и G- белков PCB, у пациентов с РСВИ.

6.Проанализировать влияние материнских антител на характер РСВ-специфического гуморального ответа, формирующегося у детей при первичном заболевании.

7. Провести сравнительную оценку формирования аутореактивных антител при респираторных вирусных заболеваниях различной этиологии.

8. Оценить in vitro и in vivo иммуногенные и протекгивные свойства препаратов, созданных на основе синтетического пептида, имитирующего структуру части главного нейтрализующего домена F- белка PCB.

Научная новизна работы. Впервые в России сконструированы ИФТС для детекции PCB - специфических Ig семи изотипов (М, А, Е, Gl, G2, G3, G4), а также ИФТС на основе синтетических пептидов (СП), представляющих структуру иммунодоминантных эпитопов F- и G- белков PCB, для выявления эпитоп-специфичных IgG. Разработанные ИФТС позволили провести углубленный анализ структуры РСВ-специфического гуморального иммунного ответа.

С использованием разработанных ИФТС впервые проведена комплексная сравнительная оценка реагирования РСВ-специфических AT различных классов и субклассов в зависимости от возраста и формы заболевания пациентов. По соотношению активности ответа Thl- и ТЫ-регулируемых AT определен тип РСВ-специфического гуморального иммунного ответа в различных группах пациентов. Впервые проведена сравнительная оценка ответа со стороны Th2-зависимых анти-РСВ IgE и IgG4 при РСВИ у детей и взрослых, осложненной аллергическим компонентом. Полученные данные дополняют существующие представления о патогенезе РСВИ.

Впервые показано, что характерной особенностью осложненного течения повторных РСВИ как у детей, так и у взрослых, является повышенная активность РСВ-специфических IgM.

Впервые выявлены изменения иммунодоминирования при ответе на В-клеточные эпитопы поверхностных гликопротеинов PCB у пациентов с РСВ-реинфекциями в зависимости от характера заболевания. Полученные результаты дополняют данные литературы о механизмах иммунодоминирования среди Т-клеточных детерминант PCB.

Впервые показано негативное влияние материнских IgG, специфичных к консервативным антигенным детерминантам поверхностных гликопротеинов PCB, на характер PCB-

специфического иммунного ответа, формирующегося у детей в возрасте до 10 месяцев при первичном заболевании.

Впервые выявлен синтез аугореактивных IgM и IgG у пациентов с осложненными формами РСВИ.

Впервые синтезированы препараты с использованием синтетического пептида, имитирующего структуру нейтрализующего эпитопа F-белка PCB, и оценены их иммуногенные и протективные свойства.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Сконструированные ИФТС для детекции РСВ-специфических иммуноглобулинов различных изотипов рекомендуется использовать как для серодиагностики РСВИ, так и для оценки роли РСВИ в структуре инфекционной респираторной патологии среди различных групп пациентов.

2. Изотопическая структура РСВ-специфического ответа, оцененная с использованием разработанных ИФТС, отражает особенности гуморального иммунитета, характерные для определенного возраста и формы бронхолегочной патологии при РСВИ.

3. Осложненное течение РСВИ ассоциировано со сниженной вирус-нейтрализующей активностью антител, а также повышенным уровнем синтеза Th2-регулируемых РСВ-специфических иммуноглобулинов.

4. Перенесенная ранее РСВИ, осложненная аллергическим компонентом, показателем чего является высокое содержание в крови предсуществующих анти-РСВ IgE, оказывает негативное влияние на течение последующих респираторных заболеваний.

5. Иммунодоминирование при ответе на B-клеточные эпитопы поверхностных гли-копротеинов PCB меняется у РСВ-инфицированных лиц в зависимости от клинической формы заболевания.

6. Пассивно приобретенные материнские IgG, специфичные к консервативным детерминантам F-белка (аминокислотная последовательность 221-232) и G- белка (последовательности 152-164 и 184-198) PCB, оказывают негативное влияние на формирование адаптивного РСВ-специфического гуморального иммунного ответа при первичном инфицировании детей.

7. При осложненном течении РСВИ наблюдается интенсивный синтез аутореактивных IgM и IgG.

8. Препараты, сконструированные с использованием синтетического пептида, представляющего структуру нейтрализующего эпитопа F-белка PCB (аминокислотная последовательность 221-232), оказывают иммунопатогенное действие на лабораторных животных.

Практическая значимость результатов работы. Сконструированные ИФТС для детекции анти-РСВ Ig различных изотипов рекомендуется использовать для серодиагностики РСВИ, а также для оценки протективной и потенциально патогенной составляющих иммунного ответа.

Выявление РСВ-специфических IgE на ранних сроках заболевания позволит снизить риск отдаленных последствий перенесенной инфекции, в том числе рецидивирующей брон-

хообструкции и формирования хронической бронхолегочной патологии в более зрелом возрасте, путем устранения аллергических проявлений. Высокое содержание в крови анти-РСВ ^Е является прогностическим показателем повышенного риска осложненного течения последующих респираторных заболеваний.

Для оценки вируснейтрализующей активности РСВ-специфических АТ был предложен новый вариант постановки реакции нейтрализации (РН) с оценкой результатов в мик-рокультуральном ИФА при использовании вирусспецифических моноклональных антител. Этот метод может быть применен в эпидемиологических исследованиях для определения уровня защищенности тех или иных групп населения от РСВИ.

Детекция анти-РСВ ^А в сыворотках крови непрямым ИФА предложена в качестве диагностического теста, оказавшегося эффективным при выявлении заболевания у детей первых лет жизни наряду с детекцией антител классов Г§(5 и ^ М. Простота исполнения позволяет комплексно применять этот метод в практических лабораториях.

Низкое содержание в крови предсуществующих взаимодействующих с синтетическими пептидами, имитирующими структуру антигенных детерминант, функционально значимых для репродукции РСВ, может служить прогностическим показателем для выявления контингентов с повышенным риском инфицирования. Этот подход может быть использован при изучении защитного гуморального РСВ-специфического иммунитета. Внедрение результатов работы. По результатам Госиспытаний получен Сертификат производства (СП № 002907, июнь 2010) на производство медицинского иммунобиологического препарата «Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса О к респира-торно-синцитиальному вирусу (ИФТС-РС-^в)». ИФТС внедрена в практику и используется для диагностики РСВИ в клиниках и ФГУЗ «Центры гигиены и эпидемиологии» на территории России.

Опытные образцы сконструированных ИФТС для детекции анти-РСВ различных изотипов прошли первичную апробацию в стационарах С.-Петербурга.

Методические рекомендации по детекции специфических иммуноглобулинов различных изотипов к вирусам гриппа и ОРЗ иммуноферментным методом приведены в «Практических рекомендациях по лабораторной диагностике вирусных инфекций» (С.Петербург, 2005).

Работа выполнялась в рамках плана НИР ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразви-тия РФ, начиная с 1995г, а также по темам, выполненным в 2002 - 2003гг в рамках Межведомственной научно-технической программы "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего", Генеральным Заказчиком которой являлось Министерство промышленности, науки и технологий Российской Федерации.

раторной диагностики РСВИ, проведенной в РСК, и изоляции вирусов в культуре клеток (Голованова А.К.), иммунофлуоресценции (Милькинт К.К.), ИФА-выявления антигенов PCB в клинических материалах (Амосова И.В.), предоставлении противовирусных моно-кпональных AT (Сорокин Е.В., Царева Т.Р.). Автор выражает благодарность Зарубаеву В.В. за патоморфологический анализ, Васильевой И.А. и Головачевой Е.Г. за предоставление данных об интерфероновом статусе обследованных нами пациентов, Смирновой Т.Д. за предоставление клеточных культур, Власову Г.П. за синтез пептидных препаратов, Хромову-Борисову H.H. за предоставление авторской статистической программы SANCT.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному консультанту д.м.н., профессору A.A. Сомининой за помощь в организации исследований, консультации при обработке материала и оформлении диссертации.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были отражены в тезисах, представленных в сборниках трудов национальных, Всероссийских и международных конференций и конгрессах, в том числе: Пятом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1995), Шестом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Новосибирск, 1996), Юбилейной международной научной конференции «Грипп -XXI век» (С.-Петербург, 1997), Всероссийской научной конференции «От Materia Medica к современным медицинским технологиям» (С.-Петербург, 1998), Eropean Respiratory Society Annual Congress (Geneva, 1998), Восьмом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1998), Девятом национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва 1999), World Congress on Lung Health and 10 E.R.S. Annual Congress, (Florence, 2000), 11 European Congress of Clinical Microbiology and Infections Diseases, (Istanbul, 2001), Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 2001), Девятом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2002), Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004), Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (С.-Петербург, 2011).

Материалы исследования были доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.А.Смородинцева «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций» (С.-Петербург, 2001), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 35-летию НИИ гриппа РАМН «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций» (С.-Петербург, 2002), Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции — теоретические и практические аспекты» (С.-Петербург, ноябрь 2004), Четырнадцатом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), заседании Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (С.-Петербург, 2003 и 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 статей (из них 17 - в журналах, рекомендованных ВАК), и 23 тезиса.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав изложения результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на страницах текста, включая 15 таблиц и 46 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 350 источников, из них 20 отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клинические материалы были получены из детских городских больниц №4 и №5, Инфекционной больницы №30 им С.П. Боткина и Военно-медицинской академии им С.М.Кирова (Санкт-Петербург) в 2000-2007гг.

Диагностирование РСВИ проводили комплексом лабораторных методов, включая выделение вируса из носоглоточных смывов и мазков в культуре клеток, детекцию вирусных антигенов (АГ) в эпителиальных клетках из носовых ходов прямым иммунофлуоресцентным методом (с использованием ФИТЦ-конъюгатов, выпускаемых "Предприятием по производству диагностических препаратов", С.-Петербург), а также сэндвич-ИФА, выявление серо-конверсий РСВ-специфических AT в реакции связывания комплемента, ИФА и реакции нейтрализации.

Клетки, вирусы, вирусспецифические моноклональные антитела (МКА). В работе использовали перевиваемые культуры клеток МА-104 и MDCK, а также диплоидную культуру фибробластов легких эмбрионов человека (ФЛЭЧ) из банка клеточных культур ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития РФ. PCB, штамм Long , был получен музеем вирусов НИИ гриппа из National Institute for Medical Research, London. Вирус парагриппа 2 типа, аденовирус 6 типа, вирусы гриппа А и В были предоставлены музеем вирусов НИИ гриппа. Все использованные в работе МКА, специфичных к F-белку PCB, гексонному АГ аденовирусов, NP-белку вирусов гриппа А или В, были получены в лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа.

Культивирование вируса и получение антигенного материала. PCB культивировали в бессывороточной среде в культуре клеток МА-104. Очистку и концентрацию вируса проводили ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахаразы по методу Orvell (Orvell С. et al., 1987). Полученный цельновирионный PCB (РСВ-ЦВ) хранили при -75°С. Для контроля отсутствия контаминации полученного концентрата PCB посторонними вирусными агентами проводили электронно-микроскопический анализ и непрямой ИФА с MICA, специфичными к различным вирусам ОРЗ. Антигенную сохранность вирусного материала оценивали непрямым ИФА с использованием МКА, специфичных к F-белку PCB. Иммунологические методы для характеристики антител. Детекцию РСВ-специфических Ig изотипов G, Gl, G 2, G3, G 4, А, Е в сыворотках крови проводили непрямы.» ИФА с использованием в качестве АГ для сенсибилизации твердой фазы очищенного РСВ-ЦВ и пероксидазных конъюгатов МКА к соответствующим изотипам Ig человека (НПО "Полигност", С.-Петербург). Оценку AT класса G, специфичных к функционально значимым эпитопам поверхностных гликопротеинов PCB, проводили непрямым ИФА с

использованием для нанесения на твердую фазу синтетических пептидов (СП), имитирующих первичную структуру консервативных аминокислотных последовательностей (АП) F-и G- белков PCB. Детекцию аутореактивных антител классов Ми Gb сыворотках крови людей оценивали непрямым ИФА с использованием в качестве АГ донорского IgG человека (Предприятие НИИ им. Пастера, С.-Петербург), солюбилизированных неионным детергентом ß-октилглюкозидом (Sigma, США) белков клеток ФЛЭЧ, а также гепарина (ОАО «Синтез», г. Курган) в качестве аналога клеточного гепарансульфата. Непрямой ИФА был применен также для оценки содержания IgG различной специфичности в сыворотках крови лабораторных животных. Детекцию связавшихся с антигенами AT в сыворотках кроликов проводили с помощью пероксидазного конъюгата стафилококкового белка А (Производство при НИИ им.Пастера, С.-Петербург), в сыворотках мышей- меченных пероксидазой ан-ти-мышиных AT коз (Sigma, США). Выявление анти-РСВ IgM в сыворотках пациентов проводили в ИФА «с захватом IgM» с использованием на стадии захвата МКА М/2В9 к мю-цепи молекулы IgM человека (НПО "Полигност", С.- Петербург), затем последовательно - РСВ-ЦВ и МКА к F-белку PCB, меченных пероксидазой (на стадии детекции). Конкурентный ИФА с использованием СП применяли для детекции AT определенной эпитоп-ной направленности в сыворотках пациентов, перенесших РСВИ (Кривицкая и др., 2004). Для стандартизации результатов, полученных в лаборатории в течение ряда лет, средний групповой уровень анти-РСВ AT всех классов и субклассов представляли в виде средней арифметической нормализованных показателей OD450/OD450K+, где OD450 - показатель, полученный для анализируемой пробы, OD450 К+ - содержание Ig исследуемого изотипа в высокотитражных сыворотках (внутренний лабораторный положительный контроль), используемых в рабочих разведениях в качестве референс-препарата во всех опытах. При анализе содержания AT в ИФА использовали сыворотки в одном предварительно выбранном разведении: 1/400 , 1/200, 1/100 , 1/10 - для Ig изотипов G, М, А, Е, 1/400, 1/20, 1/40, 1/80-для изотипов Gl, G2, G3, G4, соответственно.

Методы выявления вирусных антигенов. Для оценки репродукции вирусов в культуре клеток был разработан планшетный вариант микрокулътурального ИФА с оценкой содержания внутриклеточных вирусных белков с помощью вирусспецифических МКА, меченных пероксидазой (Кривицкая и др., 2004). Сзндвич-ИФА с использованием МКА к F-белку PCB на стадии захвата и их пероксидазного конъюгата на стадии детекции применяли при выявлении антигенов PCB в вируссодержащем жидком материале. Оценку вируснейтрализующей активности РСВ-специфическизс AT проводили с применением разработанного варианта реакции нейтрализации с учетом результатов ингиби-рования репродукции вируса в присутствии AT микрокультурапьным ИФА (Кривицкая и др., 2004). Конкурентная нейтрализация с использованием СП была применена для оценки содержания в сыворотках нейтрализующих AT, взаимодействующих с определенными эпитопами поверхностных белков PCB (Кривицкая и др., 2004).

Работа с животными выполнялась согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава №724, от 13.11.1984 г). Мыши

BALB/c и кролики были -получены из ФГУП "Питомник лабораторных животных «Раппо-лово», РАМН, Ленинградская область.

Определение содержания цитокинов: интерферона-a (IFN -а), интерферона-у (IFN- 7), IL-8, TNF-a, IL-lRa, G-CSF осуществляли с помощью ИФА-тест-систем производства ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов (С.-Петербург).

Синтетические пептиды, имитирующие первичную структуру функционально важных детерминант F и G- белков PCB, а также их конъюгаты были синтезированы в НИИ высокомолекулярных соединений РАН (С.-Петербург).

Действие пептидных препаратов на репродукцию вирусов in vitro после совместного культивирования вирусов с СП оценивали по результатам ингибирования синтеза вирусных белков в микрокультуральном ИФА с помощью вирусспецифических МКА, а также по снижению инфекционной активности вирусов при последующем титровании полученного вируссодержащего материала в культуре клеток.

Оценку иммуногенности пептидных препаратов проводили при иммунизации кроликов и мышей BALB/c. Животные были иммунизированы липопептидом, который представлял собой конъюгат СП, имитирующего аминокислотную последовательность вирус-нейтрализующего домена F-белка PCB (АП221-232), с альдегидом лауриновой жирной кислоты (F-SP12-LA), а также конъюгатом СП с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Динамику образования IgG, взаимодействующих с СП, PCB и невирусными антигенами, определяли в крови иммунизированных животных непрямым ИФА с нанесением на твердую фазу соответствующих антигенов . Противовирусная активность AT из сывороток крови была определена в микрокулыуральной реакции нейтрализации.

Протективное действие пептидных препаратов было оценено после интраназального инфицирования (50 мкл культуральной жидкости, содержащей 104 ТЦД50 PCB) предварительно иммунизированных мышей BALB/c по результатам детекции вирусных АГ (через 4 дня после инфицирования) в сэндвич-ИФА, а также анализа инфекционной активности PCB в микрокультуральном ИФА (после титрования вируса, содержащегося в легких животных, на тех же сроках).

Гистологический анализ фиксированных 10% формалином срезов, приготовленных из органов животных, проводили после окрашивания гематоксилин-эозином. Оценивали общую структуру ткани, интенсивность некротических процессов и клеточный состав инфильтрата. Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета компьютеризированных программ, включая «Statistica» (версия 6) и DAG-Stat. Для представления полученных данных использовали следующие показатели описательной статистики — среднее арифметическое, стандартное отклонение, средние геометрические титры. Были применены непараметрические критерии Манна-Уитни (для независимых выборок), знаковых рангов Уилкоксона (для связанных совокупностей), корреляционный анализ Спирмена. При множественных попарных сравнениях независимых выборок на одном массиве данных использовали критерий Данна после проведения рангового дисперсионного анализа Круске-ла-Уоллиса. Для оценки качественных признаков применяли точный критерий Фишера с

учетом поправки на множественность по методу Шидака. Мерой связи между двумя качественными измерениями служил коэффициент ассоциации Пирсона. Степень согласованности результатов, полученных двумя различными методами на одной выборке, оценивали по величине Каппы Коэна. Проверяемые критериями нулевые гипотезы отвергались при уровне значимости р <0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Конструирование иммуноферментных тест-систем для детекции РСВ-специфических антител различных классов и подклассов

При создании ИФТС в качестве антигенного материала использовали цельновирион-ный PCB (РСВ-ЦВ), очищенный и сконцентрированный ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Антигенную сохранность вирусного материала, являющуюся критическим показателем для качества тест-систем, и отсутствие в нем контаминации посторонними агентами оценивали в ИФА с использованием МКА 9С5 или RS-25, направленных к F-белку PCB, а также панели МКА, специфичных к гетерологичным вирусам. Целостность и структурированность вирусных частиц анализировали с помощью электронной микроскопии. Эффективное выявление сероконверсий анти-РСВ IgG в сыворотках пациентов, перенесших РСВИ, наблюдалось при использовании вирусного материала, состоящего преимущественно из неповрежденных вирионов (по данным электронной микроскопии), активно взаимодействующих в ИФА с РСВ-специфическими МКА. Чувствительность метода снижалась на 30 - 80% при использовании морфологически неполноценного PCB с нарушенной целостностью вирусной гликопротеидной оболочки.

Оценка качества антигенного материала, используемого в сконструированных ИФТС, была проведена в сравнении с антигеном из тест-системы для детекции анти-РСВ IgG производства фирмы «Virion» (Швейцария). Более высокая интенсивность реагирования с РСВ-специфическими МКА свидетельствовала о преимуществе полученного нами антигенного вирусного материала (рис.1).

1,2 1 I В Антиген PCB (Virion, Швейцария) PI'CB (НИИ гриппа)!

50,8 Й0,6 0,4 0,2 -0

0,005

0,05

концентрация МКА (мкг/мл)

Рисунок 1 — Взаимодействие в ИФА МКА 9CS, специфичных к F- белку PCB, с антигеном PCB, используемым в ИФТС производства фирмы «VIRION» (Швейцария) и НИИ гриппа

Диагностическая эффективность разработанных ИФТС была оценена при сравнении

с данными, полученными различными лабораторными методами.

Так, результаты выявления сероконверсий РСВ-специфических AT класса G в ИФА и реакции нейтрализации (РН), которая является наиболее чувствительным серологическим методом, показали высокую степень согласованности при анализе сывороток, полученных

от 102 пациентов с ОРВИ: Каппа Коэна составила 0,78 (р<0,001). Чувствительность и специфичность ИФА по сравнению с РН составила 86,7% и 93,0%, соответственно. При этом частота диагностирования РСВИ с использованием ИФТС была в 1,5 раз выше, чем в РСК.

Согласно Программе, утвержденной Комитетом медицинских иммунобиологических препаратов МЗ и СР РФ, были проведены Госиспытания изделия медицинского назначения «Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса в к респираторно-синцитиальному вирусу (ИФТС-РС-^й)» при сравнении с ИФТС ЛЭУ-^О-ЕиЗЛ фирмы «МоуаТес» (Германия). Чувствительность ИФТС-РС- (НИИ гриппа) в сравнении с лицензированным зарубежным аналогом составила 94,4%, специфичность - 95% при общем совпадении результатов 94,7%.

Преимуществом данной ИФТС, в которой для детекции связавшихся с РСВ АТ класса в применяются МКА к общему молекулярному маркеру человека, по сравнению с разработанной нами ранее тест-системой с использованием стафилококкового белка А (Кри-вицкая и др., 1991), является детекция всех субклассов в совокупности, в то время как белок А не взаимодействует с ^03 человека, что снижает чувствительность анализа.

По результатам Госиспытаний получен Сертификат производства (СП № 002907, июнь 2010) на производство медицинского иммунобиологического препарата «Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса в к респираторно-синцитиальному вирусу (ИФТС-РС-^в)».

Следующим этапом работ являлось конструирование изотопических ИФТС. Специфичность разработанных тест-систем была подтверждена при анализе парных сывороток, полученных от 460 пациентов с ОРЗ различной (не РСВ) этиологии. Отсутствие РСВИ было подтверждено комплексом методов. Частота выявления неспецифических сероконверсий составила 0,2-0,4% для АТ субклассов 01, 02, ОЗ, в4 и 1,9-2,2% для 1§Е и 1цА.

Помимо ИФТС, основанных на принципе непрямого ИФА, для выявления РСВ-специфических АТ класса М была сконструирована тест-система, в которой использовался принцип «захвата ^М». Такой подход позволяет избежать ложноположительных результатов, свойственных методу непрямого ИФА при оценке АТ данного класса из-за присутствия в сыворотках «нормальных» аутореактивных ^М. Специфичность сконструированной ИФТС, показанная при выявлении анти-РСВ в сыворотках пациентов с ОРВИ и здоровых лиц, составила 94%. Данный тип ИФТС с успехом был использован для раннего диагностирования РСВИ, поскольку сыворотки 50-60% детей с лабораторно установленной (другими методами) инфекцией были положительными по содержанию анти-РСВ ^М на 27 день заболевания. На 8-14 день РСВИ этот показатель увеличивался до 70-80%.

Частота детекции сероконверсий анти-РСВ ^ различных изотипов была оценена при анализе парных сывороток, полученных от пациентов различных возрастных групп с лабораторно подтвержденной РСВИ (табл. 1).

Таблица 1 — Детекция сероконверсий РСВ-специфических АТ разных классов и подклассов у пациентов с документированной РСВИ, проведенная с использованием разработанных ИФТС_

Группы пациентов Число пациентов Частота регистрации сероконверсий РСВ-специфических 1ц (%) следующих изотипов:

ДО (общий) 1ёМ ДО1 ДО2 ДОЗ ДО4 18А 18Е ДО (в совокупности)

Дети до 3 лет с первичной РСВИ 36 47 72 31 11 44 31 50 39 100

Дети и подростки отЗ до18 лет 88 60 78 50 30 41 34 28 40 98

Взрослые пациенты (старше 18 лет) 115 70 50 50 45 38 29 37 32 92

Детекция сероконверсий по субклассам ^О (особенно ^Ш) позволила увеличить частоту диагностирования РСВИ на 20-30% по сравнению с результатами, полученными при выявлении только общего ^С.

Сероконверсии анти-РСВ ^А с наибольшей частотой регистрировали у маленьких детей с первичными РСВИ. При совокупном анализе общего ^О и сывороточного ^А частота диагностирования РСВИ у детей в возрасте до 3 лет возрастала в 1,5 раз. Известно, что при первичном инфицировании диагностирование РСВИ по выявлению конверсий вирус-специфических ^О затруднено в силу достаточно низкого уровня их синтеза, а детекция ^М в ИФА «с захватом 1цМ» связана с многими проблемами методического характера. В этой связи дополнительная оценка конверсий сывороточных анти-РСВ ^А в непрямом ИФА может быть предложена в качестве простого и эффективного теста для более точной серодиагностики РСВИ у детей младшей возрастной группы.

Таким образом, ИФТС, разработанные нами для детекции анти-РСВ класса С и М, обладают высокой эффективностью при диагностировании РСВИ в различных 1руппах пациентов. Выявление сероконверсий 1 и ^А может служить дополнительным диагностическим тестом. ИФТС данного типа рекомендуется также использовать при оценке роли РСВИ в структуре инфекционной респираторной патологии среди групп населения.

Представляло интерес изучить заболеваемость РСВИ, в том числе при использовании новых тест-систем, среди детей, госпитализированных с респираторными заболеваниями в клиники г.С.-Петербурга, по результатам комплекса лабораторных методов. Показано, что с высокой частотой РСВИ была диагностирована при пневмонии, обструктивных заболеваниях - остром стенозирующем ларинготрахеите (СЛТ) и особенно часто - при остром обструктивном бронхите (ООБ), а также у пациентов с бронхиальной астмой в стадии обострения. С наибольшей частотой РСВИ регистрировали при развитии стеноза гортани и бронхообструкции у детей в возрасте до 3 лет (табл. 2).

Таблица 2 — Частота выявления РСВИ среди госпитализированных детей с респираторными заболеваниями___

Группа пациентов Средний возраст Диагноз Численность групп Частота выявления

Дети в возрасте от 6 месяцев 1,3 года ОРЗ 70 39

Острый стенозирующий ларинготрахеит (СЛТ) 27 52

Острый обструктивный бронхит (ООБ) 44 66

Дети и подростки в возрасте от 3 до18 лет 7,2 года ОРЗ 179 28

Острый бронхит 28 29

Острый стенозирующий ларинготрахеит 90 28*

Острый обструктивный бронхит 70 46 **

Бронхиальная астма 63 43

Острая пневмония 47 47

Примечание - Различия между группами пациентов разного возраста с СЛТ (* - р = 0,002) и ООБ

(**-р = 0,035)

Сравнительная оценка реагирования РСВ-специфических Ig различных изо-типов у детей и взрослых в зависимости от формы бронхолегочной патологии

По современным представлениям характер иммунного ответа на чужеродные агенты, включая вирусы, во многом определяется типом цитокиновой регуляции, обусловленным различными клетками, в том числе Т-хелперами 1 и 2 типа (Thl и Th2). При первом типе иммунного ответа (условно обозначаемом как Thl-тип) ключевыми регуляторами являются IFN- у, IL -2 и IL-12. При ТЬ2-типе иммунного ответа индуцируется синтез IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13 (Lucey D.et al., 1996).

Анализ литературы показывает, что обычно, при отсутствии осложнений, РСВ индуцирует Thl- опосредованный протективный тип иммунного ответа (Openshaw Р., 2001). Характерной картиной осложненного течения РСВИ у детей является гиперрактивность бронхов и обструкция дыхательных путей. Формирование данных осложнений обусловлено гиперактивностью главным образом Th2-опосредованных факторов (IL-4, IL-5, IL-10, IL-11, IL-13), синтез которых индуцирует РСВ (Kimpen J., 2001; Legg J.et al., 2003).

Механизм регуляции АГ-специфических Ig каждого изотипа в достаточной мере индивидуален. Так, дифференциальными регуляторами для синтеза IgGl, IgG2, IgG3, к которым относятся вируснейтрализующие AT, являются главным образом Thl-факторы, включая IFN- у (Ngo-Giang-Huong N. et al., 2001; Al-Darmaki S. et al., 2004). ТЬ2-опосредованные медиаторы регулируют синтез IgE (IL-4, IL-13), IgA (TGF-beta, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10) и IgG4 (IL-4, IL-10, IL-13) (Ellyard J. et al., 2004; Stavnezer J. and Kang J., 2009). Синтез IgM у человека стимулируется in vitro как Thl-факторами - IL-12, IFN-a, IFN- у, так и Th2- цито-кинами IL-6, IL-10 (Estes D. et al., 1998; Ellyard J. et al., 2004).

Таким образом, анализ изотипической структуры РСВ-специфичного гуморального иммунного ответа может дать определенное представление об особенностях регуляторных механизмов при РСВИ, а также о соотношении Thl (протективных) и Th2 (потенциально

патогенных) составляющих, что имеет большое значение для понимания патогенеза данного заболевания. В этой связи сопоставление характера реагирования анти-РСВ Ig различных изотипов с клиническим течением заболевания составило следующий этап наших исследований.

После первичного скрининга более 1500 пациентов с ОРЗ с применением сконструированных тест-систем были проанализированы парные сыворотки, полученные в острый (2-4 день) и реконвалесцентный (7-20 день) периоды заболевания от 311пациентов (189 детей и 122 взрослых) с РСВИ, лабораторно подтвержденной комплексом методов, протекающей без осложнений или в осложненной форме (СЛТ, ООБ, ОП). Пациенты были разделены на 3 группы: дети в возрасте от 10 месяцев до 3 лет (преимущественно с первичными РСВИ), а также пациенты, уже болевшие РСВИ ранее, - дети от 3 до 18 лет и взрослые пациенты старше 18 лет. Средний возраст в группах составил 1,3 , 6,9 и 28 лет. Критерием первичного заболевания служило отсутствие анти-РСВ IgG в первые три дня РСВИ. Показателем повторного инфицирования служило наличие в крови анти-РСВ IgG в первые дни заболевания. В группу сравнения были включены 463 пациента из тех же возрастных групп с респираторными заболеваниями не РСВ-этиологии, 70 здоровых детей старше 3 лет (средний возраст 11,2 лет), участвующих в программе по выявлению генетических маркеров диабета, а также 47 взрослых волонтеров (средний возраст 20,6 лет).

Предварительный ИФА сывороток, полученных более чем от 500 здоровых волонтеров и пациентов с ОРЗ не РСВ-этиологии, показал, что у 100% лиц старше 3 лет в крови содержались анти-РСВ IgG. Полученные результаты служат свидетельством того, что к трем годам практически все дети переболевают РСВИ, и согласуются с данными литературы (Hall S.,2001).

Оценка содержания РСВ-специФических АТ класса и подклассов G у клинически здоровых лиц.

Определение содержания анти-РСВ IgG в сыворотках клинически здоровых людей дает представление о среднем возрастном уровне Thl-регулируемых «иммуноглобулинов памяти», призванных защищать организм от вирусных атак. Этот фон предсущест-вующих АТ является результатом пролонгированной активности В-клеток памяти или длительно живущих плазматических клеток, возникших при перенесенных ранее эпизодах заболевания. В наших исследованиях оценка активности АТ, обладающих вируснейтрали-зующими свойства (IgGl, IgG2, IgG3), показала, что все 100% обследованных здоровых детей старше 3 лет и взрослых были серопозитивны по общему (без подразделения на подклассы) анти-РСВ IgG, в 79-83% случаев было показано высокое содержание РСВ-специфических IgGl. IgG2 и IgG3 были выявлены лишь у 6-10% детей и 21-32% взрослых. На основании этих результатов в сопоставлении с данными таблицы 1, свидетельствующими о достаточно высокой частоте ответа со стороны РСВ-специфических Ig субклассов Gl, G2 и G3 при РСВ-реинфекциях (сероконверсии выявлены в 30-50% случаев РСВИ), можно предположить, что после перенесенных ранее РСВИ наиболее длительно сохраняются в крови противовирусные IgGl. IgG2 и IgG3 циркулируют в течение более ко-

роткого времени. В этой связи высокое содержание РСВ-специфических ^02 или ^ОЗ в крови здоровых индивидуумов или пациентов с РСВИ в первые дни заболевания с большой степенью вероятности можно рассматривать как свидетельство недавно перенесенной инфекции. Этот критерий может быть использован при оценке влияния предшествующей РСВИ на течение последующих заболеваний.

Особенности реагирования РСВ-специфических 1е01. 1ей2 и 1дОЗ в зависимости от клинической тяжести РСВИ и возраста пациентов

У детей младшего возраста при первичной РСВИ (п=62) не наблюдалось зависимости реагирования вирусспецифических 1^1, 1§С2, ^ОЗ от тяжести заболевания. Независимо от характера течения РСВИ наибольший прирост АТ в реконвалесцентной фазе по сравнению с острым периодом заболевания наблюдали со стороны 1§03. Реакция ^01 в среднем по группе была выражена слабее. Синтез анти-РСВ регисирировали только в 10-12% случаев. Сравнение с уровнем АТ, выявленным в группе детей без РСВИ, показало, что анти-РСВ появляются в циркуляции в среднем после 4-5 дня заболевания (рис. 2).

р = 0,0005 р = 0,0002

□ пациенты с респираторными заболеваниями не РСВ-этиологии (п=71)

□ 2 -4 дни РСВИ

_□ 7-14 дни РСВИ_

Рисунок 2 — Формирование РСВ-специфических антител субклассов С1, С2, СЗ при первичной РСВИ у детей в возрасте до 3 лет

С возрастом интенсивность ответа всех трех подклассов ^О значительно возрастает: содержание РСВ-специфических АТ в фазе реконвалесценции значительно выше у пациентов старше 3 лет (р< 0,01) по сравнению с детьми младшего возраста (рис. 3). Объяснением служит возрастное «созревание» иммунной системы и активирование вирусом клеток памяти, в результате чего происходит быстрый синтез противовирусных У пациентов с повторными РСВИ активность анти-РСВ ^О зависела также от характера заболевания.

Так, у детей старшего возраста активный ответ анти-РСВ и ^03 наблюдали как при РСВИ без осложнений, так и при осложненном ее течении. При этом уровень и ^ЭЗ в фазе реконвалесценции был выше (р =0,04 и р =0,0007, соответственно) у детей со стенозом гортани (СЛТ) по сравнению с неосложненным течением инфекции. Та же закономерность была показана в группе детей с бронхообструкцией (ООБ) для ^01 (р =0,02). Вероятно, более активный синтез ^ двух данных изотипов при осложненных формах РСВИ является отражением особенностей воспалительных процессов, обуславливающих об-структивные проявления.

Со стороны интенсивный ответ наблюдали только при неосложненном заболевании. При всех осложненных формах РСВ-реинфекций у детей уровень анти-РСВ в фазе реконвалесценции практически не отличался от наблюдаемого в острой фазе заболевания и был ниже (р <0,01), чем при РСВИ без осложнений. Таким образом, при осложненном течении повторных РСВИ у детей старшей возрастной группы, также как и у детей младшего возраста с первичным заболеванием, анти-РСВ проявляет низкую активность-рис. 3.

0,9

+ * 0,8

о ю 0,7

О 0,6

О 0,5

о ш 0,4

О 0,3

О 0,2

0,1

0,9 + 0,8 о 0,7 « 0,6

0 0,5

1 0,4

3 о,з Э 0,2 ° 0,1 о

¡1 *

1 ъ — | Г

§ н 1 —; <=—р *

1 =0,007 >=0,еЬО4 Р 0,(^42

ОРВИ без осложнении (N1=125, N2=49)

1дС2 1дСЗ

ч §

1-4-

§ Г

острая пневмония (N1=20, N2=21)

острый стенозирующии ларинготрахент (N1=65, N2=25)

острый обструктивный бронхит (N1=37, N2=32)

О пациенты с респираторными заболеваниями не РСВ-этиологии □ 2-4 дни РСВИ (острая фаза заболевания)

Р 7 -14 дни РСВИ (фаза реконвалесценции)_

Примечания - Горизонтальными линиями на диаграммах указан средний уровень анти-РСВ в сыворотках 70 здоровых детей соответствующего возраста. N1- численность групп пациентов с респираторными заболеваниями не РСВ-этиологии, N2 - с РСВИ

Рисунок 3 — Особенности реагирования РСВ-специфических антител субклассов

С1, С2, СЗ у детей старшего возраста в зависимости от характера РСВИ

В отличие от детей, у взрослых пациентов как при неосложненном (п=70), так и при осложненном пневмонией (п=52) течении РСВИ, активная реакция на вирус была отмечена в отношении всех трех подклассов ^О. При этом в случае РСВИ, осложненной ОП, интенсивный синтез ^вЗ наблюдали в среднем в течение более продолжительного времени, чем у пациентов с неосложненным заболеванием.

Детекция РСВ-специфических антител класса М

1§М играют важную роль в противовирусной защите в связи с тем, что образуются на ранних сроках заболевания еще до синтеза высокоаффинных 1§0. Выявление вирусспе-цифических ^М имеет большое значение для ранней диагностики инфекции. Согласно полученным данным у детей младшего возраста с первичными РСВИ, в противоположность

слабому ответу со стороны наблюдали интенсивный синтез анти-РСВ ^М вне зависимости от тяжести заболевания: на 2-7 день заболевания АТ данного типа регистрировали у 50-60% детей, на 8-14 день - у 70-80%. Столь же активный синтез наблюдали у детей старше 3 лет с РСВ-реинфекциями. При этом средний уровень ^М на 7-14 день заболевания был достоверно выше (р<0,01) при всех осложненных формах РСВИ (СЛТ, ООБ и особенно ОП) по сравнению с неосложненной инфекцией.

У взрослых людей при РСВИ, протекающей без осложнений, анти-РСВ ^М выявляли реже, чем у детей - только в 26% случаев. Однако при осложнении пневмонией частота детекции анти-РСВ ^М достигала 64% (р<0,001). При этом более чем у половины пациентов наблюдали длительное сохранение анти-РСВ ^М на высоком уровне: на протяжении всего времени наблюдения, составлявшего 3-4 недели (рис.4).

Дети в возрасте до 3 лет

Дети от 3 до 18 лет

0,8 0,7 § 0,6 ¡0,3 2 0,4 §0,3 §0,2 0,1 о

в совокупности: РСВИ без

осложнений,

СЛТ, ООБ ( п=62)

0,8 + 0,7

4 0,5 I 0,5

§ 0,4 §

3 0,2 о 0,1

р=0,005

Взрослые пациенты

РСВИ без

осложнений(п-70)

вяагь

—р=0,0006

О острая фаза (2 -4 дни) РСВИ □ 7-14 дни РСВИ В 15-20 дни РСВИ

Уровень значимости сггличий между содержанием анти-РСВ ^М в фазе рекоивапесценции и острой фазе внутри одной группы пациентов: 0,042 "

-р=0,С

► -р= 0,0005 #- р= 0,0006

р=0,0005

Рисунок 4 — Особенности ответа анти-РСВ ^М у пациентов с РСВИ в зависимости от возраста и характера заболевания

В ранних работах сообщалось о высокой частоте детекции (до 75%) противовирусных ^М и длительное их сохранение (по крайней мере, в течение 4 недель) в крови пациентов старше 70 лет с РСВ-пневмониями ^¡кегГоге! Т. й а1., 1988). Согласно нашим данным, такая же закономерность наблюдается при пневмонии РСВ-этиологии у молодых взрослых (средний возраст данной группы пациентов составлял 35,4 года).

По классическим представлениям вирусспецифические 1§М образуются в результате Т-независимого синтеза, главным образом, при первичной инфекции, после чего В-

клетки памяти не формируются, в отличие от В-клеток, секретирующих ^ других изотипов. При повторном воздействии АГ на иммунную систему ^М синтезируются заново, как и при первом контакте. При этом уровень их синтеза существенно снижен, поскольку преимущество получают В-клетки памяти, которые дифференцируются в плазматические клетки, синтезирующие высокоаффинные гипермутированные

Отмеченная нами высокая активность анти-РСВ IgM при реинфекциях, особенно в случае осложнения пневмонией, когда высокое содержание РСВ-специфических IgM регистрировали уже в первые 2-4 дня болезни, не соответствует этим представлениям.

Однако наши наблюдения согласуются с результатами исследований последних лет, которые показали, что у людей формируются популяции IgM+ В-клеток памяти, активирование которых приводит к быстрому синтезу высокоаффинных IgM при повторных заболеваниях (Kurosaki T. et al., 2010). Усиленный синтез анти-РСВ IgM (в том числе В-клетками памяти) может быть следствием повышенной активности целого ряда иммуномодулирую-щих факторов, что является характерной картиной воспаления при осложненном течении РСВИ.

Поскольку важными факторами, стимулирующими синтез IgM, являются IFN-a и IFN-y (Estes D. et al., 1998), нами была оценена связь между уровнем данных цитокинов и анти-РСВ IgM в сыворотках, полученных от 28 пациентов с ОП РСВ-этиологии (12 детей, средний возраст 5,8 лет, и16 взрослых) с активным ответом со стороны IgM, а также 34 пациентов (10 детей и 24 взрослых) с неосложненным течением РСВИ, при которой наблюдался низкий уровень синтеза AT этого класса. Было показано, что уровень интерферонов в острый и реконвалесцентный периоды РСВИ был в среднем в 2-4 раза выше у пациентов с ОП, активно отвечающих на инфекцию синтезом IgM, чем у больных с неосложненный РСВИ при слабом реагировании IgM. В группе детей была установлена прямая связь между содержанием в крови РСВ-специфических IgM и IFN-a: Коэффициент корреляции Спир-мена составил 0,58 (р < 0,001). Для IFN-y отличия между двумя 1руппами были статистически недостоверны. У взрослых пациентов, наоборот, отсутствовала статистически значимая связь между содержанием в крови IFN-a и анти-РСВ IgM. При этом установлена прямая корреляция между уровнем анти-РСВ IgM и IFN- у. Коэффициент корреляции Спирмена составил 0,60 (р < 0,001). Таким образом, одной из причин повышенной активности РСВ-специфических AT класса M у пациентов с РСВИ, осложненной ОП, может быть высокий уровень интерферонов. Известно, что в патогенезе респираторных заболеваний IFN-y играет двоякую роль. С одной стороны снижает уровень ТЬ2-опосредованного воспаления. С другой, чрезмерная его активация приводит к индукции аллергических проявлений из-за усиления выброса гистамина базофилами и тучными клетками, а также стимуляции синтеза RANTES клетками гладкой мускулатуры респираторного тракта. В свою очередь RANTES ассоциирован с притоком ТЬ2-клеток и эозинофилов (Homey В., Zlotnik А., 1999). С повышенным уровнем IFN-y связано развитие бронхообструкции у детей (Yamagata S. et al., 2008). Не исключена возможность того, что избыточная секреция IgM, являясь следствием гиперактивности провоспалительных медиаторов, может обуславливать патогенное действие AT на иммунную систему пациента.

Вируснейтрализующая активность антител у пациентов с неосложненным и осложненным течением РСВИ

В свете полученных данных о неоднозначном реагировании Thl-регулируемых AT, обладающих нейтрализующими свойствами (сниженном ответе анти-РСВ IgG2, но повы-

шенной активности анти-РСВ ^вЗ и 1§М), выявленном при осложненном течении

реинфекций, была оценена функциональная (вируснейтрализующая) активность АТ. Для этого был предложен новый вариант постановки реакции нейтрализации (РН) с оценкой результатов в микрокультуральном ИФА при использовании вирусспецифических МКА. Сопоставление уровня вирус-связывающих анти-РСВ 1% класса в, определенного в ИФА, с нейтрализующей активностью АТ, оцененной в РН, было проведено при анализе сывороток крови 82 пациентов с неосложненным и осложненным течением РСВИ (ООБ у детей и ОП у взрослых). Было показано, что для детей в возрасте до 3 лет с первичной РСВИ характерна низкая нейтрализующая активность АТ вне зависимости от тяжести заболевания -средние геометрические титры (СГТ), определенные в фазе реконвалесценции, были значительно ниже по сравнению с пациентами старшего возраста (р<0,001). В свою очередь, в рамках каждой возрастной группы СГТ нейтрализующих АТ на 7-14 день после проявления симптомов заболевания были значительно ниже у пациентов с осложненным течением инфекции по сравнению с неосложненным (рис. 5А).

В противоположность нейтрализующим АТ, показатели активности РСВ-связывающих (частота сероконверсий и уровень в фазе реконвалесценции), оцененные в ИФА внутри каждой возрастной группы, не отличались у пациентов с неосложненным и осложненным течением РСВИ (рис. 5В).

| □ острая фаза РСВИ (2-4 день) Иреконвалесцемтная фаза РСВИ {7-14 день)

s £

| 2 500 & ™ 400 300 200 100

1 Дети в возрасте ло 3 лет Дети от от 3 д©18 лет 6 0% Взрослые пациенты

67%

34°/,

57%

|.................42%......................................

1 .....п

РСВИ

о= 12

ООБ

и = 12

О.пневмония

а= 14

1Д

0,3

0,8

i 0.7

« 0,6

О 0,5

S 0,4

о 0,3

0.2

0,1

РСВИ

п= 12

ООБ

п= 12

РСВИ без осложнений

п= 12

ООБ

п =22

Взрослые папненты

РСВИ без осложнений

О. пневмония

п=14

Примечание - Цифрами над диаграммами показана частота сероконверсий PCB нейтрализующих АТ и РСВ-

епецифических IgG

Рисунок 5 -Сравнительная оценка вируснейтрализующей активности АТ (А) и содержания РСВ-специфических IgG (В) в сыворотках пациентов с РСВИ

Характер реагирования анти-РСВ IgM и субклассов IgG при этом отражал в целом картину, представленную на рис.3 и 4. Например, содержание IgM в фазе реконвалесценции было выше (р< 0,01) при осложненном течении РСВИ (показатели OD450/OD450K+ составляли 0,40 -0,52), чем при неосложненном (OD450/OD450K+ 0,28-0,31) у пациентов старших возрастных групп. У детей до 3 лет этот показатель составил 0,34 ±0,09 и не зависел от тяжести заболевания.

Таким образом, в пределах каждой возрастной группы выявлено несоответствие между одинаковым содержанием анти-РСВ (вирус-связывающих) IgG и IgM, выявленным в ИФА в сыворотках реконвалесцентов с неосложненной и осложненной РСВИ, и сниженной активностью РСВ-нейтрализующих AT при осложненной форме заболевания. Эти данные свидетельствуют о сниженной нейтрализующей функции Ig, синтезируемых при РСВИ, осложненной бронхообструкцией у детей или пневмонией у взрослых, по сравнению с не-осложненным течением заболевания, или о малой доле вируснейтрализующих AT среди общего пула циркулирующих РСВ-специфических AT.

Полученные результаты согласуются с известным положением о несовершенстве иммунной системы маленьких детей, а также об искажении иммунологических регулятор-ных процессов, при тяжелом течении РСВИ. Механизмы, обуславливающие низкую эффективность РСВ-специфического гуморального иммунного ответа, до сих пор во многом не ясны. Согласно представленным данным, одной из причин слабого нейтрализующего действия РСВ-специфических AT может быть отсутствие синтеза IgG2, показанное нами у детей в возрасте до 3 лет вне зависимости от формы заболевания, а также у пациентов старшего возраста с осложненным течением РСВИ. Известно, что Ig именно этого изотипа реагируют с гликозилированными сайтами протеинов различных патогенов. В этой связи IgG2 имеют для защиты от РСВИ особое значение. Нейтрализация РСВ зависит от AT, направленных к двум главным поверхностным белкам вируса - F и G, которые (особенно G-белок) обладают высокой степенью гликозилирования. Структура G-белка в этом отношении уникальна - две трети его молекулярной массы составляют углеводы (Mcintosh К., Channock R.M., 1990). Слабая активность AT по отношению к углеводной составляющей гликопротеинов РСВ может способствовать тому, что вирус избегает воздействия иммунной системы хозяина.

Детекция РСВ-специфическихх IgE и IgG4 у пациентов с различными Формами бронхолегочной патологии

Характерной чертой осложненного течения РСВИ является иммунопатология, в том числе аллергические проявления (стеноз гортани, бронхообструкция), обусловленные гиперактивностью Th2-опосредованных медиаторов (IL-4,IL-5,IL-13) (Oshansky С. et al., 2009).

В этой связи особую значимость при изучении патогенеза РСВИ приобретает исследование роли AT, регуляция которых обусловлена ТЬ2-зависимыми факторами (IgE и IgG4), поскольку синтез этих Ig связан с аллергическими проявлениями. Функции Ig данных изотипов при вирусных инфекциях мало изучены. Основные представления о механизмах их действия получены при изучении аллергических заболеваний. Показано, что аллер-

ген-специфические IgE играют сенсибилизирующую роль, в то время как IgG4, наоборот, могут выполнять функцию блокаторов аллергических IgE-опосредованных реакций. В модельных экспериментах выявлена связь между высокой активностью анти-РСВ IgE и формированием у инфицированных PCB животных гиперреактивности дыхательных путей и бронхоспазма (Dakhama А. et al., 2009).

В представленной работе впервые проанализировано соотношение активности РСВ-специфических IgE и IgG4 в зависимости от возраста пациентов и характера заболевания.

У детей до 3 лет жизни с первичной РСВИ, протекающей без осложнений, среднегруп-повой уровень анти-РСВ IgE и анти-РСВ IgG4 как в острый, так и в реконвалесцентный периоды заболевания, не отличался от показателей, полученных для контрольной группы (дети с ОРЗ не РСВ-этиологии). При наличии бронхообструкции (ООБ) активный синтез РСВ-специфических IgE наблюдали на 5-14 дни заболевания на фоне очень незначительного повышения содержания IgG4. Соотношение содержания IgE/IgG4 в реконвалесцентной фазе РСВИ составляло 0,8 ; 1,1 и 1,8 для ОРЗ, СЛТ и ООБ, соответственно. Таким образом, при первичной РСВИ высокая активность вирусспецифических IgE, не сопровождающаяся параллельным синтезом IgG4, ассоциирована с формированием бронхообструкции.

У детей старшего возраста при всех осложненных формах РСВ-реинфекций содержание РСВ-специфических IgE уже впервые 2 дня превышало (р < 0,05) уровень, наблюдаемый при неосложненном течении инфекции. Анализ динамики синтеза анти-РСВ Ig показал, что при РСВИ, проходящей без осложнений, увеличение содержания IgG4 в крови наблюдалось на 3-4 день заболевания (р = 0,04 по сравнению с 1-2 днем) при отсутствии синтеза IgE. При СЛТ повышение содержания анти-РСВ IgE, регистрируемое после 4-6 дня заболевания, сопровождалось одновременным синтезом IgG4. Однако на более поздних сроках (9-12 день), когда стеноз уже был компенсирован, уровень анти-РСВ IgE снижался (р=0,04 по сравнению с 7-9 днем), в то время как активность IgG4 продолжала возрастать.

Наиболее тяжелое течение РСВИ с длительно сохраняющимися изменениями дыхательных функций наблюдалось в группах детей с ООБ и ОП. У этих пациентов активность анти-РСВ IgE значительно превышала таковую со стороны IgG4 (р < 0,01) на протяжении всего времени наблюдения (пациенты с ООБ) или после 5-6 дня болезни при ОП - рис. 6.

У взрослых с неосложненным течением РСВИ (п=70) и ОП (=52) были показаны принципиально те же закономерности, что и у детей старшего возраста. При неосложненном течении РСВИ наблюдали одновременное умеренное повышение синтеза IgE и IgG4 на 5-9 день заболевания. В эти же сроки при ОП значительно возрастало содержание РСВ-специфических IgE при неизменном уровне IgG4. К 15-20 дню заболевания содержание IgE и IgG4 в обеих группах снижалось и становилось сопоставимым с исходным. Однако у пациентов с ОП падение уровня IgE происходило медленнее.

Таким образом, между клинической тяжестью РСВИ и высоким уровнем сывороточных анти-РСВ IgE была выявлена прямая связь, тогда как связь с активностью противовирусных IgG4 носила обратный характер. Признано, что синтез антиген-специфических IgE является признаком развития аллергии на данный антиген. В этой связи способность PCB

индуцировать интенсивное образование АТ данного класса свидетельствует о том, что при РСВИ, осложненной бронхообструкцией или пневмонией, вирус может выступать в качестве аллергена.

Примечание - диаграммами показаны показатели, полученные для сывороток из группы здоровых детей старше 3 лет для и [цС4 [Ц

Рисунок б — Динамика синтеза анти-РСВ ГцЕ и 1дС4 у детей старшего возраста с РСВИ в зависимости от характера респираторной патологии

О том, что анти-РСВ У$04 могут, подобно аллерген-специфическим играть

блокирующую и/или конкурирующую роль по отношению к РСВ-специфическим 1§Е, свидетельствует обратная связь между уровнем ^ этих двух изотипов. В реконвалесцентной фазе РСВИ (на 7-14 день) у лиц с высоким содержанием анти-РСВ ígE в крови наблюдали как правило низкое содержание РСВ-специфических 1§04, и наоборот. Коэффициент ассоциации (И-а) Пирсона составил для обратного соотношения в содержании ^Е и ^04 0,54 (р<0,001).

В дополнение к вышеизложенному была выявлена статистически значимая связь (Ла = 0,55 ; р= 0,0008) между высоким содержанием в крови анти-РСВ ^Е на ранних сроках (первые два дня) заболевания и развитием осложнений (СЛТ, ООБ или ОП) при РСВ-реинфекциях у детей старшего возраста. Согласно полученнным данным повышенный уровень анти-РСВ ^Е (в 2,5 раза превышающий показатель, полученный для группы здоровых лиц), регистрируемый в первые дни заболевания, является прогностическим признаком развития осложнений. Такие пациенты требуют особого внимания врачей для предотвращения патогенных последствий инфекции.

Активность анти-РСВ 1еА у пациентов различных возрастных групп в зависимости от Формы РСВИ

В отличие от секреторного ^А, защитная противовирусная роль которого хорошо изучена, функции сывороточных АТ этого класса при вирусных заболеваниях во многом не ясны. Наряду с ^Е и 1§04, синтез ^А регулируется ТЬ2-зависимыми факторами. По-

вышение содержания ^А в крови наблюдали при тяжелом течении РСВИ у новорожденных (31§игз Ы., е1 а1, 2000). Наши результаты показали более общий характер этой закономерности - высокая активность сывороточных анти-РСВ ^А была выявлена при всех осложненных формах РСВИ вне зависимости от возраста пациентов - рис. 7.

Дети в возрасте до 3 лет

Взрослые пациенты

+ 0,8 ¡£

ю0,6 □

§0,4

а0,2 О

_ р=0,0005 р=0,042 +р=0,031 #р= 0,0006

Дети в возрасте от 3 до 18 лет РСВИ без ОСЛ (п= 25) ООБ (п= 32) ОП (п=21)

осложнении-(п=49)

□ 2-4 дни РСВИ в 7-14 дни РСВИ » 15-20 дни РСВИ

» р=0,007 + р=0,025

Примечания -*, +, # - в рамках каждой возрастной группы показаны отличия между показателями, полученными в фазе рсконвалесценции, по сравнению с острым периодом заболевания для данной формы РСВИ Рисунок 7 — Содержание РСВ-специфических ^А, выявленное в крови пациентов с

различным течением РСВИ

При этом была показана прямая корреляция между содержанием в крови РСВ-специфических ^Е, являющихся признанными маркерами развития аллергических процессов, и 1§А. Коэффициент корреляции между содержанием (показателями ОО450) этих двух классов АТ в пробах реконвалесцентов составил 0,60 (р< 0,001). На этом основании можно предположить, что высокое содержание в крови вирусспецифических ^А, подобно ^Е, ассоциировано с аллергическим течением РСВИ и может служить дополнительным показателем индуцированной вирусом аллергии.

Оценка влияния предсуществующих анти-РСВ 1аЕ на течение последующих острых респираторных заболеваний

На основании полученных данных была показана возможность негативного влияния предшествующей РСВИ на течение последующего респираторного заболевания.

Поскольку анти-РСВ ^Е сохраняются в крови в течение 3-12 месяцев после перенесенной инфекции (Роро\¥-Кгаирр Т. е! а1., 1989), высокое их содержание, выявленное у пациента при отсутствии документированной РСВИ, свидетельствует о том, что эти АТ являются предсуществующими и, согласно представленным выше данным, могут служить показателем аллергического течения РСВИ, перенесенной ранее. Анализ сывороток детей

старшей возрастной группы показал, что при СЛТ или ООБ не РСВ-этиологии содержание анти-РСВ ^Е в крови значимо превышало показатели, полученные для здоровых детей и пациентов с неосложненным течением заболевания — рис. 8. 0,8

О 0,4

□ здоровые дети

□ неосложненное течение заболевания 0 стенозирующий ларинготрахеит

■ острый обструктивный бронхит ЕЗ острая пневмония_

п=70 11=125 п=«5 а=37 л=20 Рисунок 8 — Содержание анти-РСВ предсуществующих в крови, у детей в возрасте от 3 до 18 лет без диагностированной РСВИ

При этом была выявлена связь между высоким содержанием в крови предсуществующих РСВ-специфических 1§Е и развитием обструктивных проявлений (стеноза гортани или бронхообструкции) при респираторных заболеваниях иной, не РСВ-этиологии - Яд составил 0,5 (р =0,006)

В дополнение к этому предшествующая РСВИ, проходящая с аллергическим компонентом, показателем чего служили сохранившиеся в крови анти-РСВ ^Е, повышает восприимчивость к другим респираторным патогенам. Так, анализ материалов, полученных от 89 больных с ОРЗ не РСВ-этиологии, показал повышенную частоту выявления аденовирусной (31% против 8%, р= 0,004) и парагриппозной (17% против 2%, р=0,011) инфекций в группе пациентов с высоким содержанием предсуществующих анти-РСВ 1§Е в крови по сравнению с пациентами, у которых эти АТ отсутствовали.

Таким образом, впервые на клиническом материале получены данные, дополняющие результаты модельных экспериментов, проведенных на мышах, о негативном влиянии осложненного течения РСВИ на патогенез последующих гетерологичных инфекций. Объяснением данного явления служит ТЬ2-цитокиновая локальная среда (1Ь-4, 1Ь-5, 11.-13), создаваемая долгоживущими резидентными лимфоцитами, привлеченными в респираторный тракт в процессе перенесенной ранее РСВИ (\Valzl в. е1 а1., 2000; Нагкег Л.е1 а1., 2007).

Результаты проделанной работы свидетельствуют о том, что детекция анти-РСВ ^ различных изотипов предоставляет возможность для выявления закономерностей, которые невозможно обнаружить при анализе АТ только основных классов. Структура РСВ-специфического системного гуморального иммунного ответа отражает особенности клинического течения заболевания, характерные для каждой возрастной группы и присущие определенным формам патологии. При этом изотипическую картину, выявленную при неос-ложненной РСВИ у лиц старшего возраста (когда иммунная система уже сформирована, в отличие от детей первых лет жизни), можно рассматривать в качестве «точки отсчета»,

сравнение с которой позволяет оценивать нарушения, характерные для осложненного течения заболевания, а также выявить закономерности возрастного несовершенства гуморального противовирусного иммунного ответа.

Так, при РСВИ, протекающей без осложнений, как первичной у детей до 3 лет жизни, так и при реинфекциях у пациентов старшего возраста, наблюдается ответ преимущественно со стороны Thl - регулируемых изотипов анти-РСВ Ig, обладающих вируснейтрали-зующими свойствами- IgGl, IgG3 и IgG2 (за исключением слабой реакции со стороны IgG2 при первичном заболевании). При этом уровень Ig данных изотипов у детей первых лет жизни вне зависимости от формы заболевания, значительно уступает (особенно IgG2) показателям, полученным при РСВИ в старших возрастных группах.

РСВ-реинфекции, осложненные стенозом гортани, бронхообструкцией или пневмонией у детей, а также пневмонией у взрослых, характеризуются появлением в крови РСВ-специфических IgE и IgA, являющихся показателем ТЬ2-опосредованного аллергического течения заболевания. Помимо этого при осложненных формах повторных РСВИ у детей значительно снижена реакция IgG2 по сравнению с неосложненным течением инфекции.

Необходимость выявления ТЬ2-зависимых реакций при РСВИ обусловлена негативным влиянием этой инфекции, проходящей с осложнениями, на патогенез последующих заболеваний, вызванных как PCB, так и иными респираторными вирусами, что было показано в экспериментах на лабораторных животных (Schwarze J. et al., 1999; Harker J.et al., 2007). Детекция повышенного содержания анти-РСВ IgE в крови на ранних сроках ОРЗ является основанием для принятия мер, призванных не допустить развития обструкции и гиперреактивности дыхательных путей.

Наряду с активированием ТЬ2-зависимой составляющей гуморального иммунного ответа, осложненное течение РСВ-реинфекций у детей и взрослых ассоциировано с усиленной реакцией Ig, синтез которых регулируется Thl-зависимыми факторами (IgGl, IgG3), и IgM при одновременно сниженной вируснейтрализующей активности AT.

Поскольку AT всех классов, особенно IgG, являются мощными иммуномодулятора-ми, чрезмерная их активность может быть чревата патогенными последствиями (гипервоспалением) (Heyman В., 2000; Nimmerjahn F. And Ravetch J. et al., 2010). Не исключена возможность того, что AT, взаимодействующие с вирусом, но не способные снизить уровень его репродукции, усугубляют течение инфекции. В экспериментах на мышах была показана патогенная роль ненейтрализующих анти-РСВ AT. Образованные ими циркулирующие иммунные комплексы активировали систему комплемента, что приводило к повреждению нормальной ткани легких и бронхиальной гиперреактивности (Polack F. et al., 2002). Помимо этого, согласно экспериментальным данным, комплексы (PCB+IgG) способствуют инфицированию вирусом альвеолярных макрофагов в результате взаимодействия с клеточными FcO-рецепторами. Инфицированные PCB макрофаги начинают секретировать им-муносупрессорные факторы IL-4 и IL-10, что приводит к иммуносупрессии и, соответственно, утяжелению течения РСВИ (Fach S. et al, 2007). В связи с вышеизложенным полученные в проделанной работе данные ставят вопрос о необходимости проведения исследо-

ваний, направленных на оценку безопасности применения препаратов, стимулирующих активность гуморального иммунитета, для лечения РСВИ.

Характеристика гуморального иммунного ответа, направленного к функционально значимым эпитопам F- и G - белков PCB, у пациентов с РСВИ

В последние годы установлено, что определенные эпитопы белков PCB способны индуцировать синтез медиаторов и AT, оказывающих в зависимости от условий протектив-ное или повреждающее действие. В этой связи выяснение роли сайт-специфичных AT как в антивирусной защите, так и в развитии осложнений, важно для определения правильной стратегии борьбы с РСВИ. Для решения этого вопроса по результатам анализа литературы были синтезированы синтетические пептиды (СП), представляющие первичную структуру четырех консервативных линейных B-клеточных детерминант F- белка (F- SP 12, F- SP 13) и G-белка (G-T15, G-H13), играющих важную роль в репродукции вируса. Эпитоп F-SP12 (АП 221-232) идентифицирован как часть «главного вируснейтрализующего домена» F-белка PCB. F-SP13 (АП 478-516) принимает участие в процессах слияния вирусной и клеточной мембран. Эпитопы G-T15 (АП 184-198) и G-H13 (АП 152-164) играют важную роль в присоединении PCB к клетке. На основе СП были сконструированы иммунофер-ментные тест-системы (ИФТС-СП) для детекции эпитоп-специфических AT класса G в сыворотках крови. Специфичность ИФТС-СП в отношении выявления анти-РСВ IgG была доказана в конкурентном ИФА способностью пептидов конкурировать с вирионами PCB за связь с РСВ-специфическими AT из сывороток людей, переболевших РСВИ.

С использованием ИФТС-СП были проанализированы сыворотки, полученные в острой и реконвалесцентной фазах от 226 детей и взрослых с лабораторно установленной РСВИ. Результаты показали, что IgG к анализируемым эпитопам синтезируются у РСВ-инфицированных пациентов всех возрастных групп, однако с различной интенсивностью. При первичной инфекции у детей младшего возраста частота сероконверсий IgG, специфичных к эпитопам F-SP-12, F-SP-13, G-T15 и G-H13, была в 1,7-2,2 раза ниже, чем в среднем по группе у старших пациентов с повторными РСВИ. При этом, несмотря на повышение иммуногенности вирусных B-клеточных детерминант при РСВ-реинфекциях (с возрастом), частота регистрации сероконверсий эпитоп-специфических AT была недостаточно высока даже в группе взрослых пациентов (табл.3).

Таблица 3 — Частота сероконверсий IgG, специфичных к антигенным детерминантам F- белка и G-белков PCB, у пациентов с установленной РСВИ

Группы больных Численность групп Средний возраст Глет) Частота сероконверсий IgG (%) к антигенам:

РСВ-ЦВ F-SP12 G-T15 G-H13

Дети до 3 лет с первичной РСВИ 33 1,1 42 + 21 21* 24

Дети и подростки с повторной РСВИ 47 6,8 66 45 43 47

Взрослые пациенты с РСВИ 64 27,8 72 + 42 47* 45

Примечания - Отличия между группами детей до 3 лет жизни и взрослыми пациентами, показанные для АТ определенной специфичности : + - р = 0,012 * - р = 0,04

Полученные результаты подтверждают имеющиеся в литературе немногочисленные данные о достаточно низком уровне гуморального ответа на отдельные антигенные детерминанты различных белков PCB. Частота сероконверсий, регистрируемых в ИФА с использованием различных СП, составляет по сообщениям различных авторов 19-38% у детей с первичной РСВИ, 30-50% у взрослых (Akerlind-Stopner В. et al., 1995; Leonova I. et al., 1998; Murata Y. et al.,2010).

Слабая активность AT, взаимодействующих с иммунодоминантными эпитопами PCB, может отражаться на эффективности защитного противовирусного ответа. Для проверки этого положения на материале, полученном от 82 пациентов с РСВИ, было проведено сопоставление активности IgG, взаимодействующих с СП, имитирующими структуру двух эпитопов F-белка PCB (F-SP12 и F-SP13), индуцирующих по данным литературы синтез нейтрализующих AT у лабораторных животных, с интенсивностью образования вирус-нейтрализующих AT у обследованных лиц. В предварительных экспериментах в реакции конкурентной нейтрализации была показана способность данных СП взаимодействовать именно с нейтрализующими РСВ-специфичными AT из сывороток крови людей, переболевших РСВИ.

Было показано, что во всех возрастных группах пациентов 75-80% случаев отсутствия синтеза нейтрализующих AT было ассоциировано (р = 0,02) с одновременным отсутствием ответа со стороны эпитоп-специфичных IgG. Полученные результаты указывают на то, что одной из причин характерного для РСВИ недостаточно эффективного вирусспеци-фического гуморального иммунитета, может быть низкая иммуногенность консервативных антигенных детерминант, функционально значимых для репродукции вируса.

Преимуществом ИФТС-СП перед использованием в качестве антигена РСВ-ЦВ, представляющего совокупность всех иммуногенных детерминант, является возможность оценить роль, которую в структуре противовирусного гуморального иммунного ответа играют AT, специфичные к отдельным эпитопам вирусных белков. Так, использование СП позволило нам впервые выявить изменение иммунодоминирования (иерархии иммунного ответа на различные антигенные детерминанты) при ответе на B-клеточные эпитопы поверхностных гликопротеинов PCB.

При первичном заболевании сероконверсии IgG, направленных к эпитопам F-SP12, G-T15 и G-H13, выявляли с одинаковой частотой вне зависимости от течения РСВИ. В отличие от этого, в группе детей старшего возраста и взрослых пациентов с РСВ-реинфекциями наблюдалась определенная иерархия иммунного ответа, которая зависела от характера заболевания. Так, частота конверсий AT, взаимодействующих с эпитопом F-SP12, была значительно выше, а к G-H13, наоборот, ниже при осложненном течении инфекции по сравнению с неосложненным. При этом активность IgG, специфичных к G-T15, не зависела от характера РСВИ (рис.9).

Иерархию иммунодоминирования среди B-клеточных антигенных детерминант поверхностных белков PCB, наблюдаемую при РСВИ у пациентов старших возрастных групп, можно схематически представить следующим образом: эффективность ответа на эпитопы

G-H13 > G-T15 > SP12 - при неосложненной РСВИ, SP12 = G-T15> G-H13 - при осложненном течении инфекции.

Дети с первичной РСВИ

неосложнснное осложненное течение, п=18 течение (СЛТ, ООБ) п=15

неосложнснное осложненное

течение, п=69 течение, п=42 (СЛТ, ООБ, ОП)

OF-SP12 BG-T15 DG-H13 BPCB-IgG

Рисунок 9 — Изменение иммунодоминировання среди В-клеточных антигенных детерминант поверхностных белков РСВ в зависимости от течения РСВИ

В отличие от СП-специфических AT, реакция IgG на РСВ-ЦВ, определенная в ИФА, не зависела от клинического характера РСВИ. По-видимому, различия, касающиеся отдельных эпитопов, нивелируются при использовании цельных вирусных частиц, представляющих собой сложную смесь антигенных детерминант всех вирусных компонентов.

Таким образом, при повторных РСВИ у пациентов старших возрастных групп наблюдалась иерархия иммунного ответа на В-клеточные эпитопы поверхностных F- и G-белков РСВ. Поскольку картина иммунодоминировання менялась при осложненном течении заболевания по сравнению с неосложненным, можно предположить, что одним из факторов, обуславливающих данные изменения, может быть локальная воспалительная среда в очаге поражения. Например, в экспериментах на мышах показано, что гиперсекреция некоторых провоспалительных медиаторов (IFN-y) является причиной изменения иммунодоминировання ответа Т-клеток на антигенные белковые детерминанты (Liu F. et al., 2004).

Поскольку иммунодоминирование среди В-клеточных эпитопов было отмечено нами только у лиц старшего возраста при повторных РСВИ, но не у маленьких детей, можно заключить, что это явление носит кумулятивный характер и является результатом воздействий на иммунную систему нескольких перенесенных ранее инфекций. Полученные данные согласуются с результатами экспериментов о различии в характере иммунодоминировання, наблюдаемого при ответе СБ4+Т-клеток на определенные эпитопы F- белка РСВ при первичном и повторном заражении мышей (Castilow E.et al., 2008).

Изучение закономерностей иммунодоминировання имеет не только научный интерес, но и большое практическое значение. Понимание механизмов его формирования необходимо для выработки стратегии вакцинации, поскольку в состав препарата должны быть включены антигены, которые индуцируют такой иммунный ответ, который обеспечит эф-

Пациенты с РСВ-реинфекциями

фективную защиту большинства привитых людей вне зависимости от характера течения последующей инфекции (первичной, повторной, осложненной).

Оценка роли предсуществующих эпитоп-специфичных анти-РСВ IgG в патогенезе РСВИ

Анализ литературы показывает, что Ig любых изотипов обладают большим имму-номодулирующим потенциалом, степень реализации которого зависит от конкретных условий (Heyman В., 2000; Hjelm F. et al., 2006). Свидетельства негативного влияния РСВ-специфических AT, синтез которых обусловлен Th2- опосредованными факторами (IgE), на патогенез РСВИ приведены выше. Однако Thl-зависимые AT, призванные обеспечить противовирусную защиту, также могут при определенных условиях проявлять патогенные свойства. Так, в литературе активно обсуждается роль пассивно (трансплацентарно) приобретенных материнских антител в патогенезе первичной РСВИ, поскольку наибольшая частота осложненного ее течения наблюдается среди детей в возрасте до 7-10 месяцев, когда в крови еще циркулируют материнские анти-РСВ IgG (m-IgG). Данные по этому вопросу противоречивы. Результаты некоторых эпидемиологических исследований свидетельствуют о протективном действии анти-РСВ m-IgG (Glezen W. et al, 1981). Результаты других исследований показывают, что m-IgG не обеспечивают достаточной протекции от РСВИ. Напротив, могут ингибировать адаптивный синтез собственных противовирусных AT, что показано в экспериментах на животных (Crowe J. et al, 2001; Vangeel 1. et al, 2007). После вакцинации грудных детей интенсивный синтез РСВ-специфических нейтрализующих AT происходил только при отсутствии у привитых РСВ-специфических материнских AT (Crowe J.et al, 2001; Siegrist С., 2003).

Для прояснения данного вопроса с использованием ИФТС для детекции IgG, взаимодействующих как с РСВ-ЦВ, так и с синтетическими пептидами, имитирующими структуру трех консервативных эпитопов поверхностных гликопротеинов РСВ (F-SP12, G-T15, G-H13), была проведена оценка влияния m-IgG на характер анти-РСВ адаптивного гуморального ответа, формирующегося у детей при первичном инфицировании.

Проведенное предварительное исследование показало, что материнские анти-РСВ IgG могут циркулировать в крови детей вплоть до 10 месяцев жизни, что согласуется с данными других авторов. Для исследования была сформирована группа из 41 пациента в возрасте 1-10 месяцев. Из них у 27 детей была диагностирована РСВИ. Группу сравнения составили 14 детей с ОРЗ не РСВ-этиологии, заболевшие впервые. Поскольку известно, что при первичном инфицировании собственные анти-РСВ IgG не продуцируются раньше 5-6 дня заболевания, ранние сроки забора крови (не позднее 3 дня заболевания) позволили считать выявленные анти-РСВ антитела предсуществующими (материнскими).

Было показано, что m-IgG, взаимодействующие с РСВ-ЦВ, присутствовали в крови детей, инфицированных как РСВ, так и другими инфекционными агентами, приблизительно с одинаковой частотой - в 63% и 57% случаев, соответственно. Напротив, частота детекции m-IgG, специфичных хотя бы к одному из трех выбранных эпитопов поверхностных гликопротеинов РСВ, была в 2,7 раз выше (р = 0,047) в группе детей с РСВИ (56%), чем у паци-

ентов с ОРЗ иной этиологии (21%). Несмотря на выявленные различия, не было установлено статистически значимой связи между содержанием в крови детей m-IgG к анализируемым вирусным эпитопам с частотой заболевания РСВИ: Ra составил 0,28 (р =0,06). Таким образом, можно предположить, что материнские анти-РСВ IgG в крови детей грудного возраста не является фактором, влияющим на возможность первичного инфицирования PCB.

Тем не менее, дальнейший анализ показал влияние материнских AT на характер первичного РСВ-специфического гуморального ответа, которое удалось выявить только благодаря использованию в ИФА синтетических пептидов (но не РСВ-ЦВ), позволивших оценить уровень m-IgG к отдельным иммуногенным эпитопам поверхностных белков PCB. Суммарные данные о влиянии материнских AT на характер собственного иммунного ответа детей на первичное инфицирование PCB приведены ниже.

Так, при первичном ответе на РСВ-инфицирование наличие в крови детей материнских IgG, специфичных к консервативным детерминантам F или G-белков PCB:

- ассоциировано с осложненным клиническим течением РСВИ (бронхообструкци-ей) - Коэффициент ассоциации Пирсона (RA) =0,60, р = 0,006. Осложненную бронхообст-рукцией инфекцию значительно чаще (р = 7,0 хЮ"6) выявляли в группе детей с m-IgG в крови (82%), чем при их отсутствии (18%).

- не связано со снижением активности анти-РСВ IgM - Ra =0,10, р > 0,05. У детей, в крови которых присутствовали или отсутствовали m-IgG , синтез анти-РСВ IgM наблюдали приблизительно с одинаковой частотой (71% и 62%, соответственно)

- ассоциировано с отсутствием или сильным запаздыванием (по крайней мере, в течение двух недель) синтеза у детей собственных анти-РСВ IgG - Ra =0,50, р = 0,009. Так, частота сероконверсий анти-РСВ IgG у детей с m-IgG в крови (14%) была значительно ниже (р= 0,018), чем в случае их отсутствия (62%).

- ассоциировано с активацией синтеза Th2- регулируемых анти-РСВ IgA (частота сероконверсий составила в группах детей, имеющих или не имеющих в крови m-IgG, 86% и 8% (р=0,0002) , соответственно. RA =0,60, р = 0,009

Таким образом, в результате проведенного исследования впервые было показано негативное влияние предсуществующих материнских IgG, специфичных к определенным иммуногенным детерминантам F- белка (АП 221-232) и G-белка (АП 152-164 и 184-198) на течение первичной РСВИ у детей в возрасте до 10 месяцев. Наличие в циркуляции эпитоп-специфичных m-IgG ассоциировано у детей с повышенной активностью анти-РСВ IgA, синтез которых, согласно нашим данным, являются показателем аллергического течения РСВИ, и, наоборот, с низкой активностью противовирусных IgG. При этом наличие м-АТ у детей не влияло на синтез анти-РСВ IgM.

В последнее десятилетие описаны некоторые механизмы супрессорного воздействия пассивно введенных Ig на адаптивный синтез АГ-специфичных AT. Например, коагре-гирование образованными иммунными комплексами B-клеточных рецепторов с ингиби-рующими рецепторами Fc-gammaRII-bl на мембране B-клеток приводит к супрессии биологических функций лимфоцитов, а также превращения их в плазматические клетки, сек-

ретирующие AT. Этим объясняется тормозящее действие, оказываемое при внутривенном введении АГ-специфического иммуноглобулина на формирование у пациента собственного гуморального иммунного ответа на соответствующий АГ (Ravetch J. and Nimmeijahn F., 2008). Возможно, материнские AT могут оказывать ингибирующее влияние на адаптивный иммунитет ребенка по такому же принципу.

Характеристика аутореактивных антител у пациентов с острыми респираторными вирусными инфекциями

В последнее десятилетие наблюдается возрастающий интерес к аутоиммунным процессам, вызванным инфекционными заболеваниями и противовирусной вакцинацией. Известно, что в крови людей изначально присутствуют «нормальные» (natural) AT, которые являются необходимой составляющей врожденного иммунитета. Данные AT выполняют у млекопитающих функцию первой линии иммунологической защиты до начала синтеза высокоаффинных АГ-специфичных AT, поскольку взаимодействуют с эволюционно консервативными шаблонами, присущими вирусам, бактериям и паразитам, зачастую структурно сходными также с хозяйскими антигенами. В этой связи нормальные AT обладают ауторе-активностью. Помимо нормальных AT, принадлежащих, главным образом, к классу М, синтез аутореактивных IgM (ауто-IgM) и ауто-IgG может быть следствием нарушения иммунологической толерантности в условиях сильного локального воспаления, в том числе вирусного. Недавно проведенные исследования показали, что одни и те же механизмы (гиперактивация B-клеточных регуляторов BAFF и APRIL, повышенный синтез IL-17, гиперэкспрессия TLR на иммунокомпетентных клетках) обуславливают такие, на первый взгляд, разные явления, как атопия (включая астму) и аутоиммунитет. Сходные нарушения в регу-ляторных процессах обнаружены также при тяжелом течении РСВИ (Mackay F. et al., 2007; Reed J. et al., 2009; Mukheijee S. et al., 2011). В то время как связь РСВИ с аллергизацией организма и развитием астмы уже установлена, возможная роль аутоиммунных процессов в патогенезе этой инфекции не изучена. Тем не менее, учитывая возможную общность механизмов, рассмотрение этого аспекта патогенеза РСВИ являлось, на наш взгляд, вполне оправданным. Правомерность такого положения показали результаты единственной известной нам работы, целенаправленно исследовавшей аутоиммунную активность при РСВИ. В 2009г были опубликованы данные о том, что в назальных секретах детей с документированной РСВИ (но не гриппом), осложненной бронхиолитом, были обнаружены анти-нуклеарные ауто-IgA, ассоциированные с высоким содержанием BAFF и APRIL (Reed J.et al., 2009).

При выборе антигенов для детекции в непрямом ИФА аутореактивных AT в сыворотках пациентов с ОРВИ мы руководствовались известными данными, о том, что некоторые вирусы способны индуцировать синтез IgM, направленных к молекуле IgG (анти-IgG IgM). К таким AT относится ревматоидный фактор. Все респираторные вирусы вызывают апоптоз и/или некроз инфицированных клеток, и, следовательно, могут индуцировать синтез AT к компонентам нормальных клеток человека (анти-NCAg IgM , анти-NCAg IgG). Для приготовления нормальных клеточных AT (NCAg) использовали солюбилизированные по-

верхностные структуры фибробластов легкого эмбриона человека (клетки культуры ФЛЭЧ). Еще одним ауто-АГ при анализе ауто-^О был выбран гепарин - аналог гепаран-сульфата, входящего в структуру мембран практически всех клеток человека (анти-Нг ^в).

Определение содержания аутореактивных АТ в сыворотках клинически здоровых людей дает представление о среднем уровне «физиологической» аутореактивности, присущей данному возрасту и сформированной в результате воздействия на иммунную систему чужеродных и собственных АГ. Среди обследованных клинически здоровых детей в возрасте 3-16 лет (п=50) и взрослых доноров (п=47) с большой частотой регистрировали случаи высокого содержания в крови как анти-^О 1§М (52% и 40%), так и aнти-NCAg ^М (58% и 64%). У детей первых трех лет жизни эти показатели были ниже (р< 0,001) и составляли 20-25%. В тех же материалах, ауто-^в детектировали значительно реже во всех возрастных группах: в 2-8% случаев. Полученные результаты свидетельствуют о том, что аутореактивные АТ класса М, взаимодействующие с молекулой и антигенами неинфи-цированных клеток человека, относятся к нормальным и являются частью врожденного иммунитета, поскольку присутствуют в сыворотках крови клинически здоровых людей всех возрастных групп, в том числе детей грудного возраста. При этом физиологический уровень нормальных ^М в крови здоровых людей увеличивается с возрастом, что можно объяснить «созреванием» иммунной системы под действием постоянной стимуляции чужеродными и собственными АГ в течение всей жизни. В свете известных данных о защитных и регуля-торных функциях, выполняемых аутореактивными нормальными ^М, можно предположить, что формирование и поддержание оптимального (фонового) уровня этого типа АТ важно для иммунологической защиты, а низкое их содержание в крови может быть одной из причин повышенной чувствительности маленьких детей к вирусным инфекциям. Низкая частота выявления ауто-^О у здоровых людей указывает на то, что они не являются нормальными, а образуются, вероятно, в результате антиген-специфичных адативных процессов, в том числе при вирусных заболеваниях. Присутствие аутореактивных 1$0 в крови некоторых здоровых лиц можно объяснить длительной циркуляцией АТ, образованных в результате предшествующих контактов с различными антигенами.

Активность аутореактивных АТ при ОРВИ была проанализирована в сыворотках 750 пациентов в зависимости от возраста и этиологии заболевания.

У детей от 11 месяцев до 3 лет жизни частота сероконверсий ауто-^М была невысокой (0-16%) вне зависимости от этиологии заболевания. У пациентов старших возрастных групп с РСВИ и аденовирусной инфекцией (АВИ) частота регистрации конверсии аутореактивных ^М (особенно aнти-NCAg 1§М) была в 1,4 -5,3 раз выше, чем при ОРВИ иной этиологии. Кроме того, в группах больных РСВИ и АВИ, в отличие от пациентов с другими заболеваниями, были выявлены статистически значимые возрастные отличия (рис. 10)

При оценке аутореактивных 1§0 у пациентов с ОРВИ активный ответ со стороны этого типа АТ был отмечен только при РСВИ (табл. 4).

40 35 30 25 20 15 10 5 0

IgM, взаимодействующие с молекулой IgG

* а Дети до 3 лет о Пациенты в возрасте 3 пет * старше

—

1 1 1

— '/А 1 —

||i- p-iui М '-р=0,04-1 „-2YIII-5 1

+ м— IgM, взаимодействующие с

1 1 1 YA клеточными АГ

— 1-

n1=>62n2=1SÖ ni=1fin2=67 Гт1=15п2=113 n1=Sfl2=3i ft1=1Sn2=3Q РСВ-инфекцик Азедовнрусаая ГршшД ГршщВ Парагрндп ннфекдня

п1=«9 п2=159

ОРБИ

этыодогнн

Примечания- п1, п2-численность групп детей в возрасте до 3 лет и пациентов старше 3 лет. Отличия между возрастными группами для каждого заболевания: * - р-0,028 , + - р-0,0029 -Н- - р-0,037

Рисунок 10 — Частота сероконверсий аутореактивных 1ц\1 у пациентов с респираторными вирусными инфекциями в зависимости от возраста

Таблица 4 — Частота сероконверсий аутореактивных выявленная у пациентов с ОРЗ различной этиологии

Заболевание IgG к антигенам клеток ФЛЭЧ (анти-NCAg IgG) IgG к гепарину/гепарансульфату (анти-Hr IgG)

Численность групп Частота сероконверсий (%) Р* Численность групп Частота сероконверсий (%) Р*

PCB - инфекция 337 16 1 212 34 1

Грипп А 106 5 0,007 92 16 ** 0,0015

Грипп В 42 0 0,025 41 2 5.6x10"5

Аденовирусная инфекция 70 3 0,013 70 6 1,7 хХО 5

Парагрипп 32 3 0,17 26 4 0,01

ОРВИ недифференцированной природы 173 4 0,0002 173 8 6,1 хЮ 13

Примечание — * - статистическая значимость различий между частотой сероконверсий данного типа АТ, выявленной в группах пациентов с РСВИ и заболеваниями иной этиологии.

В результате проведенного анализа было показано, что интенсивный синтез двух классов аутореактивных AT (IgM и особенно IgG) является характерной чертой патогенеза РСВИ, в отличие от гриппа А, гриппа В, парагриппа

Поскольку не исключается возможность того, что в условиях сильного вирусного воспаления непатогенные в норме «нормальные» ауто-АТ могут принимать участие в патологических процессах (Merbl Y. et al., 2007), особый интерес представляло определение связи между тяжестью клинического течения заболевания и активностью аутореактивных AT.

У детей в возрасте до 3 лет не было установлено подобной зависимости ни при одном из анализируемых заболеваний. В старшей возрастной группе при заболеваниях PCB- и аденовирусной этиологии, протекающих в осложненной форме (обструкция респираторного тракта или пневмония), частота сероконверсий аутореактивных IgM была в 1,4 -1,8 раз выше, чем у больных с неосложненным течением этих инфекций.

Полученный результат дает основание для предположения о том, что чрезмерная активация нормальных ауто-IgM , призванных защищать организм, может играть патогенную роль и способствовать развитию осложнений у людей старшего возраста (т.е. при наличии зрелой иммунной системы, обуславливающей быстрый синтез большого количества AT, включая нормальные IgM), но не у детей до 3 лет жизни с еще не сформированной иммунной системой.

Частота сероконверсий аутореактивных IgG также была значительно выше (в 1,73,8 раз) при осложненном течении РСВИ (ООБ, пневмония) по сравнению с неосложненным. В дополнение к этому была установлена прямая связь (р< 0,001) между активностью ауто-IgG и РСВ-специфических IgE, чего не было показано для ауто-IgM. Синхронные конверсии анти-РСВ IgE и ауто-IgG были выявлены в 61-74% случаев, что указывает на потенциально патогенный характер аутореактивных AT класса G и возможную их роль в возникновении IgE-зависимой аллергии на компоненты PCB.

Таким образом, характерной чертой патогенеза РСВИ, особенно осложненного ее течения, является синтез аутореактивных IgM и IgG. Вопрос о механизмах возможной реализации патогенного действия AT данного типа предстоит решить в будущем.

Оценка биологических, иммуногенных и протективных свойств препаратов, созданных на основе синтетического пептида F-SP12

Несмотря на настоятельную потребность, до сих пор не существует ни одной лицензированной вакцины против РСВИ. Спектр препаратов для лечения РСВИ при этом весьма ограничен. В настоящее время ведутся разработки в направлении создания противовирусных препаратов на основе синтетических пептидов (СП), имитирующих структуру коротких фрагментов поверхностных белков PCB, функционально важных для репродукции вируса.

Отдельной задачей проделанной работы являлась оценка иммуногенных и протективных свойства СП, имитирующего первичную структуру части «главного вируснейтрали-зующего домена» F-белка PCB с АП 221-232 (F-SP12) (рис.П).

- + + -

221- Ile - Glu - Pbe - Gin - Gin - Lys - Asn - Asn - Arg - Leu - Leu - Glu -232

Примечание — Сверху указан заряд аминокислотных остатков (АК), снизу подчеркнуты гидрофобные АК

Рисунок 11 - Схема структуры синтетического пептида F-SP12, представляющего аминокислотную последовательность 221-232 F-белка PCB

Известно, что с этим эпитопом взаимодействуют РСВ-нейтрализующие мышиные МКА (Lopez J. et al.,1998). Согласно нашим данным, полученным методами конкурентного ИФА и конкурентной нейтрализации, с последовательностью F-SP12 эффективно реагируют РСВ-специфические AT, в том числе нейтрализующие, из сывороток пациентов, перенесших РСВИ.

При оценке противовирусной активности F-SP12 in vitro в культуре эпителиальных клеток почки обезьяны MA-104 было показано, что F-SP12 ингибировал синтез F- белка PCB на 35-50% при добавлении 0,6-10 мкг/мл в культуральную среду на ранних сроках репродукции вируса. Параллельно наблюдалось падение инфекционной активности вируса в 20-40 раз при концентрациях F-SP12 0,6 -2,5 мкг/мл и в 80-100 раз при добавлении 5-10 мкг/мл СП. Ингибирующее действие СП на репродукцию PCB можно объяснить показанной нами способностью препарата взаимодействовать как с клеточными мембранами, так и с вирусом, что может создавать стехиометрические и/или электростатические препятствия для присоединения вируса к клетке.

На следующем этапе исследований была проведена работа по оценке протективного действия препарата in vivo. Одним из перспективных направлений противовирусной вакци-нопрофилактики является создание липовакцин, в том числе на пептидной основе. Высокая иммуногенность препаратов такого типа обусловлена взаимодействием липидных составляющих конструкции с клеточными Toll-like рецепторами (TLR), что индуцирует созревание антиген-презентирующих клеток, процессинг и презентацию антигенных детерминант белкового компонента липопептида. Результатом является активирование СП-специфичного клеточного и гуморального иммунитета, а также формирование долгосрочной иммунологической памяти. Подобный механизм был показан для липопептидных вакцин против гриппа, ВИЧ, ЦМВ- инфекции, гепатита В и С (Brown L. and Jackson, 2005). Известно, что F-белок PCB является лигандом для TLR4, активирование которого на имму-нокомпетентных клетках необходима для развития интенсивного адаптивного иммунного ответа на PCB (Kurt-Jones Е. et al., 2000). С учетом этих данных был сконструирован конъ-югат СП F-SP12 с альдегидом насыщенной жирной лауриновой кислоты, которая является лигандом для TLR4 (Bainbridge В. et al., 2006). Оценка иммуногенности липопептида (F-SP12-LA) была проведена с использованием двух моделей - кроликов и мышей BALB/c.

После проведения цикла иммунизации сыворотки кроликов и мышей интенсивно взаимодействовали в ИФА как с СП, так и с PCB. При долгосрочном наблюдении за четырьмя иммунизированными кроликами был показан замедленный, но пролонгированный синтез СП/РСВ-специфических AT. Пик активности этих AT наблюдали лишь через 12 месяцев, а достаточно высокое их содержание выявляли в крови в течение 2-3 лет после иммуниза-

ции. При этом синтез вируснейтрализующих АТ был отмечен не ранее, чем через 2,5 месяца после начала цикла иммунизации (рис. 12).

1,4

0,6 0,4

до

иммунизации

0,5

2,5

,36

сроки после первой иммунизации (мес.)

Диаграммами представлены средние арифметические показателей 0045о, полученные в ИФА при анализе сывороток четырех кроликов, иммунизированных липонептидом 12-1.А. Над диаграммами показаны значения средних геометрических титров РСВ-нейтрализующих АТ. В качестве NCЛg были использованы мембранные белки клеток МА-104.

Рисунок 12 — Иммуногенная активность липопептида F-SP12-LA, оцененная при введении препарата кроликам

У кроликов, иммунизированных РСВ-ЦВ (п=4), пик активности РСВ/СП-специфичных, в том числе РСВ-нейтрализующих АТ, наблюдали значительно раньше - через 1 -2 месяца с последующим постепенным снижением их уровня до полного исчезновения из циркуляции через 9-12 месяцев после иммунизации.

Для оценки возможного патогенного действия СП-препарата в сыворотках животных был проанализирован синтез IgG, взаимодействующих с клеточными АГ (мембранные белки клеток MA-104, в которых культивировали PCB, использованный для иммунизации животных контрольной группы) (анти-NCAg IgG), ауто-IgG к лимфоцитарным АГ, а также АТ к бычьему сывороточному альбумину (BSA). Появление анти-BSA IgG при введении неродственного антигена является показателем общей диерегуляции иммунной системы и характерным признаком аутоиммунного воспаления (Oyarzûn A. et al., 2003).

У всех кроликов, иммунизированных F-SP12-LA, были выявлены АТ, взаимодействующие с невирусными АГ, причем их репертуар со временем расширялся. Так, подъем уровня IgG, взаимодействующих с мембранными АГ аллогенных и аутологичных лимфоцитов, детектировали через 1 месяц после первой иммунизации. Синтез анти-NCAg IgG и анти-BSA IgG наблюдали позднее - через 2,5 месяца после введения препарата. Уровень их возрастал вплоть до 12-ого месяца, после чего снижался, однако в течение трех лет значительно превышал фоновые показатели (в сыворотках до иммунизации) - рис. 12,13.

Ни у одного из кроликов, иммунизированных РСВ-ЦВ, уровень IgG, взаимодействующих с лимфоцитарными АГ и BSA, не превышал фоновых значений, определенных в сыворотках, взятых до начала опыта. Синтез АТ к клеткам MA-104, в которых культивировали PCB, использованный для иммунизации, был менее длительным, а их уровень значительно более низким, чем у кроликов после введения F-SP12-LA.

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

QD450

□ ЛФ неиммунных кроликов(п=2)

□ ауто-ЛФ

ЛФ PCB -кроликов (п=2) О ЛФ SP12 -кроликов <п=2)

до 0,5

иммунизаци

2,5

7 9 12 20 25

сроки после первой иммунизации (мес)

Рисунок 13 — Содержание антител к антигенам лимфоцитов (ЛФ) в крови кроликов, иммунизированных липопептидом F-SP12-LA

Патоморфологический анализ органов двух кроликов, иммунизированных F-SPI2-LA, проведенный через 25 месяцев после начала иммунизации, показал истощение лимфоидной ткани селезенки и наличие нейтрофильной инфильтрации в интерстиции легких и альвеолах. В селезенке также наблюдались многочисленные очаги нейтрофильного воспаления и некроза. Патологические изменения были ассоциированы с высоким уровнем сывороточных AT к NCAg и BSA. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о патогенном потенциале IgG, взаимодействующих с чужеродными и собственными клеточными AT, а также о том, что причиной образования AT к клеточным компонентам после введения Р-5Р12-липопептида могло быть хроническое воспаление и повреждение тканей.

Для оценки протективного действия пептидных препаратов были использованы мыши BALB/c (по 5 животных в группе). Две группы мышей были интраназально инфицированы введением 50 мкл культуральной жидкости, содержащей 104 ТЦЦ50 PCB, после двукратной иммунизации липопептидом F-SP12-LA или неконъюгированным свободным F-SP12. Предварительная иммунизация F-SP12-LA, и в еще большей степени неконъюгированным F-SP12, не только не снижала репродукцию PCB в легких при последующем инфицировании, но наоборот, способствовала ее увеличению. Так, в легких мышей, иммунизированных свободным F-SP12, содержание антигенов PCB, по данным сэндвич-ИФА, в среднем в 4,6 раз, а инфекционная активность PCB, определенная при пассировании в культуре клеток, в 3-4 раза превышала показатели, полученные для животных, инфицированных без предварительной иммунизации. Патоморфологический анализ показал, что у мышей, иммунизированных предварительно препаратом СП, последующее РСВ-инфицирование вызывало геморрагию легких. У животных, зараженных PCB без предварительного введения СП, не было обнаружено геморрагических явлений. У 50% мышей, иммунизированных F-SP12-LA, наблюдались обширные очаги кровоизлияния. После иммунизации неконъюгированным пептидом повреждения были наиболее выражены - обширные очаги поражения (1-3 доли) были обнаружены в легких 80% мышей, при этом в 2 случаях выявили отек легкого.

Таким образом, препарат, сконструированный на основе синтетического пептида F-SP12, имитирующего структуру консервативного эпитопа главного нейтрализующего домена F-белка PCB, обладал выраженными иммуногенными свойствами и индуцировал у лабораторных животных синтез AT, взаимодействующих с PCB. У кроликов инъекция F-SP12-LA вызывала более пролонгированный синтез вируснейтрализующих AT при замедленной динамике их формирования по сравнению с иммунизацией цельновирионным PCB. Однако препараты вызывали патологические изменения в организме иммунизированных животных.

Результаты нашей работы вынуждают присоединиться к мнению исследователей, призывающих соблюдать особую осторожность и осуществлять тщательный контроль безопасности при разработке вакцин, изготовленных на основе синтетических конструкций, а также сделать вывод о необходимости долгосрочных наблюдений при проведении испытаний таких препаратов для исключения отдаленных последствий вакцинации.

ВЫВОДЫ

1. Гарантированное диагностирование РСВИ по результатам детекции в ИФА РСВ-спецнфических антител (в 92-100% случаев) вне зависимости от возраста и иммунного статуса пациентов может быть достигнуто только при одновременном тестировании иммуноглобулинов классов G, М и А, что обусловлено индивидуальными отличиями в характере синтеза антител различных классов.

2. Осложненные формы РСВИ (острый стенозирующий ларинготрахеит, острый об-структивный бронхит, острая пневмония) ассоциированы, как правило, с искаженной реакцией Thl-регулируемых изотипов РСВ-специфических иммуноглобулинов, обладающих вируснейтрализующими свойствами: слабым ответом со стороны IgG2 при повышенной активности IgGl, IgG3, IgM.

3. Осложненное течение РСВИ характеризуется повышенным уровнем РСВ-специфических ТЬ2-регулируемых иммуноглобулинов классов Е и А на фоне низкой активности вирусспецифических IgG4. Перенесенная ранее РСВИ, осложненная аллергическим компонентом, оказывает негативное влияние на течение последующей инфекции иной, не РСВ-этиологии, а также повышает восприимчивость к другим патогенам.

4. Характер иммунодоминирования при ответе на консервативные антигенные детерминанты F- белка (АП 221-232) и G-белка (АП 152-164 и 184-198) меняется у пациентов старших возрастных групп с РСВИ в зависимости от формы заболевания.

5. Наличие в крови детей в возрасте до 10 месяцев материнских IgG, специфичных к консервативным детерминантам поверхностных гликопротеинов PCB, ассоциировано с осложненным клиническим течением первичной РСВИ, замедленным ответом противовирусных IgG при одновременно усиленном синтезе РСВ-специфических Т112-регулируемых сывороточных IgA.

6. Характерной особенностью осложненного течения РСВИ является синтез ауторе-активных IgM и IgG.

7. Препарат, сконструированный на основе синтетического пептида, представляющего структуру нейтрализующего эпитопа F-белка PCB с АП 221-232, и жирной лауриновой кислоты, являющейся лигандом для TLR4, индуцирует in vivo синтез РСВ-специфических IgG, однако вызывает патологические изменения в организме иммунизированных животных, в том числе синтез аутореактивных антител.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кривицкая В.З. Особенности некоторых показателей гуморального ответа на респи-раторно-синцитиальную вирусную инфекцию у детей с острыми бронхитами / Кривицкая В.З., Яковлева Н.В. //Лабораторное дело.-1991.- № 7.- С 45-48.

2. Кривицкая В.З. Применение иммуноферментного анализа для выявления антител к респираторно-синцитиальному вирусу с помощью конъюгата стафилококкового белка А с пероксидазой / Кривицкая В.З., Яковлева Н.В., Мурыгина Г.Л. // Вопросы вирусологии.-1991,-№ 1.-С.76-78.

3. Кривицкая В.З. Особенности гуморального ответа на респираторно-синцитиальную вирусную инфекцию у взрослых пациентов с различными формами бронхита / Кривицкая В.З., Яковлева Н.В. //Вопросы вирусологии,- 1992.-№3.-С 146-149.

4. Борисенко Л.В. Применение галотерапии для реабилитации больных с острым бронхитом с затяжным и рецидивирующим течением /Борисенко Л.В., Червинская A.B., Степанова Н.Г., Лукьян B.C.. Гончарова В.А., Походзей И.В., Кривицкая В.З. и др. // Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры - 1995.- №1.-С.11-15.

5. Кривицкая В.З. Особенности анти-РС-вирусного гуморального иммунитета при пер-систенции антигенов респираторно-синцитиального (PC) вируса у взрослых больных с хроническим обструктивным бронхитом / Кривицкая В.З., Яковлева Н.В., Александрова Н.И. // Вопросы вирусологии,-1996.- №5.-С. -234-237.

6. Кривицкая В.З.. Анти-РС-вирусный IgE при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у взрослых пациентов с осложнен-ным течением бронхита/ Кривицкая В.З., Александрова Н.И., Похазникова М.А // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии .- 1998.- №4.-С.56-61.

7. Кривицкая В.З. Реакция иммуноглобулина А на респираторно-синцитиальную вирусную инфекцию у детей и взрослых с различными формами острого и хронического бронхита / Кривицкая В.З., Александрова Н.И., Орлов A.B., Походзей И.В. // Иммунология,- 1999.-№2,- С.51-55.

8. Кривицкая В.З. Разработка новых подходов к стандартизации иммуноферментных тест-систем для детекции антител к респираторно-синцитиальному вирусу с использованием электронной микроскопии и моноклональных антител / Кривицкая В.З., Сироткин А.К., Самойлович М.П., Соминина A.A. // Вопросы вирусологии.-1999- № 6.-С. -279-284.

9. Кривицкая В.З. Возрастные особенности сайтнаправленного иммунитета при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции / Кривицкая В.З., Соминина A.A., Власов Г.П., и др. // Вопросы вирусологии. - 2004. - Т.49, №4 . - С.25-29.

10. Кривицкая В.З. Имунопатологический аллергический ТЬ2-тип противовирусного гуморального иммунного ответа у детей с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией / Кривицкая В.З, Соминина A.A., Суховецкая и др. // Цитокины и воспаление.- 2004,-Т.З, №3.- С. 34-41.

11. Кривицкая В.З. Иммунопатология при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции. Обзор литературы // Международная конференция «Актуальные вирусные инфекции, теоретические и практические аспекты», С-Петербург, ноябрь 2004г . Сборник тру-дов.-2004.- С. 58-64,104-110.

12. Штерншис Ю.А. Влияние вирусной инфекции на развитие атопической бронхиальной астмы / Кривицкая В.З.. Самойликов П.В., Гервазиева В.Б. // Инфектология (Болгария). - 2005.-.Т. XLII.-C.26-30.

13. Штерншис Ю.А. Острые респираторновирусные инфекции и бронхиальная астма / Штерншис Ю.А., Лизогуб Н.В., Кривицкая В.З.. Гервазиева В.Б. // Инфекционные болезни -2006,-Т. 3,- стр. 18-21.

14. Чучалин А.Г. Роль респираторных инфекций в обострениях бронхиальной астмы / Чучалин'А.Г., Оспельникова Т.П., Осипова Г.Л., Лизогуб Н.В., Гервазиева В.Б., Кривицкая В.З. и др. // Пульмонология.-2007.-№5.-С. 14-18.

15. Кривицкая В.З. Выявление аутореактивных антител класса М у пациентов с респираторными вирусными инфекциями / Кривицкая В.З., Сверлова М.В., Суховецкая В.Ф. и др. // Медицинская иммунология.-2008.- Т.10, №2-3.- С.229-238.

16. Румель Н.Б. Особенности респираторно-синцитиальной инфекции у больных с гемо-бластозами и депрессией кроветворения / Румель Н.Б., Гончар В.А., Шилова Е.Р., Бес-смельцев С.С., Стрижах Н.П., Залимко Л.А., Кривицкая В.З. и др.// Эпидемиология и инфекционные болезни.-2008,- № 5.-С. 45-49.

17. Кривицкая В.З. Иммунопатологическое действие на экспериментальных живот-ных пептидных препаратов, представляющих вирус-нейтрализующий домен F-белка респира-торно-синцитиального вируса / Кривицкая В.З., Майорова В.Г., Сорокин Е.В. и др. // Цитокины и воспаление.- 2010.-Т.9, №2, С. 18-26.

18. Суховецкая В.Ф. Этиология острых респираторных инфекций у госпитализированных детей в пре- и пандемический период гриппа H1N1 / Суховецкая В.Ф., Дондурей Е.А., Осидак Л.В., Дриневский В.П., Гудкова Т.М., Коновалова Н.И., Грудинин М.П., Медведева H.A., Кривицкая В.З. и др. // Детские инфекции.- 2010.-Т. 9, № 2.- С.8-12.

19. Кривицкая В.З. Характеристика аутореактивных антител класса IgG у пациентов с острыми респираторными вирусными инфекциями // Цитокины и воспаление,- 2011.- Т. 10, №2,- С. 21-27.

20. Суховецкая В.Ф. Лабораторная диагностика острых респираторных инфекций в условиях эволюционной изменчивости вирусов гриппа/ Суховецкая В.Ф., Дондурей Е.А., Дриневский В.П., Соминина A.A., Майорова В.Г., Писарева М.М., Гудкова Т.М., Амосова И.В., Кривицкая В.З.. Голованова А.К. // Журнал инфектологии.- 2012 - Т.4, № 1 .-С.36-41

21. Кривицкая В.З. Применение синтетиче-ских пептидов для характеристики сайт-направленного противовирусного гуморального иммунного ответа у пациентов с респира-торно-синцитиальной вирусной инфекцией / Кривицкая В.З., Соминина А.А., Войцехов-ская Е.М. и др. // Клиническая лабораторная диагностика,- 2012 - в печати

Список сокращений

АВИ - аденовирусная инфекция АГ- антиген

АК - аминокислотные остатки

АП - аминокислотная последовательность

AT- антитела

Ауто-АТ- аутореактивные антитела

ИФА -иммуноферментный анализ

ИФТС - иммуноферментная тест-система

ЛФ - лимфоциты

МКА - моноклональные антитела

ООБ - острый обструктивный бронхит

ОП - острая пневмония

РН - реакция нейтрализации

РСВ - респираторно- синцитиальный вирус

РСВИ - респираторно- синцитиальная вирусная инфекция

РСВ-ЦВ - цельновирионный респираторно-синцитиальный вирус

СГТ - средний геометрический титр антител

СЛТ - острый стенозирующий ларинготрахеит

СП- синтетический пептид

ТЦЦ50 - 50%-ная тканевая цитопатическая доза

ФЛЭЧ — фибробласты легкого эмбрионов человека

ЦМВ - цитомегаловирус

BSA - бычий сывороточный альбумин

IFN-a - интерферон- альфа

IFN-y - интерферон- гамма

Ig - иммуноглобулины

LA — альдегид лауриновой кислоты

m-IgG - материнские антитела

NCAg- нормальный клеточный антиген

SP- синтетический пептид

TLR - Toll-like рецептор

Подписано в печать 16.04.12 Формат 60x84'/i6 Цифровая пе-Печ. л. 2.5

Тираж 150 Заказ 13/04 чать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кривицкая, Вера Зорьевна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Структура вириона PCB

1.2 Структурная организация F-белка PCB

1.3 Структурная организация G-белка PCB

1.4 Антигенные детерминанты главных гликопротеинов PCB

1.5 Репродукция PCB

1.6 Эпидемиология и клиническая картина РСВИ

1.7 Иммунный ответ при РСВИ

1.8 Патогенез РСВИ. Иммуномодулирующие свойства PCB. Иммунопатологические проявления, характерные для РСВИ

1.9 Лабораторная диагностика РСВИ

1.10 Лекарственные препараты для лечения РСВИ

1.11 Создание вакцин против РСВИ

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ЗЛ Конструирование иммуноферментных тест-систем для детекции РСВ-специфических антител различных классов и подклассов Ю

3.1.1 Конструирование иммуноферментных тест-систем для детекции РСВ-специфических антител класса и подклассов G

3.1.2 Конструирование иммуноферментных тест-систем для детекции РСВ-специфических IgM

3.1.3 Эффективность использования сконструированных ИФТС при диагностике РСВИ

3.2 Сравнительная оценка реагирования РСВ-специфических иммуноглобулинов различных изотипов у детей и взрослых в зависимости от формы бронхолегочной патологии

3.2.1 Оценка содержания РСВ-специфических AT класса и под классов G у клинически здоровых лиц

3.2.2 Особенности реагирования РСВ-специфических IgGl, IgG2 132 и IgG3 в зависимости от тяжести РСВИ и возраста пациентов

3.2.3 Детекция РСВ-специфических антител класса М

3.2.4 Вируснейтрализующая активность антител у пациентов с неосложненным и осложненным течением РСВИ

3.2.5 Детекция РСВ-специфичных IgE и IgG4 у пациентов с различными формами РСВИ

3.2.6 Оценка влияния предсуществующих анти-РСВ IgE на течение последующих острых респираторных заболеваний

3.2.7 Активность анти-РСВ IgA у пациентов различных возрастных групп в зависимости от формы РСВИ

3.2.8 Соотношение активности Thl- и ТЬ2-опосредованного гуморального противовирусного ответа у пациентов с различными формами РСВИ

3.3 Характеристика гуморального иммунного ответа, направленного к функционально значимым эпитопам F- и G - белков PCB, у пациентов с РСВ-инфекцией

3.4 Оценка роли предсуществующих эпитоп-специфичных анти-РСВ IgG в патогенезе РСВИ

3.4.1 Влияние материнских антител на характер РСВ-специфического гуморального иммунного ответа, формирующегося у детей при первичном инфицировании

3.4.2 Влияние предсуществующих РСВ-специфических IgG на течение РСВ-реинфекций

3.5 Характеристика аутореактивных антител у пациентов с острыми респираторными вирусными инфекциями

3.5.1 Аутореактивные антитела класса М у здоровых лиц и пациентов с острыми респираторными вирусными заболеваниями различной этиологии

3.5.2 Аутореактивные антитела класса G у здоровых лиц и пациентов с острыми респираторными вирусными 182 заболеваниями

3.6 Оценка биологических, иммуногенных и протективных свойств препаратов, созданных на основе синтетического пеп- 189 тида F-SP

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности гуморального иммунного ответа у пациентов с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией при различных формах респираторной патологии"

Актуальность работы.

Актуальность проведенного исследования определяется важной ролью, которую респираторно-синцитиальный вирус (PCB) играет в структуре инфекционной патологии дыхательного тракта. PCB является одной из основных причин госпитализации детей первых двух лет жизни [111]. Смертность от РСВ-инфекции (РСВИ), регистрируемая среди госпитализированных пациентов в возрасте до 18 лет, достигает в некоторых странах 33% и составляет около 37% при осложненном анамнезе [324]. Несмотря на то, что РСВИ представляет наибольшую опасность в раннем возрасте, она является значимой в структуре респираторных заболеваний во всех возрастных группах [314]. Факторами риска для осложненного течения инфекции являются детский и престарелый возраст, наличие кардиопульмонологических заболеваний, имму но дефицитных состояний. Среди взрослых реципиентов трансплантатов различных органов РСВИ принимает тяжелые формы и может являться причиной смерти у 30-100% пациентов [326]. Адаптивный иммунитет, формирующийся в результате перенесенной РСВИ как у детей (с еще незрелой иммунной системой), так и у взрослых, является краткосрочным и не обеспечивает полную противовирусную защиту, что является одной из причин реинфекций, наблюдаемых на протяжении всей жизни [221]. Материнские РСВ-специфические антитела, содержащиеся в крови новорожденных, также не гарантируют защиту от инфицирования [305]. Долгосрочные наблюдения показывают, что поражение нижних дыхательных путей в результате РСВИ может повлечь за собой функциональную дыхательную недостаточность, регистрируемую в течение последующих 3-4 лет [229]. До 70% маленьких детей, госпитализированных с бронхиолитами, обусловленными PCB, подвержены рецидивирующим эпизодам бронхообструкции в течение последующих 6-12 лет [138] с риском развития в дальнейшем бронхиальной астмы. РСВИ способствует развитию хронических легочных заболеваний и у взрослых - хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), а также бронхиальной астмы [19; 293].

В большинстве случаев РСВИ протекает в виде обычного ОРЗ. Причины и механизмы осложненного ее течения (бронхиолита, бронхита или пневмонии) и отдаленных последствий до конца не ясны и являются в настоящее время предметом интенсивного изучения. В последние годы было показано, что ключевую роль при этом играет нарушение баланса Thl/Независимых регуляторных механизмов со сдвигом в сторону активирования ТЬ2-опосредованных реакций, оказывающих патогенное действие [36]. PCB обладает мощным иммуномодулирующим потенциалом. Индуцируемая им патология может быть обусловлена как супрессией, так и гиперактивацией различных типов иммунокомпетентных клеток. Баланс между протективными и патологическими иммунными реакциями весьма подвижен. В зависимости от конкретных условий (состава локальной цитокиновой среды, генетической предрасположенности, наличия сопутствующих заболеваний) одни и те же иммунологические механизмы могут индуцировать как противовирусные защитные, так и патологические реакции [237]. Такая двойственность присуща также гуморальному противовирусному иммунитету. В модельных опытах было показано, что наряду с противовирусным протективным действием РСВ-специфические антитела (AT) могут принимать участие в иммунопатологических механизмах, обуславливающих осложненное течение РСВИ [247].

Большинство исследований, изучающих патогенез РСВИ, выполнено в модельных экспериментах на животных, которые не всегда адекватно отражают процессы, протекающие в организме человека. До сих пор при изучении закономерностей противовирусного иммунитета преобладают исследования, посвященные Т-клеточным реакциям. Механизмы Вклеточного иммунитета изучены в значительно меньшей степени. О характере гуморального РСВ-специфического иммунитета у инфицированных больных 7 до сих пор можно судить главным образом на основании работ, выполненных 20-30 лет назад, что свидетельствует о недостаточной изученности проблемы на современном уровне. При этом некоторые недавно обнаруженные особенности патогенеза РСВИ указывают на необходимость изучения закономерностей именно B-клеточного иммунного ответа. Так, из двух основных поверхностных гликопротеинов (F и G) образование анти-РСВ протективных цитотоксических CD8+ Т-клеток вызывает только F-белок. При этом вируснейтрализующие антитела формируются в ответ на воздействие обоих гликопротеинов [79]. Для защиты от PCB необходимы высокоаффинные AT к G-белку, что обусловлено патогенным действием на иммунную систему определенных антигенных детерминант этого гликопротеина. Кроме того PCB обладает уникальной для респираторных вирусов особенностью - наличием секреторной формы G-белка (sG), играющей в организме роль «антигенной ловушки» для нейтрализующих AT [56]. Эти особенности структуры PCB должны быть учтены при создании вакцинных препаратов.

Недостаточное понимание этого аспекта патогенеза РСВИ привело к трагическим последствиям при введении детям инактивированной формалином РСВ-вакцины. Этот тип вакцин без патогенных последствий был применен при вакцинации против гриппа и некоторых других ОРВИ. Однако в случае PCB введение препарата привело к более тяжелому течению последующей РСВИ (с несколькими летальными исходами) по сравнению с непривитыми детьми грудного возраста [155]. Такого негативного эффекта не было зарегистрировано в группах старших детей, уже перенесших РСВИ до вакцинации [318]. Этот пример ясно показал необходимость расширения 8 возрастных рамок при изучении закономерностей формирования гуморального РСВ-специфического иммунного ответа у пациентов.

Изучению РСВ-специфического гуморального ответа у инфицированных лиц с точки зрения соотношения активности иммуноглобулинов различных изотипов посвящены лишь единичные работы. Тем не менее, результаты модельных экспериментов свидетельствуют о значимости изучения этого вопроса. Например, показана патогенная роль анти-РСВ связь этих АТ с развитием аллергических реакций, характерных для тяжелого течения РСВИ: легочной эозинофилии и повышенной гиперреактивности дыхательных путей [76].

Изотипическая структура противовирусного гуморального ответа дает определенное представление об особенностях регуляторных механизмов и патогенезе заболевания. Соотношение активности антиген-специфических \gG2dJ традиционно рассматривается как показатель баланса между протективным ТЫ и патогенным ТЬ2 -типом иммунного ответа у мышей [228], в том числе при характеристике гриппозной инфекции и свойств гриппозных вакцин. Отсутствие соответствующей информации затрудняет понимание механизмов патогенеза РСВИ и той роли, которую играют при этом РСВ-специфические АТ.

Решение этих вопросов может быть осуществлено с использованием иммуноферментного анализа. Иммуноферментные тест-системы (ИФТС) для серодиагностики РСВИ производятся целым рядом зарубежных фирм, однако спектр РСВ-специфических иммуноглобулинов которые можно детектировать с их помощью, ограничен тремя классами - ^ М и А. Нет коммерческих ИФТС для выявления анти-РСВ ^Е и субклассов Все вышеизложенное определило необходимость создания отечественных иммуноферментных тест-систем, позволяющих проводить углубленный анализ изотипической и сайт-специфической структуры анти-РСВ гуморального ответа у больных. Создание чувствительных серологических тест-систем имеет также важное практическое значение. Поскольку симптомы 9

РСВИ и гриппа сходны клинически, РСВИ в период эпидемии гриппа остаются во многих случаях нераспознанными. Необходимость дифференциальной диагностики РСВИ и назначения своевременного лечения диктуется тем, что PCB значительно чаще, чем другие респираторные вирусы, вызывает развитие иммунопатологических проявлений в легких [313].

Задачи исследования

1. Сконструировать ИФТС для детекции в сыворотках крови РСВ-специфических антител различных классов и подклассов (IgG, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgE), а также выявления IgG, взаимодействующих с функционально значимыми консервативными эпитопами F- и G- белков PCB.

4. Оценить влияние перенесенной ранее РСВИ на течение последующих респираторных заболеваний.

6. Проанализировать влияние материнских антител на характер РСВ-специфического гуморального ответа, формирующегося у детей при первичном заболевании.

7. Провести сравнительную оценку образования аутореактивных антител при респираторных вирусных заболеваниях различной этиологии. ю

8. Оценить in vitro и in vivo иммуногенные и протективные свойства препаратов, созданных на основе синтетического пептида, имитирующего структуру части главного нейтрализующего домена F- белка PCB.

Научная новизна работы. Впервые в России сконструированы ИФТС для детекции PCB - специфических Ig семи изотипов (М, А, Е, Gl, G2, G3, G4), а также ИФТС на основе синтетических пептидов (СП), представляющих структуру иммунодоминантных эпитопов F- и G- белков PCB, для выявления эпитоп-специфичных IgG. Разработанные ИФТС позволили провести углубленный анализ структуры PCB-специфического гуморального иммунного ответа.

С использованием разработанных тест-систем впервые проведена комплексная сравнительная оценка реагирования РСВ-специфических AT различных классов и субклассов в зависимости от возраста и формы заболевания пациентов. По соотношению активности ответа Thl- и Th2-регулируемых AT определен тип РСВ-специфического гуморального иммунного ответа в различных группах пациентов. Впервые проведена сравнительная оценка ответа со стороны ТЬ2-зависимых анти-РСВ IgE и IgG4 при РСВИ у детей и взрослых, осложненной аллергическим компонентом. Полученные данные дополняют существующие представления о патогенезе РСВИ.

Впервые показано негативное влияние материнских IgG, специфичных к г консервативным антигенным детерминантам поверхностных гликопротеинов PCB, на характер РСВ-специфического иммунного ответа, формирующегося у детей в возрасте до 10 месяцев при первичном заболевании.

Впервые выявлен синтез аутореактивных IgM и IgG у пациентов с осложненными формами РСВИ.

Основные положения, выносимые на защиту.

2. Изотипическая структура РСВ-специфического ответа, оцененная с использованием разработанных ИФТС, отражает особенности гуморального иммунитета, характерные для определенного возраста и формы бронхолегочной патологии при РСВИ.

3. Осложненное течение РСВИ ассоциировано со сниженной вирус-нейтрализующей активностью антител, а также повышенным уровнем синтеза ТЬ2-регулируемых РСВ-специфических иммуноглобулинов.

5. Иммунодоминирование при ответе на B-клеточные эпитопы поверхностных гликопротеинов PCB меняется у PCB-инфицированных лиц в зависимости от клинической формы заболевания.

7. При осложненном течении РСВИ наблюдается интенсивный синтез аутореактивных IgM и IgG.

Выявление РСВ-специфических IgE на ранних сроках заболевания позволит снизить риск отдаленных последствий перенесенной инфекции, в том числе рецидивирующей бронхообструкции и формирования хронической бронхолегочной патологии в более зрелом возрасте, путем устранения аллергических проявлений. Высокое содержание в крови анти-РСВ IgE является прогностическим показателем повышенного риска осложненного течения последующих респираторных заболеваний.

Для оценки вируснейтрализующей активности РСВ-специфических AT был предложен новый вариант постановки реакции нейтрализации (РН) с оценкой результатов в микрокультуральном ИФА при использовании вирусспецифических моноклональных антител [7]. Этот метод может быть применен в эпидемиологических исследованиях для определения уровня защищенности тех или иных групп населения от РСВИ.

Детекция анти-РСВ IgA в сыворотках крови непрямым ИФА предложена в качестве диагностического теста, оказавшегося эффективным

13 при серодиагностике заболевания у детей первых лет жизни наряду с детекцией антител классов и М. Простота исполнения позволяет комплексно применять этот метод в практических лабораториях.

Низкое содержание в крови предсуществующих взаимодействующих с синтетическими пептидами, имитирующими структуру антигенных детерминант, функционально значимых для репродукции РСВ, может служить прогностическим показателем для выявления контингентов с повышенным риском инфицирования. Этот подход может быть использован при изучении защитного гуморального РСВ-специфического иммунитета. Внедрение результатов работы. По результатам Госиспытаний получен Сертификат производства (СП № 002907, июнь 2010) на производство медицинского иммунобиологического препарата «Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса в к респираторно-синцитиальному вирусу (ИФТС-РС-^в)». ИФТС внедрена в практику и используется для диагностики РСВИ в клиниках и ФГУЗ «Центры гигиены и эпидемиологии» на территории России.

Опытные образцы сконструированных ИФТС для детекции анти-РСВ 1§ различных изотипов прошли первичную апробацию в стационарах С.Петербурга.

Работа выполнялась в рамках плана НИР ФГБУ «НИИ гриппа» Минздравсоцразвития РФ, начиная с 1995г, а также по темам, выполненным в 2002 - 2003гг в рамках Межведомственной научно-технической программы "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего", Генеральным Заказчиком которой являлось Министерство промышленности, науки и технологий Российской Федерации.

Личный вклад автора в проведенные исследования состоял в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, разработке методологии, выборе моделей, статистической обработке, анализе полученных результатов и формулировке научных положений. Вклад соавторов выражается в предоставлении клинических материалов (Суховецкая В.Ф., Головачева Е.Г., Львов Н.И., Войцеховская Е.М.), результатов лабораторной диагностики РСВИ, проведенной в РСК, и изоляции вирусов в культуре клеток (Голованова А.К.), иммунофлуоресценции (Милькинт К.К.), ИФА-выявления антигенов PCB в клинических материалах (Амосова И.В.), предоставлении противовирусных моноклональных AT (Сорокин Е.В., Царева Т.Р.).

1999), World Congress on Lung Health and 10 E.R.S. Annual Congress, (Florence,

2000), 11 European Congress of Clinical Microbiology and Infections Diseases, (Istanbul, 2001), Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (С.-Петербург, 2001), Девятом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2002), Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004),

Всероссийском ежегодном конгрессе «Инфекционные болезни у детей: диагностика, лечение и профилактика» (С.-Петербург, 2011).

Материалы исследования были доложены и обсуждены на Всероссийской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.А.Смородинцева «Современные аспекты вакцинопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций» (С.-Петербург, 2001), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 35-летию НИИ гриппа РАМН «Новые препараты в профилактике, терапии и диагностике вирусных инфекций» (С.-Петербург, 2002), Международной научной конференции «Актуальные вирусные инфекции - теоретические и практические аспекты» (С.-Петербург, ноябрь 2004), Четырнадцатом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007), заседании Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (С.-Петербург, 2003 и 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 статей (из них 17 - в журналах, рекомендованных ВАК), и 23 тезиса.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 6 глав изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 306 страницах текста, включая 15 таблиц и 46 рисунков. Список цитируемой литературы содержит 350 источников, из них 20 отечественных.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Кривицкая, Вера Зорьевна

Выводы

1. Гарантированное диагностирование РСВИ по результатам детекции в ИФА РСВ-специфических антител (в 92-100% случаев) вне зависимости от возраста и иммунного ста-туса пациентов может быть достигнуто только при одновременном тестировании иммуноглобулинов классов в, М и А, что обусловлено индивидуальными отличиями в ха-рактере синтеза антител различных классов.

2. Осложненные формы РСВИ (острый стенозирующий ларинготрахеит, острый об-структивный бронхит, острая пневмония) ассоциированы, как правило, с искаженной реакцией ТЫ-регулируемых изотипов РСВ-специфических иммуноглобулинов, обладающих вируснейтрализующими свойствами: слабым ответом со стороны при повышенной активности 1ё01,1ёОЗ, 1ёМ.

3. Осложненное течение РСВИ характеризуется повышенным уровнем синтеза РСВ-специфических ТЬ2-регулируемых иммуноглобулинов классов Е и А на фоне низкой активности вирусспецифических Перенесенная ранее РСВИ, осложненная аллергическим компонентом, оказывает негативное влияние на течение последующей инфекции иной, не РСВ-этиологии, а также повышает восприимчивость к другим патогенам.

4. Характер иммунодоминирования при ответе на консервативные антигенные де-терминанты Б- белка (АП 221-232) и в-белка (АП 152-164 и 184198) меняется у пациентов старших возрастных групп с РСВИ в зависимости от формы заболевания.

5. Наличие в крови детей в возрасте до 10 месяцев материнских специфичных к консервативным детерминантам поверхностных гликопротеинов РСВ, ассоциировано с осложненным клиническим течением первичной РСВИ, замедленным ответом противовирусных ^О при одновременно усиленном синтезе РСВ-специфических ТЬ2-регулируемых сывороточных ^А.

6. Характерной особенностью осложненного течения РСВИ является синтез ауторе-активных IgM и IgG.

7. Препарат, сконструированный на основе синтетического пептида, представляющего структуру нейтрализующего эпитопа F-белка РСВ с АП 221-232, и жирной лауриновой кислоты, являющейся лигандом для TLR4, индуцирует in vivo синтез РСВ-специфических IgG, однако вызывает патологические изменения в организме иммунизированных животных, в том числе синтез аутореактивных антител.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Кривицкая, Вера Зорьевна, Санкт-Петербург

1. Акимов B.C., Хаитов М.Р., Файзулоев Е.Б. и др. Подавление репродукции респираторно-синцитиального вируса методом siRNA. Вопросы вирусологии. №2', 2007, С. 8-12.

2. Афанасьева О.И., Суховецкая В.Ф., Осидак J1.B. и др. Клинико-лабораторная характеристика и терапия ОРВИ со стенозирующим ла-ринготрахеитом у детей // Детские инфекции.- 2005.- №1.- С. 32-36.

3. Климович В.Б., Грязева И.В., Крутецкая И.Ю. и др. Применение моно-клональных антител против иммуноглобулинов в диагностике заболеваний человека. Пособие для врачей клинико-диагностических лабораторий // Санкт-Петербург.-2000.-18с.

4. Кожевникова E.H., Горелов A.B. Клинико-эпидемиологические особенности и лечение PC-вирусной инфекции у детей // Инфекционные болезни.- 2007.- Т.5, №4.- С.15-21.

5. Кривицкая В.З., Яковлева Н.В., Мурыгина Г.Л. Применение иммуно-ферментного анализа для выявления антител к респираторно-синцитиальному вирусу с помощью конъюгата стафилококкового белка А с пероксидазой // Вопросы вирусологии.- 1991.- № 1.- С.76-78.

6. Кривицкая В.З., Соминина A.A., Власов Г.П. и др. Возрастные особенности сайтнаправленного иммунитета при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции // Вопросы вирусологии. 2004. - Т.49, №4 . - С.25-29.

7. Лещинская Н.П. Вакцинация против респираторно-синцитиальной инфекции // Вопросы вирусологии.- 1986.- Т.31, №5.- С.517-527.

8. Михалченкова H.H., Князева Л.Д., Слепушкин А.Н. Респираторно-синцнтиальная вирусная инфекция у больных хроническим бронхитом //Тер. архив.- 1987.-№7.- С.50-52.

9. П.Олейников В.А. Полупроводниковые нанокристаллы (квантовые точки) в белковых биочипах // Биоорганическая химия .- 2011.- Т. 37, № 2. С. 171-189.

10. Румель Н.Б., Гончар В.А., Шилова Е.Р. и др. Особенности респираторно-синцитиальной инфекции у больных с гемобластозами и депрессией кроветворения// Эпидемиология и инфекционные болезни.- 2008.- № 5.-С. 45-49.

11. Самойлович М.П., Сухубаевская Л.П., Климович В.Б. и др. Получение моноклональных антител к респираторно-синцитиальному вирусу человека// Вестник РАМН.- 1994.- №9.- С. 18-21.

12. Соминина A.A., Сухубаевская Л.П., Самойлович М.П. и др. Характеристика моноклональных антител к PC-вирусу в иммуноферментных и иммунофлуоресцентных реакциях// Вестник РАМН.- 1995.- №9.- С. 4954.

13. Соминина A.A., Монаенков А.О., Смородинцева Е.А. и др. Анализ этиологической структуры гриппоподобной заболеваемости и мониторинг эпидемии гриппа 1998-1999 г.г. с использованием методов лабораторной диагностики// Вестник РАМН.- 2001.- №3,- С. 8-12.

14. Соминина A.A., Кривицкая В.З., Войцеховская Е.М. и др. Практические рекомендации по диагностике вирусных инфекций // С.-Петербург.-2005.-40с.

15. Суховецкая В.Ф., Соминина А.А., Дриневский В.П. и др. Клиника и диагностика острых стенозирующих ларинготрахеобронхитов у детей при РВИ различной этиологии // Детские инфекции.- 2004.- № 1.- С. 10-15.

16. Чешик С.Г., Вартанян Р.В. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция: клиника, диагностика, лечение // Детские инфекции.- 2004.-№1.- С. 43-49.

17. Чучалин А.Г., Оспельникова Т.П., Осипова Г.Л. и др. Роль респираторных инфекций в обострениях бронхиальной астмы // Пульмонология.-2007.-№5.- С.14-18.

18. Яковлева Н.В., Походзей И.В., Товт-Коршинская М.И. и др. Особенности вирусной инфекции у больных хроническим обструктивным бронхитом // Тер. архив.- 1987.-№7.- С.47-50.

19. Aalberse R. Specific IgE and IgG responses in atopic versus nonatopic subjects // Am. J. Respir. Crit. Care Med.- 2000,- Vol. 162.- P. S124-S127.

20. Aberle J.H., Aberle S.W., Dworzak M.N. et al. Reduced interferon-gamma expression in peripheral blood mononuclear cells of infants with severe respiratory syncytial virus disease // Am.J.Respir.Crit.Care Med. 1999-V.160.-P. 1263-1268.

21. Akerlind-Stopner В., Utter G., Norrby E. et al. Evaluation of subgroup-specific peptides of the G protein of respiratory syncytial virus for characterization of the immune response // J. Med. Virol. -1995 Vol. 47, № 2-P. 120-125.

22. A1-Darmaki S., Knightshead K., Ishihara Y. et al. Delineation of the role of platelet-activating factor in the immunoglobulin G2 antibody response// Clin.Diagnos. Labor. Immunology 2004,- Vol. 11, № 4.- P. 720-728.

23. Almansa R., Anton A., Ramirez P., et al. Direct association between pharyngeal viral secretion and host cytokine response in severe pandemic influenza // BMC. Infect. Dis. -2011.- Vol. 31, № 11.-P.232.

24. Alving C.R. Antibodies to lipids and liposomes: immunology and safety // J. Liposome Res. -2006.- Vol.16, №3.-P. 157-166

25. Anderson L.J., Hierholzer J.C., Tsou C. et al. Antigenic characterization of respiratory syncytial virus strains with monoclonal antibodies // J. Infect. Dis.- 1985.-Vol.151, №4.-P.626-633.

26. Aung S., Graham B.S. IL-4 diminishes perforin-mediated and increases Fas ligand-mediated cytotoxicity In vivo // J. Immunol.- 2000.- Vol. 164, № 7.-P.3487-3493.

27. Ausar S.F., Rexroad J., Frolov V.G. et al. Analysis of the thermal and pH stability of human respiratory syncytial virus // Mol. Pharm. -2005.- Vol.2, №6.-3.491-499.

28. Avadhanula V., Rodriguez C.A., Devincenzo J.P. et al. Respiratory viruses augment the adhesion of bacterial pathogens to respiratory epithelium in a viral species- and cell type-dependent manner//J.Virol.- 2006.- Vol. 80, №4.-P.1629-1636.

29. Barnea B.S., Fogel A. Detection of rubella- specific IgM antibodies by the staphylococcal absorption method (SAM) // Isr. J. Med. Sci.-1987 V. 23-P. 1223-1227.

30. Bartz H., Buning-Pfaue F., Turkel O. et al. Respiratory syncytial virus induces prostaglandin E2, IL-10 and IL-11 generation in antigen presenting cells // Clin .Exp. Immunol. -2002.- Vol.129, № 3.-P.438-445.

31. Baumgarth N.,Tung J., Herzenberg L. Inherent specificities in natural antibodies: a key to immune defense against pathogen invasion // Springer Semin. Immunopathol. -2005.- Vol. 26, № 4.- P.347-362.

32. Becker Y. Respiratory syncytial virus (RSV) evades the human adaptive immune system by skewing the Thl/Th2 cytokine balance toward increased levels of Th2 cytokines and IgE, markers of allergy—a review // Virus Genes. -2006.-Vol. 33, № 2.-P. 235-252.

33. Behera A.K., Matsuse H., Kumar M. et al. Blocking intercellular adhesion molecule-1 on human epithelial cells decreases respiratory syncytial virus infection // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2001.- Vol.280, №1.-P.188-195.

34. Beyer M., Bartz H., Horner K. et al. Sustained increases in numbers of pulmonary dendritic cells after respiratory syncytial virus infection// J. Allergy Clin. Immunol. -2004.- 113, № 1.-P. 127-133.

35. Blanco J.C., Boukhvalova M.S., Shirey K.A. et al. New insights for development of a safe and protective RSV vaccine // Hum. Vaccin 2010 - Vol.6, №6.-P.482-492.

36. Bleek van G.M., Poelen M.C., van der Most R. et al. Identification of immunodominant epitopes derived from the respiratory syncytial virus fusion protein that are recognized by human CD4 T cells // J. Virol. -2003- Vol.77, № 2.- P.980-988.

37. Boukhvalova M.S., Prince G.A., Soroush L. et al. The TLR4 agonist, monophosphoryl lipid A, attenuates the cytokine storm associated with respiratory syncytial virus vaccine-enhanced disease // Vaccine. -2006 .- Vol. 24, № 23-P. 5027-5035.

38. Boukhvalova M.S., Prince G.A., Blanco J.C. Inactivation of respiratory syncytial virus by zinc finger reactive compounds // Virol. J. -2010 Vol.7.-P. 20.

39. Bourgeois C, Bour JB, Lidholt K. et al. Heparin-like structures on respiratory syncytial virus are involved in its infectivity in vitro// J. Virol-1998.-Vol.72, № 9.-P.7221-7227.

40. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem.-1976.-Vol.72, № 1-2.-P.248-254.

41. Bramley A.M., Vitalis T.Z., Wiggs B.R. et al. Effects of respiratory syncytial virus persistence on airway responsiveness and inflammation in guinea-pigs // Eur. Respir. J.- 1999.-Vol.l4,№5.-P.1061-1067.

42. Brandlein S., Pohle T., Ruoff N. et al. Natural IgM antibodies and immunosurveillance mechanisms epithelial cancer cells in humans // Cancer Res.- 2003.- Vol. 63 .-P. 7995-8005.

43. Brandtzaeg P. Mucosal immunity: induction, dissemination, and effector functions// Scand. J. Immunol.- 2009.- Vol.70,№ 6.-P.505-515.

44. Branigan P.J., Day N.D., Liu C. et al. The cytoplasmic domain of the F protein of human respiratory syncytial virus is not required for cell fusion // J. Gen. Virol. -2006.- Vol. 87, Pt 2.- P.395-398.

45. Brown W.R. Relationships between immunoglobulins and the intestinal epi-thelium//Gastroenterology. -1978.- Vol.75,№1.-P.129-138.

46. Brown L.E, Jackson D.C. Lipid-based self-adjuvanting vaccines// Curr Drug Deliv. -2005.- Vol.2, № 4.- P. 383-393.

47. Budge P.J., Graham B.S. Inhibition of respiratory syncytial virus by RhoA-derived peptides: implications for the development of improved antiviral agents targeting heparin-binding viruses // J. Antimicrob. Chemother. -2004.- Vol. 54.- P.299-302.

48. Bueno S.M., González P.A., Riedel C.A. et al. Local cytokine response upon respiratory syncytial virus infection // Immunol. Lett.- 2011.- Vol.136, №2.-P. 122- 129.

49. Bui R.H.D., Molinaro G.A., Kettering J.D. et al. Virus-specific IgE and IgG4 antibodies in serum of children infected with respiratory syncytial virus // J.Pediatr- 1987,- Vol.110.-P.87-90.

50. Burton O.T., Oettgen H.C. Beyond immediate hypersensitivity: evolving roles for IgE antibodies in immune homeostasis and allergic diseases// Immunol. Rev.- 2011.- Vol.242, № 1.- P. 128-143.

51. Byeon J.H., Lee J.C., Choi I.S. et al. Comparison of cytokine responses in nasopharyngeal aspirates from children with viral lower respiratory tract infections // Acta Paediatr. -2009.- Vol. 98, № 4.- P.725-730.

52. Casiano-Colon A.E., Hulbert B.B., Mayer T.K. et al. Lack of sensitivity of rapid antigen tests for the diagnosis of respiratory syncytial virus infection in adults // J. Clin. Virol. -2003.- Vol. 28, № 2,- P. 169-174.

53. Castilow E.M., Varga S.M. Overcoming T cell-mediated immunopathology to achieve safe RSV vaccination // Future Virol. -2008- Vol. 3, №5.-P.445-454.

54. Castro M., Schweiger T., Yin-Declue H. et al. Cytokine response after severe respiratory syncytial virus bronchiolitis in early life // J. Allergy. Clin. Immunol.- 2008.- Vol.122, № 4.-P. 726-733.

55. Cevenini R., Donati M., Bertini S. et al. Capture-ELISA for serum IgM antibody to respiratory syncytial virus // J. Hyg. (Lond) .- 1986.-V.97.-P. 511517.

56. Chan P.K., To W.K., Liu E.Y. et al. Evaluation of a peptide-based enzyme immunoassay for anti-SARS coronavirus IgG antibody // J. Med. Virol. -2004:- Vol.74, № 4.-P.517-520.

57. Chang J., Braciale T.J. Respiratory syncytial virus infection suppresses lung CD8+ T-cell effector activity and peripheral CD8+ T-cell memory in the respiratory tract //Nat. Med. -2002.- Vol. 8, № l.-P. 54-60.

58. Chen M., Hu K.F., Rozell B. et al. Vaccination with recombinant alphavirus or immune-stimulating complex antigen against respiratory syncytial virus // J. Immunol. 2002 .- Vol.169, №6.-P.3208-3216.

59. Chi X.Y., Jiang S.J., Wang J. et al. Effect of glucocorticoid in mice of asthma induced by ovalbumin sensitisation and RSV infection// Asian Pac. J. Allergy. Immunol. -2011.- Vol.29, №2.-P. 176-180.

60. Collins P.L., Chanock R.M., Murphy B.R. Respiratory syncytial virus // In: Fields Virology, Fourth edition. Edited by: Fields B.N. and Howley P.M., Philadelphia, Lippincott, Williams, and Wilkins.- 2001.-Vol.1.- P. 11821215.

61. Coro E.S., Chang W.L., Baumgarth N. Type I IFN receptor signals directly stimulate local B cells early following influenza virus infection //J. Immunol. -2006.- Vol.176, № 7- P.4343-4351.

62. Corvaisier C., Bourgeois C., Pothier P. Cross-reactive and group-specific immune responses to a neutralizing epitope of the human respiratory syncytial virus fusion protein //Archio Virol.- 1997.- Vol.142, № 6.-P.1073-1086.

63. Cowton V.M., McGivern D.R., Fearns R. Unravelling the complexities of respiratory syncytial virus RNA synthesis // J. Gen. Virol. -2006.- Vol. 87, Pt 7.-P.1805-1821.

64. Crim R.L., Audet S.A., Feldman S.A. et al. Identification of linear heparin-binding peptides derived from human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein that inhibit infectivity // J. Virol. -2007-Vol. 81, № 1- P. 261271.

65. Crowe J.E. Influence of maternal antibodies on neonatal immunization against respiratory viruses // Clin. Infect. Dis. -2001 Vol.33, № 10-P. 1720-1727.

66. Crowe J.E., Williams J.V. Immunology of viral respiratory tract infection in infancy // Paediatr. Respir .Rev. -2003.- Vol.4, № 2.-P.112-119.

67. Dakhama A., Lee Y.M., Ohnishi H. et al. Virus-specific IgE enhances airway responsiveness on reinfection with respiratory syncytial virus in newborn mice // J. Allergy Clin. Immunol. -2009.- Vol.123, № l.-P.138-145.e5.

68. Day N.D., Branigan P.J., Liu C. et al. Contribution of cysteine residues in the extracellular domain of the F protein of human respiratory syncytial virus to its function// Virol. J.- 2006.- Vol. 3.-P. 34.

69. De Waal L., Power U.F., Yuksel S. et al. Evaluation of BBG2Na in infant macaques: specific immune responses after vaccination and RSV challenge // Vaccine. -2004.- Vol. 22, № 8.-P. 915-922.

70. De Waal L., Siizer Y., Wyatt L.S. et al. T cell responses to respiratory syncytial virus fusion and attachment proteins in human peripheral blood mononuclear cells // Viral. Immunol.- 2006.-Vol.l9,№ 4.-P.669-678.275

71. Delgado M.F., Coviello S., Monsalvo A.C. et al. Lack of antibody affinity maturation due to poor Toll-like receptor stimulation leads to enhanced respiratory syncytial virus disease //Nat. Med. 2009- Vol.15, № 1.-P.34-41.

72. Dennissen M.A., Jenniskens G.J., Pieffers M. et al. Large, tissue-regulated domain diversity of heparan sulfates demonstrated by phage display antibodies // J. Biol. Chem. -2002.- Vol. 277,№ 13.-P. 10982-10986.

73. Drexler S.K., Foxwell B.M. The role of toll-like receptors in chronic inflammation // Int. J. Biochem. Cell. Biol.- 2010. -Vol. 42, №4.-P. 506-518.

74. Eckardt-Michel J., Lorek M., Baxmann D. et al. The fusion protein of respiratory syncytial virus triggers p53-dependent apoptosis // J. Virol-2008-Vol.82, № 7.-P. 3236-3249.

75. Eisenhut M. Extrapulmonary manifestations of severe respiratory syncytial virus infection—a systematic review//Crit. Care-2006 Vol.10, № 4 -P.R107.

76. Ellyard J., Avery D., Phan T. et al. Antigen-selected, immunoglobulin-secreting cells persist in human spleen and bone morrow // Blood.-2004.-Vol. 103, № 10 .- P.3805-3812.

77. Ercolini A.M., Miller S.D. The role of infections in autoimmune disease // Clin. Exp. Immunol. -2009.- Vol.155, №1.- P. 1-15.

78. Erdman D.D., Anderson L.J. Monoclonal antibody-based capture enzyme immunoassays for specific serum immunoglobulin G (IgG), IgA, and IgM antibodies to respiratory syncytial virus // J. Clin. Microbiol 1990 - Vol. 28, № 12.-P. 2744-2749.

79. Fach S.J., Meyerholz D.K., Gallup J.M. et al. Neonatal ovine pulmonary dendritic cells support bovine respiratory syncytial virus replication with enhanced interleukin (IL)-4 And IL-10 gene transcripts// Viral. Immunol-2007 .-20, №1-p.i 19-130.

80. Falsey A.R., Formica M.A., Walsh E.E. Diagnosis of respiratory syncytial virus infection: comparison of reverse transcription-PCR to viral culture and serology in adults with respiratory illness// J. Clin. Microbiol.- 2002.- Vol.40, № 3.- P.817-820.

81. Falsey A.R., Singh H.K., Walsh E.E. Serum antibody decay in adults following natural respiratory syncytial virus Infection // J. Med. Virol. -2006-Vol.78, №11.-P. 1493-1497.

82. Feldman S.A., Hendry R.M., Beeler J.A. Identification of a linear heparin binding domain for human respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G // J. Virol. -1999.-Vol.73, № 8.-P. 6610-6617.

83. Feldman S.A., Audet S., Beeler J.A. The fusion glycoprotein of human respiratory syncytial virus facilitates virus attachment and infectivity via an interaction with cellular heparan sulfate. // J. Virol. -2000 Vol. 74, № 14-P.6442-6447.

84. Fink K., Zellweger R., Weber J. et al. Long-term maternal imprinting of the specific B cell repertoire by maternal antibodies // Eur. J. Immunol. -2008-Vol.38, № 1.-P.90-101.

85. Fischer J.E., Johnson J.E., Kuli-Zade R.K. et al. Overexpression of interleu-kin-4 delays virus clearance in mice infected with respiratory syncytial virus // J. Virol. -1997.- Vol. 71, №11.- P.8672-8677.

86. Fondera J., Huguet M., Macura-Biegun A. et al. Detection and enumeration of circulating HIV-I-specific memory B cells in HIV-I-infected patients // J.Acquir. Immune Defic. Syndr- 2004.- Vol.35, № 2 .- P. 114-119.

87. Forster J., Maier O., Löbbert J. et al. Prevalence of antibodies against HEp-2 cell antigen in infants and children hospitalized with respiratory syncytial virus infection \\ Infection. -1996.- Vol.24, № 6.- P.407-411.

88. Frogel M.P., Stewart D.L., Hoopes M. et al. A systematic review of compliance with palivizumab administration for RSV immunoprophylaxis // J. Manag. Care. Pharm.-2010 .-Vol.16, № 1.-P.46-58.

89. Fuentes S., Tran K.C., Luthra P. et al. Function of the respiratory syncytial virus small hydrophobic protein // J. Virol. -2007.- Vol.81, № 15.-P. 83618366.

90. Gan S.W., Ng L., Lin X. et al. Structure and ion channel activity of the human respiratory syncytial virus (hRSV) small hydrophobic protein transmembrane domain // Protein Sei.- 2008.- Vol.17, № 5.-P.813-820.

91. García-Beato R., Martínez I., Francí C. et al. Host cell effect upon glycosyl-ation and antigenicity of human respiratory syncytial virus G glycoprotein // Virology.- 1996 .- Vol. 221, № 2.-P. 301-309.

92. Getahun A., Heyman B. Studies on the mechanism by which antigen-specific IgG suppresses primary antibody responses: evidence for epitope masking and decreased localization of antigen in the spleen // Scand. J. Immunol.- 2009.- Vol.70, №3.-P.277-287.

93. Gimenez H.B., Chisholm S., Dornan J. et al. Neutralizing and enhancing activities of human respiratory syncytial virus-specific antibodies// Clin. Diagn.Lab. Immunol. -1996.- Vol.3, № 3.-P.280-286.

94. Glezen W., Paredes A., Allison J. et al. Risk of respiratory syncytial virus infection for infants from low income families in relationship to age, sex, ethnic group, and maternal antibody level // J. Pediatr. -1981- Vol. 98.-P.708-715.

95. Hacimustafaoglu M., Celebi S., Aynaci E. et al. The progression of maternal RSV antibodies in the offspring// Arch. Dis. Child. -2004 .- Vol.89, № 1.-P.52-53.

96. Hagglund S., Hu K.F., Larsen L.E. et al. Bovine respiratory syncytial virus ISCOMs protection in the presence of maternal antibodies // Vaccine. -2004 .- Vol. 23, №5.-P.646-655.

97. Halfpenny K.C., Wright D.W. Nanoparticle detection of respiratory infection //Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 2010.- Vol.2, №3.-P.277-290.

98. Hao Y.Q., Chen T.X., Zhu Y.Z. et al. Mechanism of inhibitory effect of intravenous immunoglobulin on neonatal umbilical cord blood lymphocytes // Zhonghua Er Ke Za Zhi.- 2005 Vol.43,№ 6 .-P. 438-443.

99. Harcourt J., Alvarez R., Jones L.P. et al. Respiratory syncytial virus G protein and G protein CX3C motif adversely affect X3CR1+ T cell responses // J. Immunol. -2006.- Vol.176, № 3.-P. 1600-1608.

100. Harker J., Bukreyev A., Collins P.L. et al. Virally delivered cytokines alter the immune response to future lung infections // J. Virol.— 2007.-Vol. 81, №.23. P. 13105-13111.

101. Hasegawa M., Fujimoto M., Takehara K. et al. Pathogenesis of systemic sclerosis: altered B cell function is the key linking systemic autoimmunity and tissue fibrosis// J. Dermatol. Sei.- 2005.-Vol.39, № 1.-P.1-7.

102. Haynes L.M., Moore D.D., Kurt-Jones E.A. et al. Involvement of toll-like receptor 4 in innate immunity to respiratory syncytial virus // J. Virol. -2001.-Vol.75, № 22.-P.10730-10737.

103. Hebeis B.J., Klenovsek K., Rohwer P. et al. Activation of virus-specific memory B cells in the absence of T cell help // J. Exp.Med. -2004- Vol.199, №4.-P.593-602.

104. Heilman C.A. From the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and the World Health Organization. Respiratory syncytial and parainfluenza viruses// J.Infect. Dis. -1990.- Vol.161, № 3.-P.402-406.

105. Helson R., Olszewska W., Singh M. et al. Polylactide-co-glycolide (PLG) microparticles modify the immune response to DNA Vaccination // Vaccine. -2008,-Vol. 26, № 6.-P.753-761.

106. Hendry R.M., Burns J.C., Walsh E.E. et al. Strain-specific serum antibody responses in infants undergoing primary infection with respiratory syncytial virus // J. Infect. Dis. -1988.- Vol.157, № 4.-P. 640-647.

107. Henrickson K.J., Hall C.B. Diagnostic assays for respiratory syncytial virus disease // Pediatr. Infect. Dis. J. -2007.- Vol. 26, №11, Suppl.-P. S36-40.

108. Herrera-van Oostdam D.A., Esparza-Ibarra E., Ramírez-Sandoval R. et al. Apoptosis and necrosis increase antigenicity of proteins recognized by antinuclear antibodies // Reumatismo. -2004.- Vol.56, № 3.-P.156-161.

109. Heyman B. Regulation of antibody responses via antibodies, complement, and Fc receptors // Annu. Rev. Immunol 2000 - Vol.18.- P.709-737.

110. Hirayama M., Maruyama T., Mitsui H. et al. IgGl anti-P2 as a marker of response to interferon in patients with chronic hepatitis C // Clin. Exp. Immunol. -2001.-Vol.126, № 1.-P.92-100.

111. Hjelm F., Carlsson F., Getahun A. et al. Antibody-mediated regulation of the immune response // Scand. J. Immunol. -2006- Vol.64, № 3.-P.177-184.

112. Homey B., Zlotnik A. Chemokines in allergy// Curr. Opin. Immunol.- 1999.-Vol.l 1, №6.-P.626-634

113. Horimoto T., Kawaoka Y. Pandemic threat posed by avian influenza A viruses// Clin. Microbiol. Rev.- 2001.- Vol.l4,№ 1.-P. 129-149.

114. Hornsleth A., Bech-Thomsen N., Friis B. Detection by ELISA of IgG-subclass-specific antibodies in primary respiratory syncytial (RS) virus infections // J.Med. Virol.-l 985.-Vol. 16.-P.321-328.

115. Huang S., Wei W., Yun Y. Upregulation of TLR7 and TLR3 gene expression in the lung of respiratory syncytial virus infected mice// Wei Sheng Wu Xue Bao.-2009 .- Vol.49, №2.-P.239-245.

116. Hyvarinen M.K., Kotaniemi-Syrjanen A., Reijonen T.M. et al. Lung function and bronchial hyper-responsiveness 11 years after hospitalization for bronchiolitis // Acta Paediatr.- 2007.- Vol.96,№10.-P. 1464-1469.

117. Jiang X.B., Wang Z.D., Zhu Y. et al. Inhibition of CD8+ T lymphocytes attenuates respiratory syncytial virus-enhanced allergic inflammation // Respiration.- 2009.- Vol. 77, № l.-P. 76-84.

118. Johnson P.R., Collins P.L. The fusion glycoproteins of human respiratory syncytial virus of subgroups A and B: sequence conservation provides a structural basis for antigenic relatedness // J. Gen. Virol. -1988- Vol.69, Pt. 10-P. 2623-2628.

119. Johnson P.R., Collins P.L. The IB (NS2), 1C (NS1) and N proteins of human respiratory syncytial virus (RSV) of antigenic subgroups A and B: sequence conservation and divergence within RSV genomic RNA // J. Gen. Virol. 1989,-Vol. 70.-P. 1539-1547.

120. Johnstone C., Guil S., Rico M.A. et al. Relevance of viral context and diversity of antigen-processing routes for respiratory syncytial virus cytotoxic T-lymphocyte epitopes // J. Gen. Virol.- 2008.- Vol.89, Pt. 9.- P. 2194-2203.

121. Jones L.P., Zheng H.Q., Karron R.A. et al. Multiplex assay for detection of strain-specific antibodies against the two variable regions of the G protein of respiratory syncytial virus// Clin. Diagn. Lab. Immunol- 2002 № 3 -P. 633-638.

122. Karlsson M.C., Wernersson S., Diaz de Stahl T. et al. Efficient IgG-mediated suppression of primary antibody responses in Fcgamma receptor-deficient mice// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 1999.- Vol.96, № 5.-P.2244-2249.

123. Kehl S.C., Henrickson K.J., Hua W. et al. Evaluation of the Hexaplex assay for detection of respiratory viruses in Children //J. Clin. Microbiol.-2001.-Vol.39, №5.- P.1696-1701.

124. Kendall E.A., Tarique A.A., Hossain A. et al. Development of immunoglobulin M memory to both a T-cell-independent and a T-cell-dependent antigen following infection with Vibrio cholerae 01 in Bangladesh // Infect. Immun. 2010.-Vol.78,№l.-P.253-259.

125. Kim H.W., Canchola J.G., Brandt C.D. et al. Respiratory syncytial virus disease in infants despite prior administration of antigenic inactivated vaccine // Am. J. Epidemiol.- 1969.- Vol. 89, №4, P.422-434.

126. Kim H.J., Kim J.K., Seo S.B. et al. Intranasal vaccination with peptides and cholera toxin subunit B as adjuvant to enhance mucosal and systemic immunity to respiratory syncytial virus // Arch. Pharm. Res. -2007 V.30, №3-P.366-371.

127. Kimpen J.L. Respiratory syncytial virus and asthma. The role of monocytes // Am. J. Respir. Crit. Care Med. -2001.- Vol.163, №3 pt 2.-P. S7-9.

128. King K.A., Hu C., Rodriguez M.M. et al. Exaggerated neurogenic inflammation and substance P receptor upregulation in RSV-infected weanling rats // Am. . Respir. Cell Mol. Biol. -2001.- Vol.24, № 2,- P. 101-107.284

129. Klein U., Küppers R., Rajewsky K. Evidence for a large compartment of IgM-expressing memory B cells in humsns // Blood.-1997.-Vol. 89, № 4 .P. 1288-1298.

130. Kumar H., Kawai T., Akira S. Toll-like receptors and innate immunity// Biochem. Biophys. Res. Commun. -2009.- Vol.388, №4.-P.621-625.

131. Kurosaki T., Aiba Y., Kometani K. et al. Unique properties of memory B cells of different isotypes // Immunol. Rev.- 2010.- Vol.237, №1.-P.104-116.

132. Kurt-Jones E.A., Popova L., Kwinn L. et al. Pattern recognition receptors TLR4 and CD 14 mediate response to respiratory syncytial virus // Nat. Immunol.- 2000.- Vol. 1, № 5.-P.398-401

133. Lamb R.A., Pares G.D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. In: Knipe D.M., Howley P.M., editors. Fields Virology. 5.1. Wolters Kluver:Lippencott Williams and Wilkins- 2007-P. 1449-1496.

134. Lambert D.M., Barney S., Lambert A.L. et al. Peptides from conserved regions of paramyxovirus fusion (F) proteins are potent inhibitors of viral fusion //Proc. Natl. Acad. USA.- 1996.-V. 93.-P. 2186-2191.

135. Lau L.T., Feng X.Y., Lam T.Y. et al. Development of multiplex nucleic acid sequence-based amplification for detection of human respiratory tract viruses //J.Virol. Methods. -2010.- Vol. 168,№l-2.-P.251-254.

136. Lausen B., Hougs L., Schejbel L. et al. Human memory B cells transferred by allogenic bone morrow transplantation contribute significantly to the antibody repertoire of the recipient // J. Immunol 2004- Vol.172.- P. 33053318.

137. Law M., Hangartner L. Antibodies against viruses: passive and active immunization. // Curr. Opin. Immunol. -2008.- Vol. 20, № 4.- P.486-492.

138. Le Bon A., Thompson C., Kamphuis E. et al. Cutting edge: enhancement of antibody responses through direct stimulation of B and T cells by type IIFN // J. Immunol.- 2006.-Vol.176, № 4.- P.2074-2078.

139. Li W., Shen H.H. Effect of respiratory syncytial virus on the activity of matrix metalloproteinase in mice // Chin. Med. J. (Engl). -2007 Vol.120,№ 1-P. 5-11.

140. Li J.P., Vlodavsky I. Heparin, heparan sulfate and heparanase in inflammatory reactions // Thromb. Haemost.- 2009.- 102, № 5.- P.823-828.

141. Liang B., Gardner D., Griswold D. et al. Anti-interleukin-6 monoclonal antibody inhibits autoimmune responses in a murine model of systemic lupuserythematosus// Immunology.-2006.-Vol.l 19,№ 3.-P.296-305.286

142. Liu K., Iyoda T., Saternus M. et al. Immune tolerance after delivery of dying cells to dendritic cells in situ // J. Exp. Med. -2002 Vol.196, № 8-P.1091-1097.

143. Liu F., Feuer R., Hassett D.E. et al. Peptide vaccination of mice immune to LCMV or vaccinia virus causes serious CD8 T cell-mediated, TNF- ependent immunopathology // J. Clin. Invest. -2006.- Vol. 116, № 2.-P.465-475.

144. Looney R.J., Falsey A.R., Walsh E. et al. Effect of aging on cytokine production in response to respiratory syncytial virus infection// J. Infect. Dis. -2002.- Vol.185, №5.-P.682

145. Lopez J.A., Andreu D., Carreno C. et al. Conformational constraints of conserved neutralizing epitopes from a major antigenic area of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein // J. Gen. Virol 1993 - Vol.74, Pt. 122567-2577.

146. Lopez J. A., Buston R., Orvell C. et al. Antigenic structure of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein // J.Virol.- 1998 Vol.72 , № 8-P.6922-6928.

147. Lucey D.R., Clerichi M., Shearer G.M. Type 1 and type 2 cytokine dysregulation in human infectious, neoplastic, and inflammatory diseases // Clin. Microbiol. Rev.- 1996.- Vol. 9, № 4.- P. 532-562.

148. Lukacs N.W., Glovsky M.M., Ward P.A. Complement-dependent immune complex-induced bronchial inflammation and Hyperreactivity // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol.- 2001.-Vol. 280, № 3.-P. L512-L518.

149. Lukacs N.W., Smit J.J., Mukherjee S. et al. Respiratory virus-induced TLR7 activation controls IL-17-associated increased mucus via IL-23 regulation // J. Immunol. -2010.- Vol.185, № 4.- P. 2231-2239.

150. Lopez J.A., Andreu D., Carreño C. et al. Conformational constraints of conserved neutralizing epitopes from a major antigenic area of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein // J. Gen. Virol 1993- Vol.74, Pt. 122567-2577.

151. Mackay F., Silveira P.A., Brink R. B cells and the BAFF/APRIL axis: fast-forward on autoimmunity and signaling // Curr. Opin. Immunol. -2007.-Vol.19, № 3.- P.327-336.

152. Magro M., Andreu D., Gómez-Puertas P. et al. Neutralization of human respiratory syncytial virus infectivity by antibodies and low-molecular-weight compounds targeted against the fusion glycoprotein // J. Virol 2010 .-Vol.84,№ 16-P.7970-7982.

153. Malhotra R., Ward M., Bright H. et al. Isolation and characterisation of potential respiratory syncytial virus receptor(s) on epithelial cells // Microbes Infect. -2003-Vol. 5, № 2.-P.123-133.

154. Mantel P.Y., Schmidt-Weber C.B. Transforming growth factor-beta: recent advances on its role in immune tolerance// Methods. Mol. Biol-2011-Vol.677.-P.303-338.

155. Martin D.A., Elkon K.B. Autoantibodies make a U-turn: the toll hypothesis for autoantibody specificity // J. Exp. Med. -2005.-Vol. 202, №11.- P. 14651469.

156. Martinello R.A., Chen M.D., Weibel C. et al. Correlation between respiratory syncytial virus genotype and severity of illness // J. Infect. Dis 2002-Vol.186, № 6.-P.839-842.

157. Martins T.B., Jaskowski T.D., Mouritsen C.L. et al. An evaluation of the effectiveness of three immunoglobulin G (IgG) removal procedures for routine IgM serological testing // Clin. Diagn. Lab. Immunol 1995.-V. 2.-P. 98103.

158. Mathiesen T., Persson M., Sundqvist V. et al. Neutralization capacity and antibody dependent cell-mediated cytotoxicity of separated IgG subclasses 1,3 and 4 against herpes simplex virus // Clin.Exp. Immunol 1988 - Vol. 72, №2.-P. 211-215.

159. Matic G., Hofmann D., Winkler R. et al. Removal of immunoglobulins by a protein A versus an antihuman immunoglobulin G-based system: evaluation of 602 sessions of extracorporeal immunoadsorbtion // Artif.0rgans.-2000-V.24.-P. 103-107.

160. McIntosh K., Channock R.M. Respiratory syncytial virus . In: Virology. Ed-it.by B.N. Fields, D.M.Knipe et al. Raven Press, Ltd.,New York-1990.-P. 1045-1072.

161. McLellan J.S., Yang Y., Graham B.S. et al. Structure of respiratory syncytial virus fusion glycoprotein in the postfusion conformation reveals preservation of neutralizing epitopes// J. Virol.- 2011.- Vol.85, № 15.-P.7788-7796.

162. McNamara P.S., Flanagan B.F., Selby A.M. et al. Pro- and antiinflammatory responses in respiratory syncytial virus bronchiolitis // Eur.Respir J.- 2004.-Vol. 23, №1.-P.106-112.

163. Mejias A., Chavez-Bueno S., Gomez A.M. et al. Respiratory syncytial virus persistence: evidence in the mouse model // Pediatr. Infect. Dis. J. -2008.-Vol.27, № 10, Suppl.-P.S60-62.

164. Merbl Y., Zucker-Toledano M., Quintana F.J. et al. Newborn humans manifest autoantibodies to defined self molecules detected by antigen microarray informatics // J. Clin. Invest. -2007.- Vol. 117, №3.-P.712-718.

165. Meurman O., Ruuskanen O., Sarkkinen H. et al. Immunoglobulin class-specific antibody response in respiratory syncytial virus infection measured by enzyme immunoassay // J. Med. Virol 1984.-Vol.14, №1.-P.67-72.

166. Mevorach D, Zhou JL, Song X. et al. Systemic exposure to irradiated apop-totic cells induces autoantibody production // J.Exp. Med. -1998-Vol.l88,№ 2.-P.387-392.

167. Meyer G., Deplanche M., Schelcher F. Human and bovine respiratory syncytial virus vaccine research and development // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. -2008.-Vol.31, № 2-3.-P. 191-225.

168. Mgbemena V., Segovia J., Chang T. et al. Kriippel-like factor 6 regulates transforming growth factor-P gene expression during human respiratory syncytial virus infection// Virol. J.- 2011.- Vol.8.-P.409.

169. Monick M.M., Yarovinsky T.O., Powers L.S. et al. Respiratory syncytial virus up-regulates TLR4 and sensitizes airway epithelial cells to endotoxin // . J. Biol. Chem. -2003.- Vol. 278, № 52.-P.53035-53044.

170. Moore M.L., Peebles R.S. Respiratory syncytial virus disease mechanisms implicated by human, animal model, and in vitro data facilitate vaccine strategies and new therapeutics // Pharmacol. Ther. -2006 Vol.112, № 2.-P.405-424.

171. Morton C.J., Cameron R., Lawrence L.J. et al. Structural characterization of respiratory syncytial virus fusion inhibitor escape mutants: homology model of the F protein and a syncytium formation assay// Virology-2003 .-Vol.311, № 2.-P. 275-88.

172. Mottram P.L., Leong D., Crimeen-Irwin B. et al. Type 1 and 2 immunity following vaccination is influenced by nanoparticle size: formulation of a model vaccine for respiratory syncytial virus// Mol. Pharm- 2007-Vol.4,№l.-P.73-84.

173. Mukherjee S., Lindell D.M., Berlin A.A. et al. IL-17-induced pulmonary pathogenesis during respiratory viral infection and exacerbation of allergic diseas// Am. J. Pathol.- 2011.- Vol. 179,№ 1 .-P.248-258.

174. Munir S., Le Nouen C., Luongo C. et al. Nonstructural proteins 1 and 2 of respiratory syncytial virus suppress maturation of human dendritic cells // J. Virol. -2008.- Vol. 82, №17.-P.8780-8796.

175. Murata Y., Lightfoote P.M., Biear J.N. et al. Humoral response to the central unglycosylated region of the respiratory syncytial virus attachment protein // Vaccine. -2010.- Vol.28, № 38.-P.6242-6246.

176. Murawski M.R., Bowen G.N., Cerny A.M., Anderson L.J., Haynes L.M., Tripp R.A., Kurt-Jones E.A.,Finberg R.W.Respiratory syncytial virus activates innate immunity through Toll-like receptor 2 // J. Virol. -2009-Vol.83,№3 .-P. 1492-1500.

177. Murry A.R., Dowell S.F. Respiratory syncytial virus: not just for kids// Hosp. Pract- 1997.- Vol.32, №7-P.87-88, 91-94.

178. Muto O., Sato Y., Umeki Y.et al HGF/SF-induced spreading of MDCK cells correlates with disappearance of barmotin/7H6, a tight junction-associated protein, from the cell membrane // Cell Biol. International .2000.- V. 24.- P. 439-446.

179. Nair H., Nokes D.J., Gessner B.D. et al. Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis // Lancet. 2010.-Vol. 375 (9725).-P. 15451555.

180. Nguyen D.T., de Witte L., Ludlow M. et al. The synthetic bacterial lipopeptide Pam3CSK4 modulates respiratory syncytial virus infection independent of TLR activation // PLoS Pathog.- 2010.- Vol.6, № 8.-P. el001049.

181. Ni L., Zhao L., Qian Y. et al. Design and characterization of human respiratory syncytial virus entry inhibitors // Antivir. Ther. -2005 Vol.10, № 7-P.833-840.

182. Nimmerjahn F., Ravetch J.V. Antibody-mediated modulation of immune responses // Immunol. Rev. -2010.- Vol.236-P.265-275.

183. Patton A., Mullenix M.C., Swanson S.J et al. An acid dissociation bridging ELISA for detection of antibodies directed against therapeutic proteins in the presence of antigen // J. Immunol. Methods. -2005.-304, № 1-2.-P. 189-195.

184. Peixoto E.B., Collares-Buzato C.B. Modulation of the epithelial barrier by dexamethasone and prolactin in cultured Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells//Cell Biol. Int. -200.-Vol.30, № 2.-P.101-113.

185. Perez J.W., Vargis E.A., Russ P.K. et al. Detection of respiratory syncytial virus using nanoparticle amplified immuno-polymerase chain reaction// Anal. Biochem.- 2011.- Vol.410,№1.-P.141-148.

186. Peter K., Brunda M.J, Corradin G.IL-12 administration leads to a transient depletion of T cells, B cells, and APCs and concomitant abrogation of the HLA-A2.1-restricted CTL response in transgenic mice // J. Immunol. -2002.- 169, №i.p. 63-67.

187. Piedimonte G. Contribution of neuroimmune mechanisms to airway inflammation and remodeling during and after respiratory syncytial virus infection \\ Pediatr. Infect. Dis. J. -2003.- Vol.22, № 2.- Suppl.-P. :S66-74.

188. Plotnicky-Gilquin H., Goetsch L., Huss T. et al. Identification of multiple protective epitopes (protectopes) in the central conserved domain of a prototype human respiratory syncytial virus G protein // J. Virol- 1999 Vol.73, № 7 - P.5637-5645.

189. Polack F.P., Teng M.N., Collins P.L. et al. A role for immune complexes in enhanced respiratory syncytial virus disease // J. Exp. Med. -2002 .- Vol.196, № 6-P.859-865.

190. Popow-Kraupp T., Lakits E., Kellner G. et al. Immunoglobulin class-specific immune response respiratory syncytial virus structural proteins in infants, children, and adults // J.Med.Virol.-l989.- V.27.-P. 215-223.

191. Portocala R., Spyrou N., Lambropoulou V. et al. The presence of both antivirus and antiself antibodies in sera from patients with adenovirus and influenza B // Virologie. 1988.- Vol. 39, №3.-P.207-216.

192. Queiroz D., Durigon E., Botosso V. et al. Immune response to respiratory syncytial virus in young Brazilian children // Braz. J. Med. Biol. Res 2002-Vol.35, № 10.-P.l 183-1193.

193. Rabatic S., Gagro A., Lokar-Kolbas R. et al. Increase in CD23 + B cells in infants with bronchiolitis is accompanied by appearance of IgE and IgG4 antibodies specific for respiratory syncytial virus // J. Infect. Dis- 1997-Vol. 175.-P.32-3 7.

194. Rabe K.F. Mechanisms of immune sensitization of human bronchus // Am. J. Respir.Crit.Care Med.- 1998.-Vol.l58.-P.S161-S171.

195. Radhakrishnan A., Yeo D., Brown G. et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shockprotein 90 in virus particle assembly // Mol. Cell. Proteomics 2010-Vol.9,№9.-P. 1829-1848.

196. Ramilo O. Evolution of prophylaxis: MoAb, siRNA, vaccine, and small molecules // Paediatr. Respir. Rev. -2009.- Vol.10, Suppl l.-P. 23-25.

197. Randolph A.G., Wang E.E. Ribavirin for respiratory syncytial virus infection of the lower respiratory tract // Cochrane Database Syst. Rev- 2004.-№ 4-CD000181.

198. Ravetch J.V., Nimmerjahn F. Fc Receptors and Their Role in Immune Regulation and Inflammation // In: Fundamental Immunology, 6th edition, edited by Paul W.E., Lippincott, Williams and Wilkins- 2008 Chapter 22.-P.685-705.

199. Reed J.L., Welliver T.P., Sims G.P. et al. Innate immune signals modulate antiviral and polyreactive antibody responses during severe respiratory syncytial virus infection // J. Infect. Dis.-2009.- Vol.199, № 8.-P.1128-1138.

200. Renaudineau Y., Revelen R., Dueymes M. et al. Autoantibodies to heparan sulfate proteoglycans. Review // Autoimmun. Rev. -2002.-Vol.l, №5-P.305-312.

201. Richer M.J., Fang D., Shanina I. et al. Toll-like receptor 4-induced cytokine production circumvents protection conferred by TGF-beta in coxsackievirus-mediated autoimmune myocarditis // Clin. Immunol. -2006.- Vol. 121, № 3.-P. 339-349.

202. Roivainen M., Klingel K. Virus infections and type 1 diabetes risk // Curr. Diab. Rep. -2010.-Vol.10, №5.-P.350-356.

203. Roosnek E., Lanzavecchia A. Efficient and selective presentation of antigen-antibody complexes by rheumatoid factor B cells //J. Exp. Med.- 1991.- Vol. 173, №2 .-P. 487-489.

204. Routledge E. G., Willcocks M. M., Samson A. C. et al. The purification of four respiratory syncytial virus proteins and their evaluation as protective agents against experimental infection in BALB/c mice // J. Gen. Virol-1988.- Vol. 69.-P. 293-303.

205. Roux X., Dubuquoy C., Durand G. et al. Sub-nucleocapsid nanoparticles: a nasal vaccine against respiratory syncytial virus// PLoS One- 2008-Vol.3,3 el766.

206. Rutigliano J.A., Graham B.S. Prolonged production of TNF-alpha exacerbates illness during respiratory syncytial virus infection // J. Immunol. -2004.-Vol. 173, № 5.-P. 3408-3417.

207. Rutigliano J.A., Ruckwardt T.J., Martin J.E. et al. Relative dominance of epitope-specific CD8+ T cell responses in an F1 hybrid mouse model of respiratory syncytial virus infection // Virology. -2007 Vol.362, № 2.-P. 314— 319.

208. Saha S., Tieng A., Pepeljugoski K.P. et al. Prolactin,systemic lupus erythematosus, and autoreactive B cells: lessons learnt from murine models // Clin. Rev. Allergy. Immunol.- 2011.- Vol.40, № 1.-P.8-15.

209. Saji F., Samejima Y., Kamiura S. et al. Dynamics of immunoglobulins at the feto-maternal interface // Rev. Reprod.- 1999.- Vol.4, № 2.-P. 81-89.

210. Salonen E., Vaheri A., Suni J. et al. Rheumatoid factor in acute viral infections: interference with determination of IgM, IgG, and IgA antibodies in an enzyme immunoassay // J. Infect. Dis 1980.-V. 142.-P. 250-255.

211. Sarmiento R.E., Tirado R.G., Valverde L.E. et al. Kinetics of antibody-induced modulation of respiratory syncytial virus antigens in a human epithelial cell line // Virol. J.- 2007.- Vol.4:68.

212. Schlender J., Walliser G., Fricke J. et al. Respiratory syncytial virus fusion protein mediates inhibition of mitogen-induced T-cell proliferation by contact // J. Virol. -2002.- Vol.76,, № 3.- P. 1163-1170.

213. Schrejver R.S., Langedijk J.P.,van der Poel W.H.et al.Antibody responses against the G and F proteins of bovine of respiratory syncytial virus after experimental and natural infection // Clin. Diagn. Lab. Immunol.- 1996.- Vol.3 , № 5.- P.500-506.

214. Schroeder H.W., Cavacini L. Structure and function of immunoglobulins// J.Allergy. Clin. Immunol. -2010.- Vol.125, № 2 .-P. S41-52.

215. Shao H.Y., Lin Y.W., Yu S.L. et al. Immunoprotectivity of HLA-A2 CTL peptides derived from respiratory syncytial virus fusion protein in HLA-A2 transgenic mouse // PLoS One.- 2011.- Vol.6, № 9.-P. e25500.

216. Shaw P.,Goodyear C., Chang M. et al. The autoreactivity of anti-phosphorylcholine antibodies for atherosclerosis-associated neo-antigens and apoptotic cells //J. Immunol. -2003.- Vol. 170, №12.- P. 6151-6157.

217. Shukla D., Spear P.Herpesviruses and heparan sulfate: an intimate relationship in aid of viral entry // J. Clin. Invest.-2001.- Vol.108, №4.-P.503-510.

218. Siegrist C.A. Mechanisms by which maternal antibodies influence infant vaccine responses: review of hypotheses and definition of main determinants //Vaccine .-2003.-Vol.21.-P. 3406-3412.

219. Sigurs N., Bjarnason R., Sigurbergsson F. Respiratory syncytial virus bronchiolitis in infancy is an important risk factor for asthma and allergy at age 7 // Am. J. Respir. Crit. Care .Med. -2000 .-Vol. 161-P. 1501- 1507.

220. Simpson J.L., Moric I., Wark P.A. et al. Use of induced sputum for the diagnosis of influenza and infections in asthma: a comparison of diagnostic techniques // J. Clin. Virol.- 2003.- Vol.26, № 3.- P.339-346.

221. Singh S.R., Dennis V.A., Carter C.L. et al. Immunogenicity and efficacy of recombinant RSV-F vaccine in a mouse model // Vaccine. -2007a Vol.25, №33.- P. 6211-6223.

222. Singh S.R., Dennis V.A., Carter C.L. et al. Respiratory syncytial virus recombinant F protein (residues 255-278) induces a helper T cell type 1 immune response in mice // Viral Immunol. -2007b- Vol. 20, № 2 P.261-275.

223. Srikiatkhachorn A., Chang W., Braciale T.J. Induction of Th-1 and Th-2 responses by respiratory syncytial virus attachment glycoprotein is epitope and major histocompatibility complex independent // J. Virol. -1999- Vol.73 , № 8-P.6590-6597.

224. Stavnezer J., Kang J. The surprising discovery that TGF beta specifically induces the IgA class switch // J. Immunol. -2009.- Vol.182, № 1.-P.5-7.

225. Stensballe L.G., Ravn H., Kristensen K. et al. Respiratory syncytial virus neutralizing antibodies in cord blood, respiratory syncytial virus hospitalization, and recurrent wheeze // J. Allergy Clin. Immunol. -2009 Vol.123, № 2.-P.398-403

226. Strannegard O., Cello J., Bjarnason R. et al. Association between pronounced IgA response in RSV bronchiolitis and development of allergic sensitization //Pediatr. Allergy. Immunol 1997-Vol.8, № 1.-P.1-6.

227. Techaarpornkul S.,Barretto N., Peeples M.E. Functional analysis of recombinant respiratory syncytial virus deletion mutants lacking the small hydrophobic and/or attachment glycoprotein gene // J. Virol-2001- Vol.75.- P. 6825-6834.

228. Teilum K., Hoch J.C., Goffin V. et al. Solution structure of human prolactin //J. Mol. Biol.- 2005.- Vol.351, №4 .-P.810-823.

229. Thornburg N.J., Shepherd B., Crowe J.E. Transforming growth factor beta is a major regulator of human neonatal immuneresponses following respiratory syncytial virus infection // J. Virol.- 2010.- Vol.84, №24.-P. 12895-12902.

230. Toms G.L., Webb M.C., Milner P.D. et al. IgG and IgM antibodies to viral glycoproteins in respiratory syncytial virus infections of graded severity // Arch. Dis. Child .-1989.- Vol.64.-P.1661-1665.

231. Traves S.L., Proud D. Viral-associated exacerbations of asthma and COPD// Curr. Opin. Pharmacol. 2007.-Vol.7, № 3.- P.252-258.

232. Tregoning J.S., Schwarze J. Respiratory viral infections in infants: causes, clinical symptoms, virology, and immunology// Clin. Microbiol. Rev. -2010-Vol.23, №l.-P.74-98.

233. Tripp R.A., Hou S., Etchart N. et al. CD4(+) T cell frequencies and Thl/Th2 cytokine patterns expressed in the acute and memory response to respiratory syncytial virus I-E(d)-restricted peptides // Cell Immunol. 2001 -Vol.207,№ 1.-P.59-71.

234. Tripp R.A., Alvarez R., Anderson B. et al. Bioconjugated nanoparticle detection of respiratory syncytial virus infection // Int. J. Nanomedicine.- 2007.-Vol.2, №1.- P. 117-124.

235. Trudel M., Nadon F., Seguin C. et al. Identification of a synthetic peptide as a part of major neutralization epitope of respiratory syncytial virus // J.Gen.Virology.-1987.- Vol.68.- P.2273 2280.

236. Tulic M.K., Hurrelbrink R.J., Prêle C.M. et al. TLR4 polymorphisms mediate impaired responses to respiratory syncytial virus and lipopolysaccharide.// J. Immunol.-2007.-V. 179, № 1.-P. 132-140.

237. Valarcher J-F., Schelcher F., Bourhy H. Evolution of bovine respiratory syncytial virus // J. Virol.- 2000.- Vol.74. № 22.- P. 10714-10728.

238. Vangeel I., Antonis A.F., Fluess M. et al. Efficacy of a modified live intranasal bovine respiratory syncytial virus vaccine in 3-week-old calves experimentally challenged with BRSV // Vet. J. -2007.- Vol. 174, № 3.- P. 627-635.

239. Varga S.M., Wissinger E.L., Braciale T.J. The attachment (G) glycoprotein of respiratory syncytial virus contains a single immunodominant epitope that elicits both Thl and Th2 CD4+ T cell responses // J. Immunol.- 2000.- Vol. 165, № 11.-P.6487-6495.

240. Vey M., Schäfer W., Berghöfer S. et al. Maturation of the trans-Golgi network protease furin: compartmentalization of propeptide removal, substrate cleavage, and COOH-terminal truncation // J. Cell Biol 1994- Vol.127, № 6 Pt 2 - P. 1829-1842.

241. Vieira S.E., Gilio A.E., Durigon E.L. et al. Lower respiratory tract infection caused by respiratory syncytial virus in infants: the role played by specific antibodies // Clinics (Sao Paulo). -2007.- Vol. 62, № 6.-P.709-716.

242. Vikerfors T., Grandien M., Johasson M. et al. Detection of an immunoglobulin M response in the elderly for early diagnosis of respiratory syncytial virus infection//J. Clin. Microbiol.- 1988.- V.26.-P. 808-811.

243. Wagner D.K., Muelenaer P., Henderson F.W. et al. Serum immunoglobulin G antibody subclass response to respiratory syncytial virus F and G glycoproteins after first, second, and third infections // J. Clin. Microbiol. -1989 Vol. 27, № 3.-P.589-592.

244. Walsh E.E., Falsey A.R. Age related differences in humoral immune response to respiratory syncytial virus infection in adults // J. Med. Virol.-2004.- Vol.73, № 2.-P.295-299.

245. Walsh E.E., Falsey A.R. Humoral and mucosal immunity in protection from natural respiratory syncytial virus infection in adults // J. Infect. Dis- 2004a-Vol.190, №2.-P.373-378.

246. Walsh E.E., Peterson DR, Falsey AR. Is clinical recognition of respiratory syncytial virus infection in hospitalized elderly and high-risk adults possible? //J. Infect. Dis. -2007.- Vol.195, №7.-P. 1046-1051.

247. Walsh E.E. Respiratory syncytial virus infection in adults // Semin. Respir. Crit. Care. Med. -2011.- Vol. 32, 4.-P. 423-432.

248. Walzl G., Tafuro S., Moss P. et al. Influenza virus lung infection protects from respiratory syncytial virus-induced immunopathology // J. Exp. Med. -2000.- Vol. 192, № 9.-P. 1317-1326.

249. Welliver R.C., Kaul T.N., Putnam T.I. et al. The antibody response to primary and secondary infection with respiratory syncytial virus: kinetics of class-specific responses // J. Pediatr. -1980,- Vol.96, № 5.-P.808-813.

250. Welliver R.C. Sun M., Rinaldo D. et al. Predictive value of respiratory syncytial virus-specific IgE responses for recurrent wheezing following bronchiolitis // J. Pediatr. -1986.-Vol.109, № 5.-P.776-780.

251. Welliver R.C., Duffy L. The relationship of RSV-specific immunoglobulin E antibody responses in infancy, recurrent wheezing, and pulmonary function at age 7-8 years// Pediatr. Pulmonol. -1993.- Vol.15, №1.-P. 19-27.

252. Welliver R.C. The immune response to respiratory syncytial virus infection: friend or foe? // Clin. Rev. Allergy. Immunol. -2008.- Vol.34, №2.-P.163-173.

253. Welliver R.C., Checchia P.A., Bauman J.H. et al. Fatality rates in published reports of RSV hospitalizations among high-risk and otherwise healthy children // Curr. Med. Res. Opin. -2010.- Vol. 26, № 9,- P.2175-2181.

254. West W.H., Lounsbach G.R., Bourgeois C. et al. Biological activity, binding site and affinity of monoclonal antibodies to the fusion protein of respiratory syncytial virus // J. Gen. Virol. -1994,- Vol.75, Pt. 10.- 2813-2819.

255. Whimbey E, Ghosh S. Respiratory syncytial virus infections in immunocompromised adults // Curr. Clin.Top.Infect.Dis.-2000- Vol. 20.-P.232-255.

256. White H., Gray D. Analysis of immunoglobulin (Ig) isotype diversity and IgM/D memory in the response to phenyl-oxazolone// J. Exp. Med 2000-Vol.191, № 12.-P.2209-2219.

257. Wong O.H., Huang F.P., Chiang A.K. Differential responses of cord and adult blood-derived dendritic cells to dying cells// Immunology- 2005-Vol.116, №1.-P. 13-20.

258. Wright P.F., Karron R.A., Belshe R.B. et al. Evaluation of a live, cold-passaged, temperature-sensitive, respiratory syncytial virus vaccine candidate in infancy // J. Infect. Dis. -2000.- Vol.182 , № 5.- P. 1331-1342.

259. Wright M., Piedimonte G. Respiratory syncytial virus prevention and thera-py:past, present, and future// Pediatr. Pulmonol.- 2011.- Vol.46, № 4.-P.324-347.

260. Yamagata S., Tomita K., Sato R. et al. Interleukin-18-deficient mice exhibit diminished chronic inflammation and airway remodelling in ovalbumin-induced asthma model // Clin. Exp. Immunol. -2008.- Vol.154, №3.- P.295-304.

261. Yamashita M., Katakura Y., Shim S.Y. et al. Different individual immune responses elicited by in vitro immunization// Cytotechnology-2002-Vol.40,№ 1-3.-P.161-165.

262. Yamazaki H., Tsutsumi H., Matsuda K. et al. Respiratory syncytial virus group-specific antibody response in nasopharyngeal secretions from infants and children after primary infection // Clin. Diagn. Lab. Immunol. -1994-Vol.l, № 4 P.469-472.

263. Yewdell J.W . Confronting complexity: real-world immunodominance in antiviral CD8+ T cell responses // Immunity.- 2006.- Vol. 25, № 4.- P.533-543.

264. Yoon J.S., Kim H.H., Lee Y. et al. Cytokine induction by respiratory syncytial virus and adenovirus in bronchial epithelial cells// Pediatr. Pulmonol.-2007.- Vol.42,№3.-P.277-282.

265. Yu D.X., Chen Q., Zhang L.L. et al. A field trial of recombinant human interferon alpha-2b for nasal spray to prevent SARS and other respiratory viralinfections //Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. -2005-Vol.19, № 3.-P.216-219.

266. Zamora M.R., Budev M., Rolfe M. et al. RNA interference therapy in lung transplant patients infected with respiratory syncytial virus // Am. J. Respir. Crit. Care. Med.- 201 l.-Vol. 183, № 4.-P.531-538.

267. Zavattoni M., Percivalle E., Cattaneo E. et al. Optimized detection of respiratory viruses in nasopharyngeal secretions // New Microbiol.- 2003.- Vol. 26, № 2.- P.133-140.

268. Zeng R., Li C., Li N. et al. The role of cytokines and chemokines in severe respiratory syncytial virus infection and subsequent asthma // Cytokine. -2011.-Vol. 53, № l.-P. 1-7.

269. Zhang M., Carroll M.C. Natural antibody mediated innate autoimmune response// Mol. Immunol. 2007.- Vol. 44, № 1-3 .-P. 103-110.

270. Zhao X., Liu E., Chen F.P. et al. In vitro and in vivo fitness of respiratory syncytial virus monoclonal antibody escape mutants// J. Virol- 2006-Vol.80, №23.-P. 11651-11657.

271. Zhen Q., Xie Ch., Wu T. et al. Identification of autoantibody clusters that best predict lupus disease activity using glomerular proteome arrays // J. Clin. Invest. 2005.- Vol.115, № 12 .-P. 3428-3439.

272. Zheng Y., Gallucci S., Gaughan J.P. et al. A role for B cell-activating factor of the TNF family in chemically induced autoimmunity // J.Immunol.- 2005.-Vol.175, № 9.-P.6163-6168.

273. Zhou Z.H., Tzioufas A.G., Notkins A.L. Properties and function of polyreactive antibodies and polyreactive antigen-binding B cells // J. Autoimmun-2007- Vol. 29,№ 4.-P.219-228.

274. Zimmer G., Budz L., Herrler G. Proteolytic activation of respiratory syncytial virus fusion protein. Cleavage at two furin consensus sequences // J. Biol. Chem. 2001.- Vol. 276, № 34.- P.31642-3150.

275. Zimmer G., Rohn M., McGregor G.P. et al. Virokinin, a bioactive peptide of the tachykinin family, is released from the fusion protein of bovine respiratory syncytial virus // J. Biol. Chem. -2003.- Vol. 278, № 47.-P.46854-46861.

276. Zinkernagel R.M. On differences between immunity and immunological memory // Curr. Opin. Immunol. 2002 - Vol.14, №4.-P.523-536.

277. Zinkernagel R.M., Hengartner H. Protective 'immunity' by pre-existent neutralizing antibody titers and preactivated T cells but not by so-called 'immunological memory'// Immunol. Rev. -2006 Vol.211 -P.310-319.

Информация о работе

Кривицкая, Вера Зорьевна
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.02.02

Диссертация

Особенности гуморального иммунного ответа у пациентов с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией при различных формах респираторной патологии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы