Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности формирования взаимоотношений растений пшеницы и картофеля с возбудителями грибных болезней с различной стратегией питания

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Особенности формирования взаимоотношений растений пшеницы и картофеля с возбудителями грибных болезней с различной стратегией питания"

На правах рукописи

ЯРУЛЛИНА ЛИЛИЯ МАРАТОВНА

ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ И КАРТОФЕЛЯ С ВОЗБУДИТЕЛЯМИ ГРИБНЫХ БОЛЕЗНЕЙ С РАЗЛИЧНОЙ СТРАТЕГИЕЙ ПИТАНИЯ

г

03.01.05- физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа-2015

005567648

005567648

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»

Научный руководитель:

Новосёлова Евдокия Ивановна доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Плотникова Людмила Яковлевна доктор биологических наук, профессор

Профессор кафедры агрономии, селекции и семеноводства ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет им. П.А.Столыпина»

Иванов Игорь Игоревич доктор биологических наук

Старший научный сотрудник лаборатории физиологии растений ФГБУН Института биологии Уфимского научного центра Российской академии наук

Ведущая организация:

ФГБНУ Всероссийский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова

Защита диссертации состоится « 29 » января 2015 г. в «14.00» часов на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 при ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет» по адресу: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332.

Факс (347)273-67-78, e-mail: disbiobsu@mail.ru

Официальный сайт БашГУ: http://www.bashedu.ru

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет»: http://www.bashedu.ru/.

Автореферат разослан « /6 » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н.

М.Ю. Шарипова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследований. Возбудители грибных болезней наносят значительный ущерб урожайности и качеству продукции растениеводства. Степень устойчивости растений к патогенам определяется не только их генотипическими и фенотипическими параметрами, но и в значительной степени зависит от особенностей паразитирующего организма (Дьяков и др., 2012). Проникновение патогена в растительные ткани и его дальнейшее развитие обеспечивается набором специфических ферментов, токсинов, гормонов (Gechev et al., 2006; Озерецковская и др.: 2009; Galvez-Valdivieso et al., 2010). В растительных тканях выявлен целый ряд соединений, участвующих в реализации защитных реакций, среди которых лектины, ингибиторы гидролаз. пероксидазы, оксалатоксидазы. хитиназы (Zhang et al., 2004; Копарев и др., 2006; Falcon et al.. 2008: Мосолов и др., 2009; Ибрагимов и др.. 2010; Sami, Shakoori, 2011). Более того, обнаружены вещества, запускающие в растениях цепь ответных биохимических и физиологических процессов при воздействии патогена. В частности, такую роль могут выполнять салициловая и жасмоновая кислоты, перекись водорода, оксид азота, олигосахариды (Horvath et al., 2002; Озерецковская и др., 2009; Egusa et al., 2009; Pieterse et al., 2012).

Несмотря на большой массив данных в этой области, физиологические и биохимические особенности взаимодействия растений с патогенными микроорганизмами, характеризующимися различным типом паразитизма, остаются пока малоизученными. В этом плане весьма ценные сведения могли бы дать исследования параметров возбудителей болезней, определяющих их патогенные и вирулентные свойства, а также возможности искусственного индуцирования защитных реакций растений с учетом особенностей растения-хозяина и патогена.

Цель исследования: выявление особенностей формирования совместимых/несовместимых взаимоотношений пшеницы и картофеля ■ с возбудителями грибных болезней с различным типом трофности. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ морфофизиологических параметров Tilletia caries, Bipolaris sorokiniana, Phytophthora infestans из различных агроценозов.

2. Исследовать характер изменения содержания перекиси водорода и активности про-/антиоксидантных ферментов при инфицировании растений пшеницы и картофеля возбудителями грибных болезней с биотрофным. некротрофным, гемибиотрофным типом питания.

3. Изучить факторы, влияющие на формирование агрессивных свойств возбудителей грибных болезней с различной стратегией питания.

4. Провести сравнительное изучение развития защитных реакций пшеницы и картофеля in vitro и in vivo под воздействием салициловой и жасмоновой кислот.

5. Исследовать формирование реакций индуцированной устойчивости пшеницы и картофеля к грибным патогенам под воздействием биопрепаратов.

Научная новизна. Выявлена аналогия развития защитного ответа под воздействием обработки СК и ЖК у пшеницы и картофеля к возбудителям грибных болезней с различным типом трофности, опосредованная накоплением Н2О2 в растительных тканях. Формирование устойчивости растений пшеницы к некротрофному патогену В. эогокгтапа происходит на эктофитной стадии развития гриба. Агрессивные штаммы гемибиотрофного гриба РИ. ¡п[ез1ат обладают способностью подавлять развитие защитных реакций у картофеля путем снижения продукции Н202 вследствие активации каталазы.

Практическая значимость работы. Совокупность полученных данных позволяет расширить представления о механизмах развития защитного ответа в растениях пшеницы и картофеля к возбудителям болезней с различным типом питания, об особенностях формировании агрессивных форм в популяциях патогенов. Результаты исследований могут быть использованы при создании нового' поколения антимикробных препаратов, новых методов ДНК-диагностики возбудителей грибных болезней. Научные положения исследований рекомендуется использовать в качестве учебного материала по дисциплинам: физиология и биохимия растений, экология, фитопатология, защита растений.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на: всероссийском симпозиуме «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии» (Москва, 2011); международной конференции студентов и молодых ученых «Мир науки» (Алматы, 2012); III Международной научно - практической конференции (Запорожье, 2012); всероссийской молодежной конференции «Экотоксикология» (Уфа. 2012); II всероссийской международной школе - конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, 2012); международной научной конференции «Достижения и перспективы развития биотехнологии» (Саранск, 2012); VI международной конференции молодых ученых «Биоразнообразие. Экология. Адаптация. Эволюция» (Одесса, 2013); всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013); всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биохимии и биотехнологии» (Уфа, 2013); международной научно-практической конференции «Практико-ориентированные биотехнологические исследования в растениеводстве, животноводстве и медицине» (Брест, 2013); Всероссийской молодёжной научно-практической конференции «Экологические проблемы регионов» (Уфа, 2013); V международной научной конференции «Восстановление нарушенных природных экосистем (Донецк, 2014); Всероссийской конференции с международным участием «Биотехнология - от

науки к практике», (Уфа, 2014); V всероссийской с международным участием конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Полевые и экспериментальные исследования биологических систем» (Ишим, 2014).

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 20092013 годы (ГК Министерства образования и науки РФ в рамках государственного задания, К» госрегистрации 01201456414).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 257 источников. Диссертация содержит 18 таблиц и 20 рисунков.

Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н., проф. Новоселовой Е.И., заведующему кафедрой биохимии и биотехнологии БашГУ д.б.н., проф. Ибрагимову Р.И., сотрудникам ИБГ УНЦ РАН д.б.н. Трошиной Н.Б.. к.б.и. Суриной О.Б.; к.б.н. Кулуеву Б.Р., к.б.н., доц. БГАУ Исаеву Р.Ф за научно-методическое руководство, оказанное при проведении исследований, всем соавторам за неоценимую помощь при выполнении и обсуждении работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили на растениях пшеницы (Triticum aestivum L.) сортов Башкирская 24. Башкирская 26, Авиада, Жница, на растениях и клубнях картофеля {Solanum tuberosum L.) сортов Удача, Башкирский, Невский, Луговской. Семенной материал был получен в Чишминском и Бирском ОПХ (Республика Башкортостан). Грибы - возбудители твердой головни Tilletia caries (DC) Tul., корневой гнили Bipolaris sorokiana (Sacc.) Shoenaker., фитофтороза Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу, были выделены из производственных посевов Уфимского, Чишминского, Балтачевского, Бирского районов (Республика Башкортостан)-

Семена пшеницы перед проращиванием стерилизовали, после чего, в зависимости от целей эксперимента, выращивали в стерилизованном песке, вермикулите или в кюветах на фильтровальной бумаге на дистиллированной воде. Для выделения грибов в чистую культуру использовали листья, корни, стебли пшеницы, а также клубни и листья картофеля (Бенкен и др., 1988). Инфицирование семян пшеницы спорами Т. caries проводили по традиционной

методике (Кривченко. 1984). Заражение проростков В. sorokiniana осуществляли путем полива семисуточных проростки пшеницы суспензией спор патогена из расчета 10б конидий/мл (Кумачева, Попов. 1976). Степень поражения проростков оценивали по выраженности симптомов корневых гнилей в основании 2-ого листа (Эльчибаев, 1981; Чулкина, 1985). В части экспериментов суспензию конидий В. sorokiniana наносили на листья (Дементьева, 1985). Степень инфицирования растений картофеля грибом Ph. infestans оценивали по проценту поражения листовой пластины (Воловик и др., 1995).

Фунгицид Байтан. CK. ЖК в различных концентрациях вводили в среду инкубации каллусов пшеницы и картофеля, добавляли в среду культивирования фитопатогенных грибов. Биопрепараты (Фитоспорин М, Гуми 20, Ризоплан) использовали для предпосевной обработки семян пшеницы и клубней картофеля. В качестве эксплантов для получения каллусной ткани использовали незрелые зародыши мягкой пшеницы сорта Жница и листья картофеля сорта Луговской, растущие на полной питательной среде MC (Шаяхметов. 1999). Развитие Т. caries и Ph. infestans оценивали в каллусах, фиксированных в смеси этанола и уксусной кислоты (3:1). Индукцию защитного ответа под воздействием CK и ЖК выявляли в модельной системе на дисках картофеля (Озерецковская и др., 2009). Отложение лигнина оценивали по автофлуоресценции фиксированных в 96 % этаноле листьях (Schafer et al., 2004; Плотникова. Штубей, 2009). Микроскопические исследования проводили на микроскопе Imager Ml («CarlZeiss», Германия).

Для выделения белков растительную ткань гомогенизировали в 0,01 М Ыа-фосфатном буфере. pH 6,2. Гомогенат центрифугировали, в супернатанте спектрофотометрически оценивали активность пероксидазы, оксалатоксидазы, каталазы. Активность пероксидазы и оксалатиоксидазы определяли по окислению ОФД. Оценку активности каталазы проводили с использованием молибдата аммония. Содержание Н2О2 в растительных тканях определяли с помощью красителя ксиленолового оранжевого (Bindschedler et al., 2001). Концентрацию белка в образцах оценивали по методу Бредфорд (Bradford, 1976). ДНК из растений и грибов выделяли фенольно-детергентным методом (Chomezynski, 1987) с модификациями. РНК - реагентом Trizol по рекомендациям фирмы-изготовителя. кДНК получали с помощью набора, содержащего обратную транскриптазу (Силекс, Россия). Поиск гомологичных генов и выравнивание нуклеотидных последовательностей осуществляли при помощи программы Megalign из пакета программ Lasergene (DNASTAR, Inc., США). ПЦР проводили со стандартным набором реагентов (ДНК-технология). Эксперименты проводили в трехкратной биологической и четырехкратной аналитической повторностях. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ Stat Soft (Statistica 6.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ морфофизиологических свойств Т. caries из различных агробноценозов

К числу распространенных и вредоносных патогенов зерновых культур относятся головневые грибы, борьба с которыми в настоящее время является важной задачей (Рупухова, 2005). В хозяйствах Уфимского района (место сбора изолята №1) с 2001 г для защиты сельскохозяйственных растений преимущественно использовались фунгициды азолового ряда и бензимидазолы (Раксил, Барьер-колор, Доспех, Виал, Винцит, Байтан универсал), а в Балтачевском районе (место сбора изолята 2) - в основном биологические средства защиты растений (Фитоспорин М, Интеграл, Гуми 20. Планриз). Наблюдения за ростом гриба Т. caries на каллусах, культивируемых на среде МС, показали, что споры изолята 1 начинали прорастать в среднем через 5 сут после инокуляции, а спустя 15 сут мицелий покрывал 83,6±2,8 % поверхности каллусов (таблица 1).

Таблица 1. Влияние Байтана на площадь поверхности каллусов, покрытую мицелием Т. caries (%). 15 сут после инокуляции _

Вариант Изолят 1 Изолят 2

Контроль 83,6±2,8 38.3±1,6*

Байтан 0,1 мг/л 82,3±3.4 21.0±1,0**

Байтан 1,0 мг/л 17,8±0,8** мицелий отсутствует

Примечание - *- Различия достоверны при Р < 0,05 по отношению к

изоляту 1, ** - по отношению к соответствующему контролю.

Прорастание спор изолята 2 происходило значительно позже (в среднем через 10 сут после их нанесения), а спустя 15 сут мицелий покрывал около 40 % поверхности каллусов (таблица 1). Введение в среду культивирования каллусов 0,1 мг/л Байтана задерживало прорастание спор изолята 2 примерно на 10 суток. Скорость распространения по каллусу этого изолята также снижалась: через 15 сут после прорастания спор мицелий гриба покрывал около 20 % поверхности каллусов (таблица 1). Добавление Байтана в концентрации 1.0 мг/л в среду МС приводило к полному подавлению прорастания спор изолята 2 гриба Т. caries. Вместе с тем, введение в среду культивирования 0,1 мг/л Байтана не оказывало влияние на скорость прорастания спор и рост изолята 1 (таблица 1). Снижение скорости роста этого изолята на каллусах наблюдалось только при добавлении в среду культивирования Байтана в концентрации 1,0 мг/л. Сравнение нуклеотидных последовательностей этих изолятов показало высокий уровень гомологии между ними, но были обнаружены и однонуклеотидные замены. Таким образом, из агроценозов с различной пестицидной нагрузкой выделены природные изоляты Т. caries, отличающиеся сроками прорастания спор и устойчивостью к фунгициду in vitro.

Влняние СК и ЖК на развитие Т. canes и формирование защитного ответа у пшеницы

Кроме фунгицидов, средствами борьбы с грибными болезнями растений являются интермедиа™ сигнальных систем и стрессовые фитогормоны. Механизмы индукции защитного ответа растений такими препаратами до конца не раскрыты. Анализ срезов инфицированных каллусов пшеницы показал, что развитие возбудителя твердой головни в контрольных каллусах и каллусах, растущих на средах с добавлением СК и ЖК, имело черты сходства. Однако скорость проникновения гифов гриба внутрь каллуса, а также степень развития воздушного мицелия на контрольных и опытных каллусах различались (таблица 2).

Таблица 2. Влияние СК и ЖК на рост Т. caries на каллусах пшеницы в _ разные сроки совместного культивирования__

Параметры Среда культивирования Время после инокуляции, сут

7 14 21

Размер инфицированных зон. % от диаметра каллуса МС 4,3±0,3 6,7±0,4 14,1±0,8

МС+СК 3,4±0,2 4,5±0,2 7,6±0.3

МС+ЖК 3,0±0,2 3,2±0,2 7,8±0,4

Толщина слоя воздушного мицелия, % от диаметра каллуса МС 5,(Ж),6 8,8±0,7 20.7±1,9

МС+СК 3,5±0,2 5,0±0,3 15,2±1,1

МС+ЖК 3,4±0,2 6,6±0,4 12,8±0,7

Проявления индуцированной устойчивости каллусов к возбудителю твердой головни становились ярко выраженными через 21 сут после инокуляции, когда размеры инфицированных зон контрольных каллусов превосходили соответствующие показатели каллусов, растущих на средах с СК или ЖК, примерно в 2 раза. Аналогичные результаты были получены при исследовании степени развития воздушного мицелия.

Некоторые механизмы повышения под влиянием СК и ЖК устойчивости пшеницы к Т. ссичез могли быть обусловлены продукцией Н202 (ОаКег-Уа1(Зтехо. МиШпеаих 2010). Как показали результаты исследований, в предобработанных СК и ЖК проростках содержание 11202 превышало показатель конгрольных растений (рисунок 1). Инфицирование проростков вызывало повышение в них уровня Н202, при этом в обработанных растениях накопление Н202 было выше, чем в необработанных.

Изменение концентрации Н2Ог в растительных тканях может происходить в результате многих метаболических процессов, но в большей степени, вероятно, в результате изменения активности ферментов про-/антиоксидантной системы.

Рисунок 1. Изменение содержания Н202 в проростках пшеницы сорта Жница под влиянием обработки СК и ЖК и инфицирования Т. caries.

1 - неинфицированные проростки,

2 - инфицированные проростки.

3 - обработка СК, 4 обработка СК + инфицирование, 5 - обработка ЖК;

6 - обработка ЖК + инфицирование.

Анализ влияния СК и ЖК выявил их индуцирующее действие на экспрессию гена оксалатоксидазы, как в здоровых проростках пшеницы, так и при инфицировании Т. caries. Различия в воздействии исследуемых индукторов устойчивости заключались в величине и сроках максимального повышения экспрессии гена оксалатоксидазы. В варианте опыта с использованием ЖК в неинфицированных и инфицированных проростках интенсивная экспрессия гена оксалатоксидазы регистрировалась уже через 3 сут от начала опыта, тогда как в варианте опыта с использованием СК — через 5 сут. Стимулирующий эффект на экспрессию Гена пероксидазы начинал проявляться через 5 сут после обработки СК и на 10 сут после обработки ЖК. Причем, индуцирующее действие ЖК на экспрессию гена пероксидазы было значительно выше, чем у СК, как в неинфицированных проростках, так и при заражении Т. caries. Важная роль в регуляции уровня Н202 в растениях отводится каталазам (Kawano et al:', 2003; Максимов и др., 2004). В наших исследованиях в инфицированных Т. caries проростках пшеницы активность каталазы на протяжении эксперимента возрастала в среднем на 30%. СК и ЖК оказывали ингибирующее- действие на активность каталазы, что также способствовало накоплению Н202.

Влияния биопрепаратов на развитие возбудителя твердой головни пшеницы в зависимости от инфекционной нагрузки

Для широкого применения биопрепаратов в растениеводстве необходимы сведения о связи их защитного действия с патогенными свойствами возбудителя болезни. В качестве контроля были взяты посевы пшеницы без искусственной инокуляции семян спорами возбудителя твердой головни Т. caries (естественный фон). Степень лораженности растений в контроле составляла от 0 до 76 %, а в условиях опытов она варьировала от 0 до 71 %, в зависимости от начальной инфекционной на1рузки на семена и используемого препарата (рисунок 2). Причем, в условиях низкой инфекционной нагрузки (0,01 г/кг) различий в степени пораженное™ между контролем и опытными растениями не наблюдается.

70

40

20

30

50

60

10

0

-о- Контроль □ Гуми-М о Гуми-М + СК -а фитоспорин фитоспорин + СК

-10

-2

О

2

4

6

8

10

12 ■ СК

Нагрузка, г/кг

Рисунок 2. Зависимость степени пораженное™ растений пшеницы сорта Жница Т. caries от инфекционной нагрузки на семена и обработки защитным препаратом.

По оси X - инфекционная нагрузка (г/ кг); по оси Y - степень пораженности посевов (%). Сравнение проводили с помощью критерия Стьюдента для зависимых переменных с принятым уровнем значимости 0,05.

Достоверные различия появляются при повышении инфекционной нагрузки на семена до 0,2 г/кг. Максимальным защитным эффектом против Т. caries при высокой степени инфекционной нагрузки оказывал препарат Гуми М

Влияние условий культивирования на рост и развитие В. нигокш 'шпа

Корневые гнили продовольственных культур, вызываемые патогеном с некротрофным типом питания В.зогоктшпа, являются весьма распространенным и вредоносным заболеванием. В связи с интенсивным применением против них химических средств защиты растений актуальными являются исследования по изучению развития резистентности В.хогоМтапа к фунгицидам. Анализ размеров колоний штамма В. $огокШапа показал, что постепенное увеличение концентрации Байтана в среде культивирования существенно замедляло рост гриба. Так, после многократного пассирования на среде Чапека, насыщаемой Байтаном до концентрации 0,02 %, размер колоний уменьшался от 30,6±1,1 мм до 12,4±0,9 мм против 26,3±1,2 мм в отсутствии Байтана (таблица 3). Посев В.зогок'т'шпа непосредственно на среду с добавлением Байтана в концентрации 0,02% приводил к гибели культуры. Таким образе,'м, при культивировании В.хогокМапа на среде с постепенным

+ СК.

повышением концентрации Байтана был получен устойчивый к нему штамм гриба.

Таблица 3. Влияние условий культивирования на рост B.sorokiniana

Вариант опыта Диаметр колоний, мм

22 "С, pH 7,0 (контроль) 37 °С, pH 7.0 22 "С. pH 2,0

Первый пассаж 30,6±1,1 23,2±1.3 6,7±0,5

Пятый пассаж 26,3±1,2 18.8±1.2 4,2±2.3

Пятый пассаж на среде с Байтаном 12,4±0,9 21,0±1,4 10,7±2,0

Сопоставление скорости развития B.sorokiniana при различных условиях культивирования позволило заключить, что рост исходного штамма, пассируемого на чистой питательной среде, угнетался как при повышении температуры среды (диаметр колоний уменьшался на 25-30 %), так и при снижении pH среды до 2,0 (на 80-85 %). Скорость роста резистентного штамма существенно отличалась от скорости роста чувствительного штамма: снижение pH среды угнетало развитие гриба, однако диаметр колоний уменьшался при этом только на 14%, а подъем температуры до 37 С ускорял рост гриба в 1,7 раза. Полученные данные означают, что штамм B.sorokiniana одновременно с приобретением устойчивости к Байтану приобретал неспецифическую устойчивость к изменению температуры и pH среды.

Влияние генотипа растения-хозяина на морфофшиологические параметры В. sorokiniana

Экологически безопасным способом защиты продовольственных культур от корневой гнили является использование устойчивых сортов. Однако для их внедрения и широкого использования необходимо исследовать особенности взаимоотношений растения-хозяина и фитопатогена. В лабораторных опытах выявлено, что степень развития корневых гнилей у растений пшеницы сорта Жница достигала 35 %, сорта Авиада - 25 % и 10 - 15 % - у пшеницы сортов Башкирская 26 и Башкирская 24 соответственно (таблица 4).

Таблица 4. Развитие Bipolaris sorokiniana на листьях пшеницы __различных сортов__

Сорт Степень развития патогена, % Число проросших конидий, %

Башкирская 24 15±1,1 28±1.9

Башкирская 26 10±1,2 23±1,3

Авиада 25±1,8 41 ±3,1

Жница 35±2,3 50±4.2

Интересно, что количество проросших конидий на листьях устойчивой пшеницы сорта Башкирская 26 было в 2 раза меньше, чем на листьях восприимчивой пшеницы сорта Жница. Кроме того, при развитии В. sorokiniana на листьях устойчивой пшеницы помимо нормальных, появлялись более длинные ростДО.вые трубки (56,2±1,0 мкм), а также ростковые трубки, растущие поверхностно и не проникающие под эпидермис. Возможно, причиной наблюдаемого аномального развития В. sorokiniana на листьях устойчивого сорта пшеницы явилось обильное отложение в клеточной стенке лигнина.

Влияние CK и ЖК на устойчивость пшеницы к В. sorokiniana

Развитие устойчивости растений против возбудителей грибных болезней осуществляется в результате включения многих неспецифических защитных реакций, таких как генерация АФК и синтез PR- белков (Suzuki, Mittler. 2006: Креславский и др., 2012). Биохимический анализ выявил, что инфицирование листьев В. sorokiniana вызывает повышение в них уровня Н202 (таблица 5).

Таблица 5. Содержание Н202 в листьях пшеницы сорта Жница при

обработке CK и ЖК и заражении В. sorokiniana, мкМУг сырого веса

Вариант Время после инокуляции, ч

24 ^ 48 72

контроль 6,3 ±0,02 7,6 ±0,03 6,9 ±0,04

инфицирование 10,7±0,91 9.8±0,98 8,1 ±0,84

СК 8.4±0,03 10.1±0,05 8,4±0,02

СК + инфицирование 17,1 ±0,98 15,4±0,96 13,8±0,89

ЖК 7,9±0,02 10,7±0,84 8,7±0,71

ЖК + инфицирование 11,6±0,86 18,1 ±0.93 14,6±0,97

В листьях предобработанных СК и ЖК растений уровень накопление Н202 был значительно выше, чем в листьях необработанных растений. Были получены данные, указывающие на вклад оксалатоксидазы в накопление Н202: предобработка растений ЖК повышала активность оксалатоксидазы в среднем в 2-3 раза, предобработка СК - в 1,5-2 раза. Известно, что перекись водорода опосредует лигнификацию клеточной стенки, укрепляя ее барьерные свойства (Макапс1аге1а1.,2010).

Развитие В. 5огокМапа сопровождалось появлением интенсивной зеленой флуоресценции, указывающей на накопление лигнина, в устьичных клетках и в прилежащих к ним эпидермальных и мезофилльных клетках в зоне роста гриба (рисунок 3). В варианте опыта с предобработкой растений ЖК количество флуоресцирующих клеток возрастало, однако в варианте опыта с предобработкой СК этот параметр был близок к значению показателя у инфицированных необработанных растений.

а б в

Рисунок 3. Автофлуоресценция лигнина в инфицированных В. sorokinlana листьях пшеницы, предобработанных СК и ЖК. I - 24 ч, II - 36 ч после инокуляции, а - контроль, б - обработка СК, в - обработка ЖК.

Итак, инфицирование листьев пшеницы грибом В. sorokiniana вызывает активацию оксалатоксидазы, накопление Нг02 и отложение в клеточной стенке лигнина. СК и ЖК регулируют эти процессы, поэтому предобработка растений исследуемыми соединениями повышает устойчивость пшеницы к патогену.

Особенности формирования взаимоотношений в системе «Solanum tuberosum - Ph. infestans»

Основной причиной резкого усиления вредоносности фитофтороза картофеля является значительное изменение структуры популяции возбудителя болезни (Рогозина, 2011 ). Поэтому весьма важным представляется изучение агрессивных свойств штаммов Ph. infestans из различных популяций. Так выявлена высокая продуктивность спороношения (2x104 конидий/мл) и большая площадь некротизированных участков н^ листьях картофеля (31,2±1,7%) при инфицировании высокоагрессивными штаммами гриба из северной лесостепи по сравнению с низкоагрессивными штаммами (3x102 конидий/мл и 1 1.3±0.9% соответственно), выделенными с картофельных полей южной лесостепи. Биохимический анализ показал, что через 24 ч после инокуляции высокоагрессивным штаммом в листьях картофеля в 3 раза возрастала продукция Н202 которая снижалась входе патогенеза (48 ч). При инфицировании низкоагрессивными штаммами интенсивная генерация Н202 прослеживалась на протяжении 72 ч. Вероятно, высокоагрессивные штаммы через снижение продукции Н202 могут подавлять развитие защитных реакций картофеля. Удобной моделью для изучения механизмов развития защитного ответа картофеля к Ph infestans под воздействием сигнальных молекул

являются каллусы картофеля, на которых можно наблюдать развитие гриба на экто- и эндофитных стадиях развития. Так культивирование каллусов на средах, содержащих CK и ЖК, через 24 ч после инокуляции тормозило рост грибов (рисунок 4). CK и ЖК оказывали защитное действие на каллусы и клубни картофеля против Ph infestons, снижая степень некротизации растительных тканей.

Рисунок 4. Развитие Ph. infestans на каллусах картофеля сорта Луговской. I — 24 ч после инфицирования, II - 48 ч после нфицирования. а - контроль (среда MC); б - MC + CK; в - MC + ЖК. Ув.: ок. 10х. об. 10х.

Основным орудием нападения патогенов являются продуцируемые ими гидролитические ферменты и токсины (Schlüter et al., 2010). Ответная защитная реакция растений сопровождается синтезом ингибиторов этих ферментов (Валуева, Мосолов. 2002; Ma et al., 2011). Исследования показали, что уровень транскрипционной активности гена ингибитора протеиназы в клубнях картофеля достоверно возрастал по сравнению с контролем через 48 ч после инфицирования (рисунок 5).

Рисунок 5. Транскрипционная активность гена ингибитора протеиназы в клубнях картофеля сорта Луговской при обработке СК и ЖК и инфицировании Ph. infestans. % к контролю, 100% 1 - контроль, 2 - инфицирование Ph infestans, 3 - обработка СК, 4 -обработка СК + Ph infestans, 5 -обработка ЖК. 6 - обработка ЖК+ Ph infestans.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что при всех примененных способах обработки, СК и ЖК оказывают влияние на развитие Ph infestans на эктофитной и эндофитной стадиях развития. Оно выражалось в изменении морфологии мицелия патогенного гриба и снижении его проникающей способности в ткани картофеля.

Выводы

1. Выявлена аналогия развития защитных реакций клубней и каллусов картофеля к инфицированию возбудителем фитофтороза Phytophthora infestons, опосредуемая накоплением H;Oj в растительных тканях под воздействием обработки индукторами устойчивости (салициловой и жасмоновой кислотами). В растениях картофеля защитное действие жасмоновой кислоты обусловлено стимуляцией транскрипционной активности гена ингибитора протеиназы.

2. Формирование устойчивости растений пшеницы к некротрофному патогену Bipolaris sorokiniana происходит на эктофитной стадии развития гриба. Предпосевная обработка семян салициловой и жасмоновой кислотами способствует интенсификации защитных реакций: активации оксалатоксидазы. накоплению Н2О2 и раннему отложению лигнина в зоне инфицирования.

3. Развитие защитного ответа пшеницы к возбудителю твердой головни Tilletia caries in vitro и in vivo опосредовано накоплением М2О2 при участии про-и антиоксидантных ферментов. Салициловая и жасмоновая кислоты повышают устойчивость пшеницы, подавляя эктофитное развитие возбудителя путем регулирования активности защитных ферментов: оксалатоксидазы, пероксидазы. каталазы.

4. Показана зависимость пораженности растений пшеницы возбудителем твердой головни от степени инфекционной нагрузки на семена и использования защитных биопрепаратов (Фитоспорин, Гуми, СК). В предобработанных биопрепаратами растениях происходит достоверное снижение степени пораженности Tilletia caries при инфекционной нагрузке на семена в интервале 0,2-10 г/кг.

5. Агрессивные штаммы гемибиотрофного гриба Phytophthora infestons характеризуются высоким показателем спороношения, способностью вызывать интенсивную некротическую реакцию на листьях и клубнях картофеля, подавлять развитие защитных реакций растений за счет снижения содержания Н2О2 в инфицированных тканях вследствие активации каталазы.

6. Выявлены морфологические и физиологические различия между природными изолятами биотрофного патогена Tilletia caries, собранными с растений пшеницы из агроценозов с различной пестицидной нагрузкой. Различия касаются сроков прорастания спор, скорости роста гриба на каллусах пшеницы как в присутствии фунгицида в среде культивирования, так и в его отсутствии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ

1. Шпирная, И.А. Иммуностимулирующий эффект препаратов -биорегуляторов при обработке клубней картофеля / И.А.Шпирная, А.Р.Ахатова, В.О.Цветков, Л.М.Яруллина, М.А.Артемьева. Р.И.Ибрагимов // Известия Самарского научного центра РАН. 2011. Т.13. №5 (3). С. С221-

224.

2. Яруллина, Л.Г. Морфофизиологическая и генетическая характеристика возбудителя твердой головни пшеницы Tilletia caries из агроценозов Южного Урала с различной пестицидной нагрузкой / Л.Г.Яруллина, Н.Б.Трошина, О.Б.Сурина, Б.Р.Кулуев, Р.Ф.Исаев, А.Р.Ахатова, Р.И.Касимова, Л.М.Яруллина, Р.И.Ибрагимов // Агрохимия. 2014. №2. С. 60 - 65.

3. Яруллина, Л.Г. Оценка устойчивости к фунгицидам в культуре in vitro изолятов гриба Tilletia caries Tul. из различных агроклиматических зон Республики Башкортостан / Л.Г.Яруллина. О.Б.Сурина, Б.Р.Кулуев, И.А.Умаров, Л.М.Яруллина, Р.И.Ибрагимов // Известия Самарского научного центра РАН. 2013. Т. 15. №3 (5). С.1541-1544.

Публикации в других изданиях

4. Yarullina, L.G. Comparative Study of Bunt PathogenResistance to the Effects of Fungicides in Callus Co-Cultures Triticum aestivum with Tilletia caries / L.G. Yarullina, RT.Kasimova, B.R.Kuluev, O.B.Surina, L.M.Yarullina, R.I.Ibragimov // Agricultural Sciences. 2014. V. 5, № 10. P. 906-912.

5. Яруллина, Л.М. Роль антиоксидантных ферментов в формировании устойчивости растений к ионам кадмия / Л.М.Яруллина // Всероссийский симпозиум экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные технологии. Москва. 2011. С. 166.

6. Умаров, И.А. Структура микробных сообществ различных агробиоценозов / И.А.Умаров, Л.М.Яруллина, Е.И.Новоселова, Р.И.Ибрагимов // Международная конференция студентов и молодых ученых "Мир науки". Алматы. 2012. С. 158.

7. Яруллина, Л.Г. Влияние экологических факторов на морфологические параметры возбудителей грибных болезней культурных растений. / Л.Г.Яруллина, Р.И.Ибрагимов, Л.М.Яруллина. И.А.Умаров / 111 Международная научно - практическая конференция. Запорожье. 2012. С. 445 - 446.

8. Яруллина, Л.М. Влияние экологических факторов на физиологические показатели возбудителя фитофтороза картофеля / Л.М.Яруллина, И.А.Умаров, Р.И.Ибрагимов, Е.И.Новоселова // Всероссийская молодежная конференции "Экотоксикология". Уфа. 2012. С. 105.

9. Яруллина, JI.M. Изучение морфофизиологических параметров возбудителей болезней культурных растений из различных агробиоценозов / Л.М. Яруллина. И.А.Умаров // II Всероссийская международная школа - конференция молодых ученых ./'Биология будущего: традиции и новации". Екатеринбург. 2012'. С. 53 - 54. .

Ю.Яруллина, Л.Г. Мониторинг чувствительности' патогенных . грибов к фунгицидам в культуре in vitro / Л.Г: Яруллина Н.Б.Трошина, О.Б.Сурина, Р.Ф.Исаев, И.А.Умаров, Л.М.Яруллина, Р.И.Ибрагимов // Международная научная конференция:' "Достижения и перспективы развития биотехнологии". Саранск. 2012; С. 99.

11 .Яруллина, Л.М. Влияние почвенно - климатических факторов на морфологические и физиологические показатели Septoria nodorum / Л.М. Яруллина, И.А.Умаров //1VI Международная конференция молодых ученых "Биоразнообразие. Экология. Адаптация. Эволюция'". Одесса. 2013. С.60-61. - ' ■ -'V-- : . ;

12.Ибрагимов, Р.И. Регуляция активности ингибиторов гидролаз в тканях пшеницы и картофеля при 'инфицировании грибными ¡ патогенами / Р.И.Ибрагимов, ' Й:А.П1нирйая,- Л.М.Яруллина И.АУмаров, Е.И.Новоселова // Тезисы докладов Всероссийской научной конференции с международным участием "Инновационные направления современной физиологии растений" Москва. 2013. С. 275 - 276.

13.Умаров. И.А. Анализ агрессивных свойств грибов рода Fusarium из различных агробиоценозов Южного Урала / И.А.Умаров, Л.М.Яруллина Р.И.Ибрагимов // Материалы Всероссийской конференции с международным участием '"Современные проблемы биохимии и биотехнологии". Уфа. 2013. С. 210 - 213.

Н.Яруллина Л.Г. Сравнительная оценка параметров Tilletia caries Tul. из различных почвенно - климатических зон Южного Урала / Л.Г.Яруллина, Б.Р.Кулуев, О.Б.Сурина, Р.Ф.Исаев, Л.М.Яруллина Р.И.Ибрагимов // Материалы Международной научно-практической конференции "Практико-ориентированные биотехнологические исследования в растениеводстве, животноводстве и медицин". Брест. 2013. С. 111 - 114.

15.Яруллина, Л.М. Сравнительная оценка физиологических параметров Phytophthora infestans при различных стратегиях защиты растений / Л.М.Яруллина И.А.Умаров. Р.И.Ибрагимов // Тезисы Всероссийской молодёжной научно-практической конференции «Экологические проблемы регионов. Уфа 2013. С. 88-89.

16.Яруллина Л.М. Влияние генотипа растения - хозяина на морфофизиологические параметры возбудителя корневой гнили пшеницы ¡¡¡polaris sorokiniana / Л.М.Яруллина И.А.Умаров. Е.И.Новоселова // Труды Международной научной конференции и школы молодых ученых

«Физиология растений - теоретическая основа инновационных arpo- и фитобиотехнологий». Калининград. 2014. С. 521-523.

П.Яруллина, J1.M. Влияние экологических факторов на взаимоотношения в системе «растение - патоген» / Л.М.Яруллина, И.А.Умаров, Е.И.Новоселова, Р.И.Ибрагимов // Тезисы V международной научная конференции «Восстановление нарушенных природных экосистем». Донецк. 2014. С. 411-412.

18. Яруллина. Л.М. Анализ структуры популяций Phytophthora infestans в различных агробиоценозах Южного Урала / Л.М.Яруллина // Материалы V Всероссийской (с международным участием) конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Полевые и экспериментальные исследования биологических систем». Ишим. 2014. С. 97-101.

19.Яруллина, Л.М. Влияние биопрепаратов на защитный потенциал и устойчивость растений картофеля к фитофторозу / Л.М.Яруллина, И.А.Умаров, Р.Ф.Исаев, Е.И.Новоселова, Р.И.Ибрагимов // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Биотехнология - от науки к практике». Уфа. 2014. Т 1. С. 202-204.

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода; ЖК - жасмоиовая кислота; МС - среда Мурасиге и Скуга; ОПХ - опытное производственное хозяйство;

ПААГ - полиакриламидный гель; ПЦР - полимеразная цепная реакция; СВЧ-реакция - сверхчувствительная реакция;

СИУ - системная индуцированная

устойчивость;

СК - салициловая кислота;

ФБ - Иа-фосфатный буфер;

ФЭК - фотоэлектроколориметр;

Н202 - перекись водорода;

РЯ-белки - патоген-индуцированные

белки.

ГТР> 1/1 Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принт+», ___у заказ № 375, тираж 100. 450054, пр. Октября, 71.