Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биотехнологические экспресс-методы в микробиологии и вирусологии

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биотехнологические экспресс-методы в микробиологии и вирусологии"

На правах рукописи

МАКАРЯН Эдуард Артемович

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ЭКСПРЕСС-МЕТОДЫ В МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 2 МАЙ 2011

Тверь 2011

4845465

Работа выполнена на кафедре «Основы ветеринарии, акушерства и зоогигиены» Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тверская государственная сельскохозяйственная академия».

Научный консультант: доктор биологических наук,

профессор, академик РАСХН, Дегтярев Владимир Павлович.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Телишевская Любовь Яковлевна (ФГУ ВГНКИ);

доктор биологических наук, профессор Соколова Надежда Львовна (ГУ ВНИИЭВ имени Я. Р. Коваленко Россельхозакадемии);

доктор биологических наук, профессор Прунтова Ольга Владиславовна (ФГУ ВНИИЗЖ).

Ведущая организация: ГУ «Всероссийский научно-

исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии

__ V»—1

Защита диссертации состоится «£> г. в^З часов на

заседании диссертационного совета Д 220.011.01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ) по адресу. Россия, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ВГНКИ.

Автореферат разослан " ^.5"" 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат ветеринарных наук, доцент, заслуженный

ветеринарный врач РФ у//' / / К' зырев Ю.А.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И СЛОВ

BALB/C-линии мышей.

СВА - линии мышей.

199 - питательная среда.

46-47 - почки зеленой мартышки.

CEF - фибробласты куриных эмбрионов.

FBC - слизистая прямой кишки эмбриона коровы.

FBN - слизистая носа эмбриона коровы.

FBTR - слизистая трахеи эмбриона коровы.

FLK - почка эмбриона овцы.

HeLa - карцинома шейки матки.

RPMI - питательная среда.

A.C. - Авторское Свидетельство.

А-2ПТК-стимулятор (ирритант) перитонеальных макрофагов.

АОК - антителообразующие клетки.

БОЕ - бляжкообразующие единицы.

БСА - бычий сывороточный альбумин.

БХ - бумажная хромотография.

В/Б - внутрибрюшинно.

В/М - внутримышечно.

ВА/ВП-ДФХ - вениламин-винилпирралидон в модификации

дифенилхиноном.

ГЛА - гидропизат лактальбумина.

Дикалсид-антибактериальное средство наружного применения.

ДЛЭК - легкие эмбриона коровы (ВИЭВ).

ДМСО - диметилсульфоксид. "

ДСН - додецилсульфат натрия. . .

ДЭ - дрожжевой экстракт.

ДЭАЭ - диэтиламиноэтанол.

ЖКИ - желудочно-кишечная инфекция.

И/Н - интроназально.

Игла - питательная среда.

ИМК - инфекционный мастит крыс.

ИФА - иммуноферментный анализ.

КРС - крупный рогатый скот.

ККС - клеточно- культуральная среда.

ЛЭЦ - левоэритроциклин.

МА-104 - почки обезьян макаки- резус.

МДВК - почка эмбриона коровы.

MEM - питательная среда.

МКВД - Московский кожно-венерологический диспансер. МПА - мясо-пептонный агар. МПБ - мясо-пептонный бульон. П/К - подкожно.

ПААГ - полиакриламидный гель. ПВП - поливинилпирролидон.

«Пинексид» - неспецифический стимулятор микробной активности.

ПМФ - перитонеальные макрофаги.

«Повин-ВМ» - антибактериальный, химиотерапевтический

препарат широкого спектра действия.

ПС - преципитационная смесь.

ПЭ - пневмознтерит.

ПЭГ - лолиэтиленгликоль.

ПЭК - почки эмбриона коровы.

РАЛ - реакция агглютинации латекса.

РАЦ - реакция агглютинации целлюлозы.

РДП - реакция длительной преципитации.

РЕК-реакция Ерне-Каненгема.

РКОА(М) - реакция коагглютинации стафилококка в модификации.

РН - реакция нейтрализации. РИГА - реакция непрямой гемагглютинации. PCB - респираторно-синцитиальный вирус. РСВИ - респираторно-синцитиальная вирусная инфекция. РСК- реакция связывания комплемента. РТММ(Л) - реакция торможения миграции макрофагов (лейкоцитов).

Т-1 - почка теленка. ТБ -тестикулы бычков.

ТГК - трансмиссивный гастроэнтерит кроликов.

«Тризолон» - стимулятор антителогинеза.

Триптоксид - неспецифический стимулятор вирусной активности.

ТЭК-тимус эмбриона коровы.

УФЛ - ультрафиолетэкспонированная сыворотка.

ФБР - фосфатнобуферный раствор.

ФГА - фитогемагглютинин.

ХНЗЛ - хронические неспецифические заболевания легких. ЦКВИ - Центральный кожно-венерологический институт. ЦПД - цитопатическое действие. ЦПЭ - цитопатический эффект.

Л5Э - легкие эмбриона коровы (ВГНКИ).

П5Э - почки эмбриона коровы.

С5Э - селезенка эмбриона коровы.

Т5Э - тимус эмбриона коровы.

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат.

Э/1ЭК - эксплантаты легких эмбриона коровы.

ЭС - экстракционная среда.

ЭФ - электрофорез.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Значительные успехи, достигнутые в области биохимии, вирусологии и микробиологии, создали предпосылки для управления элементарными механизмами жизнедеятельности клетки, что явилось мощным импульсом для развития биотехнологии. Эти достижения поставили биотехнологию на новый уровень, отличающийся возможностью качественно управлять клеточными процессами. Биотехнологический процесс включает ряд этапов: подготовку объекта, его культивирование, выделение, очистку, модификацию и использование продуктов. Многоэтапность процесса обуславливает необходимость привлечения к его осуществлению разных специалистов: молекулярных биологов, биохимиков, вирусологов, микробиологов. Биотехнология позволяет проводить раннюю диагностику инфекционных заболеваний на основе применения препаратов антигенов и антител. Для этого необходимы экспресс-методы инфекционных болезней, позволяющих в течение нескольких минут установить эпизоотический статус. Чтобы повысить эффективность диагностики и лечения в системе организации про-тивоэпизоотических мероприятий необходимо расширить ассортимент высокоэффективных диагностикумов, лечебных препаратов и вакцин, пригодных к использованию в лабораторных и полевых условиях. С помощью новых вакцинных препаратов возможно предупреждение инфекционных болезней. Однако универсальных сред, пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, вирусов и клеток, не существует. Длительное благополучие нашей страны по инфекционным болезням требует усиленного контроля над соблюдением животных в связи с их восприимчивостью.

Значительную проблему в ветеринарии представляют собой респираторные вирусные инфекции и другие заболевания инфек-

ционной природы, которые наносят большой экономический ущерб промышленному животноводству (Дегтярев В.П., 1968; Гу-ненков В.В., 1975, 1977; Воронин Е.С., 1989,1991; Сюрин В.Н., 1998; Белоусова Р.В., Преображенский Н.И., 2001; Петров A.M., 2002; Белоусова Р.В., 2008). Одной из них является респиратор-но-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота - контагиозная болезнь, вызываемая респираторно-синцитиальным вирусом (PCB), относящимся к семейству парамиксовирусов, роду - пнев-мовирусы. Болезнь проявляется поражением нижних отделов респираторного тракта, повышением температуры, затрудненным дыханием, одышкой, истечением из носа, сильным кашлем с последующим развитием бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем.. Сложности культивирования в свою очередь затрудняют получение вирусного сырья в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью для изготовления диагностических препаратов и средств специфической профилактики.

. Остается весьма важной разработка иммунологических средств и методов лабораторной экспресс-диагностики с использованием гомологичного вируса и антител. Поэтому ускоренное культивирование PC-вирусных штаммов «Long» человека и «РС-Б» PC-вируса крупного, рогатого скота, а также инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3,, вирусов, поражающих желудочно-кишечный тракт (вирус диареи, ротавирусы), для изготовления диагностикумов, разработки оптимальных условий репродукции вирусов, бактерий и грибов являются важным, биотехнологическим вопросом. Решение этих проблем позволили бы получить максимальные титры микробных антигенов и активного вируса, необходимых для производства средств лечения и специфической профилактики, приготовления иммуностимулирующих препаратов для получения антисывороток, модификации иммунологических методов исследований.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью работы явилась разработка эффективных методов культивирования возбудителей вирусных, бактериальных и грибных респираторно-ки-шечных инфекций животных и человека, а также способов получения антигенов микроорганизмов (вирусов, бактерий и грибов), обеспечивающих максимальное накопление антигенов для получения диагностических и иммунизирующих препаратов, экспресс-методов диагностики инфекционных болезней.

.. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить чувствительность первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток к штамму «РС-Б» респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота и к штамму «Long» респираторно-синцитиального вируса человека. Разработать оптимальные способы культивирования микроорганизмов: бактерий, грибов, вирусов PC-вируса штаммов «РС-Б» и «Long», вируса диареи (ВД), ПГ-3, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и ротавируса (РВ) крупного рогатого скота.

2. Изучить использование вирусов, выращенных на различных культурах клеток, для изготовления латексных и целлюлозных диагности кумов.

3. Разработать экспресс-методы получения вирусных антигенов для приготовления диагностических и иммунизирующих препаратов. i'

4. Испытать антигенные свойства PC-вируса штаммов «РС-Б» крупного рогатого скота и «Long» человека на лабораторных животных и получить соответствующие антисыворбтки.

5. Разработать ускоренный способ максимального получения микроорганизмов (вирусов, бактерий и грибов) на необогащен-ь1ых средах.

. 6. Модифицировать методы исследования для контроля иммунизирующих свойств разных антигенов PC-вируса in vitro. 1; (

7. Разработать иммуномодулятор для повышения титра антител к PC-вирусу на лабораторных животных при моделировании заболевания.

8. Испытать антимикробные средства с расширенным спектром действия для деконтаминации питательных сред и сывороток крови животных.

9. Разработать препараты на основе антибиотиков, обладающих противовирусным и антимикробным действиями.

10. Приготовить PC-вирусный препарат, обладающий иммунизирующими свойствами.

1.3. Научная новизна. Изучена репродуктивная способность штаммов «РС-Б» и «Long» PC-вируса крупного рогатого скота и человека в первичных, диплоидных, перевиваемых, гомологичных и гетерологичных культурах клеток.

' Впервые разработаны технологичные способы культивирования и получения вирусов, микробов и грибов с использованием стимуляторов роста.

Определены оптимальные условия их накопления в различных культурах клеток и питательных средах для изготовления иммунизирующих препаратов и экспресс-диагностикумов.

Разработан и апробирован метод контроля размножения и учета инфекционной активности вирусов: PC-вируса штаммов «РС-Б» и «Long», вируса диареи (ВД), ПГ-3, инфекционного ри-нотрахеита (ИРТ) и ротавируса (РВ) крупного рогатого скота.

Модифицированы реакция торможения миграции лейкоцитов (макрофагов) и реакция Ерне- Каненгема для иммунологических исследований.

Разработан эффективный метод очистки и выделения антигенов PC-вирусов, ВД, ИРТ, ПГ-3, РВ.

Предложены стимуляторы антителогенеза и перитонеальных макрофагов для лабораторных животных.

Приготовлена лекарственная форма на основе антибиотика для лечения вирусных и микробных заболеваний.

Разработан иммуностимулятор пролонгированного действия с противовирусной и антимикробной активностью.

Создан иммунизирующий PC-вирусный препарат на основе синтезированных сополимеров.

. Научная новизна проведенных исследований подтверждена патентом и 10 авторскими свидетельствами:

Патент РФ на изобретение №22816171 от 27.10.2006 г. «Препарат для профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекций бактериальной и вирусной этиологии с.-х. животных и способ профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекций бактериальной и вирусной этиологии с.-х. животных».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1785659 от 08.09.1992 «Способ определения респираторно-синцитиальной вирусной инфекции».

Авторское свидетельство СССР на изобретение №1596252 от 01.06.1990 г. «Способ определения миграционной способности макрофагов и лейкоцитов».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1719432 от 15.11.1991 г. «Способ выделения вирусных антигенов».

Авторское свидетельство СССР на изобретение №1655983 от 15.02.1991 г. «Способ культивирования респираторно-синци-тиального вируса».

Авторское свидетельство СССР на изобретение №1834288 от 13.10.1992 г. «Способ культивирования микроорганизмов».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1785660 от 08.09.1992 г. «Способ определения респираторно-синцитиальной вирусной инфекции».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1785658 от 08.09.1992 г. «Способ диагностики гриппозной инфекции».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1767517 от 08.06.1992 г. «Стимулятор индукции перитонеальных макрофагов для экспериментального животного».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1561687 от 03.01.1990 г. «Способ для определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1536316 от 15.09.1989 г. «Способ оценки лечения хронического катарального бронхита».

Положительное решение на изобретение по заявке 4678450/ 14(054942) от 13.03.1989 г. «Средство для лечения заболеваний, вызванных вирусной инфекцией».

1.4. Теоретическая и практическая значимость работы. Разработка и внедрение полученных препаратов, соединений и способов позволят решить важные научно-производственные проблемы, имеющие большое хозяйственное и промышленное значение.

Разработан проект лабораторного регламента культивирования респираторно-синцитиальных вирусов КРС и человека: РС-вируса штаммов «РС-Б» и «Long» в культуре клеток для изготовления специфических вирусных антигенов, необходимых для экспресс-диагностики.

Предложен целлюлозный диагностикум для выявления антител к PC-вирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота, овец и коз, который опробован в лабораторных и производственных испытаниях.

Установлен эффект стимуляции репродуктивной активности вирусов с использованием стимулятора «Триптоксид». Неприспособленные к питательным средам и клеткам вирусы в присутствии стимулятора и УФЛ-экспонированной сыворотки позволяют получить за короткий отрезок времени максимальный титр вирусов.

Выявлена неспецифическая активность препарата «Пинек-сид», обладающего стимуляцией роста грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, мицелиальных и дрожже-подобных грибов на необогащенных питательных средах.

Доказана высокая специфичность, простота постановки и учета результатов исследований при использовании экспресс-диагностикумов на основе латексных частиц и порошковой целлюлозы.

Впервые показана возможность получения стабильной композиции диагностикумов в связих применением 10%-ного кальция хлорида, глютар-альдегида и красителя азура II.

Показана эффективность выделения вирусных антигенов с применением преципитационной смеси (ПС) и экстракционной смеси (ЭС).

Концентрация вирусных белков, полученных в результате выделения и очистки вирусов на низкоскоростных центрифугах, во много раз превышает показатели, полученные известными способами. Об этом свидетельствуют результаты электрофореза (ЭФ) и определения белка в вирусных антигенах.

Проведена широкая апробация модифицированной пластиковой чашки Петри для проведения иммунологических, фармакологических, вирусологических и других исследований. Простая постановка камеральных опытов позволила значительно упростить проведение реакций, сократить время и учет результатов в реакции торможения миграции лейкоцитов (макрофагов) (РТМЛ(М), реакции Ерне-Каненгема (РЕК), по бляшкообразую-щим единицам (БОЕ), цитопатическому действию ЦПД и т.д.

Учет репродуктивной активности вирусов стал нагляднее в камере чашки Петри, содержащей взвесь культуры клеток в питательной среде. За короткий отрезок времени (6-10 ч.) ЦПД очевидно по БОЕ.

Средство для стимулированного получения перитонеальных макрофагов стало возможным в связи с использованием «А-2ПТК» (смеси гидроокиси алюминия, пептона, ПГ, трипсина и кальция хлорида). Образовавшиеся восковидные тельца, после в/б введения ирританта, обеспечивают быстрое появление ЛМФ в течение в 100-120 дней. ПМФ, помещенные в камеру модифицированной чашки Петри в присутствии антигенов, антител, лекарственных средств, являются доступной моделью в иммунологических, фармакологических и токсикологических исследованиях.

Применение препарата «Тризолон» лабораторным животным, как стимулятора антителогенеза, за 2-4 часа перед интра-назальным заражением РСВ позволяет получить высокотитраж-ные антисыворотки.

Выявлена лечебная эффективность препарата «Дикалсид» (смесь диклоксациллина, кальция хлорида, трипсина и ДМСО) при интраназальном введении в случаях респираторных заболеваний и разных видов герпес-вирусной инфекции.

Проведенная апробация препарата «Повин-ВМ» при инфекционном мастите крыс, пневмоэнтеритах морских свинок, трансмиссивном гастроэнтерите кроликов, РС-вирусной инфекции показала высокую терапевтическую активность:1 однократное, парентеральное введение обеспечивает курс лечения в связи с пролонгированной формой препарата. «Повин-ВМ» эффективен при вирусных и микробных заболеваниях разной локализации как иммуномодулятор клеточного и гуморального ответов. Показаны положительные результаты деконтаминации питательных сред (среда Эрла, Хенкса, 199, МПБ и МПА). Апробация препарата на свиньях с профилактической целью обеспечила сохран: ность поголовья, увеличение прироста массы тела, экономию вакцин, антисывороток и антибиотиков:

Иммунизирующий РС-вирусный препарат на основе ВА/ВП-ДФХ при интраназальном введении стимулировал клеточный и гуморальный иммунитет. ч > 11

Результаты проведенных исследований нашли отражение в методических рекомендациях: «Профилактика и терапия инфекционных болезней животных», «Интенсификация культивирования микроорганизмов и вирусов», «Экспресс-диагностика инфекционных болезней животных», рассмотренных и одобренных на заседании научно-технического совета ФГОУ ВПО МГАВМиБ (протокол № 2 от 16.10.09 г.) и на заседании секции инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН, (протокол № 4 от 21.10.09 г.), методические рекомендации по применению «Повина-ВМ» - пролонгированного иммуностимулятора однократного применения противомикробного и противовирусного действия в свиноводстве, методические рекомендации по применению набора для выявления респиратор-но-синцитиального вируса и антител к нему в реакции агглютинации целлюлозы, методические рекомендации по применению чашечной камеры в ветеринарной иммунологии, одобренных методическим советом Тверской государственной сельскохозяйственной академии (протокол №10 от 19.04.06 г.).

1.5. Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на межлабораторных заседаниях Государственного научного центра РФ Института иммунологии

Федерального медико-биологического агентства (ГНЦ. «Институт иммунологии» (1987-88), на конференциях молодых;ученых (Саратов, 1987-88), на курсах информации и стажировки врачей-вирусологов по теме: «Современные методы диагностики рота-вирусной инфекции» в Республиканской санэпидстанции Минздрава СССР, в Институте вирусологии им. Ивановского, Академии медицинских наук СССР (Москва, 1988), на Каунасском предприятий по производству бактерийных препаратов (1987), на Всесоюзной научно-практической конференции. МГАВМиБ (1989), на заседании лаборатории инфекционной патологии при муниципальном госпитале г. Осло (Норвегия, 1991), на свинокомплексе «Владимирский» Владимирской области (1990), на племзаводе «Заволжский» Тверской области (2004), на Международных научно-практических конференциях (2006-2009), на внутрикафедральном и межкафедральном совещаниях по апробации диссертационной темы (2010).

1.6. Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 41 работе, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК РФ-6, 1 патенте РФ, 10 авторских свидетельствах, 17 - в сборниках научных конференций, а также в 6 методических рекомендациях.

1.7. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 299 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, данных о практическом использовании научных результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы и 30 страниц приложений. Работа содержит 56 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 235 источников, из них 69 отечественных и 166 зарубежных авторов.

1.8. На защиту выносятся следующие положения:

1. Подобраны культуральные, среды, культуры клеток и тканей, температурные режимы и другие параметры для получения вирусных антигенов в максимальных титрах.

2. Результаты применения неспецифического стимулятора роста вирусов «Триптоксид», позволяющего получать максимальные титры антигенов вирусов за короткий отрезок времени.

3. ПС и ЭС способствуют быстрой очистке и получению обогащенных вирусных белков.

4. Разработан неспецифический стимулятор роста микроорганизмов «Пинексид», который способствует получению макси-

мальных объемов бакмассы в ускоренном режиме культивирования.

5. Иммунизирующие препараты, содержащие PC-вирус на основе ВА/ВП-ДФХ, показали иммунологическую эффективность на лабораторных животных.

6. Использование диагностикумов на основе латекса или порошковой целлюлозы, 10% кальция хлорида, глютаральдегида, сенсибилизированных антигенами или антителами, разведенных ФБР pH 7,2±0,1 и окрашенных азуром II, которые позволяют за 5-10 мин. поставить диагноз. " ;

7. Модифицированная пластиковая чашка Петри создает оптимальные камеральные условия для постановки иммунологических (РТММ(Л), (РЕК), вирусологических (ЦПД, БОЕ) и фармакологических исследований.

8. Препарат «Тризолон» (трипсин с преднизолоном, 9:1), в/м за 2-4 часа до заражения лабораторных животных обеспечивает максимальные титры антител в сыворотке крови.

9. Препарат «Дикалсид» (комплекс антибиотика диклокса-циллина с ДМСО, трипсином и 10% кальция хлоридом) устраняет воспаление инфекционной этиологии при наружном применении за короткий отрезок времени.

10. Препарат «Повин-ВМ» (комплекс антибиотика тетрациклина с трипсином, полимерами и ЭДТА) является эффективным при лечении и профилактике инфекционных заболеваний лабораторных животных, свиней и при деконтаминации питательных сред.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в течение 1986-2010 годов на кафедре «Основы ветеринарии, акушерства и зоогигиены» в Тверской государственной сельскохозяйственной академии. Отдельные эксперименты были проведены в проблемной вирусологической лаборатории ФГОУ ВПО МГАВМиБ и в лаборатории препаративной биохимии антигеновГНЦ «Институт иммунологии» г. Москвы.

В опытах использовали штаммы: PCB крупного рогатого скота «РС-Б», и человеческие штаммы «Long», также ротавирусы, парагриппа 3, аденовирусы, вирус болезни Марека и инфекционного ринотрахеита, гриппа А и В. Вирусы получены

13

в МГАВМиБ и в лаборатории препаративной биохимии антигенов ГНЦ «Институт иммунологии» г. Москвы. Использованные штаммы микроорганизмов получены из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

В работе использовали органные, первичные, диплоидные и перевиваемые культуры клеток различных видов животных и человека. Органная культура клеток - эксплантаты легкого эмбриона коровы (ЭЛЭК); первичные культуры клеток: почки эмбриона коровы {ПЭК), легкие эмбриона коровы (ЛЭК), тимус эмбриона коровы (ТЭК), тестикулы бычков (ТБ) и их субкультуры (ПЭК, ЛЭК, ТБ); диплоидные культуры клеток: легкие эмбриона коровы (Л5Э), почки эмбриона коровы (П5Э), селезенки эмбриона коровы (С5Э), тимуса эмбриона коровы (Т5Э), полученные в лаборатории культур клеток ВГНКИ, легкие эмбриона коровы (ДЛЭК) из лаборатории технологии культур клеток и питательных сред ВИЭВ, карциномы человека (Hela и Нер-2) в ГНЦ «Институте иммунологии».

С целью получения высоких титров урожая PCB разработали и апробировали препарат «Триптоксид» (A.C. № 1655983).

В экспериментах по к/льтивированию PCB, штамм «Long» использованы первичные и перевиваемые культуры клеток: фибробласты легких мышей линии BALB/c, тестикулы бычка, Hela Нер-2. Культуры клеток выращивали с использованием сред Игла и 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота в 1,5 л матрацах и 1 л> бутылях на роллере марки «Rollacell», New Bruswick Scientific, N.Y., USA при 35+37°C 24-72 ч. Дальнейшее культивирование PCB осуществляли при добавлении разработанного нами стимулятора инфекционной активности «Триптоксид»: 1 мл стимулятора на 100 мл культуральной среды одновременно с заражением. PCB очищали по методу Levíne L. и разработанному нами способу.

Разработали способ стимулированного культивирования микроорганизмов с применением препарата «Пинексид» (A.C. № 1834288).

Использованы МПА и МПБ в пробирках, МПБ также в 3 л бутылях, содержащих препарат «Пинексид»: в 1 мл стимулятора на 100 мл питательной среды, а в качестве контроля использовали препарат эритрит-агар. Микроорганизмы инкубировали в посевной концентрации, использовали 3-5х103кл/мл при 37°С. Учет результатов роста осуществляли со времени появления первых колоний,на МПА или замутнения МПБ. Колонии-подсчи-

тывали, а степень замутнения определяли по 3-балльной крестовой системе и стандартам мутности.

Оценку вирусной активности проводили путем титрования вируса в культурах клеток, определяли наибольшее его разведение, вызывающее ЦПЭ в 50% зараженных многослойных культурах клеток.

Для обнаружения вируса в некоторых культурах клеток использовали выявление цитоплазматических телец - включений и образование синцитий, характерных для PC-вируса. Препарат окрашивали гематоксилиэозином (Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1971), подсушивали и монтировали покровное стекло на канадском бальзаме. С этой целью культуры клеток Л5Э, FLK и HeLa выращивали в 50-миллилитровых флаконах. Клеточную суспензию (в обычной посевной концентрации) вносили по 6-7 мл во флаконы. Культуры инкубировали при 37°С. Монослой формировался на 2-3 сутки. На фоне окрашенного неразрушенного монослоя бляшки диаметром 1-2 мм были видны в виде бесцветных пятен. Титр вируса выражали в БОЕ/мл.

2.2. Титрование PC-вируса по бляшкообразующим фокусам в модификации

Использовали приготовленные камеры из пластиковой чашки Петри, предложенные нами для определения инфекционной активности вируса, а также для некоторых иммунологических реакций, представленных в настоящей диссертации: Для приготовления камеры совмещали наружную поверхность чашки с внутренней поверхностью крышки. Имеющийся на чашке ободок не позволял двум поверхностям плотно сомкнуться (A.C. № 1596252). Во внутреннюю поверхность крышки вносили культуру клеток в объеме 0,8 мл в оптимальной посевной концентрации, добавляли 0,2 мл PC-вируса в различных разведениях на куль-туральной среде № 199, или Игла, к которой адаптирована культура клеток, затем аккуратно, чтобы не образовалось пузырьков воздуха, совмещали 2 части чашки и помещали в чашку Петри, диаметром 90-100 мм. Инкубировали при 37°С, 5% С02, 1-3 суток. На 1 сутки можно заметить бляшки на черном фоне в косых лучах света и сосчитать. Титр вируса вычисляли по формуле:

где Т - титр вируса, выраженный числом ФОЕ в мл; А - среднее количество фокусов в камере; Р - разведение вируса.

15

Рис, 1 Макроскопическая картина БОЕ вирусов на клеточно-культуральной среде в модифицированной чашке Петри

Реакции агглютинации

РС-вирусы крупного рогатого скота, человека и другие респи-раторно-кишечные штаммы вирусов использовали для приготовления, антительных и антигенных диагностикумов на основе стафилококка, латёкса и порошковой целлюлозы (носители). Специфические сыворотки или гамма-глобулины применяли для приготовления антительных диагностикумов.

Постановка РА:

1) специфический РС-вирусный диагностикум на основе стафилококка, латекса или целлюлозы;

2) положительная сыворотка или антиген;

3) отрицательная сыворотка или антиген;

4) 0.15 М (ФБР), рН 7,2-7,4 для разведений.

Постановку РА осуществляли на предметных стеклах, выложенных по длине горизонтально, на белом фоне. На каждое предметное стекло наносили по 2 капли ФБР в объеме 0,05 мл. В первую каплю вносили 0,05 мл исследуемой сыворотки, 2-3 раза пипетировали в этой капле и 0,05 мл переносили в следующую каплю. Из последней капли, после пипетирования, 0,05 мл разведения удаляли. В каждую каплю вносили по 0,05 мл того или иного антигенного диагностикума, перемешивали стеклянной палочкой, начиная с большего разведения до меньшего. Через 5-10 минут учитывали результаты РА до максимального разведения образца, в котором отмечали агглютинацию в 2 креста.

2.3. Экспресс-методы диагностики вирусных инфекций в реакции агглютинации целлюлозы

2.3.1. Разработка экспресс-способа диагностики вирусной инфекции с использованием порошковой целлюлозы в реакции агглютинации

На обезжиренное предметное стекло наносили по 0,05 мл исследуемого и контрольного образцов с последующим добавлением антигенного или антительного диагностикума в равном объеме. Положительные результаты РА учитывали через 5-10 минут в крестах по 3-балльной системе. Разработан способ приготовления экспресс-диагностикума на основе порошковой целлюлозы ЭКТЕОЛА, ОН-формы, 0,1-0,25 мкм, для сорбции на ней белка. Целлюлозу растворяли в 10%-ном растворе CaCI2 и глютаральде-гида (7:100:1). Сенсибилизация раствора целлюлозы: 37°С, 1-1,5 ч. на магнитной мешалке в соотношении: 1 мл раствора целлюлозы, 1 мл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) на ФБР, рН 7,2-7,4 и 1 мл сенситина (сыворотка, гаммагло-булины или антиген). Отмывали в ФБР рН 7,2-7,4, вносили 1 мл 1% азура II и 9 мл ФБР, рН 7,2-7,4. Диагностикум готов к применению. РАЦ учитывали в качественной и полуколичественной постановке по трехбалльной крестовой системе через 5-10 мин.

, по 50м.л ФБР (РН 7.2 - Г.4)

Т-r~i i 1

о a lePolo о|6 о[о~

тт

I©© © © 1© ©1© ©I© ©1© ©1

Внесение дмагносучхуч» по 50икп

i 1 1 1 1 i ~ГТ~ i

1© © © © 1© © !© ©иг ©1

4- + +

+ -+ —

Рис.2. Способ постановки реакции агглютинации целлюлозы

3+ - крупнозернистая агглютинация; 2+ - мелкозернистая агглютинация;

1+ - мелкозернистая агглютинация в незначительных количествах; ---кучкование диагностикума в центре или его равномерное распределение в исследуемом образце. Диагностический титр: агглютинация в 2 креста.

2.3.2. Разработка способа приготовления и диагностики с использованием латексного диагностикума

Способ получения антительного латекс-диагностикума: 2 мл РСВ - сыворотки разводили 1 мл ФБР, рН 7,2-7,4, замораживают при -20°С, 45 мин., размораживали 7 мл водно-метаноловой смеси (3:4), 30 мин., 0°С, центрифугировали 3000 д, при 5 мин, осадок ресуспендировали в 2 мл физраствора с 0,04% азида натрия. 3 мл, 8% полистиролового латекса трижды отмывали в дистиллированной воде (3000 д, 5 мин.), осадок латекса ресуспендировали в 3 мл у-глобулиновой фракции, в разведении 1:20 на ФБР, рН 7,8-8,0 с 0,1% сыворотки КРС или БСА и 0,04% азида натрия. Инкубация: 45-60 мин., 37°С, на магнитной мешалке. Дважды центрифуговали на ФБР, рН 7,2-7,4, 3000 д, 5 мин. Осадок ресуспендировали в 9-10 мл 1%-ного раствора азура II на ФБР, рН 7,8-8,0. Способ постановки и учета реакции аналогичен РАЦ.

2.3.3. Разработка бумажной хроматографии для диагностики респираторных заболеваний

Метод разработан нами для определения степени эндоброн-хита и воспаления верхних и нижних отделов дыхательных путей. Использовали синпоровые фильтры диаметром 0,23 мк, Химопол, Прага. Фильтр обрабатывали в буфере, состоящем из 0;02 М триса и 0,19 М глицина рН 8,3-8,6 при 37°С, 30-45 минут, высушивали 20-30 минут при 37°С, наносили на поверхность фильтра по 5 мкл исследуемых образцов носовых или бронхиальных смывов. После высыхания образцов фильтр окрашивали 0,25% водным раствором азура II при +18...+22°С, 30 сек., трижды промывали в дистиллированной воде, высушивали 15-20 мин. при 37°С, изучали хроматограмму. При воспалении образцы окрашивались в темно-синие тона в виде колец. Чем меньше воспалительный процесс,'Де^ менее отчетливы круги. При отсутствии воспаления нет.окрашивания образца.

Реакцию нейтрализации вируса применяли для определения титра нейтрализующей активности гипериммунных и «полевых» сывороток к РС-вирусу. Для постановки РН обычным методом использовали пробирки с культурой клеток или платы. Реакцию ставили общепринятым методом (Сюрин В.Н. и др., 1986).

18

2.4. Экспериментальные животные

Использовали белых мышей линии BALB/c, массой 20-30 г (более 1000 мышей), морских свинок массой 300-350 г (более 400 морских свинок), цыплят месячного возраста для. получения сыворотки крови (более 500 цыплят), кроликов 4,5-3 кг (более 2000 кроликов), поросят 5-8 кг (более 13000 поросят). г

2.5. Исследованные и используемые сыворотки' '

. Испытуемые сыворотки крови в реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ), РСК, РН, ИФА и РИГА получали от.крупного рогатого скота, коз, мышей, морских свинок, кроликов и поросят различных половозрастных групп из некоторых регионов страны. Использовали также образцы сывороток людей, заболевших РСВ-инфекцией и реконвалесцентов.

Для получения . гипериммунных сывороток в лаборатрр.н.ых условиях разработали и применяли препарат «Тризолон». Гипериммунные сыворотки к штаммам «РС-Б» и«Long» PCB получали на морских свинках и кроликах. В работе также, использовали специфические гипериммунные сыворотки телят и лошадей, получаемые путем интраназальной иммунизации РС)В антигенами.

2.6. Разработка способа максимального выделения вирусных антигенов

Для повышения выхода вирусных белков разработали способ (A.C. № 1719432) путем осаждения клеточно-культуральной среды (ККС), экстрагирование антигенов раствором, содержащим хлорид калия, центрифугирования в смеси следующего состава (об.%):ПС- Твин-20-7-13,10% р-р хлорида кальция-10-20, 32-40% р-р ПЭГ (М М. 4000-6000), р-р Хенкса, pH 7,2-7,4- остальное, при постоянном перемешивании 4-5 часов, +4...+10°С, центрифугировали при 4300-5200 д, 35-40 мин. Экстрагирование антигенов из образовавшегося осадка осуществляли ЭС: 0,02% р-р Версена, содержащий додецилсульфат натрия (ДСН) и хлорид калия, г/л: ДСН- 8-12, хлорид калия- 74-75, 1,5-2 часа, 8600-10400 д, 10-15 мин., с последующим удалением надоса-дочной жидкости. Осадок, содержащий вирусные антигены, ре-суспендировали в 1-3 мл среды Игла или 199.

Электрофорез вирусных антигенов осуществляли в присутствии ДСН в полиакриламидном геле (ПААГ) на установке «Муль-

19

тифор 2117» (LKB, Швеция) с применением имидазольного буфера в 10% ПААГ без системы концентрирующего геля.

2.7. Разработка иммунизирующего препарата, содержащего PC-вирусные антигены

Конструирование иммунизирующего РСВ препарата проводили на основе сополимеров виниламиниа - винилпирролидона, модифицированного дифенилхиноном (ВА/ВП-ДФХ). Экспериментальную апробацию проводили на лабораторных животных. Эффективность иммунизирующих препаратов оценивали при определении первичного и вторичного иммунных ответов в сыворотках крови с помощью антигенного диагностикума «ВИРО-ЦЕЛЛ», в РАЦ, РСК, РН, ИФА через 3-5 и 21-25 суток, соответственно. Через 21-25 суток после однократной интраназальной иммунизации мышей заражали 10 ЦПД50/0,05 мл на мышь РСВ штаммов «Long» или «РС-Б». Через 5-9 суток готовили гомоге-нат легочной ткани на растворе Хенкса рН 7,2-7,4 в соотношении: 1 мл раствора..на: 100 мг ткани, однократно дефростирова-ли, центрифугировали, при 3000-6000 об/мин., в супернатанте определяли титр вируса и его антигенов с помощью антительного целлюлозного диагностикума «ВИРОЦЕЛЛ», ЦПД, РСК. Кле-точноопосредованный иммунитет легких определяли в реакции торможения миграции макрофагов в нашей модификации, заключающейся в использовании пластиковых чашек Петри диаметром 35-40 мм, диска из фильтровальной бумаги диаметром 6 мм, на который наносили 10 мкл исследуемого материала, и макроскопического учета результатов реакции через 10-12 часов при инкубации 37°С в растворе Хенкса без и с антигеном (40 мкг/мл вирионной фракции РСВ). Осуществляли реакцию гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) путем введения в объеме 50 мкл нуклеокапсидной фракции /80 мкг/мл/ в плантарную поверхность стопы задней лапки мыши. Через 1824 часа учитывали результаты РГЗТ путем отсечения лапки на уровне скакательного сустава и взвешивания на торсионных весах.

2.8. Иммунизирующий препарат респираторно-синцитиального вируса

Использовали вирус, инакгивированный УФЛ- облучением в тонком слое культуральной жидкости (2 лампы по 30 Вт, на рас-

стоянии 50 см от объекта, 30 мин.). Иммунизацию и заражение мышей BALB/C 16-20 г культурой PCB {5x102 БОЕ/мл) осуществляли интраназально. Иммунизация: 4-кратно, один раз в 7 дней и через 7, 14 и 21 день определяли иммунный ответ. Титры антител к PCB в сыворотке крови определяли в РКОА(М), РАЦ, РН и ИФА. В ИФА вируссодержащую среду наносили на планшет фирмы «Flow», добавляли разные разведения исследуемых сывороток и уровень присоединившихся антител выявляли анти-глобулиновыми кроличьими сыворотками, меченными перокси-дазой (производство ИЙИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи). Клеточный иммунитет оценивали по РТМЛ в модификации Э.А. Макаряна и В.П. Дегтярева.

2.9. Состав для получения перитонеальных макрофагов А-2ПТК

Готовили водные растворы ПВП, хлорида кальция и пепсина (20 г поливинилпирролидона (ПВП) растворяли в 100 мл дистиллированной воды), смешивали все жидкие компоненты состава: гель гидроокиси алюминия (014 мг/мл)-17-23 мл 20% р-р ПВП (ММ 280000-360000), 10% р-р кальция хлорида - 8-12 мл, 10% р-р пепсина 4-6 мл, 0,25% р-р, трипсина 100-120ЕД - до 100 мл (A.C. № 1767517). Стерилизация: «А-2ПТК» - 1,5 атм., 30 мин. Перед в/б введением состав взбалтывали, набирали в стерильный шприц. Мыши - 0,3-0,5 мл/гол., крысы и морские свинки - 0,8-1 мл/гол., кролики - 3-5 мл/гол. Дренаж брюшной полости осуществляли средой - 199 с 10 ЕД/мл гепарина и помещали на 2 часа в пластиковые чашки Петри, диаметром 90100 мм в стерильных условиях, смыв удаляли, а адгезирован-ные ПМФ заливали средой 199 с 20% сыворотки крупного рогатого скота.

2.10. Модификация реакции торможения миграции лейкоцитов

В две группы по 10 чашек Петри диаметром 35-40 мм вносили по 1 мл р-ра Хенкса с 5% сывороткой КРС, в опытную группу - 0,1% фитогемагглютинин (ФГА), в контроле - без. Наносили по 5 мкл цельной, без стабилизатора крови, полученной из ушной вены кролика. После свертывания 2 части чашки Петри совмещали, инкубировали при 37°С, 10-12 ч.

Рис.3. Схема приготовления чашечной камеры для постановки реакции торможения миграции лейкоцитов;

■ I. Пластиковая чашка Петри в разобранном виде.

II. Внесение 1 мл миграционной среды в крышку и нанесение

5 мкл исследуемого образца на наружную поверхность чашки.

III. Наложение фильтровального диска на исследуемый образец.

IV. Чашечная камера в готовом виде.

Учёт результатов: в косых лучах света на черном фоне очерчивали контуры миграции лейкоцитов маркером, переносили на кальку, взвешивали на торсионных весах. Индекс миграции по формуле:

ИМ=-, Б

где ИМ - индекс миграции; А - средний вес кальки в опыте; В -средний вес кальки в контроле.

2.11. Реакция Ерне-Каненгема

Во внутреннюю поверхность крышки от пластиковой чашки Петри диаметром 35-40 мм вносили: 0,6 мл нестабилизиро-ванной крови исследуемого (иммунизированного) животного, 0,2 мл антигена (вирусного или микробного) и 0,2 мл цельного комплемента морской свинки. Полученную смесь пипетиро-

вали несколько раз без образования пузырьков и осторожно совмещали с наружной поверхностью чашки Петри (см. РТММ). Получали равномерную, без пузырьков воздуха камеру со средой, которую помещали на 20-30 минут в термостат при температуре 37°С. Оценку результатов осуществляли невооруженным глазом. Можно использовать увеличительное стекло. В косых лучах света на темном фоне подсчитывали зоны гемолиза, в центре которой находилась антителообра-зующая клетка (АОК):

АОК=^, V

где а - среднее количество АОК; в - разведение исследуемого образца крови; V- объем исследуемого образца крови.

В качестве исследуемого образца можно использовать гомо-генат различных органов иммунизированных лабораторных животных (см. приготовление образца для постановки РТММ), мазки, смывы и т.д.

1 2 , Рис.4. Макроскопическая картина реакции

Ерне-Каненгема: 1 - без АОК, 2-е АОК

2.12. «Повин-ВМ» - препарат для лечения и профилактики респираторных и желудочно-кишечных инфекций вирусной и бактериальной этиологии и средство для инактивации микроорганизмов in vitro

Поставленная цель достигается составом на основе раствора 10%-ного тетрациклина (1-1,5 мл), который дополнительно содержит 20%-ный водный р-р ПЭГ ММ 2000-6000 - 17-20'мл, 20%-ный водный р-р ПВП ММ 280000-360000-2-8 мл, 0,02% коммерч. раствор Версена 17-23 мл, 0,25%-ный р-р трипсина, 100-128 ЕД (Патент РФ №2286171).

2.13. Разработка схемы лечения трансмиссивного гастроэнтерита кроликов (ТГК)

Три группы кроликов массой 2-3 кг, по 10 гол. в каждой группе: первая группа - обработка препаратом «Повин-ВМ», 1-2 мл/гол. однократно на весь курс лечения (5-7 дней), вторая группа -ЛЭЦ, 1-2 мл/гол.,2 раза с интервалом в 3 дня, в течение 5-7 дней. Третья группа - 0,1 г/гол, 2 р./сут., 5-7 дней. Эффективность лечения оценивали по РТМЛ и антителообразующим клеткам (АОК) крови в нашей модификации (А.С. №4456827).

2.14. Разработка схемы лечения «Повином-ВМ» пневмоэнтерита морских свинок

■ В опыте использовали по 25 голов морских свинок в группе и составили 4 группы: первая группа - лечение препаратом «Повин-ВМ»' 0,5-0,8 мл/гол., однократно, в/м, на весь курс лечения (5-7 дней); вторая группа - лечение ЛЭЦ, 1-2 мл/гол, однократно, на курс лечения (5-7 дней), в/м, третья группа - миксогпобулин, 3-5 мл/гол., однократно, в течение 5-7 дней, четвертая группа - тетрациклин, 0,3— 0,5 г/гол., 2 раза в день, в/м, в течение 5-7 дней. Контроль за животными в течение 6-8 месяцев для выявления рецидивов ПЭ.

2.15. Разработка схемы лечения препаратом «Повин-ВМ» инфекционного мастита крыс

В опыты взяты крысы с острым течением заболевания и составлены 3 группы по 20 голов: первая группа - препарат «По-вин-ВМ», 0,5-1 мл/гол., однократно, на весь курс лечения (5-7 дней). Вторая группа - тетрациклин, 0,1-0,2 г/гол., 2 раза в день, 5-7 дней. Третья группа - ЛЭЦ, 1-2 мл/гол., однократно, на весь курс лечения (5-7 дней). Результаты лечения оценивали по выживаемости, периоду наступления клинического выздоровления.

24

2.16. Изучение профилактического применения препарата «Повин-ВМ» в свиноводстве

Препарат применяли поросятам 2-4 мес. однократно, 0,5— 1 мл/гол., за весь период жизни (до сдачи на мясокомбинат в 6-месячном возрасте). Препарат «Повин-ВМ» апробировали в Самарской, Владимирской и Тверской областях, оценивали по падежу за время опыта (6 мес.), по средней живой массе тела в начале опыта (кг), по среднесуточному приросту поросят, отданных на откорм (г), по среднему весу животного при переводе на откорм (кг) и количеству свиней, переданных на откорм (гол).

Схема экспериментальных исследований 25

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Результаты определения чувствительности

культур клеток к штаммам «РС-Б» и «Long» PC-вируса крупного рогатого скота и человека

Важным этапом для изготовления диагностических и лечебных препаратов является подбор наиболее продуктивных клеточных систем, обеспечивающих высокое накопление вируса. Критерием служили время проявления ЦПЭ и накопление вируса. Штамм PC-вируса крупного рогатого скота репродуцировался во всех используемых в опытах культурах клеток: ТЭК, ПЭК, ЛЭК, ТБ и их субкультурах. Наибольший титр PC-вируса отмечен в культурах клеток ЛЭК, ПЭК и ТБ. Апробированы фиброб-ласты легких мышей BALB/C, тестикулы бычка, Hela и Нер-2. Результаты показали, что штамм «Long» размножался во всех видах тканей, но оптимальными оказались фибробласты легких мышей BALB/c (4,00 lg) и тестикулы бычка (3,1 Olg). В ЛЭК, ТБ, ПЭК, ЦПЭ не был отмечен в 11,1%, 16,7% и 19,2% серий, соответственно. Наибольшей чувствительностью обладали культуры клеток Л5Э и П5Э. На 2-4 сутки отмечен ЦПЭ, который сохранялся на протяжении 5 пассажей. Чувствительной к штамму оказалась линия Т-1: на протяжении пяти пассажей хорошо выражен ЦПЭ. Наиболее чувствительной оказалась клеточная линия овечьего происхождения - FLK (3,74±0,12 lg ТЦД50/мл).

3.1.2. Оптимальные условия культивирования штаммов «Long» и «РС-Б» в чувствительных культурах клеток

В исследовании использовали 3-5 сут. культуры клеток ЛЭК и Л5Э и трехсуточную FLK с предварительным 3-кратным отмыванием монослоя от ростовой среды, с 10% сыворотки КРС или телят, множественность заражения 0,1 ТЦД5о/кл., время адсорбции - 1,5 ч., поддерживающая среда - Игла, Игла - MEM, Игла -RPM1 - 1640(2:1), рН 7,4-7,8 в стационарных или роллерных условиях при 37°С. Разные степени разведения РСВ, штамма «Long» на Hela и Нер-2 выявили: с увеличением степени разведения инокулянта РСВ с 10*2 до 10"° увеличиваются титры урожая вируса на Нер-2. При 10"2 высокие титры отмечены на 24 ч. исследования (1,80 lg), в 10"3 - на 12 ч. (1,80 lg) в 10'3 - на 6 ч. изучение (2,10 lg).

3.2. Стимуляция инфекционной активности РС-вируса для получения высоких урожаев при его культивировании

Разработан способ получения максимальных титров PCB без предварительной адаптации вируса и культуры клеток.

Штамм «Long» культивировали на Hela в стационарной и роллерной системах при 37°С, среде 199, 5-10% сыворотки КРС. Сыворотку подвергали 30-минутному облучению УФ-лучами лампой БУФ-30, с расстояния 17-20 см от поверхности сыворотки. Добавили препарат «Триптоксид» в количестве: 5 мл/500 мл клеточно-культуральной среды. Через 1-2 часа вносили в среду однократно дефростированную клеточно-культуральную среду с PCB в титре 3,60-4,50 Ig: 10 мл/100 мл среды. Через 18-24 часа получали урожай. В опытах исследовали также репродуктивную активность ВД, ИРТ и вирус болезни Марека (табл. 1).

1. Влияние препарата «Триптоксид» на урожайность вирусов

Виды вирусов ККС с «Триптоксидом» ККС с ДМСО (контроль)

а б а б

РС-вирус 6,4±0,4 5,53±0,21 74,2±3,50 1,47±0,05

Вирус диареи 6,92±1,21 12,3±0,24 82,3±2,41 2,36±0,04

Инфекционный ринотрахеит 6,82±1,98 8,37±0,29 80,4±2,02 2,64±0,03

Вирус болезни Марека 6,91 ±2,02 17,42±0,52 79,5±1,25 4,21±0,28

Примечание: а - время появления ЦПД вируса (ч), б - количество вирусного белка (мг).

Анализ таблицы показал неоспоримое преимущество препарата «Триптоксид» по сравнению с ДМСО. Титры РС-вируса учитывали в реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ), которые составили 65536±2,48. Это в 16 раз больше по сравнению с 0,25% трипсином и в 64 - по сравнению с ДМСО: РСВ в присутствии препарата «Триптоксид» проявил репродуктивную активность через 6 часов, а с ДМСО - через 74 часа. Количество вирусного белка с препаратом «Триптоксид» было в 4 раза больше по сравнению с контролем. Первые проявления ЦПД с препаратом «Триптоксид» ВД, ИРТ и болезни Марека отмечали череа 7

часов, а в контроле - через 80 часов. Вирусные белки с препаратом «Триптоксид» были в 4-6 раз больше по сравнению с контролем.

3.2.1. Методы контроля и определения инфекционной активности РСВ крупного рогатого скота и человека в культурах клеток

В чашечную камеру вносили 1 мл клеток FLK или Hela (200x103кл/мл), инкубировали 1-2 суток (37°С, 5% С02), заражали вирусом в разных разведениях. Через 1-1,5 ч. адсорбции вирусом вносили среду Игла с 2% фетальной сыворотки, инкубировали в тех же условиях 5 суток и учитывали ФОЕ в косых лучах света на черном фоне. В камеру можно поместить одновременно смесь клеток и вируса. При этом за короткий период времени выявляется РСВ в больших титрах.

3.3. Разработка способа увеличения выхода бакмассы при культивировании микроорганизмов

Увеличение выхода бакмассы нами достигнуто за счет повышения ростостимулирующей активности питательных сред и сокращение времени культивирования (табл. 2).

2. Влияние стимуляторов на скорость размножения микроорганизмов, грибов

Виды микроорганизмов МПА с «Пинексидом» 0,03% эритрит-агар (контроль) ---

а б а б

1 2 3 4 5

Грамотрицательные

B.abortus В А-19 5,0±2,0 44,2±3,8 142,0±2,0 20,2±4,0

B.melitensis 4,8±1,5 50,3±3,0 20,1 ±0,2 , 25,4±1,7

E.coli 1,5±0,5 80,1 ±4,5 2,3±1,0 54,2±2,9

P.multocida 3,0±1,0 58,4±2,1 8,8±0,4 29,2±3,5

Грамположительные

B.anthracis 2,5±1,0 79,3±4,2 5,0±0,4 35,2±3,1

L.monocytogenes 6,0±1,0 70,4±4,8 26,4±0,5 40,0±2,1

S.aureus 3,0±1,5 . 90,4±3,7 18,3±0,4 35,7±2,5

1 2 3 4 5

Дрожжеподобные грибы

С. albicans 36,0±5,0 108,7±10,4 195,3±10,4 75,7±6,2

C.guilliermondii 29,0±2,0 201,4±2,4 201,4±2,4 120,5±7,0

Мицелиальные грибы

A.niger 30,2±3,5 198,4±4,0 200,5±12,5 139,7±5,4

A.fumigatus 25,7±5,0 204,5±5,7 206,9±8,4 135,5±7,2

P.notatum 20±1,0 275,4±4,5 235,0+3,5 162,4±7,0

Примечание: а - время появления первых колоний (час), б -количество бакмассы (мг).

Показана неспецифическая стимуляция роста на плотных питательных средах, которая связана не только с ранним появлением роста, но и с более крупными размерами колоний, обеспечивает повышенный выход бакмассы в 1,5-2 раза. Срок роста микроорганизмов сокращается в 2 и более раз. Примечателен рост P.notatum: время появления первых колоний в 12 раз быстрее (через 20 ч.) на среде с препаратом «Пинексид», чем на МПА с 0,03% эритрит-агаром - через 235 ч. (9,7 суток). Количество бакмассы на МПА с препаратом «Пинексид» в 2 раза больше в сравнении с контролем. C.guilliermondii: на среде с препаратом «Пинексид» рост отмечен через 29 часов, а в контроле через 201,4 часа (8,3 суток), что в 6,8 раза быстрее. Все результаты статистически достоверны (Р<0,01, 0,001). Предложенный нами стимулятор микроорганизмов препарат «Пинексид» обладает неспецифической активностью роста в отношении грампо-ложительных, грамотрицательных микроорганизмов, дрожжевых и мицелиальных грибов.

3.4. Разработка экспресс-метода определения PCB в реакции коагглютинации стафилококка

Для быстрого определения титра PCB в урожае разработали модификацию реакции коагглютинации стафилококка РКОА(м) и способ постановки реакции (табл. 3).

3. Сравнительное определение антигенов РС-вируса

Методы определения Референс РС-вирусы Клеточно-культу-раль-ная среда Осветленная куль-тураль-ная среда Концентрат РС-вируса РС-вирус в градиенте сахарозы Вирионная фракция РС-вируса

РКОА (М) РСК 1:100,±12,0 1:64,0±12,0 1:122,3±6,0 1.55,4±6,9 1,92,2±4,0 1,52,3±2,3 1:251,5*3,8 1:200,0±6,2 1:244,4±7,3 1:120,8±4,5 1:107,0±4,5 1:89,7±6,7

Анализ полученных данных показал, что чувствительность РКОА{М) в 1,1-2,0 раза выше, чем в РСК. Так, при определении титра в референс-образцах РКОА(М) 1,5 раза чувствительнее РСК, а в образцах вируса на разных этапах его очистки - более, чем в 2 раза. Следует отметить простоту предлагаемой модификации, что позволяет одновременно исследовать большое количество образцов.

При изучении чувствительности'и процента ошибки метод РКОА(М) был сопоставлен с методами РСК и ЦПД. Материалом для исследования служили 15 положительных и 10 отрицательных, по данным РСК и ЦПД, проб культуральной среды и смывов полости носа. Во всех случаях констатировано полное совпадение результатов РКОА(М) и ЦПД. С помощью РСК РС-вирус регистрировали в 12 пробах из 15, т.е. эта реакция была менее чувствительна, чем РКОА(М). При исследовании отрицательных образцов ни в одном случае не наблюдалось агглютинации, что свидетельствует о специфичности РКОА(М).

Определяли титр вируса. Окрашивание диагностикума азу-ром II в синий цвет позволило облегчить учет результатов, повысить чувствительность метода в 1,1-2,0 раза по сравнению с РСК и ЦПД.

3.5. Разработка экспресс-метода диагностики РСВ .инфекции и гриппа А в реакции агглютинации целлюлозы

Учитывая кратковременную стабильность стафилококкого носителя для РКОА(М) (3-5 дней), были разработаны целлюлозные диагностикумы, которые использовали для определения 1дА, М, (3, С - реактивного белка, микробных и вирусных инфекций, РСВ - «Вироцелл-антитело» «Вироцелл РС-вирус» и антительный диагностикум для определения гриппа серотипа А-«Вироцел- Г р. А». Было изготовлено 108 микросерий, из которых

51 была использована для выявления антител к РСВ в сыворотке крови КРС, овец и коз, для лабораторных и производственных испытаний. Исследовано более 2000 образцов сывороток (табл. 4).

4. Применение диагностикумов «Вироцелл-РС-вирус» и «Вироцелл-Гр.А» для определения PC-вируса и гриппа А в клеточно-культуральной среде в реакции агглютинации целлюлозы

Тест-система Вид вируса Учет полученных результатов

ЦПД РГА РАЦ

«Вироцелл-РС-вирус» «Вироцелл-Гр.А»

Опытная система РСВ-41 РСВ-76 РСВ-77 1:100 1:1000 1:1000 - 1:512 1:2048 1:2048 -

ГрА-смыв Гр.А-А34 - 1:256 1:512 - 1:2048 1:1024

Контрольная система Гр.В Ленинград - 1:128 1:2 1:2

ПГр-3-303 - 1:32 1:2 1:4

Ad 7-45 Ad 3-33 Ad 6-43 1:1000 1:100 1:1000 - 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2

Представленные в табл. 4 результаты показали высокую специфичность целлюлозных диагностикумов «Вироцелл РС-вирус» и «Вироцелл-Гр.А». Положительная реакция была отмечена только в тех образцах, в которых содержались PC-вирус и грипп А. Ложноположительных и ложноотрицательных реакций в исследуемых образцах не было. Отмечена высокая чувствительность целлюлозных диагностикумов по сравнению с ЦПД и РГА в 2-5 раз. Во внимание можно принять также простой способ исполнения и учета результатов РАЦ, который не требует специальной диагностической квалификации, оборудования, большого количества реактивов и т.д.

3.6. Разработка способа диагностики РСВ в реакции агглютинации латекса

Вирус штамма «Long» получен на перевиваемой ткани Нер-2 с культуральной средой 199, 2-5% фетальной сыворот-

31

ки. До исследования образцы вируса находились при -70°С (табл. 5).

Титрование РС-вируса

образцов референс-РСВ '1 Методы и результаты исследования

РСК Предлагаемый метод /РАП/

1 1:154 1:61

2 1.154 1:128

3 1:128 1 1024

4 1:128 1 1024

5 1:1024 1 2048

6 1:64 1 2048

7 1:128 1 1024

8 1:1024 1 1024

9 1:1024 1 2048

М+т 1:405,33±2,00 1:1159,11±1,96

РАЛ оказалась чувствительнее РСК в 2-3 раза.

3.7. Способ выделения вирусных антигенов

Учитывая сложные способы выделения вирусов в условиях линейных и "ступенчатых градиентов различных реагентов, а также наличия ультрацёнтрифуг и получение предварительно очищенного от клеток вируса, нами разработаны ЭС и ПС с использованием низкоскоростных центрифуг для получения и выделения вирусных антигенов. Выделенные концентраты вирусных белков оценивали в РСК, ЦПД, РАЦ, структуры нуклеокап-сида и вирионов изучали с помощью электронной микроскопии, содержание белка по Лоури. Полученные результаты показали следующее: вирусные белки, полученные по предлагаемому способу', в 3-128 раз превышали по своей активности результаты прототипа. При изучении элекгрофореграмм вирусных концентратов,, полу.^е|нных по прототипу и предлагаемому способу, отмечено, что в последнем случае произошло полное расщепление не только вирионов, но и инфицированных клеток, было выделено больше белковых фракций различного молекулярного веса: 10 - в предлагаемом и 4 фракции - в прототипе. Титры белка в предлагаемом способе в 4-8 раз больше, чем в прототипе. Выход вирусных белков: РСВ-553,2%, в РСК

32

1:18920±17,99; вирус ИРТ - 822,7%, в РСК 39477,2±15,49, ВД -1184,3%, в РСК 1:95755,9±20,05.

3.8. Разработка способа получения специфических гипериммунных сывороток к PCB

Для получения гипериммунных сывороток разработали и апробировали смесь 0.25% раствора трипсина и преднизолона (30 мг), «Тризолон», в соотношении 9:1. Способ заключается в том, что «Тризолон» вводили в/м или п/к за 2-4 ч. перед каждым применением PCB. Дозы «Тризолона», мл/гол.: мыши - 0,3-0,5; морские свинки - 0,8-1,0; кролики - 1,0-2,0. Результаты однократного заражения мышей по иммуностимулирующему влиянию «Тризолона» показали следующее: пик выработки антител к PCB отмечен в течение 20 суток и в 6-7 раз превосходил кон-трольныеТруппы. Так, у'ЬднократйЬ заражёййых мышей в динамике максимальный титр антител составил 1:1024 на 5 сутки, а при многократном - 1:8192 на 28 сутки. Титры у мышей, зараженных PCB без «Тризолона», составили 1:2 и 1:32, соответственно.

3.9. Разработка стимулятора индукции перитонеальных

макрофагов «А-2ПТК» в эксперименте

После однократного внутрибрюшинного введения препарата «А-2ПТК» мышам линии BALB/C., СВА, 0,3-0,5 мл/гол удалось сократить время формирования оптимального количества ПМФ, необходимого для получения монослоя (через 1 сутки), и быстрого его формирования на пластиковых чашках Петри.

3.10. Модификация способа определения миграционной

способности макрофагов и лейкоцитов

Мышей линии BALB/C обоих полов, 12-16 г однократно ин-траназально заражали вирионной фракцией PCB вируса, штамм "Long" (10 ЦПД 50/0,2мл/гол.). Через десять дней после заражения мышей убивали путем эвтаназии, извлекали легкие, гомогенизировали в растворе Хенкса: 100 мг легочной ткани - 0,2 мл раствора. Полученный гомогенат в объеме 4 мкл наносили на диск фильтрованной бумаги диаметром 6 мм. Пропитанный го-могенатом диск вносили в камеру, приготовленную из чашки Петри диаметром 35-40 мм, с раствором Хенкса (1 мл), содержащим раствор вирионной фракции PC - вируса на растворе

33

Хенкса в концентрации 10 мкг/мл. Камеры (по 3 с антигеном и без него) инкубировали при 37°С, 5% С02,Ю ч. Получены следующие данные:

ИМ = ^ = 0,77 19,8

Чем меньше индекс миграции, тем выше уровень клеточного иммунного ответа. Индекс миграции, равный 0,77, указывает на высокий уровень специфической кпеточно-опосредованной реакции при интраназальном заражении мышей вирионной фракцией в дозе 10 ЦПД 50/0,2 мл/гол.

Таким образом, предлагаемый метод позволяет за сравнительно непродолжительный период времени определить достоверный индекс миграции макрофагов и лейкоцитов.

3.11. Разработка метода бумажной хроматографии для определения степени воспаления при РСВ инфекции и С02в помещении

Экспресс-метод позволил определить степень воспаления в носовой полости и в бронхиальных смывах по интенсивности окрашивания хроматограмм в синий цвет. Критерием диагностики является окрашивание нанесенного на фильтр образца в темно-синий цвет при воспалении (I-II степень), и едва заметное окрашивание бледно-голубого цвета при отсутствии воспаления (III степень) (рис. 6).

Р и с 6. Экспресс-диагностика степени эндобронхита в динамике при лечении хронической пневмонии у больной К., 26 лет

е. X вт*я»ю- • 7 'щр

L

Для определения углекислого газа в модификации предварительно готовили индикаторную смесь: к 500 мл дистиллированной воды добавляли 1 каплю 40% нашатырного спирта, взбалтывали в этой смеси полоску фенолфталеиновой индикаторной бумаги длиной 0,5-0,8 см. В два шприца на 10 (20) мл помещали по одной полоске, которые после обработки индикаторной смесью приобретали фиолетовый цвет. Учитывали объем насасываемого и выдуваемого образцов воздуха поршнем шприца до появления желто-зеленой окраски индикаторных бумаг. Учет результатов опыта:

где 0,03 - количество атмосферного С02, в %; Vi - объем уличного воздуха; V2 - объем воздуха помещения.

Упрощенный способ может найти применение в условиях производства (животноводческие фермы, свинокомплексы и т.д.) и в помещениях для людей.

3.12. Результаты определения инфекционной активности PCB в присутствии фармакологических препаратов

Изучали влияние РСВ-вакцин, интерферона и антибиотиков на бляшкообразование PC-вирусом в культуре клеток легких мышей BALB/C в условиях чашечной камеры. Вакцины состояли из нук-леокапсидной и суперкапсидной белковых фракций PCB в' концентрациях 20%, 10%, 1% в сочетании с сополимером винилами-ном- винилпирролидоном в модификации дифенилхиноном.

6. Чувствительность PC-вируса к препаратам на основе вирусных белков по ЦПД

нк-20% НК-10% НК- 1% F-20% F- 10% F-1% СП-НК СП-F СП- н2о НК-Н20 F- Н20'

22,5± 2,8 14,0± 2,0 6,6± 0,7 27,2± 1,0 2,1±-0,3 28,± 6,8 25,0± 6,2 41,6± 3,3 25,0± 4,1 59,5± 4,1 40+ -8,3

Неклеокапсидные белки (НК), суперкапсидные белки(Р-белок) 20%, 10%, 1% на основе сополимеров вениламин- венилпирро-лидона в модификации дифенйлхинойом, сополимер-нуклео-капсид (СП-НК), сополимер с F-белоком (СП-Я-белок), сополи-

35

мер, разведенный дистиллированной водой (СП-Н20), нуклео-капсид, разведенный дистиллированной водой (НК- Н20), F-белок, разведенный дистиллированной водой (F-белок- Н20). Из вакцин оптимальными оказались 10% и 1% на основе нуклёо-капсидных белков, а на основании суперкапсидных (F) - 10%.

3.13. Результаты сравнительной иммунизации мышей разработанными вакцинами против PC-вирусной инфекции

Для иммунизации мышей использовали нуклеокапсидную и су-перкапсидную фракции (1% и 10%) вариантов вакцин против РС-вирусной инфекции. Установлено, что 10%-ный раствор нуклео-капсидной вакцины оказался оптимальным: в 14 раз возросли титры антител в РАЦ на 21 день по сравнению с 7 днем (Р<0,01). Отмечалось минимальное количество PCB в легочной ткани по БОЕ. РТМЛ и РГЗТ указывают на клеточную стимуляцию в иммунном ответе. Среди суперкапсидных вакцин выявлены оптимальные значения при 1% и 10% концентрациях конъюгированного F-белка с ВП/ВА-ДФХ. Уровень антител к PCB на 21 день исследования возрос в 32 и 10 раз, (Р<0,05), соответственно, по сравнению с 7 днем (Р<0,001). Наименьшее количество PCB в легочной ткани отмечено в группе мышей, иммунизированных неразведенной смесью F-белка с ВП/ВА-ДФХ. Отмечены высокие значения РГЗТ.

7. Чувствительность РС-вируса к антибиотикам и интерферону по ЦПД

д А О К См Гм Иф Сыворотка PCB, коммерч. Легочная ткань больной мыши

24± 2,1 26± 2,6 61±13,2 450± 28,1 15± 17,6 65± 23,1 31,5± 8,4 63± 15,9 141± 20,3

Ампиокс - 0,5 г (А), Оксациллина натриевая соль 0,5 г (0), Диклоксациллина натриевая соль 0,25 (Д), Канамицина сульфат, 1 г (К), Стрептомицина сульфат 1 г (См), Гентамицина сульфат, 0,08 г (Гм), Интерферон коммерческий (Иф).

Из апробированных антибиотиков эффективны: диклокса-циллин, который использовали для приготовления препарата наружного применения при герпес-вирусной и PCB инфекциях. В состав этой лекарственной формы вошли 10% CaCI2, 0,25% трипсин и ДМСО, названного «Дикалсид». Он с успехом апроби-

36

рован в Мосгорвендиспансере и институте, стоматологии имени Семашко при разных формах герпеса и др. инфекций.

Представленные в табл. 6 и 7 результаты показали, что из вакцин оптимальными являются НК-10% и НК-1%, из Р-белка - Т-10%, а из антибиотиков - Диклоксациллина Ыа соль, Ампиокс -№ и Интерферон. Препараты на основе вирусных белков и антибиотики в значительной степени подавляли рост РС-вирусов, о чем свидетельствует малое количество бляшек, которые образуются РС-вирусом в условиях клеток легочной ткани. Клиническая апробация «Дикалсида» при герпес-вирусной инфекции, локализованной на лице и половых органах, показала быстрые положительные результаты. В 98% случаях удалось за 1-3 дня устранить местные очаговые реакции (зуд, отечность, гиперемия, образование корочек, регионарный лимфоаденит и т.д.). Дикалсид предупреждал развитие различной бактериальной инфекции.

3.14. «Повин-ВМ» - препарат для лечения и профилактики респираторных и желудочно-кишечных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии животных и способ их профилактики

3.14.1. Результаты лечения трансмиссивного гастроэнтерита кроликов

Сравнительное изучение лечебного действия «Повина-ВМ» в сопоставлении с левоэритроциклином (1 мл/гол) (ЛЭЦ) и тетрациклином (0,1 г/гол., в объеме 1 мл). Кратность применения и сроки лечения составили: для 1гр. («Повин-ВМ») - однократное применение на весь курс лечения (5-7 дн.); для 2 гр. (ЛЭЦ) - 2 раза с интервалом в 3 дня, в течение 5-7 дней в группах по 30 гол а для 3 гр. (Тетрациклин) - 2 раза в сутки 5-7 дней (табл. 8).

8. Результаты иммунобиологических исследований

Препараты для лечения Результаты лечения

№№ выздоровело пало иммунологический статус

Ф- голов % голов % АОК РТМЛ РСИПЛ

1 Повин-ВМ 29 96,6 1 3,3 58,24±5,4 0,61±0,02 98,2±2,3

2 ЛЭЦ 19 63,3 11 36,6 32,15±2,7 0,79±0,04 74,3±2,8

3 Тетрациклин 2 6,6 28 93,3 21,93±3,6 0,81 ±0,02 65,8±4,0

Примечание. Наблюдение за клинически выздоровевшими (рекон-валесцентами) составило 6-8 мес.

В группе, санированной «Повином-ВМ», не отмечено случаев рецидивов заболевания; в группе, леченной ЛЭЦ, частота рецидивов - 42,2% (Р<0,001). Количество АОК в случаях применения «Повина-ВМ» превышало таковые (Р<0,01), в группе ЛЭЦ в 1,8, (Р<0,01) в группе с Тетрациклином - в 2,6 раз (Р<0,001). Показатели РТМЛ свидетельствуют о том, что индекс торможения к 0,1% фитогемагглютинину был в 1,2 раза активнее при лечении «Повином-ВМ» по сравнению с ЛЭЦ и в 1,3 раза в 3 группе, что указывает на клеточную стимуляцию предлагаемого препарата. Результаты по РСИПЛ также представляют факт клеточной стимуляции «Повином-ВМ». При этом % прилипших лейкоцитов при лечении «Повином-ВМ» был в 1,3 раза выше по. сравнению с ЛЭЦ и в 1,5 - по сравнению с Тетрациклином.. \ .... .

3.14.2. Результаты лечебной эффективности «Повина-ВМ» при пневмоэнтеритах у морских свинок

Анализ больных ПЭ и павших морских свинок позволил выявить вирусы парагриппа, РС-вируса, гриппа серотипа А, аденовирусы, пастереллы, кишечную палочку и хламидии.

В опытах использовали по 25 голов морских свинок, составивших 4 группы: 1 гр. - лечение «Повином-ВМ», 1,0-1,5 мл/гол, однократно, внутримышечно, на весь курс лечения (5-7 дней); 2 гр. - лечение ЛЭЦ, 1-2 мл/гол., однократно на курс лечения, внутримышечно; 3 гр. - внутримышечное введение миксоглобу-лина, 1-2 мл/гол., однократно в течение 5-7 дней; 4 гр. - применение Тетрациклина, 0,1-0,3 г/гол., два раза в день, внутримышечно, в течение 5-7 дней (табл. 9).

9. Лечение пневмоэнтеритов у морских свинок

№№ гр. Препараты Результаты лечения

клиническое выздоровление - падеж

голов % голов %

1 Повин-ВМ / 24 ;96,00 1. 4,00

2 ЛЭЦ 13 52,00 12 48,00

3 Миксоглобулин 12 48,00 13 г„ 52,00

4 Тетрациклин 11 44,00 14 56,00

Терапевтический эффект при лечении «Повином-ВМ» -96,0%, что в 1,8 раза превышает данные по лечению во 2 гр., и в 2,2 раза, - в 3 и 4 гр. (Р<0,01).

" -. 38

В 1 гр. появление лечебного действия препарата было отмечено спустя 6-10 часов, тогда как во 2, 3 и 4 группах он имел место спустя 12-15 и 16-22 часа, соответственно.

3.14.3 Результаты лечебной эффективности «Повина-ВМ» при инфекционном мастите крыс

Цель настоящего эксперимента - показать терапевтический эффект «Повина-ВМ» при ИМК. В опыте были взяты крысы с острым течением заболевания. Из подобранных животных были составлены 3 группы по 20 голов: 1 гр. - лечение «Повином-ВМ» в дозе 1-2 мл/гол, однократно, внутримышечно, на весь курс лечения (5-7 дней); 2 гр. - внутримышечное введение Тетрациклина в дозе 0,1-0,2 г на инъекцию, в день два раза, в течение 5-7 дней; 3 гр. - внутримышечное введение ЛЭЦ в дозе 12 мл/гол., однократно (табл. 10).

10. Лечение инфекционного мастита крыс

№№ Ф- Препараты Результаты лечения

клиническое выздоровление падеж

голов % голов %

1 Повин-ВМ 19 95,00 1 5,00

2 Тетрациклин 10 50,00 10 50,00

3 ЛЭЦ 12 60,00 8 40,00

Анализ результатов табл. 10 показал, что в 95% случаев отмечена лечебная эффективность «Повина-ВМ», что в 1,0-1,2 раза превышает результаты терапии при лечении Тетрациклином и ЛЭЦ. В 10 раз сократился падеж при лечении «Повином-ВМ» (Р<0,001). Период наступления клинического улучшения после однократного применения препаратов составил 6-8 часов в 1 гр. и 12-14 часов во 2 гр. В 3 гр. эффект лечения отсутствовал.

• Полученные результаты лечения инфекционных болезней лабораторных животных позволили разработать способы лечения и профилактики болезней у сельскохозяйственных животных.

3.14.4. Профилактическое применение «Повина-ВМ» на свиньях

«Повин-ВМ» применяли поросятам однократно на весь период откорма (6 мес.) внутримышечно 0,5-1,0 мл/гол., в возрасте от 4 до 40 дней. Контрольной группе препарат не применяли, т.к. использовали традиционные вакцины, антисыворотки и антибиотики. Сформировали 2 группы поросят, находившихся в одинаковых условиях кормления и содержания. В возрасте 40 дней животные опытной группы были вакцинированы против классической чумы свиней вакциной КС производства «Нарвак», а контрольная группа животных другими вакцинами, применяемыми в свиноводстве. Одновременно с вакцинацией КС животным опытной группы произвели внутримышечное введение «Повина-ВМ» 0,5 мл в области шеи за ухом, с противоположной стороны по отношению к месту введения вакцины (табл. 11).

11. Результаты испытания «Повина-ВМ» на свиньях с профилактической целью

Показатели «Повин-ВМ» Контроль

Доза (мл/гол) 0,5-1,0 0,5-2,0

Кратность введения препарата 1 -

Вакцины, антисыворотки, антибиотики - 4 и более раз

Количество голов в начале опыта 1149 1201

Количество голов на конец опыта 1108 884

Сохранность(%) 96,4 73,6

Среднесуточный прирост на откорме (г.) 622,75 422,88

Средняя масса тела при сдаче на мясокомбинат (кг) 126,71 120,63

Падеж во время откорма и вынужденный убой 41 (3,6%) 317(26,4%) ... '

Примечание. Р<0,01; 0,05.

Анализ полученных результатов по апробации «Повина-ВМ» выявил преимущества в сравнении с контрольной группой: пре-

парат применяли однократно в течение всего периода выращивания и сдачи на мясокомбинат. Отмечен высокий процент выживаемости свиней в опытной группе (96,4%), среднесуточный прирост на откорме (на 47,3% больше), вес поголовья при сдаче на мясо (на 5% больше). Очевиден низкий уровень падежа и вынужденного убоя животных при введении «Повина-ВМ» (3,6%) по сравнению с контролем (26,4%). «Повин-ВМ» позволил предупредить вирусные и микробные заболевания. Отрицательный фармакологический эффект от применения «Повина-ВМ» не отмечен как в момент отъема, так и в возрасте 2-4 месяцев. Более того, животные, получившие «Повин-ВМ», были гораздо активнее.

3.15. «Повин-ВМ» - средство для инактивации микроорганизмов

«Повин-ВМ» апробирован для деконтаминации культураль-ных и микробных сред. Эксперименты по противовирусному эффекту «Повина-ВМ» проведены с PCB, ротавирусом и вирусом диареи на культурах клеток Hela, Нер-2, ВНК-21, ПЭК ПЭС. В 95-98% «Повин-ВМ» блокировал формирование БОЕ. Бактерицидное влияние «Повина-ВМ» проведено на примерах изучения роста Е. coli, Str. Spp., Enterobacterium Spp., Salm. Cholerea suis, на МПБ и МПА. Определение количества колоний и степени мутности показало, что число колоний с применением «Повина-ВМ» составило 15,2±0,4, тетрациклина -195,7±20,3, а без добавок - 1000,2±12,8 из 1500 микробных клеток, посеянных на МПА. На МПА, содержащих «Повин-ВМ», отсутствие роста отмечено в 99,2±0,1%, Тетрациклин - в 85,7±2,7% случаев.

о

X о 3 В) 3

■а о s и Ш О Й о

м s

CD X X

(Г

S s о

3

ir

4 m

X

s

s<

4. ВЫВОДЫ

1. Подобраны органные, первичнотрипсинизированные клетки и их субкультуры, диплоидные и перевиваемые клеточные культуры к PC-вирусам штаммов «РС-Б» КРС и «Long» человека (диплоидные культуры клеток легкого (Л5Э) и почки эмбриона коровы (П5Э), перевиваемая линия почки эмбриона овцы (FLK), первичнотрипси-низированная культура клеток легкого коровы (ЛЭК), фибробласты легких мышей BALB/c, тестикул бычка. Наибольший титр РС-вируса штамма «РС-Б» определен в культурах клеток ЛЭК, ПЭК и ТБ. Для штамма «Long» оптимальными оказались фибробласты легких мышей BALB/c (4,00lg) и тестикулы бычка (3,10lg).

2. Установлен оптимальный режим получения РС-вируса штаммов «РС-Б» и «Long»: возраст клеточных культур (ЛЭК, ПЭК, ТБ, HeLa и фибробласты легких мышей).

3. Обработка вирусов преципитационной и экстракционной средами позволили выделить максимальное количество обогащенной фракции вирусных белков: PC-вирус- выход вирусных белков- 553,2%, в титрах РСК 1:18920,2±17,99; вирус ИРТ -822,7%; в титрах РСК 39477,2±15,49; вирус диареи 1184,3%; в титрах РСК 1:95755,9±20,05.

4. Разработана система стимулированного роста вирусов с применением облученной ультрафиолетом сыворотки КРС (2%) и препарата «Триптоксид»—смеси 0,25% раствора трипсина с диметилсульфоксидом в соотношении 9:1. Внесение «Трипток-сида» в количестве 1% в суспензионную клеточно-культу-ральную среду, одновременно или за 1-2 часа до инокуляции вирусами, позволило получить обогащенный вирусный антиген без предварительной адаптации к условиям культивирования вирусов в клеточно-культуральных средах. Титры PC-вируса с «Триптоксидом» составили 1:65536+20,48.

5. Установлен широкий спектр микробной ростстимулирую-щей активности смеси питуитрина (маммофизина, гифотоцйна, окситоцина) с диметилсульфоксидом в соотношении 9:1 («Пинексид»). Отмечено раннее появление роста и наибольшее накопление бакмассы грамотрицательных, грамположительных бактерий, грибов, дрожжей за короткий промежуток времени. С. albicans: «Пинексид» - рост через 36±5,0 ч., бакмасса-108,7±10,4 мг, с эритрит-агаром - 195,3±10,4 ч., бакмасса-75,7±6,2 мг P. notatum: «Пинексид» - рост через 20±1,0 ч., бак-масса 275,4±4,5 мг, с эритрит-агаром - 235,0±3,5 ч., бакмасса-162,4±7,0 мг.

6. Изучены иммуностимулирующие свойства смеси 0,25% раствора трипсина с преднизолоном в соотношении 9:1 («Тризо-jiOH»). Парентеральное (внутримышечное, подкожное) применение («Тризолона») за 2-4 часа до 1-4-кратного интраназального заражения PC-вирусом белых мышей и морских свинок позволило получить гипериммунные сыворотки в титрах 1:512-1:1024.

7. Разработан состав «А-2ПТК» на полимерной основе для стимуляции получения перитонеальных макрофагов (ПМФ) в максимальном количестве за короткий промежуток времени. ПМФ ;можно использовать как модельные клетки для изучения фармакологического, иммунологического и других свойств препаратов. Через сутки & группе лабораторных животных, получивших «А-2ПТК», количество ПМФ было в 2,7 раза больше в сравнении с прототипом и в 3,6 раза по сравнению с контролем. Максимальный пик индукции наблюдался на 5 сутки. Количество ПМФ в группе, получившей «А-2ПТК», составило 100%, в прототипе - 95%, а в контроле - 29%. Процент жизнеспособных ПМФ в группе с «А-2ПТК» составил 95,8±0,72%, в прототипе -71,5±0,2%, в контроле - 65,2±0,17%.

8. Предложена модификация чашки Петри для приготовления камеры, которая обеспечивает возможность проследить торможение миграции иммунокомпетентных клеток и выработки антител лимфоцитами. В используемой модели камеры наблюдается торможение миграции макрофагов и лейкоцитов, выделяющих при контакте с антигенами интерлейкины - маркеры чувствительности к антигенам, как результат положительной реакции на заболевание. Камера обеспечивает демонстративность, достоверность и повторяемость исследований. Применение модифицированной пластиковой чашки Петри позволило ускорить рост и дифференциальную диагностику возбудителей заболеваний по бляшкооборазующим единицам и другим проявлениям цитОПатического действия инфектантов.

9. Вирусные антигены штаммов «РС-Б» и «Long» PC-вируса испШйзованы для изготовления целлюлозных диагностикумов «Вироцёлл-вирус» и «Вироцелл-антитело» в реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ). РАЦ осуществляли в качественной и в полуколичественной постановке на предметных стеклах. Лабораторные, клинические и производственные испытания антительных и антигеных диагностикумов показывают их высокую специфичность, активность, воспроизводимость результатов, достоверность и простоту исполнения.

10. Модифицированные реакции агглютинации латекса на предметных стеклах обеспечивают быстрый и простой учет результатов по гриппу серотипов А и Б, PC-вируса штаммов «РС-Б» и «Long», вируса диареи (ВД), ПГ-3, инфекционного ринотра-хеита (ИРТ) и ротавируса (РВ) крупного рогатого скота.

11. Экспресс-методы диагностики воспаления респираторного тракта человека и животных с использованием целлюлозных фильтров в хроматографическом исследовании позволило определить клинику и дифференциацию хронических неспецифических заболеваний легких. Окраска образцов смывов в темно-синий цвет указывает на обострение заболевания, а отсутствие окрашивания - на клиническое выздоровление. Модификация определения содержания СОг в воздухе помещения позволила быстро контролировать его концентрацию в помещениях для животных и человека.

12. Композиция антибиотика Диклоксациллина с 10% кальция хлорида, диметилсульфоксидом и трипсином - «Дикалсид», является эффективным препаратом для лечения РС-вирусной, микробной и других видов инфекции. Местное и интраназальное применение «Дикалсида» быстро устраняло клинику заболевания PC-вирусной инфекции (гнойно-катаральные выделения из носа, кашель и другие) и герпес-вирусной инфекции (зуд, припу-хание, покраснение, воспаление на коже губ, глаз, лимфоузлов). «Дикалсид» в 95% случаях эффективен при герпесе глаз, носа, губ, герпеса Зостер: прекратились зуд, жжение, покраснение, разрешились очаги, исчезли пузырьки, отечность, боли, уменьшились регионарные лимфоузлы за 1-3 суток. Количество РСВ по БОЕ в легочной ткани у санированных «Дикалсидом» мышей составило 24±2,1, интерфероном - 31,5±8,4, коммерческой РСВ сывороткой - 63±15,9.

13. Препарат «Повин-ВМ» - лекарственная форма, содержащая тетрациклин, сополимеры, трипсин, раствор Версен, обладает широким спектром антибактериальной и противовирусной активности при деконтаминации питательных и культуральных сред. В 95-98% «Повин-ВМ» блокировал формирование БОЕ PC-вируса, ротавируса, парагриппа-3. Подавление микробного роста с применением ««Повина-ВМ»»; 15,2±0,4 (Р<0,01), Тетрациклина - 195,7+20,3 (Р<0,01). Показана иммуностимулирующая, антибактериальная и противовирусная активность «Повина-ВМ» при парентеральном применении.

45

14. Интраназальное введение иммунизирующего комплекса ядерных (нуклеокапсидных) и оболочечных (суперкапсидных) фракций бел.ков PC-вируса штамма «Long» на основе винила-мин-вилилпирролидона-дифенилхинона способствовало выработке антител и обеспечило клеточную защиту иммунизированных мышей.. Отмечено преимущество нуклеокапсидных препаратов: в 14 раз возросли титры антител в парных сыворотках (7 и 21 день), данные PTMJ1 и РГЗТ указывали на клеточную стимуляцию иммунного ответа. ч

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций, рассмотренных и одобренных на заседании научно-технического совета ФГОУ ВПО МГАВМиБ (протокол №2 от 16.10:09 г.) и на заседании секции инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол №4 от 21.10.09 г.): «Экспресс-диагностика инфекционных болезней животных», «Интенсификация культивирования микроорганизмов и вирусов», «Профилактика и терапия инфекционных болезней животных».

2. Методические рекомендации: «Применение набора по выявлению РСВ и антител к ,нему в РАЦ», «Применение чашечной камеры в ветеринарной иммунологии», «Применение «Повина-ВМ» - пролонгированного иммуностимулятора однократного применения противомикробного и противовирусного действия» (протокол №8 от 14.04.2006 г.). - Тверь, 2006.

3. Разработаны проекты нормативных документов для диагностики PC-вирусной инфекции.

4. Результаты исследований по биотехнологическим экспресс-методам в микробиологии и вирусологии внедрены (с 1988 по 2010 гг.):

< • В Витебском медицинском институте имени Дружбы народов 8.07.1988-26.09.1989 г.

• В Литовской республиканской ветеринарной лаборатории, 18.05.1988 г.

• В республиканской ветеринарной лаборатории г. Таллинн, 28.06.1988 г.

• В ВНИВИП, 18.06.1990 г.

• В лаборатории молекулярной биологии Института биохимии и физиологии АН Кирг. ССР, 04.04.1990 г.

• В Ошской областной ветеринарной лаборатории, 21.07.1989 г.

• В республиканской ветеринарной лаборатории Кирг. ССР, 27.07.1989 г.

• В Куйбывшевской области, совхоз «Алексеевскй», 27.01.1992 г.

• Во Владимирской области, свинокомплекс «Владимирский», 14.10.1990 г.

• В -Тверской области, свинокомплекс «Верхневолжский», 10.05.2005 г.

• МГАВМиБ имени К.И. Скрябина в научно-исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии от 10.01.2010 г.

. • В Тверской государственной сельскохозяйственной академии, 19.04.2006 г.

• ГНЦ «Институт иммунологии».

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Для сокращения времени роста грамположительных, гра-мотрицательных микроорганизмов, дрожжевых и мицелиальных грибов, а также получения обогащенной бакмассы, в питательные среды рекомендуется вносить «Пинексид»: 1 мл. стимулятора на 100 мл питательной среды.

2. Для ускорения появления и обогащения урожаев ДНК- и РНК-содержащих вирусов необходимо вносить «Триптоксид» в клеточ-но-культуральную среду: 1 мл стимулятора на 100 мл среды.

3. Ускоренный и упрощенный способ очистки обогащенных белковых фракций вирусов для получения антигенов можно использовать для приготовления диагностикумов, иммунизирующих препаратов и получения антисывороток.

4. Для экспресс-диагностики в лаборатории и на производстве целесообразно использовать латексные и целлюлозные ди-агностикумы, способы их приготовления и постановки реакции.

5. Для получения высокотитражных сывороток, за 2-4 часа до заражения вирусами, в/м или п/к рекомендуется вводить лабораторным животным «Тризолон» - смесь 0,25% р-ра трипсина сДМСО, 9:1.

6. Предлагается контролировать показатели иммунологической резистентности с помощью модифицированной чашки Петри в РТМЛ(М) и РЕК.

. 7. Камеральную (модифицированную) чашку Петри можно использовать для определения колититра, колииндекса, токси-

47

кологческих исследований препаратов на культурах клеток или тканей, бактериальной загрязненности молока и т.д.

8. Для профилактики респираторных заболеваний предлагается проводить исследование воздуха на содержание С02, а носовые или бронхиальные смывы - методом бумажной хроматографии.

9. Для лечения инфекционных заболеваний лабораторных Животных при наружной локализации рекомендуется применять нанесение «Дикалсида».

10. Однократное в/м или п/к использование препарата «По-вин-ВМ» с профилактический целью в свиноводстве позволяет получить максимальный прирост массы тела, сохранность поголовья и сокращение времени откорма для сдачи на мясокомбинат. «Ловин-ВМ» можно также применять для лечения инфекционных заболеваний лабораторных животных.

7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Макарян, Э.А. Лечебная эффективность и методы применения левоэритроциклина при пастереллезе кроликов: Автореф. дисс....канд. вет наук / Э.А. Макарян. - М., 1984, 16 с.

2. Макарян, Э.А. Левоэритроциклин при пастереллезе кроликов / Э.А. Макарян // Труды ВИЭВ,-1984. - Т. 60. - С. 120-123.

3. Макарян, Э.А. Левоэритроциклин и неспецифическая резистентность кроликов / Э.А. Макарян // Бюлл. ВИЭВ, 1984. - В.54. - С.64-67.

4. Макарян, Э.А. Левоэритроциклин при пастереллезе кроликов / Э.А. Макарян, А.Х. Саркисов //Ветеринария, № 11,1984.-С.37-38.

5. Макарян, Э.А. Иммунологические экспресс-методы исследования у больных ХНЗЛ / Э.А. Макарян II Конф. молодых ученых Института иммунологии. - М., 1987.

6. Макарян, Э.А. Сравнительное изучение антигенов PC-вируса и антител соответствующей специфичности / Э.А. Макарян II Тез. докл. конф. молодых ученых. - Саратов, 1987.

7. Макарян, Э.А. Способ получения высоких урожаев PC-вируса / Э.А. Макарян // Тез. докл. X Мечниковской конференции молодых ученых-медиков, 15-17сентярбя, 1987.

8. Макарян, Э.А. Способ определения PC-вирусной инфекции /Э.А, Макарян, В.А. Дроженников, С.Г. Кремлев //Авторское свидетельство № 4253082. -1987.

9. Макарян, Э.А. Способ оценки лечения хронического катарального бронхита / В.А. Дроженников, И.И. Дыханов, О.Г. Оглоблина, A.M. Борисов, В.А. Ляшенков, Э.А. Макарян II Авторское свидетельство №4330938.-1987.

10. Макарян, Э.А. Способ определения PC-вирусной инфекции / Э.А. Макарян, В.А. Дроженников, И.В. Красильников II Авторское свидетельство № 4253592. -1987.

11. Макарян, Э.А. Способ диагностики гриппозной инфекции / Э.А. Макарян, В.А. Дроженников, Е.А. Белякова // Авторское свидетельство № 4252494. -1987.

12. Макарян, Э.А. Экспресс-диагностика хронических неспецифических заболеваний легких / Э.А. Макарян, И. В. Дыханов, Е.А. Белякова, В.А. Дроженников II Конф. молодых ученых института иммунологии МЗ СССР. - М., 24 декабря, 1987. - С. 28-30.

13. Макарян, Э.А. Способ определения миграционной способности макрофагов и лейкоцитов / Э.А. Макарян, И.В. Красильников, В.А. Дроженников // Авторское свидетельство № 4456827. - 1988.

14. Макарян, Э.А. Экспресс-диагностика PC-вирусной инфекции у больных при ХНЗЛ / Э.А. Макарян // Конф. молодых ученых Института иммунологии. - М., 26 декабря 1988.-1 С.

15. Макарян, Э.А. Йкспресс-меТбд "" 'определения 1 РС-вируса I Э.А. Макарян, И.В. Красильников, В.А. Дроженников II Вопросы вирусологии, № 4, 1989. - С. 458-459. "J "

16. Макарян, Э.А. Экспресс-диатостика PC-вирусной инфекции у крупного рогатого скота / Э.А. Макарян, И.Я. Строгонова, И.В. Красильников // Интенсификация с.-х. производства в условиях радикальной экономической реформы: Тезисы, докл. - М.: МВА. - 1989. - С. 173-174.

17. Макарян, Э.А. Способ культивирования PC-вируса I Э.А. Макарян, И.В. Красильников // Авторское свидетельство № 4651255. - 1989.

18. Макарян, Э.А. Экспресс-диагностика хронических неспецифических заболеваний легких / Э.А. Макарян, В.А. Дроженников // Лабораторное дело, № 10, 1990.-С.16-19.

19. Макарян, Э.А. Способ выделения вирусных антигенов / Э.А. Макарян //Авторское свидетельство №4825888. - 1990.

20. Макарян, Э.А. Способ культивирования микроорганизмов / Э.А. Макарян, В.Е. Маликов //Авторское свидетельство № 4800510. -1990.

21. Макарян, Э.А. Стимулятор индукции перитонеальных макрофагов для экспериментального животного / Э.А. Макарян //Авторское свидетельство № 4838673. - 1990.

22. Макарян, Э.А. Состав для определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях / Э.А. Макарян, И.В. Красильников, В.А. Дроженников // Описание. Авторское свидетельство № 4406971. -1990.

23. Макарян, Э.А. Патент РФ на изобретение №2286171 Препарат для профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии с.-х. животных и способ профилактики и лечения респираторных желудочно-кишечных инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии с.-х. животных / Э.А. Макарян // Патент РФ: заявка № 2005110473 с приоритетом от 12.04.2005.

24. Макарян, Э.А. «Повин-ВМ» - иммуностимулятор пролонгированного действия лротивомикробной и противовирусной активности / Э.А. Макарян, Г.Н. Прокофьева, И:Е. Вельмискин // Научное обеспечение национального проекта. Развитие АПК: Сб. науч. трудов. - Тверь: ТГСХА. - 2006. - С. 227-229.

25. Макарян, Э.А. Модификация определения инфекционной активности вирусов / В.П. Дегтярев, Э.А. Макарян // Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения: Сб. науч. тр. - Дубровицы: ВИЖ, 2008. - С. 24.

26. Макарян, ЭЛ. Экспресс-методы определения вирусов / В.П. Дегтярев, Э.А. Макарян // Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения: Сб. науч. трудов. - Дубровицы: ВИЖ. - 2008. - С, 23.

27. Макарян, Э.А. Способ ускоренного роста бруцелл в диагностике и производстве биопрепаратов / Э.А. Макарян, В.П. Дегтярев // Достижения супрамолекуляной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии: Тезисы докладов. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2008. - С. 93.

28. Макарян, Э.А. Сравнительная динамика роста патогенных мик-роогранизмов при культивировании / В.П. Дегтярев, Э.А. Макарян // Достижения супрамолекуляной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии: Тезисы докладов. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2008. - С. 94.

29. Макарян, Э.А. Ускоренная технология производства бактериальной массы бруцелл / В.П. Дегтярев, Э.А. Макарян II Достижения супрамолекуляной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии: Тезисы докладов. - М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2008. - С. 95.

30. Макарян, Э.А. Влияние стимуляторов на выход биомассы микроорганизмов и их биохимические свойства / Э.А. Макарян, Г.Н. Прокофьева // Проблемы аграрной науки и образования: Сб. научных трудов. - Тверь: Агросфера, 2008. - С.167-170.

. 31. Макарян, Э.А. Эффективный способ стимуляции роста микроорганизмов / Э.А. Макарян, Г.Н. Прокофьева II Проблемы аграрной науки и образования: Сб. науч. трудов. - Тверь: Агросфера, 2008. - С. 170-172.

32. Макарян, Э.А. Определение углекислого газа в модификации по методу Прохорова / Э.А. Макарян, Г.Н. Прокофьева, Э.К. Ромашевский // Актуальные проблемы аграрного образования современной России и на постсоветском пространстве: Сб. науч. трудов. - Тверь: Агросфера,

2008. - С. 61-63.

33. Макарян, Э.А. Модификация определения инфекционной активности вирусов / Э.А. Макарян, В.П. Дегтярев // Ветеринарный врач, № 1,

2009. - С. 26-28.

34. Макарян, Э.А. Средство для лечения заболеваний, вызываемых вирусной инфекцией / Э.А. Макарян и др. // Решение государственной научно-технической экспертизы изобретений № 4678450/14 (054942) -. Приоритет от 13.03.89 г.

35. Макарян, Э.А. Профилактика и терапия инфекционных болезней животных: Методические реком. / В.П. Дегтярев, Э.А. Макарян. - М., 2009. - 22 С.

36. Макарян, Э.А. Экспресс-диагностика инфекционных болезней животных: Методические реком. / Э.А. Макарян, В.П. Дегтярев. - М,, 2009. - 22 С.

• 37. Макарян, Э.А. Интенсификация культивирования микроорганизмов и вирусов: Методические реком. / В.П. Дегтярев, Э.А. Макарян. -М„ 2009. -8 С.

38. Макарян, Э.А. Биотехнологические экспресс-методы в эпизоотологии: Методические реком. / В.П. Дегтярев, Э.А. Макарян. - Тверь: Агросфера, 2009. - 30 С.

39. Макарян, Э.А. Методические рекомендации по применению «По-вина - ВМ» пролонгированного иммуностимулятора однократного применения противомикробного и противовирусного действия в свиноводстве / Э.А. Макарян, Г.Н. Прокофьева. - Тверь: Агросфера. - 2006. -12 С.

40. Макарян, Э.А. Методические рекомендации по применению набора для выявления респираторно-синцитиального вируса и антител к нему в реакции агглютинации целлюлозы / Э.А. Макарян, Г.Н. Прокофьева. - Тверь: Агросфера. - 2006. - 6 С.

41. Макарян, Э.А. Методические рекомендации по применению чашечной камеры в ветеринарной иммунологии / Э.А. Макарян, Г.Н. Прокофьева. - Тверь: Агросфера, 2006. - 8 С.

Сдано в производство 25.02.2011 г. Ризограф Тираж 100 Заказ №48 Издательско-полиграфический отдел ФГОУ ВПО МГАВМиБ 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Макарян, Эдуард Артемович

СПИСОСК СОКРАЩЕНИЙ И СЛОВ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Инфекционные заболевания животных, распространение и клинические признаки

1.2 Репликация, антигенные свойства и размножение микроорганизмов

1.3 Патогенность возбудителей инфекционных заболеваний в эксперименте

1.4 Культуральные свойства микроорганизмов

1.5 Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний.

1.6 Лечение инфекционных заболеваний

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы

2.2 Микроорганизмы

2.3 Культуры клеток, среды и растворы

2.4 Культивирование диплоидных культур клеток

2.5 Культивирование микробов

2.6 Культивирование вируса в культуре клеток—; 2.7 Приготовление препаратов для изучения цитоморфологии

2.8 Титрование вируса методом бляшек

2.9 Титрование вируса по бляшкообразующим единицам в модификации—59 ' 2.10 Реакция агглютинации-;

2.11 Качественная реакция агглютинации целлюлозы

2.12 Способ приготовления латексного диагностикума

2.13 Бумажная хромотография

2.14 Реакция нейтрализации вируса

2.15 Экспериментальные животные

2.16 Сыворотки

2.17 Способ максимального выделения вирусных антигенов

2.18 Электорофез вирусных антигенов

2.19 Иммунизирующий препарат

2.20 Состав для получения перитонеальных макрофагов А-2ПТК

2.21 «Повин-ВМ»- препарат для лечения и профилактики респираторных желудочно-кишечных инфекций вирусной и бактериальной этиологии и. средство для инактивации микроорганизмов in vitro

2.22 Разработка схемы лечения трансмиссивного гастроэнтерита кроликов

2.23 Реакция торможения миграции лейкоцитов

2.24 Реакция Ерне-Каненгема

2.25 Разработка схемы лечения «Повином-ВМ» пневмоэнтерита у морских свинок

2.26 Разработка схемы лечения «Повином-ВМ» инфекционного мастита крыс

2.27 Разработка профилактического применения «Повина-ВМ» в свиноводстве

2.28 Иммунизирующий препарат PC-вируса

2.29 Статистическия обработка данных

З.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Изучение спектра чувствительности, культур клеток к штаммам «РС-Б» и «Long»

3.1.1 Подбор тканей для культивирования респиратоно-синцитиального вируса штамма «Long»

3.1.2 Изучение чувствительности первичных культур клеток к респираторно-синцитиальному вирусу штамма «РС-Б»

3.1.3 Чувствительность диплоидных культур клеток к штамму «РС-Б»

3.1.4 Чувствительность перевиваемых клеточных линей к штамму «РС-Б»—

3.2 Оптимизация условий культивирования штаммов «РС-Б» и «Long» в чувствительных культурах клеток---—ВО

3.2.1 Влияние концентрации респиратоно-синцитиального вируса штамма «Long» на урожайность--87'

3.2.2 Определение максимального урожая респираторно-синцитиального1 вируса штамма «Long» в динамике

3.2.3 Адаптация штамма «РС-Б» к культуре клеток

3.2.4 Стимуляция инфекционной активности респираторно-синцитиального вируса для получения высоких урожаев

3.3 Увеличение выхода бакмассы при культивировании микроорганизмов—

3.4 Методы контроля размножения и определения инфекционной активности респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота и человека в культурах клеток

3.4.1 Определение инфекционной активности вируса по бляшкообразующим единицам

3.5 Разработка экспресс-методов определения респираторно-синцитиального вируса и гриппа

3.5.1 Активность антигенов респираторно-синцитиального вируса, накопленных в разных культурах клеток для приготовления целлюлозных диагностику-мов-1

3.5.2 Титры респираторно-синцитиального вируса в реакции коагглютинации-стафилококка в модификации

3.5.3 Разработка экспресс-метода в диагностике респираторно-синцитиального вируса в реакции агглютинации целлюлозы

3.5.4 Способ определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях в реакции агглютинации целлюлозы

3.6 Способ экспресс-диагностики PC- вируса в реакции агглютинации латекса

3.6.1. Экспресс-диагностика гриппозной инфекции в реакции агглютинации латекса

3.7 Способ выделения вирусных антигенов--—

3.8 Получение гипериммунных сывороток к РС-вирусу

3.8.1 Стимулированное получение гипериммунных сывороток к РС-вирусу

3.8.2 Определение титра антител к,РС-вирусу в сыворотке крови мышей в реакции коагглютинации стафилококка в модификации

3.8.3 Титры антител к РС-вирусу после интраназального заражения морских свинок методом реакции коагглютинации стафилококка в модификации—

3.9 Реакция гиперчувствительности замедленного типа на мышах, зараженных РС- вирусом-:

3.10 Стимулятор индукции перетониальных макрофагов в эксперименте—

3.11 Способ определения миграционной активности макрофагов и лейкоцитов

3.12 Метод бумажной хромотографии для определения степени воспаления Респираторного тракта при РС-вирусной инфекции и определение содержания СОг в модификации

3.13 Определение инфекционной активности РС-вируса при разработке противовирусного препарата

3.13.1 Средство для инактивации микроорганизмов

3.13.2 Изучение ростовой активности культуральных сред и сывороток, содержащих деконтамирующие средства

3.13.3 Препарат для профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных заболеваний бактериальной и вирусной этиологии сельскохозяйственных животных и способ профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекционных заболеваний, бактериальной и вирусной этиологии сельско-хозяйственных животных

3.13.3.1 Лечение трансмиссивного гастроэнтерита кроликов

3.13.3.2 Лечебная эффективность при пневмоэнтеритах у морских свинок

3.13.3.3 Лечение инфекционного мастита крыс

3.13.3.4 Применение «Повина-ВМ» на свиньях

3.14 Иммунизирующие препараты респираторно-синцитиального вируса—

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биотехнологические экспресс-методы в микробиологии и вирусологии"

1.1.Актуальность темы. Значительные успехи, достигнутые в области биохимии, вирусологии и> микробиологии, создали предпосылки для- управления элементарными механизмами жизнедеятельности клетки, что явилось мощным, импульсом для развития биотехнологии. Эти достижения^ поставили биотехнологию * на- новый уровень, качественно отличающийся» возможностью качественно управлять клеточными процессами. Биотехнологический процесс включает в себя ряд этапов: подготовку объекта, его культивирование, выделение, очистку, модификацию и использование продуктов. Многоэтапность процесса обуславливает необходимость привлечение к его осуществлению разных специалистов: молекулярных биологов, биохимиков, вирусологов, микробиологов. Биотехнология позволяет проводить раннюю диагностику инфекционных заболеваний на основе применению препаратов антигенов и антител. Для этого необходимы экспресс - методы инфекционных болезней, позволяющих в течение нескольких минут установить эпизоотический статус. Чтобы повысить эффективность диагностики и лечения в системе организации противоэпизоотических мероприятий необходимо расширить ассортимент высокоэффективных диагно-стикумов, лечебных препаратов и вакцин, пригодных к использованию в лабораторных и полевых условиях. С помощью новых вакцинных препаратов возможно предупреждение инфекционных болезней. Однако универсальных сред, пригодных для роста всех без исключения ^микроорганизмов, вирусов «и клеток не существует. Длительное благополучие нашей страны по инфекционным болезням требует усиленного контроля над соблюдением животных в связи с их восприимчивостью.

Значительную проблему в ветеринарии представляют собой респираторные вирусные инфекции и другие заболевания инфекционной природы, которые наносят большой экономический ущерб промышленному животноводству (Дегтярев В.П. 1968; Гуненков В.В. 1975, 1977; Воронин Е.С. 1989Д991; Сюрин В.Н. 1998; Белоусова Р.В., Преображенский Н.И., 2001; Петров A.M., 2002; Белоусова Р.В. 2008).0дной из них является респираторно-синцитиальная,инфекция крупного рогатого скота - контагиозная, болезнь, вызываемая респиратор-но-синцитиальным вирусом (РСВ), относящимся к семейству парамиксовиру-сов, роду - пневмовирусы. Болезнь проявляется поражением нижних отделов* респираторного1 тракта, повышением .температуры, затрудненным дыханием; одышкой, истечением из носа, сильным кашлем с последующим развитием' бронхопневмоний и интерстициальных эмфизем. Сложности культивирования, в свою очередь, затрудняют получение вирусного сырья в достаточном количестве и с необходимой инфекционной активностью для изготовления диагностических препаратов и средств специфической профилактики.

Остается весьма важной разработка иммунологических средств и методов лабораторной экспресс-диагностики с использованием гомологичного вируса и антител. Поэтому, ускоренное культивирование PC-вирусных штаммов «Long» человека и «РС-Б» PC-вируса крупного рогатого скота, а также инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусов, поражающих желудочно-кишечный тракт (вирус диареи, ротавирусы) для изготовления' диагностикумов, разработки оптимальных условий репродукции вирусов, бактерий и грибов являются важным биотехнологическим вопросом. Решение этих проблем позволили бы получить максимальные титры микробных антигенов и активного вируса, необходимых для производства средств лечения и специфической профилактики, приготовления иммуностимулирующих препаратов для получения* антисывороток, модификации иммунологических методов исследований.

1.2.Цель и задачи исследований. Целью работы явилась разработка эффективных методов культивирования возбудителей вирусных, бактериальных и грибных респираторно-кишечных инфекций животных и человека, а также способов получения антигенов микроорганизмов (вирусов, бактерий и грибов), обеспечивающих максимальное накопление антигенов для получения диагностических и иммунизирующих препаратов, экспресс-методов диагностики инфекционных болезней.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить чувствительность первичных, диплоидных и перевиваемых культур клеток к штамму «РС-Б» респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота и к штамму «Long» респираторно-синцитиального вируса человека. Разработать оптимальные способы культивирования микроорганизмов: бактерий, грибов, вирусов PC-вируса штаммов «РС-Б» и «Long», вируса диареи (ВД), ПГ-3, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и ротавируса (РВ) крупного рогатого скота;

2. Изучить использование вирусов, выращенных на различных культурах клеток, для изготовления латексных и целлюлозных диагностикумов;

3. Разработать экспресс-методы получения вирусных антигенов для приготовления диагностических и иммунизирующих препаратов;

4. Испытать антигенные свойства PC-вируса штаммов «РС-Б» крупного рогатого скота и «Long» человека на лабораторных животных и получить соответствующие антисыворотки;

5. Разработать ускоренный способ максимального получения микроорганизмов (вирусов, бактерий и грибов) на необогащенных средах;

6. Модифицировать методы исследования для контроля иммунизирующих свойств разных антигенов PC-вируса in vitro;

7. Разработать иммуномодулятор для повышения титра антител к РС-вирусу на лабораторных животных при моделировании заболевания;

8. Испытать антимикробные средства с расширенным спектром действия для деконтаминации питательных сред и сывороток крови животных;

9. Разработать препараты на основе антибиотиков, обладающие противовирусным и антимикробным действиями;

10.Приготовить PC-вирусный препарат, обладающий иммунизирующими свойствами.

1.3.Научная новизна. Изучена репродуктивная способность штаммов «РС-Б» и «Long» PC-вируса крупного рогатого скота и человека в первичных, диплоидных, перевиваемых, гомологичных и гетерологичных культурах клеток.

Впервые разработаны технологичные способы культивирования и получения вирусов, микробов и грибов с использованием стимуляторов роста.

Определены оптимальные условия их накопления в различных культурах клеток и питательных средах, для изготовления иммунизирующих препаратов и экспресс-диагносикумов.

Разработан и апробирован метод контроля размножения и учета инфекционной активности вирусов: PC-вируса штаммов «РС-Б» и «Long», вируса диареи (ВД), ПГ-3, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и ротавируса (РВ) крупного рогатого скота

Модифицированы реакция торможения миграции лейкоцитов (макрофагов) ш реакция Ерне- Каненгема для иммунологических исследований.

Разработан эффективный метод очистки и выделения антигенов РС-вирусов, ВД, ИРТ, ПГ-3.

Предложены стимуляторы антителогенеза и перитонеальных макрофагов для лабораторных животных.

Приготовлена лекарственная форма на основе антибиотика для лечения вирусных и микробных заболеваний.

Разработан иммуностимулятор пролонгированного действия с противовирусной и антимикробной активностью.

Создан иммунизирующий PC-вирусный препарат на основе синтезированных сополимеров.

Научная новизна проведенных исследований подтверждена патентом и 10 авторскими свидетельствами:

Патент РФ на изобретение №22816171 от 27.10.2006г. «Препарат для профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекций бактериальной и вирусной этиологии с/х животных и способ профилактики и лечения респираторных и желудочно-кишечных инфекций бактериальной и вирусной этиологии с-х животных»

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1785659 от 08.09.1992 «Способ определения респираторно-синцитиальной вирусной инфекции».

Авторское свидетельство СССР на изобретение №1596252 от 01.06.1990г. «Способ определения миграционной способности макрофагов и лейкоцитов».

Авторское свидетельство СССР на изобретение N2 1719432 от 15.11.1991г. «Способ выделения вирусных антигенов».

Авторское свидетельство СССР на изобретение №1655983 от 15.02.1991г. «Способ культивирования респираторно-синцитиального вируса».

Авторское свидетельство СССР на изобретение №1834288 от 13.10.1992г. «Способ культивирования микроорганизмов».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1785660 от 08.09.1992г. «Способ определения респираторно-синцитиальной вирусной инфекции».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1785658 от 08.09.1992г. «Способ диагностики гриппозной инфекции».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1767517 от 08.06.1992г. «Стимулятор индукции перитонеальных макрофагов для экспериментального животного».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1561687 от 03.01.1990г. «Способ для определения иммуноглобулинов в биологических жидкостях».

Авторское свидетельство СССР на изобретение № 1536316 от 15.09.1989 «Способ оценки лечения хронического катарального бронхита».

Положительное решение на изобретение по заявке 4678450/14(054942) от 13.03.1989г. «Средство для лечения заболеваний, вызванных вирусной инфекцией».

1.4.Теоретическая и практическая значимость работы. Разработка и внедрение полученных препаратов, соединений и способов позволят решить важные научно-производственные проблемы, имеющие большое хозяйственное и промышленное значение.

Разработан проект лабораторного регламента культивирования респиратор-но-синцитиальных вирусов КРС и человека: PC-вируса штаммов «РС-Б» и «Long» в культуре- клеток для изготовления, специфических вирусных антигенов, необходимых для экспресс-диагностики.

Предложен целлюлозный диагностикум для выявления антител к РС-вирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота, овец и коз, который опробован в лабораторных и производственных испытаниях.

Установлен эффект стимуляции репродуктивной активности вирусов с использованием стимулятора «Триптоксид». Неприспособленные к питательным средам и клеткам вирусы в присутствии стимулятора и УФЛ-экспонированной сыворотки позволяют получить за короткий отрезок времени максимальный' титр вирусов.

Выявлена неспецифическая активность препарата «Пинексид», обладающего стимуляцией роста грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, мицелиальных и дрожжеподобных грибов на необогащенных питательных средах.

Доказана высокая специфичность, простота постановки и учета результатов исследований при использовании экспресс-диагностикумов на основе латекс-ных частиц и порошковой целлюлозы.

Впервые показана возможность получения стабильной композиции диагно-стикумов в связи с применением 10%-го кальция хлорида, глютар-альдегида и красителя азура II

Показана эффективность выделения вирусных антигенов с применением преципитационной смеси (ПС) и экстракционной смеси (ЭС).

Концентрация вирусных белков, полученных в результате выделения и очистки вирусов на низкоскоростных центрифугах, во много раз превышает показатели, полученные известными способами. Об этом свидетельствуют результаты электрофореза (ЭФ) и определения белка в вирусных антигенах.

Проведена широкая апробация модифицированной пластиковой чашки Петри для проведения иммунологических, фармакологических, вирусологических и других исследований. Простая постановка камеральных опытов позволила значительно упростить проведение реакций, сократить время и учет результатов в реакции торможения миграции лейкоцитов (макрофагов) (РТМЛ(М), реакции Ерне-Каненгема (РЕК), по бляшкообразующим единицам (БОЕ), цито-патическому действию ЦПД и т. д.

Учет репродуктивной активности вирусов стал нагляднее в камере чашки Петри, содержащей взвесь культуры клеток в питательной среде. За короткий отрезок времени (6-1 Оч.) ЦПД очевидно по БОЕ.

Средство для стимулированного получения перитонеальных макрофагов стало возможным в связи с использованием «А-2ПТК» (смеси гидроокиси алюминия, пептона, ПГ, трипсина, и кальция хлорида). Образовавшиеся восковидные тельца после в/б введения ирританта обеспечивают быстрое появление ПМФ в течении в 100-120 дней. ПМФ, помещенные в камеру модифицированной чашки Петри в присутствии антигенов, антител, лекарственных средств, являются доступной моделью в иммунологических, фармакологических и токсикологических исследованиях.

Применение препарата «Тризолон» лабораторным животным, как стимулятора антителогенеза, за 2-4 часа перед интраназальным заражением PCB позволяет получить высокотитражные антисыворотки.

Выявлена лечебная эффективность препарата «Дикалсид» (смесь диклокса-циллина, кальция хлорида, трипсина и ДМСО) при интраназальном введении в случаях респираторных заболеваниях и разных видов герпес-вирусной инфекции.

Проведенная апробация препарата «Повин-ВМ» при инфекционном мастите крыс, пневмоэнтеритах морских свинок, трансмиссивном гастроэнтерите кроликов, РС-вирусиой инфекции показала высокую терапевтическую активность: однократное, парентеральное введение обеспечивает курс лечения в связи с пролонгированной формой препарата. «Повин-ВМ» эффективен при вирусных и. микробных заболеваниях разной локализации- как иммуномодулятор клеточного и гуморального ответов. Показаны положительные результаты деконтами-нации питательных сред (среда Эрла, Хенкса1, 199, МПБ и МПА). Апробация препарата на свиньях с профилактической целью обеспечила сохранность поголовья, увеличение прироста массы тела, экономию вакцин, антисывороток и антибиотиков.

Иммунизирующий РС-вирусный препарат на основе ВА/ВП-ДФХ при ин-траназальном введении стимулировал клеточный и гуморальный иммунитет.

Результаты проведенных исследований нашли отражение в методических рекомендациях: «Профилактика и терапия инфекционных болезней животных»,ч «Интенсификация культивирования микроорганизмов и вирусов», «Экспресс-диагностика инфекционных болезней животных», рассмотренных и одобренных на заседании научно-технического совета ФГОУ ВПО МГАВМиБ (протокол № 2 от 16.10.09г.) и на заседании секции инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН, (протокол № 4 от 21.10.09г.), методические рекомендации по применению «Повипа-ВМ»- пролонгированного иммуностимулятора однократного применения противомикробного и противовирусного действия в свиноводстве, методические рекомендации по применению набора для выявления респираторно-синцитиального вируса и антител к нему в реакции агглютинации целлюлозы, методические рекомендации по применению чашечной камеры в ветеринарной иммунологии, одобренных методическим советом Тверской государственной сельскохозяйственной академии (протокол №10 от 19.04.06г.).

1.5.Апробация работы. Основные -положения диссертации были доложены и обсуждены на межлабораторных заседаниях Государственного научного центра РФ Института иммунологии Федерального медико-биологического агентства (ГНЦ «Институт иммунологии» (1987-88), на конференциях молодых ученых (Саратов, 1987-88), на курсах информации' и стажировки врачей-вирусологов по теме: «Современные методы диагностики» ротавирусной инфекции» в Республиканской санэпидстанции Минздрава СССР, в* Институте вирусологии им. Ивановского, Академии медицинских наук СССР (Москва, 1988); на Каунасском предприятии по производству бактерийных препаратов (1987), на Всесоюзной научно-практической конференции МГАВМиБ (1989), на заседании лаборатории инфекционной патологии при муниципальном госпитале г. Осло (Норвегия, 1991), на свинокомплексе «Владимирский» Владимирской области (1990), на племзаводе «Заволжский»,Тверской области (2004), на Международных научно-практических конференциях (2006-2009), на внутрикафед-ральном и. межкафедральном совещаниях по апробации диссертационной темы (2010).

1.6.Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 41 работе, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК РФ-б, 1 патенте РФ, 10 авторских свидетельствах, 17 - в сборниках научных конференций, а также в 6 методических рекомендациях.

1.7.Сгруктура и объем работы. Диссертация изложена на 299 страницах1 машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, данных о практическом использовании научных результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы и 30 страниц приложений. Работа содержит 56 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 235 источников, из них 69 отечественных и 166 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Макарян, Эдуард Артемович

5. ВЫВОДЫ

1. Подобраны органные, первично-трипсинизированные клетки и их субкультуры, диплоидные и- перевиваемые клеточные культуры к РС-вирусам штаммов «РС-Б» КРС и «Long» человека (диплоидные культуры клеток легкого (Л5Э) и почки, эмбриона коровы (П5Э), перевиваемая линия почки эмбриона овцы (FLK), первично-трипсинизированная культура клеток легкого * коровы (ЛЭК), фибробласты легких мышей BALB/c, тестикул бычка. Наибольший титр PC-вируса штамма «РС-Б» определен в культурах клеток ЛЭК, ПЭК и ТБ. Для штамма «Long» оптимальными оказались фибробласты легких мышей BALB/c (4,001g) и тестикулы бычка (3,10 lg).

2. Установлен оптимальный режим получения PC-вируса штаммов «РС-Б» и «Long»: возраст клеточных культур (ЛЭК, ПЭК, ТБ, HeLa и фибробласты легких мышей).

3. Обработка вирусов преципитационной и экстракционной средами позволили выделить максимальное количество обогащенной-фракции вирусных белков: PC-вирус- выход вирусных белков- 553,2%, в титрах РСК 1:18920,2±17,99; вирус ИРТ-822,7%; в титрах РСК 39477,2± 15,49; вирус диареи- 1184,3%; в титрах РСК 1:95755,9±20,05. :

4. Разработана система стимулированного роста вирусов с применением облученной ультрафиолетом сыворотки КРС (2%) и препарата «Трипоксид»- смеси 0,25% раствора трипсина с диметилсульфоксидом в соотношении 9:1. Внесение «Триптоксида» в- количестве 1% в суспензионную клеточно-культуральную среду, одновременно или за 1-2 часа до инокуляции вирусами, позволило получить обогащенный вирусный антиген без предварительной адаптации к условиям культивирования вирусов в клеточно-культуральных средах. Титры PC-вируса с «Триптоксидом» составили 1:65536±2,48.

5. Установлен широкий спектр микробной ростстимулирующей активности смеси питуитрина (маммофизина, гифотоцина, окситоцина) с диметилсульфоксидом в соотношении 9:1 («Пинексид»). Отмечено раннее появление роста и наибольшее накопления бакмассы грамотрицательных, грамположительных бактерий, грибов, дрожжей за короткий промежуток времени. С.albicans: «Пи-нексид»- рост через 36±5,0ч.; бакмасса-108,7±10,4мг.; с эритрит-агаром-195,3±10,4ч.; бакмасса-75,7±6,2мг. P.notatum: «Пинексид»- рост через 20±1,0ч.; бакмасса 275,4±4,5мг.; с эритрит-агаром - 235,0±3,5ч.; бакмасса- 162,4±7,0мг.

6: Изучены иммуностимулирующие свойства смеси 0,25% раствора»трипсина с преднизолоном в соотношении 9: Г «Тризолон». Парентеральное-(внутримышечное, подкожное) применение «Тризолона» за 2-4 часа до 1-4-х кратного интраназального заражения PC-вирусом белых мышей* и морских свинок позволило получить гипериммунные сыворотки в титрах 1:512-1:1024.

7. Разработан состав А-2ПТК на полимерной основе для стимуляции получения перитонеальных макрофагов (ПМФ) в максимальном количестве за короткий промежуток времени. ПМФ можно использовать как модельные клетки для изучения фармакологического, иммунологического и других свойств препаратов. Через сутки в группе лабораторных животных, получивших А-2ПТК, количество ПМФ было в 2,7 больше в сравнении с прототипом и в 3,6 раза по сравнению с контролем. Максимальный пик индукции наблюдался на 5 сутки: Количество ПМФ в группе, получившей А-2ПТК, составило 100%, в-прототипе - 95%, а в контроле - 29%. Процент жизнеспособных ПМФ в группе с А-2ПТК составил 95,8±0,72%, в прототипе - 71,5±0,2%, в контроле - 65,2±0,17%.

8. Предложена модификация чашки Петри для приготовления, камеры, которая обеспечивает возможность проследить торможение миграции иммуно-компетентных клеток и выработки антител лимфоцитами. В используемой модели камеры наблюдается торможение миграции макрофагов и лейкоцитов, выделяющих при контакте с антигенами интерлейкины - маркеры чувствительности к антигенам, как результат положительной реакции на заболевание. Камера обеспечивает демонстративность, достоверность и повторяемость исследований. Применение модифицированной пластиковой чашки Петри позволило ускорить рост и дифференциальную диагностику возбудителей заболеваний по бляшкооборазующим единицам и другим проявлениям цитопатического действия инфектантов.

9. Вирусные антигены штаммов «РС-Б» и «Long» PC-вируса использованы для изготовления целлюлозных диагностикумов «Вироцелл-вирус» и «Виро-целл-антитело» в реакции агглютинации целлюлозы (РАД). РАЦ осуществляли в качественной и в количественной постановке-на-предметных стеклах. Лабораторные, клинические и производственные испытания антительных и антигеных диагностикумов-показывают их высокую специфичность, активность, воспроизводимость результатов, достоверность и простоту исполнения.

10. Модифицированные реакции агглютинации латекса на предметных стеклах обеспечивают быстрый и простой учет результатов по гриппу серотипов А и Б, PC-вируса штаммов «РС-Б» и «Long», вируса диареи (ВД), ПГ-3, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) и ротавируса (РВ) крупного рогатого скота.

11. Экспресс-методы диагностики воспаления респираторного тракта человека и животных с использованием целлюлозных фильтров в хроматографиче-ском исследовании позволило определить клинику и дифференциацию хронических неспецифических заболеваний легких. Окраска образцов смывов в темно-синий цвет указывает на обострение заболевания, а отсутствие окрашивания- на клиническое выздоровление. Модификация определения СОг в воздухе помещения позволила быстро контролировать его концентрацию в помещениях для животных и человека.

12. Композиция-антибиотика диклоксациллина с 10% кальция хлорида, ди-метилсульфоксидом и трипсином- «Дикалсид», является эффективным препаратом для лечения PC-вирусной, микробной и других видов инфекции. Местное и интраназальное применение «Дикалсида» быстро устраняло клинику заболевания PC-вирусной инфекции (гнойно-катаральные выделения из носа, кашель и другие) и герпес-вирусной инфекции (зуд, припухание, покраснение, воспаление на коже губ, глаз, лимфоузлов). «Дикалсид» в 95% случаях эффективен при герпесе глаз, носа, губ, герпес Зостер: прекратились зуд, жжение, покраснение, разрешились очаги, исчезли пузырьки, отечность, боли, уменьшились регионарные лимфоузлы за 1-3 суток. Количество РСВ по БОЕ в легочной ткани у санированных «Дикалсидом» мышей составило 24±2,1, интерфероном-31,5±8,4, коммерческой РСВ сывороткой- 63±15,9.

13. Препарат «Повин-ВМ»- лекарственная форма, содержащая тетрациклин, сополимеры, трипсин, раствор Версен, обладает широким спектром антибактериальной и противовирусной активности при деконтаминации питательных и культуральных сред. В 95-98% «Повин-ВМ» блокировал формирование БОЕ PC-вируса, ротавируса, парагриппа-3. Подавление микробного роста с применением «Повина-ВМ»: 15,2±0,4 (Р<0.01), тетрациклина- 195,7±20,3 (Р<0.01). Показана иммуностимулирующая, антибактериальная и противовирусная активность «Повина-ВМ» при парентеральном применении.

14. Интраназальное введение иммунизирующего комплекса ядерных (нук-леокапсидных) и оболочечных (суперкапсидных) фракций белков РС-вируса штамма «Long» на основе виниламин-вилилпирролидона-дифенилхинона способствовало выработке антител и обеспечило клеточную защиту иммунизированных мышей. Отмечено преимущество нуклеокапсидных препаратов: в 14 раз возросли титры антител в парных сыворотках (7 и 21 день), данные PTMJI и РГЗТ указывали на клеточную стимуляцию иммунного ответа

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций, рассмотренных и одобренных на заседании^ научно-технического совета ФГОУ ВПО МГАВМиБ (протокол № 2'от 16.10.09г.),и на заседании секции-инфекционной патологии животных Отделения ветеринарной медицины РАСХН .(протокол № 4 от 21.10.09г.): «Экспресс-диагностика инфекционных болезней животных», «Интенсификация' культивирования микроорганизмов и вирусов», «Профилактика и терапия инфекционных болезней животных».

2. Методические рекомендации: «Применение набора по выявлению респи-раторно-синцитиального вируса и антител к нему в реацаии аглллютинации целлюлозы», «Применение чашечной камеры в ветеринарной иммунологии», «Применение «Повина-ВМ»- пролонгированного иммуностимулятора однократного применения противомикробного и противовирусного действия» (протокол № 8 от 14.04.2006г.).- Тверь, 2006.

3. Разработаны проекты нормативных документов для диагностики РС-вирусной инфекции.

4. Результаты исследований по использованию биотехнологических экспресс-методов в микробиологии и вирусологии внедрены (с 1988 по 2010гг.):

•* В Витебском медицинском институте им. Дружбы народов 8.07.198826.09.1989г.

• В Литовской республиканской ветеринарной лаборатории, Г8.05.1988г.

• В Эстонской республиканской ветеринарной лаборатории г. Таллинн, 28.06.1988г.

• В ВНИВИП, 18.06.1990г.

• В лаборатории молекулярной биологии Института биохимии и физиологии АН Кирг. ССР, 04.04.1990г.

• В Ошской областной ветеринарной лаборатории, 21.07.1989г.

• В республиканской ветеринарной лаборатории Кирг. ССР, 27.07.1989г.

• В Куйбывшевской области, совхоз «Алексеевский», 27.01.1992г.

• Во Владимирской области, свинокомплекс «Владимирский», 14.10.1990г.

• В Тверской области, свинокомплекс «Верхневолжский», 10.05.2005г.

• МГАВМиБ имени К.И. Скрябина в научно-исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии от 10.01.2010г.

• В Тверской государственной сельскохозяйственной академии 19.04.2006г.

• ГН1Д «Институт иммунологии»

7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Для сокращения времени роста грамположительных, грамотрицательных микроорганизмов, дрожжевых и мицелиальных грибов, а также получения обогащенной бакмассы, в питательные среды рекомендуется вносить «Пинексид»: 1мл. стимулятора на 100мл питательной среды.

2. Для ускорения появления и обогащения урожаев ДНК- и РНК- содержащих вирусов необходимо вносить «Триптоксид» в клеточно-культуральную среду: 1мл. стимулятора на 100мл среды.

3. Ускоренный и упрощенный способ очистки обогащенных белковых фракций вирусов для получения антигенов, можно использовать для приготовления диагностикумов, иммунизирующих препаратов и получения антисывороток.

4. Для экспресс-диагностики в лаборатории и на производстве целесообразно использовать латексные и целлюлозные диагностикумы, способы их приготовления и постановки реакции.

5. Для получения высокотитражных сывороток, за 2-4 часа до заражения вирусами, в/м или п/к рекомендуется вводить лабораторным животным «Три-золон»- смесь 0,25% р-ра трипсина с ДМСО, 9:1.

6. Предлагается контролировать показатели иммунологической резистентности с помощью модифицированной чашки Петри в РТМЛ(М) и РЕК.

7. Камеральную (модифицированную) чашку Петри можно использовать для определения коли-титра, коли-индекса, токсикологических исследований препаратов на культурах клеток или тканей, бактериальной загрязненности молока и т.д.

8. Для профилактики респираторных заболеваний предлагается проводить исследование воздуха на содержание СО 2, а носовые или бронхиальные смывы- методом бумажной хроматографии.

9. Для лечения инфекционных заболеваний лабораторных животных при наружной локализации рекомендуется применять нанесение «Дикалсида».

10. Однократное в/м или п/к использование препарата «Повин-ВМ» с профилактической целью в свиноводстве позволяет получить максимальный прирост массы тела, сохранность поголовья и сокращение времени откорма для сдачи на мясокомбинат. «Повин-ВМ» можно также применять для лечения инфекционных заболеваний лабораторных животных. сения 5мкл исследуемого образца носового или бронхиального смывов с последующим окрашиванием в 0,25% водном растворе азура И. Критерием диагностики является окрашивание фильтра в темно-синий цвет при воспалении, и едва заметное окрашивание при отсутствии такового. Проведенные лабораторные и клинические исследования показали: данный метод может найти применение не только для определения степени воспаления, но и дифференциального диагноза аллергозов от инфекционно-аллергического процесса, что позволит своевременно и правильно назначить курс патогенетической терапии.

В борьбе с PCB и др. видами инфекции были исследованы антибиотики (ам-пиокс, оксациллин, диклоксациллин, канамицин и др.), интерферон, сконструированы вакцины на основе PCB белков и лекарственной антибактериальной формы, содержащей сополимеры, ферменты и детергенты. Результаты показали лечебную эффективность иммунизирующего препарата на основе 1% и 10% нуклеокапсидной и 10% суперкапсидной фракции PCB. Из антибиотиков - диклоксациллин и ампиокс. Успешным было действие интерферона.

Разработана лекарственная форма, включающая в себя диклоксациллин, трипсин, ДМСО и 10% кальция хлорид («Дикалсид»). Показана высокая эффективность при наружном применении и закапывании в нос в случаях PCB инфекций. «Дикалсид» оказался активным при некоторых грибных инфекциях, герпес-вирусных инфекциях, гриппе, парагриппе и аденовирусах. Назначение «Дикалсида» при герпесе глаз, носа, губ, гениталий, опоясывающего герпеса Зостер показало, что в 98% отмечено клиническое выздоровление: прекратились зуд, жжение, покраснение, исчезновение пузырьков, отечности, боли и уменьшение регионарных лимфоузлов за короткое время. Препарат устранял клинику воспаления десен, губ, языка, в случаях стафилококковой, дрожжевой и вирусной этиологии стоматитов, пародонтитов, афтах губ, языка и слизистых щек. Исследования по однократному интраназальному применению «Дикалсида» зараженным PCB мышам позволило определить, что титры PCB по БОЕ в легочной ткани у санированных «Дикалсидом» мышей составили 24±2,1, ин

Биотехнологи ческие шпресс-методы

8 Г5 Ы П и л

2 » а чз о и 03 О За о Н 03 о X а V м* И а г> Я н м а а ас ш ¥иг0

Пинексид

МВГАВМиБ

Ветеринарные лаборатории разных городов

Омский ветеринарный институт

НИИ разных городов

Институт »ллкра-биологиим зпи

ДИ'ЛЮЛЗГИИ им

Н.©.Гамглаи

Витебский мед. институт

Триптоксид

МВГАВМиБ

Витебский мед. институт

Экспресс-диагностика инфекционных заболеваний

МВГАВМиБ

Ветеринарные и медицинские и производственные лаборатории

Ветеринарные лаборатории разных городов

Повин-ВМ

МВГАВМиБ

НИИ разных городов

Инфекционньэ ззбалавгнич лг5ор=тарньа ¡яизгпных

13000 голов свиней

1ГШХГО

131

Дикалсид

Тркзолон

МВГАВМиБ

ЦКВИиГКВД

НИИ разных городов

МВГАВМиБ

Витебский мед. институт ю ю

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Макарян, Эдуард Артемович, Тверь

1. Астахова Л.Н., Методы получения стандартных диагностических сывороток креспираторно-синцитальному виру су/Астахова Л.Н., Брайнингер М.Г.// Лаб. Дело. 1975. -№ 12.-С. 730-732.

2. Баженов К.С. Распространение вирусов, парагриппа-3 и респираторно-синицитальной инфекции среди телят на откорме в осенне-зимний период /Баженов К.С. // Бюлл. ВИЭВ.- 1983.- Вып. 50.-С. 6-8.

3. Беннер Ф., Биология вирусов животных. /Беннер Ф., Мак-Ослен Б., Мисис С.,

4. Уайт Д. Под ред. В.И. Агола.-М.: «Мир», 1977.-Т.1 С. 161-338.

5. Борисович Ю.Ф., Инфекционные болезни животных: Справочник / Борисович

6. Ю.Ф., Кириллов Л.В. Под ред. Д.Ф. Осидзе.- М.: Агропромиздат, 1987.- С. 7778.

7. Боровкова Н.М. Сравнительное Изучение Методов идентификации риновирусови диагностики риновирусных инфекций : Автореф. дис. канд. мед. Наук: 16.00.03

8. Бостанджиева Р., Доказване на респираторно-синцнтиальната вирусная инфекция по телятата через реакция за свързване на комплемента /Бостанджиева Р., Текерлеков М., Хараламбиев Х.Е. //Вет. мед. науки.- София. 1984. XXI. - № 9. - С. 45-50.

9. Бостанджиева Р., Иммунофлуоресцентное доказательство респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у телят / Бостанджиева Р., Митов Б., Хараламбиев Х.Е.//Вет. мед. науки. София, 1985. - № 9. - С. 20-26.

10. Бостанджиева Р. Чувствительность на клеточные культури към говяждия рес-пираторно-синцитиаленый вирус / Бостанджиева Р. //Вет. мед. науки. София, 1986.-XXII.-№2.-С. 12-18.

11. Щ) 12. Бостанджиева Р. Культивирование и диагностика респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота : Автореф. дис. канд. биол. наук: 16.00.03

12. Букринская А.Г. Вирусология. /Букринская А.Г.-М.: Медицина, 1986. С. 271274.$

13. Вилдс Б., Вирусология/ под ред. Б. Вилдса, Д. Найпа. М. : Мир, 1989. - Т.1. — С. 41-42.

14. Вилдса Б., Вирусология/ под ред. Б. Филдса, Д. Найпа. М. : Мир, 1989. - Т.2. -С. 473-480.

15. Волкова О.В. Основы гистологии с гистологической техникой / Волкова О.В., Елецкий Ю.К. М. : Медицина, 1971. - С. 201-205.

16. Генчев Г. Энзоотии респираторно-синцитиального вируса // XXI Всемирный вет. конгресс. М., 1979. - Т.З. - С. 101.

17. Грязин В.Н. Этиология респираторных заболеваний телят и меры специфической профилактики в условиях спецхоза //Научно-технический бюллетень Всесоюзной академии с-х. наук им. В.И. Ленина Сибирское отделение. 1982. -№11.-С. 19-22.

18. Гуненков В.В., Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция / Гуненков

19. B.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. // Животноводство и ветеринария. -М., 1975. -Т.8. С. 70-76.

20. Звягин И.В., Хорьков И.А., Токарин Э.Ф. Методические рекомендации по разработке режимов замораживания-высушивания биологических препаратов. — М, 1981. -С. 33.

21. Бостанджиева Р., Изоляция на респираторно-синцитиалния вирус от телят с респираторни заболевания /Хараламбиев Х.Е., Бостанджиева Р., и др.//Ве1. мед. науки.- София, 1984. XXI. - № 2. - С. 3-7.

22. Бориосивч Ю.Ф., Испытание сухого эритроцитарного диагностикума РС-инфекции крпного рогатого скота /Метревели Г.Д., Бориосивч Ю.Ф., Чистова З.Я. и др. //Сб. науч. тр. ВГНКИ ветпрепаратов. 1983. - С. 57-60.

23. Казанцев А.П., Матковский B.C. Справочник по инфекционным болезням. 3-е изд., перераб. и доп. /Казанцев А.П., Матковский B.C. - М.: Медицина, 1986.1. C. 85-87.

24. Иванов П.А., Комплексная диагностика вирусных респираторных заболеваний крупного рогатого скота / Погуляева Л.В., Иванов П.А., Цунская Н.И.,. //Инфекционные болезни с-х животных. 1984. -С. 102-105.

25. Гаврилов В.И., Культура ткани в вирусологических исследованиях /Анджапаридзе О.Г., Гаврилов В.И., Семенов В.Ф., //-М.: Гос. изд. мед. литер., 1962.-С. 57-146.

26. Глухо в В.Ф., Культивирование клеток и тканей животных : Учебно-методическое пособие /Дьяконов Л.П., Глухов В.Ф., Поздняков A.A., Денисенко Г.Ф., Калмыкова Т.П. Ставрополь, 1986. - 96с.

27. Лещинская Н.П., Лабораторная диагностика респираторно-синцитиальной инфекции : /Лещинская Н.П., Покровская Е.П., Юрлова Т.И. и др.t

28. Методические рекомендации под ред. Я.С. Шварцмана; НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекц. Болезней.: Алма-Ата., 1985. 43с.

29. Лакин Г.Ф. Биометрия./ Лакин Г.Ф. М. : Высшая школа. 1980. - 294с.

30. Лебедев Л.И. некоторых биологических свойствах респираторно-синцитиального вируса / Лебедев Л.И., Авилов B.C. //Актуальные вопросы вет. вирусологии ; Тез. докл. 5-й Всесоюз. науч. конф. Казань, 1980. — С. 83-84.

31. Лещинская Н.П. Эпидемиология гриппа и других ОРЗ / Лещинская Н.П. , Юрлова»Т.И.// Сб. науч. тр./ВНИИ МЗ СССР. Л., 1983. - С, 148-177.

32. Лещииская Н.П. Молекулярная биология и генетика вирусов гриппа: /Лещинская Н.П.//С6. науч. тр. /ВНИИ гриппа МЗ СССР. Л., 1983. - С. 13-22.

33. Лещинская Н.П. Вакцинация против респираторно-синцитиальной инфекции / Лещинская Н.П.// Вопр. вирусол. 1986. -Т.31., № 5, - С. 517-527.

34. Лещинская Н.П., Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция /Лещинская Н.П., Камфорин Л.Е// Медицина и здравоохранение: Сер. Эпидемиология, вирусология и инфекционные заболевания. М., - 1986. - 77с.

35. Лопатина O.A., Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция / Лопатина O.A., Плетнева B.A.II МРЖ, 1989. № 3 РЗ. - С. 50-54.

36. Лопатина O.A. Клинико-иммунологические показатели и лечение больных респираторно-синцитиальными вирусными заболеваниями: Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1989. - 24с.

37. Мартынов Ю.В.,Выделение PCB от телят с респираторным синдромом /Мартынов Ю.В., Орлов М.И., // Патогенез, лечение и профилактика болезней жвач. жив. в Зап. Сибири. Омск, 1985. - С. 22-24.

38. Методические указания по применению перевиваемых клеточных культур для диагностики вирусных заболеваний сельскохозяйственных животных. Госаг-ропром СССР. - М., 1988. - 12с.

39. Сюрин В.Н., Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных: Справочник/Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Соловьев Б.В.// М.: Агропромиздат, 1986.-352с.

40. Метревели Г.Д. Реакция непрямой гемагглюшнации /РНГА/ в диагностике респираторно-синцитиалыюй инфекции крупного рогатого скота //Сб. науч. тр. ВГНК ветпрепаратов. М., 1983. - С. 99-100.

41. Метревели Г.Д. Биологические свойс1ва вируса и серологическая диагностика PC-инфекции крупного рогатого скота: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1989.-19с.

42. Метревели Г.Д., Гуненков В.В. Современная диагносгика залог успешной борьбы с PC-инфекцией крупного рогатого скота //Тез. докл. Всесоюз. научн. конф. По проблемам эпизоотологии. - Казань, 1983. - С. 94.

43. Новак М. Культивирование в суспензии эксплантатов легких эмбриона крупного рогатого скота вируса парагриппа-3 и его некоторые биологические свойства: Дис. канд. биол. наук. — М., 1986. 16.00.03

44. Лопатина O.A., Особенности клинического течения респираторно-синцитиального вирусного заболевания у взрослых /Лопатина O.A., Крылов В., Иванова Л.А., и др.// -М., -1989,

45. Архипов Н.И., Патологоанатомическая диагностика вирусных болезней животных: Справочное издание / Архипов Н.И., Чевелев С.Ф., Брагин Г.И., и др//; Под ред. Н.И. Архипова. М., Колос, 1984. - С. 76-78.

46. Лопатина О.А Показатели циркулирующего интерферона при различных вирусных заболеваниях /Лаврухина Л.А., Ершов Ф.И., Лопатина О.А и др.//Вопр. Вирусологии. 1989. - № 2. - С. 244-247.

47. Прингл. К. Пневмовирусы //Вирусология. Методы: Пер. с англ.; Под ред. В. Мейхи. М., Мир. — 1988. - С. 131-159.

48. Пушкарев Н.В., Основы вариационной статистики/ Пушкарев Н.В., Соболев А.Д.//методические указания для аспирантов зооветеринарных специальностей.- 2-е изд. М.: МСЗ СССР Моск. вет. академия. - 1983. - 21с.

49. Денер Л., Разработка метода получения высокоактивного респираторно-синцитиального вирусного диагностикума для непрямой реакции гемагглюти-нации /Денер Л., Дрейзен Р.,С., Янкевич О.Д., и др.//Вопр. Вирусологии. 1976.- № 6. С. 739-745.

50. Васильев A.B., РИГА в серодиагностике респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота /Васильев A.B., Осидз Н.Г., Сюрин В.Н., и др//Ветеринария. 1988. - № Ю: - С. 33-34.

51. Сергеев В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных./Сергеев В.А./ — М.: Колос, 1976.-С. 302.

52. Сергеев В.А.,. Структура и биология вирусов животных. / Сергеев В.А., Орлян-кин Б.Г.// М.: Колос, 1983. - С. 252-267.

53. Слепенко Т.Б. Выделение и? клеток и изучение свойств вируса герпеса индеек: Автореф. дис. канд. биол. наук. -М., 1987. 16.00.03- 19с.

54. Соминина A.A., Получение комплементсвязывающего антигена PC в суспензионных клеточных культурах /. Соминина A.A., Румель Н.Б //Сб. тр./ВНИИ гриппа. 1976. - № 17. - С. 116-120.

55. Бектемиров Т.А., Состояние и перспективы специфической^ профилактики гриппа и?других 0Р37Бектемиров;Т.А., Лонекая Н.И., Кастрикина Л.Н., и др.// Вопр: Вирусологии. 1987.-№ 4: - С. 393i

56. Строганова И;Я:, Чувствительность первичных;культур клеток к:респираторно-синцитиальному /Р С/ вирусу крупного рогатого скота / Строганова ИЯ.,Акбаева Л.М.//Проблемы биологии и патологии с-х животных: Сб. науч. тр./Моск. вет. академия, 1987. С. 96-98.

57. Сюрин В .ТТ. Частная, ветеринарная вирусология / Сюрин В.Ы., Фомина Н:В. /Справочная<книга. Ms: Колос, 1979. - С. 257-262.

58. Сюрин BiH., Ветеринарная вирусология./ Сюрин В.Н., Белоусова Р1В., Фомина

59. H.B:- Mi: Колос, 1984. С. 61-63. •*

60. Трофимова; M.F. Повышение Чувствительности реакции пассивной гемагглю-тинации; с эритроцитарными диагностикумом респираторно-синицитиального вируса / Трофимова.М.Г., Быков И.Н., Семенова Н.С. //Вопр. Вирусологии. -1985.-№2.-С. 236-239.

61. Халенев Г.А. Разработка методов производства диагностикумов и усовершенствование лабораторной диагностики вирусной диареи и респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота : Дис. канд. вет. на-ук.:16.00.03 / Халенев Г.А. -М., 1976. 270 с.

62. Халенев Г.А., Респираторно-синицитиальиая, реовирусная и риновирусная инфекция крупного рогатого CKOia / Халенев Г.А., Гуненков В.В. //Лекция 15-я/ Моск. вет. академия. 1977. - С. 3-9.

63. Юрлова Т.И., Изучение естественной популяционной изменчивости респира-торно-синцитиальных вирусов по их интерферирующим и репродуктивным свойствам./ Юрлова Т.И., Зощенко Н.Я., Карпова Л.С. // — Acta virol. 1985. - № 29. - С. 279-284.

64. Stott Е. J.,Acomparison of three vagoines againat respiratoiy synoytial virus in calvts /Stott E. J., Thomas L.N., Taylor G., //J. Hyg. 1984. - v.93. - P. 251-261.

65. Andrews A.H., Crunstll C.S.G., Hill F.W.G. Respiratory disease in calves //The veterinary annual . 1983. - v.23. - P. 48-55.

66. Ward K.A., Antibodies to respiratory syncytial virus polypeptides and their significance in human infection /Ward K.A., Lambden P.R., Ogilvie M.M., // J. gen. Virol -1983/- v. 64.-P. 1867-1876.

67. Armstrong J.A., Morphology and development of reapiratory syncytial vims in cell cultures / Armstrong J.A., Pereira H.G., Valentine B.C. // Nature. 1962. - v. 196. -P. 1179-1181.

68. Floeger H. W., A sero-epidemiological survey of infections with the bovinerespirato-ry syncytial virus in firetsea son grasing calves / Floeger H. W., Boon J.H., Klaasen C.H.L., // J. Vtt. Med. 1986. - v. 33, № 4. - P. 311-318.

69. Beem M., Association of the chimpansee coryga agtnt with acute respiratory disease in children / Beem M., Wright P.H., Hamre D.,// New Eng. J. Med. 1960. - v. 263. -P. 523-530.

70. Stott E.J., A survey of virus infections of the respirators tract of cattle and their association with disease / Stott E.J., Thomas L.H., Collins A.P., // J. Hyg. 1980. - v. 83.-P. 257-270.

71. Bachi T., Morphogenesis and ultrastructure of respiratory syncytial virus / Bachi T., £ Howe C. HZ. Virol. 1973. - v. 12. - P. 1173-1180.

72. Baker J.C., Serologic studies of bovine respiratory syncytial virus in Minnesota cattle / Baker J.C., Ames T.R., Markham R.J.F. // Am. J. veter. Res. 1985. - v. 46, № 4. -P. 891-892.

73. Baldridge P., Persiatent infection of cells in culture by respiratory syncytial virus / Baldridge P., Senterfit L.B. //Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1976. - v. 151. - P. 684688.

74. Bartha A., Bovin respiratory syncytial virusfertosottseg es kovetkezmenyel nagyu-seml azarvasmarha-allamanyokban / Bartha A., Benko M., Vetial F // Magyar allatov.

75. Lapja. 1986. — v. 41, № 8.-P. 451-454.

76. Bennett C.R., Growth and serological charecteristics of respiratory syncytial virus / Bennett C.R., Hamre D. // J. inf. Dis. 1962. - v. 110. - P. 8-16.

77. Berthiaume L.,Comparative structure, morphogenesis and bioiogical characteristics of the respiratory syncytial (R'S) virus and the pneumonia virus of mice / Berthiaume L., Joncas J., Pavilanis V. //Arch. ges. Virusforsch. 1974. - v. 45. - P. 39-51.

78. Bloth B., Fractionation of respiratory syncytial virus componente by centrifugation techniques / Bloth B., Norrby E.// Arch. Ges. Virusforsch. 1966. - v. 19. - P. 385392.

79. Matumoto M., Bovin Respirarory syncytial Virus : Host Range in laboratory Animals and Cell Cultures / Matumoto M., Inaba Y., Kurogi H., Sato K., Omori T., Goto Y., Hirose O. // Arch. Ges. Virusforsch. 1974. - v. 44. - P. 280-290.

80. Inaba V.,Bovine respiratory syncytial virus. Studies on an outbreak in Japan 19681969/ Inaba V., Tanaka V., Sato K., // Jap. J. Microbiol. 1972. - v. 16. - P. 373383.

81. Brenner S., A negarive staining method for high Resolution Eiectron Microscopy of virusas / Brenner S., Home R.W // Biochim. Et Biophs. Acta. 1959. - v. 34. - P. 103-110.

82. Cash P., The polypeptides of human respiratory syncytial virus: products of cell-free protein synthesic and post-translational modifications / Brenner S., Home R.W //Virology. 1979. - v. 92. - P. 375-384.

83. Chalal Y.D., The pathogenesis of respiratory symptomaticall virus in lung of animals/ Chalal Y.D., Elashary Y.//act a veterinar. 79th Annu. Nett. Amer. Soc. Microbiol. Los angeles Calif. P.28-31

84. Chanook R.M., Recovery from infants with respiratory illnese of a virus related to chimpansee coryza agent (CCA) II, Epidemiologie aspecta of infection in infants and young children / Chanook R.M., Finberg L. //Amor. J. Hyg. 1957. - v. 66. - P. 291300.

85. Chanock R.M. Acute respiratory disease in infoncy and childbood : present understanding and prospects for prevention / Chanock R.M., Parrott R.H.//Pediat. 1965. -v. 36.-P 21-39.

86. Chanock R.M., Regovery from in fants with respiratory illness of a virus to chim-panztee coryza agent (CCA). J. Isolation properties and characteristion / Chanock R.M., Rolaman B., Myers R. H Amer. J. Hyg. 1957. - v. 66. - P 281-290.

87. Churchill A.E., Agent of Marek's disense in tiasue culture / Churchill A.E., Biggs P.M. //Nature (London). 1967. - v. 215. - P. 528-530.

88. Churchill A.E., The attenuation with loss of oncogenicity of the horpestype virus of Marek's disease (strain HPRS-16) on passage in cell culture / Churchill A.E., Chubb R.C., Baxendale W. // J.Cen. Virol. 1969. - v. 4. - P. 557-564.

89. Collins P.L., Identification of a tenth RNA of respiratory syncytial virus and assign-meht of polypeptides to the 10 viral genes / Collins P.L., Huang Y.T., Wertz G.W. //J. Virol. 1984. - v. 49. - P. 572-578.

90. Watenbrink F.,Comparison of a newly developed anzymelinked immunosorbent assay of bovine respiratory syncytial virus infections / Watenbrink F., Brinkhof J.M.A., Straver P.J., Quak J., De Leeuw P.W.//Res. Vet. Sci. 1985. - v. 38, № 3. -P. 334-340.

91. Coulis Paul A. Questions and ans were about screening tests / Coulis Paul A.//Disiena John J. AIDS Patient Care. 1987. - v. 1, № 1. - P. 25-27.

92. Cutlip R.C. Lesions in lambs experimentally infected with bovine respiratory syncytial virus / Cutlip R.C., Lehmkuhl H.D. // Am. J. Vet. Res. 1979. - v. 40. - P. 1479-1482.

93. De Jong J.C., Stimulated growth of respiratory syncytial virus in the presence of notinomycin D. Antonie van Leeuvvenhoek / De Jong J.C., Harmsen N. // J. Microbiol. Serol. 1973. - v. 39. - P. 409-413.

94. Bansal R.P., Detection of rinderpast by latex agglutination test /Bansal R.P., Joshi R.C., Chandra U., Sharma B.// Acta virol. 1988. - v. 32. - № 3. - P. 275-277.

95. Takahashi E., Diagnosis of bovine respiratory syncytial virus infection by complement fixation test / Takahashi E., Inaba Y., Kurogi H., Sato K., Goto Y., Omort T. / Nat. lust/ Anim. Health Quart. 1975. - v. 15, № 4. - p. 179-185.

96. Kiman T.G., Diagnosis of bovine respiratory syncytial virus infections improved by virus detection i lung lavage samples / Kiman T.G., Limmer G.M., Straver P.J., //Am. J. Veter. Rea. 1986. - v. 47, № l.-P. 143-147.

97. Doggett J.E., A study of an inhibitor in bovine serum active against respiratory syncytial virus / Doggett J.E., Taylor-Robinson D., Gallop R.G.C. //Arch. ges. virusforsch. 1968. - v. 23. - P. 126-137.

98. Dubovi E.J., Inhibition of respiratory syncytial virus by BIS (5-amidino-2-bensimidasolyl) methane / Dubovi E.J., Gerats J.D. Tidwell R.R.,// Virology. 1980. -v. 103.-P. 502-504.

99. Dubovi E.J., Enhancement pf respiratory syncytial virus induced cytopathology by trypsin, thrombin and plasmin / Dubovi E.J., Geratz J.D., Tidwell R.R. //Infect. Immun. - 1983. - v. 40. - P. 351-358.

100. Elashary M.A.S.Y. A natural cutbreak of bovine respiratory disease caused by bovine respiratory syncytial virus / Elashary M.A.S.Y., Silim A., Morin M. //Cornell Vet. 1982. - v. 72, № 3. - P. 325-333.

101. Belanger F., Electron microscopic evidence for bridges betwean bovine respiratory syncytial virus particles /Belanger F., Berthiaume L., Alain R., Lussier G., Trudel M. // J. Gen. Virol. 1988. - v. 69, № 6. - P. 1421-1424.

102. Kalica A. R.,Electron microscopi studies of respiratory syncytial virus temperature -sensitive mutants /Kalica A. R., Wrigth P.F., Hetrick F.M., Chanock R.M. //Aroh. Ges. Virusfosch. 1973. - v. 41. - P. 248-258.

103. De Girolami P.C., Evaluation of a new latex agglutination method for detection of antibody to herpes simplex virus /De Girolami P.C., Dokos J., Eichelberger K., Biano S. //J. Clin. Microbiol. 1988. - v. 26. № 5. - P. 1024-1025.

104. Thomas L.H., Experimental pneumonia in gnotobiotic calves produced by respiratory syncytial virus /Thomas L.H., Stott E.J., Collins A.F., Jebbett J. //Br. J. Exp. Path. 1984. - v. 65.-19-28.

105. Mills J., Experimental respiratory syncytial virus infection of abults /Mills J., Van Kirk J.E., Wright P.F., Chanook R.M. //J. Immunol. 1971. - v. 107. - P. 123-130.

106. Fernil B.P., The stabilization and purification of respiratory syncytial virus using Mg So 4 / Fernil B.P., Gerin J.L//Virology. 1980. - v. 106. - P. 141-144.

107. Pernil B.F.,. The development of BALB/c celle persistent ly infected with respiratory syncytial virus: Presense of ribonuoleprotein on the call surfoce / Pernil B.F., Ford E.C., Gerin J.L. //Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1981. - v. 167. -P 83-86.

108. Forsyth B.R. Identification of respiratory syncytial virus antigens by agar diffusion andimmunmcelectrophoresis / Forsyth B.R. //Proc. Soc. Exp Biel. Ked. 1970. - v. 133.-P 568-572.

109. Forayth B.R., Biophysical studies of respirstory syncytial virus. Identification of two soluble cjmplement fixing antigens of respiratory syncytial virus. / Forayth B.R., Coates R.V., Chanook R.M. //J. Bact. - 1966. - v. 91. - P 1270-1276

110. Gabathuler K. Respira torisches Syncytial virus Riderpraxis / Gabathuler K. //Sechweiz. Aroh/ Tierheilk. 1983. - h. 125. - S. 149-153.

111. Gillete K.G., Respiratora syncytial virus indection in trsnsported calves / Gillete K.G., Smith P.C. //Am. J. Veter. Rec. 1985. - v. 46, № 12. - c. 2596.

112. Graham D., Proteolitic enhanocment of rotavirus infectivity : biiologie mechanisms / Graham D., Estes M.K. //Virology. 1980. - v. 101, № 2. - P. 432-439.

113. Grist N.R., Influenza respiratory syncytial virus and pneumonia in Glasgow 19621965 / Grist N.R., Ross C.A.C., Stott E.J //Br. Med. J. 1967. - v. 1. - P. 456-457.

114. Hall C.B., Modes of transmission of respiratory syncytial virus / Hall C.B., Douglas K.G. //J. Pediat. 1981. - v. 99. - P. 100-103.

115. Hall C.B., Respiratory syncytial virus infections in infants : quantitation and duration of shedding / Hall C.B., Douglas R.G., Geiman J.M. //J. Pediat. 1976. - v. 89. -P.ll-15.

116. Hall C.B., Possible transmission by fomites of respiratory syncytial virus / Hall C.B., Douglas R.G., Geiman J.M.//J. Inf. Dis. 1980. - v. 141.-P. 98-102.

117. Hambling M.H. Survival of respiratory syncytial virus during storage under various conditions /Hambling M.H.//Brit. J. exp. Path. 1964. - v. 45. - P. 647-655.

118. Holzhauer C., De etiologischi rol van het bovine respiratory syncytial virus bij pinkengriep. Tijdschr /Holzhauer C., van Nieuwstadt A.P.//Diergeneoskd. 1976. -v. 101.-P. 1023-1031.

119. Huang. Y.T., The genome of respiratory syncytial virus is a negative stranded БУМА that codes for ft least seven in RNA species / Huang. Y.T., Werts G.W. //J. Virol. -1982.-v. 43.-P. 150-157.

120. Trudel M., Immunovirological studies on human respiratory syncytial virus structural proteins /Trudel M., Nadon F., Sequin C., Ghoubril S., Paument P., Trepanier P. //Can. J. Microbiol.- 1986.-v. 32, № 1.-P. 12-15.

121. Pona Marcel W., Improvement of respiratory syncytial virus replication in actively growing Hep-2 cells /Pona Marcel W., Lambert A. L., Lambert D.M., Rochovansky O.M. //J. Virol. Meth. 1983. - v. 7, № 4. - P. 217-221.

122. Hall C.B.,Infectivity of respiratory syncytial virus by various routes of inoculation /Hall C.B., Douglas R.G., Sehnabel K.C., Geiman J.M. //Infect. Immun. 1981. - v. 33.-P. 779-783.

123. Ingh P.S.G.A.M., Clinical and pathological observat ons an spontaneous bovine respiratory syncytial virus infections in calves / Ingh P.S.G.A.M., Verhoeff I., Nieuwstadt A.P.K.M.I. //Res. In veter.Sc. 1982. - v. 33, № 2. - P. 152-158.

124. Inhibition of respiratory syncytial, parainfluenza 3 and measles viruses by 2-Deoxy-D-glucose. /Hodes D.S., Schnitzel T.J., Kalica A. R., Camargo E., Chanock R.M. //Virology. 1975. - v. 63. - P. 201-208.

125. Dubovi E.J., Inhibition of respiratory syncytial virus hoat cell. interactions by monoand diamidines /Dubovi E.J., Geratz J.D., Shaver S.R., Tidwell R.R. //Antimicrob. Ag. Chemother. - 1981. - v. 19. - P. 649-656.

126. Pringle C.R,. Initiation and maintenance of persistent infection by respiratory syncytial virus /Pringle C.R, Shirodarla P.V., CashP., Chiswell D.J., Malley P. //J. Virol. -1978.-v. 28.-P. 199-211.

127. Witter R.L., Isolation from turkeys of a cell-associated herpesvirus antigenically related to Marek's disease virus /Witter R.L., Nazerian K., Purchase H.G., Burgoyne G.H. //Am. J. Vet. Res. 1970. - v. 31. - P. 525-538.

128. Calnek B.W., In vitro methods for assay of turkey herpesvirus /Calnek B.W., Garrido C., Okazaki W., Patrascu I.V. //Avian Dis. 1972. - v. 16. - P. 52-56.

129. Joncas J., The structure of respiratory syncytial virus / Joncas J., Berthfaume L., Pavilanis V.//Viroligy. 1969. - v. 38. - P. 493-496.

130. Jordan W.S. Groqth Characteristics of respiratory syncytial virus / Jordan W.S. //J. Immunol. 1962.-v. 88. - P. 581-590.

131. Kisch Q.L., A plaque assouy for respiratory syncytial virus / Kisch Q.L., Johnson K.N.// Prac. Soc. Exp. Biol. Med. 1963.-v. 112,№3.-P. 583-589.

132. Koves B., Isolation of respiratory syncytial (RS) virus from coffle diseased with respiratory symptoms / Koves B., Bartha A. //Acta vet. Acad, soi hung. 1975 (1976). - v. 25, № 4. - P. 357-362.

133. Koves B., Respiratory syncytial (RS) virus isolalosa legzoszer vi tunetekkel meg betegibitt szarvasmarhakbol / Koves B., Bartha A. //Magy. Ellatorv. Lapja: 1976. -v. 31, №2.-P. 99-102.

134. Lambert D.M., Respiratory syncytial virus glycoproteina / Lambert D.M., Pons M.W. //Virology. 1983. - v. 130. - P. 204-214.

135. Lohmkuhl H.D.,Charaterization and identification of a bovine respiratory syncytial virus isolated from Young Calves / Lohmkuhl H.D., Coug P.M., Reed D.E.//Am. J. veter. Res. 1979: - v. 40, № 1. - P. 124-126.

136. Lehmkuhl H.D., Experimentally induced respiratory syncytial virus infection in lambs / Lehmkuhl H.Dt, Cutlip R.C. //Am. J. vet. Reb. 1979. - v. 40. - P. 512-514.

137. Lehmkuhl H.D., Morphogenesi and structure of caprine respiratory syncytial virus / Lehmkuhl H.D., Smith M.H., Cutlip R.C.//Virok 1980. - v. 65. - P. 269-276.

138. Polypeptides of respiratory syncytial virus /Levine S. J.// Virol. — 1977. v. 21. - P. 427-431.i

139. Levine S., Late stage synchronization of respiratory syncytial virus replication /Levine S., Buthala D., Hamilton KM Virology. 1971. - v. 45. - P. 390-400.

140. Levine S., Kinetics of respiratory syncytial virus growth cycle HeLa ctlls / Levine S., Hamilton R. //Aroh. ges. Virusforsch. 1969. - v. 28. - P. 122-132.

141. Levine S., Effect of respiratory syncytial virus infection on HeLa macromolecular synthesis / Levine S., Peebles M., Hamilton R. //J. gen. Virol. 1977. - v. 37. - P. 563.

142. Linggi T., Das bovine respiratorische synzytiabvirus als Erreger van Respirationstrakterkrankungen des epidemiologishe Untersucbung in der Schweiz /. Linggi T., WylerR. //Schweiz. Arch. Teirheilk. 1985. -Bd. 127. -H. 10. - S. 651-659.

143. Martin H.T. Indirect haemagglutination test for the detection and assay of antibody to bovine respiratory syncytial virus /Martin H.T//Vet. Rec. — 1983. V. 113, № 3. — P. 290-293.

144. Matthews R.E.F. Classification and nomenclature of viruses /Matthews R.E.F. //Intervirology. 1982. - v. 17.-P. 104-105.

145. Monulty M.S., Experimental respiratory syncytial virus pneumonia in young calves : Microbiologic and immunofluorescent findings / Monulty M.S., Bryson D.G., Allan G.M. //Am. J. Vet. Res. 1983. - v. 44. - P. 1656-1659.

146. Mohanty S.B., Experimentally induced respiratory syncytial viral infection in calves. / Mohanty S.B., Ingling A.L., Lillie M.G. //Am. J. Vet. Res. 1975. - v. 36, №4.-P. 417-419.

147. Taylor G., Monoclonsl antibodies protect against respiratory syncytial virus infection in mice /Taylor G., Stott E.J., Bew N., Fernie B.F., Cote P.J., Cjllins A.P., Hughes M., Jebbett J. //Immunol. 1984. v. 52. - P. 137-142.

148. Morris J.A, Recovery of cytopathic agent from chimpanzees with coryza / Morris J.A, Blount R.E, Savage R.E.// Prjc. Soc. Exp. Biol. Med. 1956. - v. 92. - P. 544549.

149. Moyr A. Virus krankheiten der Kalber / Moyr A.// Reportsand summaries-rapparte et resumes Reforate und zusammenfassugen. 1980. - P. 233-260.

150. Van Nieuwstadt A.P,Serology for diagnosis and cpizootilogical studies of bovine respiratory syncytial virus infections /Van Nieuwstadt A.P, Verhoeff J.//Research in Veterinary Science. 1983. - v. 35. P. 153-159.

151. Norrby E, Differences on the appearance of antibodies to structural components of measles virus after immunization with inactivated and live virus / Norrby E, Enders-Ruchle G, Ter-Meulen.V. //J. Inf. Dis. 1975. - v. 132. - P. 262-269.

152. Hall C.B, Noscomial respiratory syncytial virus infections /Hall C.B, Douglas R.G, Gefman J.M, Mesner M.K. //Ne2w Eng. J. Med. 1975. - v. 293. - P. 13431346.

153. Lambert D.M, Nucleic acide of respiratory syncytial vims / Lambert D.M, Pons

154. M.W, Mbuy G.N, Dorech-Hasler K. //J. Virol. 1980. - v. 36. - P. 837-846.i

155. Hunes A, Defeccion de anticuerpos contra el virus sincitial respirstorio bovino por seroneutralizacion / Hunes A, Castell S. //Rev. Salud anim. 1987. - v. 9, № 3. - P. 266-267.

156. Odegaard O.A.,A field caused by bovine respiratory syncytial virus / Odegaard* O.A., Krogerud J. //Acta vet. Scand. 1977. - v. 18. - P. 429-431.

157. Paccaud M.F., A respiratory syncytial virus of bovine origin / Paccaud M.F., Jacquier A. //Arch. Des. Virusforsch. 1970. - v. 30. - P. 327-342.

158. Kingsbury D.W., Paramyxovirides /Kingsbury D.W., Bratt M.A., Choppin P.W., Hanson R.P., Hosaka Y., ter Meulen V., Norrbij E., Plowright W., Rott R., Wunner W.H. //Inteiwology. 1978. - v. 10. - P. 1370152.

159. Parry J.E., Pneumoviruses : the cell surfoce of lytically and persistently infected cells / Parry J.E., Shirodaria P.V., Pringle C.R. //J. Cen. Virol. 1979. - v. 44. - P. 479-491.

160. Peacoch D., Respiratory syncytial virus in Britain / Peacoch D., Clarks S.K.R.//Lancet. 1961. - v. 2. - P. 466.

161. Peebles M., Metobolic regyirements for the naturation of respiratory syncytial virys / Peebles M., Levine S. //J. gen. Virol. 1980. v. 50. - P. 81-88.

162. Pirie H.M., Acute fetal pneumonia in calves due to respiratory syncytial virus / Pirie H.M., Petrie L., Pringle C.R. //Vet. Rec. 1981. - v. 108. - P. 411-416.

163. Inaba Y., Physicochemical properties of bovine respiratory syncytial virus /Inaba Y., anaka Y., Omort T., Matumoto M. //Jap. J. Microbiol. 1973. - v. 17. - P. 211-216.

164. Porter D.D., The age dependence of respiratory syncytial virus growth in ferret lung can be show in organ and monolayer cultures / Porter D.D., Muck K.B., Prince G.A //Clin Immund. Immunopath. 1980. - v. 15, № 3. - P. 415-423.

165. Pospisil L., leolation and Identification of a Bovine Respiratory syncytial virus in Czechoslovakia / Pospisil L., Moneik J., Valicek L //Acta vet. Brno. — 1978. v. 47. -P. 79086.

166. Potgieter L.N.D., tjse of inderect fluorescent antebidy test in the detection of bovine respiratory syncytial virus antibodies in Bovine serum / Potgieter L.N.D., Aidrida P.L. //Amer. J. Vet. Res. 1977. - v. 38, № 9. - P. 1341-1343.

167. Prince G.A., The pathogenesis of respiratory syncytial virus infection in infant forrets /Prince G.A., Porter D.D.// Am. J. Pathol. 1976. - v. 82. - P. 339-350.

168. Pringle C.R., Location and quantitation of antigen on the surfas oa virus-infected cells by specific bacterial adherence and senhing electron microscjpy / Prince G.A., Porter D.D. //J. Viral. Meth. 1980. - v. 1. - P. 61-75.

169. Charlier G., Propagation of bovine respiratory syncytial virus in calftesticle microcarrier culture / Charlier G., Wellwmans G., Lale A., strobbe R. //Arch. Exp. Vetei-narmed . 1984. - v.38, № 6. - P. 894-899.

170. Wermann J.F., Properties of a respiratory syncytial virus isolated from a sheep with rhinitis /Wermann J.F., Liggitt H.D., Parish S.M., Word A.C.S., Lea Master B.R. // J.

171. Vet. Res. 1985. - v. 46, № 4.

172. Reed L.J., A simple method of estimating 50 percent endpoints / Reed L.J., Muenchi

173. H.A. //Am. J. Hyg. 1938. - v. 27. - P. 493-497.

174. Reichselner J. The real inactivation of respiratory syncytial virus in water hypertonic solutions /Reichselner'J. // J. gen. Virol. 1969. - v. 5. - P. 397-403.

175. Richardson Wyatt L.S., Respiratory syncytial virus antibodies in non-human primates and domestic animals /Richardson - Wyatt L.S., Belshe R.B., London W.T., Sly D.L., Camargo E., ChanockR.M. //Lab. Anim. Sci. - 1981. - v. 31. - P. 413-415.

176. Johnson K.M., Respiratory syncytial virus. IV. Correlation of virus shedding, serologie response and illness imadult volunteers /Johnson K.M., Chanock R.M., Rif-hind D., Kravets H.M., Knight V. //J/ Amer. Med. Ass. 1961. - v. 176. - P. 663667.

177. Chanock R.M., Respiratory syncytial virus. IV : Evans A.S. (ed) / Chanock R.M., Kim H. W., Brandt C., Parrott R.H. //Viral Infections of Humans. Epidemiology and Control : Plenum. 1976. - P. 365-382.

178. Suto T., Respiratory syncytial virus infection and its serologie epidemiology /Suto T., Yano N., Ikeda M., Miyamoto M., Takai S., Jhigeta S., Himema Y., Ishida N. //Am. J. Epidem. 1965. - v. 82. - P. 211-224.

179. Prince G.A.,Respiratory syncytial virus infection in inbred mice /Prince G.A., Horswood R. L., Berndt J., Suffin S.C., Chanock R.M. //Infect. Immun. 1979. - v. 26.-P. 764-766/

180. Taylor G., Respiratory syncytial virus infection in mice /Taylor G., Stott E., Hughes N., Collins A.P. //Infect. Immun. 1984. - v. 43.-P. 649-655.

181. Lekeux P., Respiratory syncytial vims pneumonia in Priesian* calves : physiological findings /Lekeux P., Verhooff J., Hajer R., Breukink H.J. //Res. In veter. Sc. 1985. V. 39, № 3.

182. Bryson D.G., Respiratory syncytial vims pneumonia in young calves: Clinical ad pathologic findings /Bryson D.G., Monulty M.S., Logan E.F., Cush P.F. //Am.J. Vet. Res. 1983.-v. 44, №9.-P. 1648-1655.

183. Kravetz H.M., Respiratory syncytial vims III. Production of illness and clinical observations adult volunteers /Kravetz H.M., Knight V., Chanock R.M., Morris J.A., Johnoson K.M., Rifkind D., Utz J.P. //Amer. Med. Ass. -1961. v. 176. - P. 657663.

184. Respiratoiy Syncytial virus tomutants and nuclear immunofluorescance //j. Virol. -1976. v. 20, № 2. - P. 487-500.

185. Respiratory syncytial vims vaccine, Marck and Ca. Inc. Пат. 46727, Ирландия, заявк. 19.4.78 № 768/78. Опублик. 7.9.83. МК 61 К 39/12, с 127/08.

186. Richman A.V., Tauraso N.M. Growth of respiratory syncytial vims in suspension cell culture / Richman A.V., Tauraso N.M. //Appl. Microbiol. 1971. - v. 22. - P. 1123-1125.

187. Rossi C.R.,Serological evidence for the associationof bovine respiratory syncytial virus with respiratory tract disease in Alabama cattle / Rossi C.R., Kiesel G.K. //Infect. Immun. 1974. - v. 10. - P. 293-298.

188. Rosi C.R., Bovine respiratory syncytial virus infection of bovine embryonic lung cultures : a kinetic study by the fluorescent antibody techique / Rosi C.R., Kisel G.K. //Amer. J. Vet. Res.-1977. v. 38, №11.-p. 1901-1904.

189. Schirrmeier H. Zur morphologischen und immunhistologischen diagnostic virusbedingter respiratorischer Erkrankungen der Kalber . /Schirrmeier H. Zur //Mil. Vet.

190. Med. 1980. - H. 35. - B. 35-39.

191. Senterfit L.B., Separation and concentration of respiratory syncytial virus (RSV) antigens / Senterfit L.B., Baldridge P.B. //J. Immunol. Meth. 1974. - v. 4. - P. 349357.

192. Berthiaume L., Serological evidence of respiratory syncytial virus infection in shepp /Berthiaume L., Joncas J., Boulay G., Pavilabic V. //Vet. Rec. 1973. - v. 93. - P. 337-338.

193. Shahrabadi M.S., Calcium reguirement for syncytium formation in Hep-2 cells by respiratory suncytial vims / Shahrabadi M.S., Lee atrick W.K. //J. Clin. Micrjbiol.1988.-v. 26, № l.-P. 139-141.1. J f

194. Smith M.H., Isolation and characterisation of a bovine syncytial virus / Smith M.H., Frey M.L., Dierks R.E. //Vet. Rec. 1974. - v. 94. - P. 599.

195. Storch G.A., Evalution of a latex agglutination test for herpes simplex virus / Storch G.A., Reed C.A., Dalu L.A.//J. Clin. Microbiol. 1988. - v. 26, № 4. - P. 787-788.

196. Ito Y., Tanaka Y., Structure of bovine respiratory syncytial virus /Ito Y., Tanaka Y., Inaba Y., Omorl T. //Arch. Ges. Virusforsch. 1973. - v. 40. - P. 198-204.

197. Stott E.J., Respiratory syncytial virus / Stott E.J., Taylor G. //Arch. Virol. 1985. -v. 84.-P. 1-52.

198. Stott E.J., The characterissation and uses of monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus /Stott E.J., Bew M.PL, Taylor G., Jebbett J., Collins A.P. //Develop. Diol. Standart. 1984.

199. Routledge E.G., The development of monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus and their use in diagnosis by indirect immunofluorescence /Routledge E.G., McQuillin J, Samson F.C.R, Toms G.L. //J. Ved. Virol. 1985. - v. 15, № 3. - P. 305-320.t

200. Thomas L.N, The growth of respiratory syncytial virus in organ cultures of bovine foetal trachea / Thomas L.N, Stoff E.J, Jebbett J, hamiltot S. //Arch. Virol. 1976. -v. 52.-P. 251-258.

201. Prince G.A, The pathogenesis of respiratory syncytial virus infection in cotton rats /Prince G.A, Jenson A.B., Horawood R.L, Camargo E, Chanock R.M. //Am. J. Pathol. 1978. - v. 93. - P. 771-784.

202. Tlorent G, Bovines respiratorisches syncytial virus (BRSV) in der sohweiz : eiene serologische stutie / Tlorent G, DeMarneffe C. Boller E. //Schwauz. l.s.h. Tiasfeuk. -1985.-v. 10.-P. 127.

203. Trepanier P, Concentration of human respiratory syncytial virus usingammonium sulphate polyethylene glycol or hollow fibre ultrafiltration / Trepanier P, Payment P, Trudel M. //J. Virol. Meth. 1981. - v. 3. - P. 201-211.

204. Treuhaft M.W. A colorimetric assay for quanti fication of defective interfering particles of respiratory syncytial virus /Treuhaft M.W.//J. gen. Virol. 1983. - v. 64. -P. 1301-1309.

205. Treuhaft M.W, Becm M.O. Defective interfering particles of respiratory syncytial virus Infect /Treuhaft M.W,//Immun. 1982. - v. 37. - P. 439-444.

206. Ueba O. Purification and polypeptides of respiratory syncytial virus /Ueba O. //Microbiol. Immunol. 1980. - v. 24. - P. 361-364.

207. Dreixin R.S, Untersuchungen sum Einsetz der inderekten hemagglutination bei der serodiagnostik experimentller und naturlicher RS-Virusin jektipnen / Dreixin R.S,

208. Dohner L., Jankewitsch O.D., Mentel R., Mitjewa W., Grodnitzkaja N.A. // Dtach. Gesundheitsw. 1977. - v. 32, № 18. - P. 854-858.

209. Verhoeff J., Bovine respiratory syncytial virus infection in young dairy cattle : clinical and haematological fmdinys /Verhoeff J., Van der Ban. M., Nieuwstadt A.P.K.M.I. //Vet. Rec. 1984. - v. 114, № 1. - P. 9-12.

210. Gardner P.S., Virus cross-infection in paediatric wards /Gardner P.S., Court S.D.M., Brocklebank J.T., Downham M.A.P.S., Weightman D. //Br. Med. J. 1973. - v. 2. -P. 57-575.

211. Walsh E.E., Monoklonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins : Identification of the fusion protein / Walsh E.E., Hruska J. //J. Virol. 1983. - v. 47. - P. 171-177.

212. Walsh E.E., Purification and characterisation of GP 90, one of the velope dlyco-proteins of respiratory syncytial virus / Walsh E.E., Schesinger J.J., Brandriss M.W. //J. gen. Virol. 1984. - v. 65. - P. 761-767.

213. Wellemans G., Vaccination des bovins contre le virus respiratore syncytial (RSB) au moyen d'une souche attenues / Wellemans G., van Opdenbosch E. //Ann. Med. Vet. -1978.-v. 122.-P. 537-543.

214. Wunner W.H., Respiratory syncytial virus some biological and biochemioal propee-ties./ Wunner W.H., Faulkner G.P., Pringle G.R. // New York : Academic Press, 1975.-P. 193-201.

215. Wunner W.H., Respirstory syncytial virus proteins I Wunner W.H., Pringle C.R //Virology. 1076. - v. 73. - P. 228-243.

216. Yurlova T. J., Natural varisbility of respiratory syncytial viruses, Their interference and reproduction characteristics / Yurlova T. J., Zoshchenkova N.Ya., Karpova L.S. //Acta Virol. 1985. - v. 29, № 4. - P. 279-284.

217. Zakestiloknya L. The morphological characterisation of respiratory syncytial virus by a simple electron microscope technique / Zakestiloknya L. Ya., Almeida J.D., Bradstreet C.M.P. //Acta Virol. 1967. - v. 11. - P. 420-423.

218. Zrein M., Use of egg-yalk antibody for detection of respiratory sybcytial virus in nasal secretions by ELISA / Zrein M., Obert G., Regonmortal M.H. van. //Arch. Virol. —1986. v. 90, № 3. - P. 197-206.

219. Zygraich N. Vaccination against RS virus : a five year experience with Rispoval /Zygraich N. //Proceodinge of XII World Congress on Diseases of Cattle. 1982.1. P. 189-195.