Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности генетического разнообразия молоди семги при искусственном воспроизводстве

ВАК РФ 03.00.10, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности генетического разнообразия молоди семги при искусственном воспроизводстве"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. Ломоносова

На правах рукописи

ОФИЦЕРОВ Михаил Владимирович

ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ МОЛОДИ СЕМГИ ПРИ ИСКУССТВЕННОМ ВОСПРОИЗВОДСТВЕ

Специальность: 03.00.10. - ихтиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва, 1994

Работа выполнена в ИОГсн им. Н.И. Вавилова РАН в лаборатору генетики микроорганизмов.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Г.Г.Новиков, кандидат биологических наук Д.Г.Мальдов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В.П.Васильев,

кандидат биологических нау О.И.Карпова

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский ин титут рыболовства и океанографии.

Защита состоится ¿¿.^р/Р^-АЯ. 1994 г. в « » час на зас дании специализированного совета Д 053.05.71 по присуждению учён< степени кандидата биологических наук при Московском Государственш Университете им. М.В, Ломоносова по адресу: Москва, Ленинские гор Биологический факультет, ауд. ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ.

Автореферат разослан «/¿» об^арт^ 1994г.

Учёный секретарь Специлизированного Совета, кандидат биологических наук

А.Г. Дмитрие!

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В результате хозяйственной деятельности ^ювека ухудшается состояние водоемов. Поэтому неуклонно возрастает 1ачение мероприятий по сохранению запасов промысловых рыб. Наи->льшему антропогенному воздействию подвергаются проходные рыбы, в >м числе атлантический лосось (сёмга). Это связано главным образом с <удшением условий для естественного нереста и нагула молоди, что при-)дит к значительному уменьшению численности лососевых стад, а часто к исчезновению отдельных популяций.

Основной способ сохранения и поддержания популяций сёмги — ис-/сственное воспроизводство, которое во многих случаях отличается, не-лсокой эффективностью. В основном это связано с пониженной жизне-юсобностью выращиваемой молоди (Бакштанский и др.,1980; Каза->в,1982).

Одной из причин пониженной жизнеспособности заводской молоди эжет являться то , что искусственное воспроизводство нередко приводит изменению генетических параметров заводского стада по сравнению с тественной популяцией, из которой брали производителей (Никоноров др., 1989; Koljonen,1989; Doyle et al, 1991 и др.). Это может быть вызвано [едующим:

1) Малое количество производителей при искусственном воспроиз-адстве.

2) Условия содержания на заводах, значительно отличающиеся от тественных, что, возможно, является причиной генетического отбора, личающегося от происходящего в реке.

В связи с этим, для повышения эффективности искусственного вос-юизводства и восстановления численности естественных популяций не-ходимо не только улучшение биотехнологии, но и генетический конт-ль за заводской молодью.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в учении влияния искусственного воспроизводства на генетическое раз-юбразие молоди сёмги. Для достижения этой цели были поставлены сле-ющие задачи.

1. Исследование генетического разнообразия дикой молоди сёмги на «мере реки Лувеньга.

2. Сравнение генетического разнообразия молоди сёмга с Кандалак-:кого рыбоводного завода и молоди сёмги реки Лувеньга, из которой бра: производителей для завода.

3. Исследование генетического разнообразия искусственно воспро-водимой молоди сёмги в онтогенезе.

4. Выяснение роли факторов среды в формировании генетическо! разнообразия заводской и дикой молоди сёмги.

Научная новизна. Впервые было прослежено генетическое разноо( разие молоди сёмги в процессе искусственного воспроизводства от маль* в возрасте 2-х месяцев до ската в море (возраст 2+ — 3+), на примере 6 п< колений. Выявлен механизм, приводящий к повышенной гибели молод сёмги, в генотипе которой есть аллель IDHP-3*! 16. Выдвинуто предпол< жение о факторах внешней среды, приводящих к гибели рыб с этим алл< лем.

Практическая значимость. Выявленный механизм гибели молод сёмги вследствие стрессового поражения печени свидетельствует о необхс димости совершенствования биотехнологии в направлении снижения сп пени воздействия факторов, вызывающих стрессовое состояние у молод сёмги. Наблюдения за генетическим разнообразием по локусу ШИР-З* популяциях сёмги могут быть существенной составляющей мониторинг за состоянием искусственно воспроизводимых и естественных стад лосос; Это позволит также оценить степень антропогенного воздействия на поп> ляции сёмги, в связи с изменением экологических условий обитания .

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работ докладывались на 1-й Проблемной научно-практической конференци «Новые генетические и нейробиологические подходы к решению пробле: охраны и воспроизводства осетровых и лососевых рыб в СССР» (Москвг октябрь 1987), IV Всесоюзной научной конференции «Экологическая г« нетика растений, животных, человека» (Кишинёв, ноябрь 1991), межла бораторном семинаре ИОГен РАН (Москва, июнь 1993), научном коллок виуме кафедры ихтиологии биофака МГУ (Москва, январь 1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работь одна работа находится в печати.

Объём и структура текста. Диссертация содержит ЮЗ страниц ма шинописного текста, [ 3 рисунков и 9 таблиц. Список цитируемой ли тературы содержит /5!?названия, из которых 16 — на иностранных язы ках. Состоит из введения, трёх глав и выводов.

1. Материал и методика

Материал для выполнения данной работы был собран за период 1985 по 1991 год. Всего было проанализировано по локусу Ме-2 (5212 экз.), IDHP-3* (5020 экз.), ESTD-1* (4400 экз.), ААТ-2 (1714 экз.) (табл.1).

Диких покатников (возраст 3+) и заводскую молодь сёмги, перези мовавшую в реке после выпуска с завода (возраст 3+), отлавливали в рек Лувеньга. Возраст рыб определяли по чешуе сотрудники ПИНРО. 4

Для изучения влияния температурных условий на генетическое знообразие молоди сёмги были поставлены опыты, в которых сеголетки держались в течение длительного времени при повышенной температу-(20 22° С).

Для электрофореза использовали гомогенаты спинной мышцы и пени мальков семга (у производителей — только печень). Экстракцию лков из мышц и печени производили в 0.05М Трис-HCl буфере, рН 8.0, I г/мл сахарозы.

При электрофоретическом разделении НАДФ — зависимой малат-гидрогеназы, маликэнзима(Ме), эстеразы Д (ESTD), аспартатаминот-нсферазы (ААТ) использовался 7.5% полиакриламидный гель и Трис — 1,ТА-боратная буферная система (Peacock et al,1965). Для электрофоре-ческого исследования НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы ЭНР) использовался крахмальный гель и Трис-изоцитратный буфер ross, Ward, 1980).

НАДФ-зависимая малатдегидрогеназа(Ме)

Полиморфизм по Me—2* в скелетных мышцах лосося описан рядом торов (Cross et al, 1979). Идентифицируются три фенотипа [е—2*100/100; Ме-2*100/125; Ме-2П25/125).

Аспартатаминотрансфераза (ААТ)

В полиморфном локусе ААТ-2*, активном в печени, описано два леля (Cross, Ward, 1980). Соответственно электрофоретические нотипы (ААТ-2ф76/7б; ААТ-2*76/100; ААТ-2П00/100).

Поскольку мы в отличие от вышеупомянутых авторов производили ектрофоретическое разделение Me и ААТ в полиакриламидном геле, ло проведено сравнительное разделение в крахмальном геле и сопостав-ние электрофоретических фенотипов в полиакриламидном и крахмаль-м гелях.

Эстераза Д (ESTD)

Эстераза Д лососевых рыб была описана Л.Н. Ермоленко, Э.А. Руд-[найтисом (1984). В скелетных мышцах идентифицирутюся 3 фено-па полиморфного локуса ESTD (ESTD-1 »89/89; ESTD-P89/100; iTD—1*100/100).

НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа(ШНР).

В полиморфном локусе IDHP-3* в печени атлантического лосося ло выявлено 2 аллеля (Cross, Payne, 1977). Соответственно электрофо-гические фенотипы IDHP-3* (IDHP-3*100/100; IDHP-3400/116; НР-3*116/116).

В дальнейшем, для краткости изложения фенотипы по IDHP-3* эзначаются:

IDHP-3*100/100 — S-форма(рыба с S фенотипом, с S-ИДГ);

IDHP-3*100/116 — SF-форма (рыба с SF фенотипом, с SF-ИДГ);

IDHP-3*116/116 — F-форма (рыбас F фенотипом, с F-ИДГ).

Аллели: IDHP-ЗПОО — S-аллель, IDHP-3416 — F-аллель.

Используемые методы показали хорошую воспроизводимость иссл дованных полиморфных систем изоферментов. По полученным результ там наблюдалась высокая степень соответствия распределения эмпирич ских частот генотипов ожидаемым из закона Кастла-Харди-Вайнберг Достоверных различий между особями разного пола не обнаружено. Д стоверность различий при сравнении разных выборок оценивали по кр терию Xi-квадрат.

Для анализа физико-химических и кинетических характерней IDHP-3* использовались препараты, приготовленные из печени рыб, г мозиготных по F- и S-аллелям. Активность IDHP определяли спектроф тометрически. После центрифугирования препараты печени были очищ ны афинной хромотографией (Seelíg, Colman, 1977).

Чистота образцов IDHP и молекулярный вес F- и S-форм, а таю белки гиалоплазмй исследовались с помощью дискэлектрофореза в пр сутствии SDS (Laemmli,1972).

Протеиназную активность и действие ингибиторов определяли i расщеплению ФИТЦ-казеина (Twining, 1985). В качестве ингибиторов и пользовались лейпептин, 5,5-дитиобиснитробензойная кислота, ЭД1 Na, PMSF, ПХМБ. Активность кислой фосфатазы исследовали в 0.1М ац татном буфере рН 5.0, 0.5 mM MgS04, добавляя 1мМ паранитрофено фосфата в пробу, и смотрели при 490нм. Концетрация глюкокортикои ных гормонов измеряли при 280 нм (Bowness, Barry,1972).

Статистическая обработка результатов осуществлялась с помощ! пакета программ Statgraph 3.

2. Сравнительная характеристика заводской и дикой молоди сёмги

Естественная молодь из популяции реки Лувеньга и заводская Кандалакшского лососёвого завода по частотам исследованных полимор< ных белковых локусов (за исключением IDHP-3*) сходна с популяция! сёмги из близлежащих рек Белого моря (Казаков, Титов, 1992).

Статистически достоверных различий по частотам исследованш полиморфных белковых локусов у диких и заводских рыб одного возраст но разных генераций обнаружено не было, что позволило использова для их характеристики усреднённые значения частот аллелей этих лок сов (табл.1). Исключение составили лишь частоты аллелей локу IDHP-3* в двух выборках одной и той же заводской генерации: двухлет 6

[нварь 1987) и двухгодовиков (июнь 1987). Частота F-аллеля составляла январе 1987 - 0.450 (335 особей) и в июне 1987 — 0.358 (155 особей), роме того, в этих выборках наблюдалось достоверно повышенное коли-;ство гетерозигот (р<0.01) по локусу IDHP-3*: 0.582 (январь 1987) и 574 (июнь1987), тогда как в июне 1986 в этой же генерации частота -аллеля составляла 0.289 (151 особь) и гетерозиготность по данному ло-^су 0.306.

По частотам аллелей локусов Ме-2*, ААТ-2*, ESTD-1* статистиче-:и достоверных различий (по критерию Xi-квадрат) между всеми несделанными группами рыб обнаружено не было.

В то же время между заводской и дикой молодью обнаружены достойные различия по частотам аллелей локуса IDHP-3* (табл.1). Интерес-э отметить, что перезимовавшая молодь имеет более низкую частоту -аллеля не только по сравнению с дикой молодью, но и по сравнению с шодской, различия достоверны (р< 0.05).

Таблица 1

Частоты аллелей исследованных полиморфных ферментных локусов у диких покатников и заводской молоди сёмги

Группа рыб Частоты аллелей

1DHP-3M16 Ме-2* 125 ESTD-1MOO ААТ-2М00

авод. 0 + месяц 0.471±0.085 17 шт. - - -

авод. 0 + месяца 0.477±0.021 1088 шт. 0.721±0.019 1055 шт. 0.790+0.017 1098 шт. -

авод. 0 + ,5 месяцев 0.318±0.033* 505 шт. 0.718+0.032 449 шт. 0.774±0.030 450 шт. 0.839±0.028 450 шт.

авод. 0 + месяцев 0.298±0.033* 472 шт. 0.675+0.035 525 шт. 0.828±0.028 488 шт. 0.807±0.023 150 шт.

авод. 1 + 3 месяцев 0.267±0.031* 661 шт. 0.684+0.033 572 шт. 0.766±0.030 722 шт. 0.848±0.026 570 шт.

авод. 1 + 0 месяцев 0.309+0.031* 1158 шт. 0.659±0.03 5 1477 шт. 0.822±0.027 913 шт. 0.903±0.027 228 шт.

авод. 2 + 5 месяцев 0.278+0.033« 805 шт. 0.674±0.033 785 шт. 0.830±0.029 529 шт. 0.876±0.023 237 шт.

[резимо-авшая 3 + 8 месяцев ' 0.144±0.038* 80 шт. 0.610±0.053 86 шт. 0.841±0.040 41 шт. -

^икая 3 + 8 месяцев 0.505+0.049 234 шт. 0.721+0.046 263 шт. 0.773±0.043 159 шт. 0.886±0.041 79 шт.

* - достоверно отличные от диких покатников (р<0.05)

Результаты исследования показывают, что у заводской молоди наблюдается тенденция к снижению частоты F-аллеля с возрастом. Причём, наиболее резкие и статистически достоверные изменения наблюдаются в период со 2-го по 6-й месяц 1-го года жизни и во время зимовки на 3-ем году жизни.

Известно, что большая часть сеголетков (около 80%), старше 2 месяцев, на Кандалакшском лососевом заводе погибает с середины июля и до середины августа. В это время температура в бассейнах, в которых содержатся заводские сеголетки, достигает наиболее высоких значений (Лоен-ко,1986). В связи с этим, можно предположить, что одной из причин отбора против мальков сёмги с F-аллелем, наиболее выраженным в течение первого лета жизни, может быть действие повышенной температуры воды в излишне прогреваемых бассейнах рыбоводного завода.

В пользу этого свидетельствуют наблюдения за атлантическим лососем реки Невы. До 1980 года частота Р-аллеля(ШНР-3*116) у невского лосося была 0.075 ± 0.011 (Слынько и др., 1980). К сожалению, исследования по локусу IDHP-3* у невской семги в период с 1980 по 1985 не проводились. После возобновления наблюдений в 1986 году (Kazakov, Titov, 1991) было выявлено, что популяция реки Невы мономорфна по S-аллелк: (IDHP-3*100). Популяция семги на Неве поддерживается практически полностью за счет искусственного воспроизводства. Известно, что с 198С года молодь атлантического лосося на Невском лососевом заводе стали подращивать на теплой воде (Титов, 1992).

3. Исследование влияния повышенной температуры на генетическое разнообразие сеголетков атлантического лосося

С целью проверки гипотезы о влиянии температурных условий нг направленный генетический отбор по локусу IDHP-3* в 1989 году былр поставлены два опыта по выращиванию молоди семги при повышенной температуре (20°—22° С).

Результаты обоих опытов по подращиванию молоди сёмги в тёплог* бассейне (20°—22° С) показывают, что у мальков сёмги наблюдалась тен денция к снижению частоты F-аллеля. В контрольном бассейне (t =12° С наблюдалась та же тенденция. Одновременно в условиях опыта наблюда лась тенденция к повышению частот аллелей Ме-2*125, ESTD-1*100 тогда как в контроле — тенденция к снижению частот аллелей Ме-2* 125 ESTD-1*100. Все различия в частотах исследованных полиморфных бел ковых локусов, возникшие в результате опытов и в контроле , статистиче ски недостоверны. 8

На основании результатов опытов возникло предположение, что аснение механизма изменения генетического разнообразия молоди сем-на Кандалакшском лососевом заводе следует продолжить с помощью внительных исследований кинетических и физико-химических харак-1истик изоферментов in vitro. Так как в заводских условиях наблюда-:ь только изменение аллелей частот локуса IDHP-3* в печени, то все ледования проводились именно по этому локусу. Предполагалось, что | поможет в поиске причин, приводящих к изменению генетического шообразия молоди семги на заводе.

4. Кинетические и физико-химические характеристики F-и S-форм ИДГ из печени сёмги

НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа катализирует реакцию ¡вращения нзоцитрата в 2-оксиглутарат, восстанавливая при этом в НАДФН.

F- и S-формы ИДГ имеют одинаковую температурную зависимость ходный рН оптимум.

Обе формы проявляют одинаковую зависимость от содержания в :де инкубации двухвалентных катионов, сходную с описанной в литера-зе для других объектов. Их активности в равной степени зависимы от щетраций Mn++, Mg++, Са++, Zn-H-.

F- и S-формы фермента ингибируются при одной и той же концет-дии эффекторов.

После очистки кинетические характеристики обеих форм ИДГ не пенились, что является доказательством нативности фермента.

Константа Михаэлиса (Km) для 105000g супернатанта F-формы составила 32 мМ, а для очищенного препарата — 0.0016 мМ. Кш для ^юрмы ИДГ составила 125 и 0.0062 мМ соответственно. Последняя ве-чина представляется более реальной и близка к Km данного фермента у бы Fundulus heteroclitus — 0.00158 мМ (Gonzalez-Villasenor, Powers, 85).

По данным гельфильтрации обе формы фермента имеют небольшие зличия в молекулярной массе ( S- 97-100 kDa, F - 90-92 kDa). Но •S — форез препаратов (очищенных с помощью гельфильтрации, афин-й хроматографии на сефарозах F- и S- формы, и полос, которые соот-гствуют гомозиготам по F- и S-аллелям, вырезанным из крахмального 1я, на котором проводилось разделение F- и S-форм ИДГ) выявил нали-е одного и того же пептида 52 kDa.

По молекулярному весу F- и S-формы из печени атлантического лс сося близки к IDHP из печени фундулюса Fundulus heteroclilus — 90kD (Gonzalez —Villasenor, Powers,1985).

Исходя из сходства и различий по физико-химическим свойства (различие в массах S- и F- форм ферментов, определенных методом гел! фильтрации на сефадексе G 150, одинаковой молекулярной массе субп единиц, из которых состоят F- и S-формы фермента) мы можем сделан вывод о различной конформации субъединиц IDHP-3*: IDHP—3*100/1С и IDHP-3*116/116.

Несмотря на различие в Km, F- и S- формы ИДГ демонстрируй значительное сходство по энзиматическим и физико-химическим xapai теристикам.

Таким образом, первоначальное представление о существовании о' бора против мальков сёмги с F-аллелем ИДГ, обусловленного кинетич! скими и физико-химическимим характеристиками F-формы ИДГ, пре, ставляется сомнительным.

5. Эколого-физиологические характеристики атлантического лосося с F- и S-формами ИДГ

Электрофорез в ПААГ с 0.1 % желатином показал наличие протеа ной активности в препаратах с F-формой ИДГ. В то же время в препар тах, содержащих S-форму ИДГ, протеазной активности не наблюдалос Протеаза, находящаяся в препаратах с F- формой ИДГ, показала сходну активность как в кислых (рН 5.0), так и нейтральных буферах (рН 7.4), не ингибировалась PMSF.

В то же время ряд свойств протеаз, обнаруженных в препаратах с формой ИДГ (активность в кислой и нейтральной среде, отсутствие инг бирования PMSF), позволили сделать предположение, что данные проте зы являются лизосомальными.

Чтобы определить принадлежность протеаз к определённым кла сам , был проведен анализ протеазной активности с различными ингиб торами и субстратами (табл. 2). Частично протеазная активность инг бировалась лейпептином и5,5дитиобиснитробензоатом (табл. 2), чтоп зволяет отнести , по крайней мере, часть данных протеаз к группе тиол вых. Экстракт пробы с F-ИДГ в присутствии лейпептина и 5,5 дитиоби нитробензоата расщеплял субстрат, характерный для аспарагиновых пр теаз— Bz-Arg-Gly-Phe-Phe-Leu-M/J.NA' НС1. ю

Таблица 2

Влияние ингибиторов на протеазную активность в препаратах гиалоплазмы клеток печени сёмги с Р-формой ИДГ

Ингибитор Протеазная активность*

арахлормеркурийбензоат(ПХМБ) 56.61 ± 459 (37%)

,5 дитиобиснитробензоат 91.80 ± 6.12 (60%)

ейпептин 64.26 ± 4.63 (42%)

ДТА N3 137.70 ± 6.08 (90%)

МБИ 153.12 ±5.25(100%)

онтроль 153.08 ± 4.85 (100%)

* — мг ФИТЦ-казеина/мг белка в час

Это позволяет сделать предположение, что в пробах с Р-ИДГ, кроме шловых протеаз, есть еще аспарагиновые протеазы. Такой набор протеаз фактерен для лизосом.

Кроме того, электрофорез проб супернатанта 10500(^ из гомогената ;чени сёмги (ЬаештН, 1972) показал, что в препаратах с Р-формой ИДГ I препаратах с Б-формой этого не наблюдалось) происходит разрушение ¡лков гиалоплазмы, что говорит о наличии нецитоплазматических проте-I. Это ещё раз подтверждает лизосомальную природу исследованных про-:аз. Кроме того, в препаратах гиалоплазмы из клеток печени рыб с Р-ормой ИДГ обнаружена значительная активность кислой фосфатазы Ю мМ паранитрофенола /мг белка час), в 2 раза превышающая актив-эсть этого фермента в препаратах с Б-формой (22 мМ паранитрофено-\/мг белка час), что также свидетельствует о лабилизации лизосомаль-лх мембран (Панин, Маянская,1987).

Известно, что выход значительного количества лизосомальных фер-ентов в гиалоплазму клеток является симптомом стрессового состояния )гана (Панин, Маянская,1987). Развитие стрессового состояния по елье(1960) характеризуется повышенным уровнем глкжокортикоидов. В 1стности, на Нижней Волге у русских осетров, поражённых миопатией, >мимо увеличения активности лизосомальной протеазы — катепсина Б 1емова и др., 1990), наблюдалось повышенное содержание глюкокорти-)ида — кортизола в различных тканях (Баранникова и др.,1990). Поэто-у для проверки гипотезы о стрессовом состоянии рыб были измерены кон-п-рации глкжокортикоидов в гомогенатах из печени рыб с Р- и

и

Б-формами ИДГ (как у погибших, так и у только что пойманных). У по гибших (1) рыб с Р-формой ИДГ уровень стероидных гормонов оказалс достоверно выше (р<0.01), чем у рыб с Б-формой ИДГ и только что пой манных (2) рыб, независимо от их фенотипа (табл. 3). Кроме того, у все только что пойманных рыб, независимо от фенотипа, протеазной активно сти вышеописанным методом обнаружено не было.

Таблица

Концентрация глюкокортикоидов в печени сёмги (мкг / г белка)

генотип ГРУППА РЫБ

1» 2*

IDHP-3'100/100 200.20 ± 3.70 n= 150 199.10 ± 2.61 n = 9

IDHP-3 * 100/116 262.00 ±6.28 n= 150 19850 ± 4.25 n= 12

IDHP-3*116/116 447.52 ± 6.82 n= 150 200.25 ± 3.65 n = 8

* - пояснения в тексте.

Таким образом, с большой долей уверенности можно сказать, чт причиной гибели мальков сёмги с F-формой ИДГ был некий фактор, вы зывающий стрессовое состояние клеток печени. Так как концентраци стероидных гормонов была не столь велика (у рыб с F-ИДГ в 2 раза выше чем у рыб с S-ИДГ), то можно говорить о поражении клеток печени, а н другого органа как первичной причине гибели рыб. У рыб с S-формой ИД причина гибели, вероятно, иная.

Наблюдавшийся отбор против рыб, в генотипе которых есть F-ал лель ИДГ, обнаруженная активность лизосомальных протеаз у рыб F-формой ИДГ позволяют сделать предположение, что F-аллель являете маркёром неустойчивости особей к факторам, вызывающим стресс.

7. Обсуждение полученных результатов о влиянии заводского воспроизводства на генетическое разнообразие молоди сёмги

Проведённые нами исследования согласуются с наблюдениями том, что в условиях искусственного воспроизводства возможно изменени генетического разнообразия выращиваемой молоди, которое проявляете в различии частот полиморфных белковых систем между заводской и дк кой молодью (Никоноров и др., 1989; Koljonen, 1989; Doyle et al, 1991 др.).

Наше исследование показало, что в заводской популяции из 4-х оферментных систем измененение затронуло один локус ШНР-3*. При ом у искусственно воспроизводимой молоди обнаружено снижение часты Р-аллеля по сравнению с дикой молодью (табл.1).

На основании результатов нашего исследования вероятность отбора отив мальков сёмги с Р-аллелем ИДГ, обусловленного кинетическими и 13ико-химическимим характеристиками Б-формы ИДГ, представляется мнительной.

В то же время, сопоставляя полученные результаты по изменению 1етического разнообразия по локусу ШНР-З* у заводской молоди, нали-ю протеазной активности в печени у рыб, гомозиготных по Р-аллелю и отношению концентраций глюкокортикоидов (табл. 3) у рыб с разными нотипами по ШНР-З*, можно сделать вывод, что направленный отбор локусу ШНР-З* ( гибель мальков , несущих Р-аллель ) происходил тедствие стрессового поражения печени. При этом разрушаются или шовятся очень лабильными лизосомальные мембраны в клетках пече-, и ряд лизосомальных протеаз выходит в гиалоплазму, расщепляя ци-юльные белки и поражая клетки печени.

Наши данные позволяют предположить, что печень мальков сёмги пяется одной из мишеней воздействия не выявленного нами фактора гшней среды. Учитывая, что печень является органом, отвечающим за таболизм чужеродных соединений, попавших через желудочно-кишеч-й тракт (Сравнит, физиология животных, 1977) и невысокое качество сусственных кормов, можно предположить, что причиной гибели рыб тяется некий токсический агент, содержащийся в пище рыб.

В пользу этого свидетельствует отсутствие значимого изменения готического разнообразия по локусу ШНР-З* в проведенном нами опыте влиянию повышенных температур, в котором молодь получала живой >м хорошего качества. Результаты опыта показали, что температура во-не является прямым фактором, приводящим к гибели мальков семги с шлелем. По-видимому, повышенная температура лишь усугубляет дей-ие каких-то других факторов, вызывающих стресс у мальков. Это могут гь используемые в рыбоводстве искусственные корма и особенно просты их разложения (токсичные компоненты) (Лашманов, Никоно-1,1990; Тойвонен и др., 1991). Учитывая, что при загрязнении воды ха-:терны изменения в жабрах (Ьеп^ас! е1 а1,1987; ТаЬсЬе е1 а1,1990), мы :дполагаем, что поражение печени связано с токсическими компонента, содержащимися в кормах и попадающими в организм рыб через желу-:но-кишечный тракт. Кроме того, обнаруженный в наших исследовани-вдвое более высокий уровень стероидных гормонов в печени погибших 5 с Р-ИДГ по сравнению с рыбами с Б-ИДГ (табл. 3), позволяет гово-•ь, что причиной гибели мальков с Р-аллелем является поражение пече-лизис печёночных клеток.

Существенное влияние на функционирование лизосомальных фе ментов оказывают, воздействуя, главным образом, на проницаемость л: зосомальных мембран, такие жизненно важные микроэлементы, к; цинк, кобальт и никель (Высоцкая, 1989). Сопоставление данных по ги, рохимическому составу воды разных рек и генетическому разнообрази естественных популяций сёмги (Cross, Ward, 1980; Cross, King, 198 Kazakov, Titov,1991) не позволяет выявить корреляцию между каким; либо факторами среды обитания и генетической изменчивостью по локу( IDHP-3*.

В наших исследованиях заводской популяции было выявлено к; снижение, так и повышение частоты F-аллеля. Таким образом, отбор пр тив молоди семги, геному которой различаются по локусу IDHP-3*, м жет идти в двух направлениях. Следовательно, должны различаться фа; торы, приводящие к снижению частоты F-аллеля, и факторы, вызываь щие повышение частоты F-аллеля (увеличение доли гетерозигот).

Применительно к Кандалакшскому лососевому, а также и к Ум; скому (Казаков, Титов,1992) заводам наиболее вероятной причиной chi жения частоты F-аллеля у молоди семги является действие токсическ1 факторов (стрессовое поражение печени), усугубляемое действием пов! шенной температуры. Аналогичные причины, вероятно, привели к пра; тически полному исчезновению F-аллеля в популяции атлантического л< сося реки Невы.

Особый интерес представляют данные по перезимовавшей мол о; семги (табл.1). Выявлено снижение частоты F-аллеля у перезимовавпн молоди (на 3-м году жизни) не только по сравнению с дикой, но даже и заводской молодью. Многими авторами отмечалась пониженная жизн способность заводской молоди после выпуска в реку по сравнению с дикс (Бакштанский и др.,1980; Казаков, 1982). Вероятно, возможной причине изменения генетического разнообразия по локусу IDHP-3* у заводскс молоди семги во время зимовки в реке является стрессовое состояние, во никающее вследствие непривычных, тяжелых для неё условий обитания неподготовленности к зимовке. Особое значение этих наблюдений за п резимовавшей молодью семги связано с тем, что основной промвозвр; (99%) от заводской молоди дает перезимовавшая молодь (Лоенко,1985).

Примером другой группы факторов может служить воздействие г: зопузырьковой болезни, предположительно вызвавшей генетически с лективную гибель молоди семги, приводящую к увеличению количесп особей, гетерозиготных по локусу IDHP-3*. Повышение частоты F-алле; (с 0.289 до 0.45), наблюдавшееся у двухлеток семги на Кандалакшскс лососевом заводе в начале 1987, сопровождалось достоверным избытке гетерозигот ( р<0.01 ) по локусу IDHP-3*. По частотам остальных иссл! дованных ферментных систем отклонений от средних по годам (табл.1) н

блюдалось. Вероятно, гетерозиготные по локусу ШНР-З* особи облада-• повышенной устойчивостью к газопузырьковой болезни.

Таким образом, можно сделать предположение о возможной селек-вной ценности геномов атлантического лосося, маркируемых аллеля-[ локуса ШНР-З*.

Наблюдения за генетическим разнообразием по локусу ШНР-З* в пуляциях атлантического лосося могли бы стать существенной состав-ющей мониторинга за состоянием искусственно воспроизводимых и ес-ственных стад лосося. Это, вероятно, позволило бы выявить причины, иводящие к изменению генетического разнообразия молоди семга на задах, оценить степень антропогенного воздействия на экологические ус-вия обитания атлантического лосося.

Выводы

1. При искусственном воспроизводстве у атлантического лосося ;мги) из реки Лувеньга наблюдается изменение генетического разнооб-зия по локусу ШНР-З* в печени, выражающееся в снижении частоты леля ШНР-3*116 с 0.5 до 0.3. У дикой молоди сёмга в р. Лувеньга ана-гачных изменений не наблюдалось.

2. Гибель в искусственных условиях молоди атлантического лосося, нотип которой имеет аллель ШНР-З* 116, связана со стрессовым пора-;нием печени.

3. Аллель ШНР-3*116 является маркёром генома мальков сёмга, устойчивых к факторам внешней сре^ы,.вызывающим стресс.

4. На основании анализа физико-химических и кинетических ха-ктеристик ШНР-З'* из печени'атлантического лосося сделано предположив , что сам фермент не является причиной отбора против особей, в ге-1типе которых есть аллель ШНР-З* 116. V./

5. Наблюдения за генетическим разнообразием по локусу ШНР-З* >гут быть использованы при мониторинге за искусственным воспроиз-дством атлантического лосося и антропогенным воздействием на струк-ру естественных популяций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. Никоноров С.И., Офицеров М.В., Витвицкая Л.В. Неконтролиру-[ый генетический отбор лососей.// Рыб. хоз-во(Москва).—1989—N 1.— 54-55.

2.0фицеров М.В.,Голованова Т.С.,Витвицкая Л.В.,Никоноров С.И. шяние заводского выращивания на генетическое разнообразие мо-

15

лоди атлантического лосося Salmo salar L.// Вопросы ихтиологии. 1989. —Т. 29, вып. 5. —С. 871-874.

3. Мальдов Д.Г., Офицеров М.В., Дадашев С.Я. Исследование физ ко-химических свойств разных форм изоцитратдегидрогеназы из пече) сёмги.// Тез. докл. IV Всес. науч. конф. «Экологическая генетика pací ний, животных, человека.», 20-21 ноября 1991 — Кишинёв, 1991. С. 145.

4. Офицеров М.В., Мальдов Д.Г., Витвицкая JI.3., Никоноров С. Влияние заводского выращивания на соотношение различных форм из цитратдегидрогеназы в популяции сёмги. Кинетическая характеристи разных изоаллельных форм фермента.// Тез. докл. IV Всес. науч. кон «Экологическая генетика растений, животных, человека.», 20-21 нояб 1991 — Кишинёв, 1991.—С.167.

5. Офицеров М.В., Мальдов Д.Г. Аллель IDHP-3*116 — маркёр и устойчивости к факторам внешней среды у сёмги.// Докл. РАН (в печ ти).