Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гидролитические ферменты и их белковые ингибиторы в регуляции защитного ответа растений пшеницы на инфицирование грибными патогенами

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гидролитические ферменты и их белковые ингибиторы в регуляции защитного ответа растений пшеницы на инфицирование грибными патогенами"

На правах рукописи

АХАТОВА АЛЬБИНА РАШИТОВНА

ГИДРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ И ИХ БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ В РЕГУЛЯЦИИ ЗАЩИТНОГО ОТВЕТА РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ НА ИНФИЦИРОВАНИЕ ГРИБНЫМИ ПАТОГЕНАМИ

03.01.05 — физиология и биохимия растении

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 ИЮН 2015

Уфа - 2015

005569665

005569665

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Доктор биологических наук Яруллина Любовь Георгиевна

Плотникова Людмила Яковлевна,

доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Омский государственный аграрный университет им. П.А.Столыпина», профессор кафедры агрономии, селекции и семеноводства

Марданшнн Ильдар Салимьянович,

кандидат биологических наук, ФГБНУ Башкирский НИИ сельского хозяйства, заведующий лабораторией селекции и семеноводства картофеля

ФГБУН Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук

Защита состоится « /» октября 2015 года в «14:00» на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный университет» по адресу: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332.

Факс (347)273-67-78, e-mail: disbiobsu@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет» http://www.bashedu.ru

Автореферат разослан <<*1Р » —_2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.б.н.

М.Ю. Шарипова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. На протяжении всего онтогенеза сельскохозяйственные растения подвергаются атаке патогенными микроорганизмами, которые наносят значительный ущерб урожайности и качеству продукции растениеводства. Способность возбудителей болезней к внедрению и распространению в растительных тканях во многом определяется активностью их гидролитических ферментов (Рубин и др., 1975; Basaran et al., 2007; Protsenko et al., 2010; Van den Brink, De Vries, 2011; Кудрявцева и др., 2013; Silva et al., 2013).

Эффективным механизмом, препятствующим проникновению фитопатогенов в растение и распространению по нему, служит процесс подавления активности гидролаз специфическими ингибиторами (Хадеева и др., 2009; Ревина и др., 2010; Kalve et al., 2012). Причем, ингибиторы могут инактивировать непосредственно как чужеродные ферменты внедряющегося микроорганизма, так и повышать устойчивость растений опосредованно, за счет снижения интенсивности деградации собственными ферментами (Valencia-Jiménez et al., 2008; Gatehouse, 2011).

Индукция защитного ответа в растениях против патогенов осуществляется с помощью различных сигнальных систем (Тарчевский, 2002). Известными их медиаторами являются салициловая (СК) и жасмоновая (ЖК) кислоты (Kazan, Manners, 2008; Radwan et al., 2010). СК, как интермедиат НАДФН-оксидазной системы, стимулирует защитные реакции растений против болезней, вызываемых биотрофными патогенами (Sendon et al., 2011; Delano-Frier et al., 2013). В отношении ЖК - интермедиата липоксигеназной сигнальной системы, показано, что в обработанных ею растениях в ответ на некротрофную инфекцию повышается активность ингибиторов протеиназ и ферментов антиоксидантной защиты (Wasternack, 2007; Antico et al., 2012). Поскольку в некоторых случаях тип питания у возбудителей грибных болезней бывает смешанным (гемибиотрофы), то представляет значительный интерес выяснение роли СК и ЖК в индукции ингибиторов гидролаз в таких патосистемах.

Несмотря на ясность общей стратегии защиты растений от патогенов, конкретные молекулярно-биохимические механизмы, определяющие исход взаимоотношений растений и патогенов, остаются, в значительной мере, невыясненными. Поскольку развитие устойчивости растений к возбудителям болезней определяется морфогенетическими особенностями партнеров, то изучение роли гидролитических ферментов и их ингибиторов в формировании взаимоотношений в системе «растение-хозяин - патоген» необходимо проводить с учетом пищевой специализации гриба. Исследования в этом плане приобретают особую актуальность в связи с необходимостью разработки

экологически безопасных, ресурсосберегающих технологий производства сельскохозяйственной продукции.

Цель и задачи исследований. Цель работы - выявить особенности формирования защитного ответа растений пшеницы к возбудителям грибных болезней с различным типом паразитизма при участии гидролаз и их белковых ингибиторов. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- провести сравнительный анализ изменений активности гидролаз и их белковых ингибиторов в растениях пшеницы при инфицировании возбудителями грибных болезней с некротрофным, биотрофным и гемибиогрофным типом питания;

- оценить изменения транскрипционной активности гена ингибитора протеиназы пшеницы при заражении возбудителями септориоза и корневой гнили;

- изучить влияние штаммов Septoria nodoritm различной агрессивности на активность гидролитических ферментов и уровень экспрессии гена ингибитора протеиназы в растениях пшеницы;

- исследовать индуцирующее действие сигнальных молекул и элиситоров на активность ингибиторов протеиназ в тканях пшеницы при инфицировании грибными патогенами различной трофности;

- изучить связь устойчивости пшеницы к септориозу с уровнем транскрипционной активности гена ингибитора протеиназы в растениях.

Научная новизна. Получены приоритетные данные об участии комплекса «гидролаза - белковый ингибитор» в формировании защитного ответа растений пшеницы к возбудителям грибных болезней с биотрофным, некротрофным и гемибиотрофным типом питания. Впервые выявлено разнонаправленное изменение активности гидролитических ферментов у пшеницы на инфицирование возбудителями грибных болезней, различающихся типом питания: активация гидролаз - при заражении некротрофом Bipolaris sorokiniana и гемибиотрофом Septoria nodorum и снижение их активности - при заражении биотрофом Tilletia caries. Выявлены различия индуцирующего эффекта хитоолигосахаридов (ХОС) на активность ингибиторов протеиназ в зависимости от степени их ацетилирования и трофности патогена: в патосистеме «Triticitm aestivum - гемибиотроф Septoria nodorum» более эффективны ХОС со степенью ацетилирования 30%, в патосистеме «Triticum aestivum - некротроф Bipolaris sorokiniana» - ХОС со степенью ацетилирования 65%.

Практическая значимость работы. Полученные данные вносят вклад в понимание молекулярных механизмов естественного и индуцированного иммунитета. Изменение баланса активности протеиназ и их ингибиторов в растительных тканях является одним из механизмов повышения устойчивости к возбудителям грибных болезней пшеницы с различным типом трофности. Наиболее перспективным в этом плане является использование препаратов на

основе сигнальных молекул, таких как ХОС, салициловая и жасмоновая кислоты, приводящих к длительной индукции активности ингибиторов гидролитических ферментов в растениях. Научные положения исследований рекомендуется использовать в качестве учебного материала по дисциплинам: физиология и биохимия растений, фитопатология, защита растений.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на: международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2012» (Саратов, 2012); всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации» (Екатеринбург, 2012); всероссийской научной конференции с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений» (Москва, 2013); международных 17-й и 18-й школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2013,. 2014); всероссийской конференции «Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция» (Петрозаводск, 2014); международной научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы и перспективы исследований растительного мира» (Ялта, 2014); международной научной конференции «Физиология растений -теоретическая основа инновационных arpo- и фитобиотехнологий» (Калининград, 2014); всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология» (Саратов, 2014).

Конкурсная поддержка работы. Работа поддержана грантами АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» №2.1.1./5676; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № 16.740.11.0061, ГК № П339); РФФИ_поволжье_а № 11-04-97037; ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК № 16.512.11.2014), Министерства образования и науки РФ № 14.604.21.0016 по приоритетному направлению «Науки о жизни».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад соискателя заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 287 источников. Диссертация содержит 3 таблицы и 27 рисунков.

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н. Л.Г. Яруллиной, сотрудникам лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН, в которой проводились исследования: зав. лаб., д.б.н.

Максимову И.В., д.б.н. Трошиной Н.Б., к.б.н. Суриной О.Б., асп. Касимовой Р.И. за неоценимую помощь при выполнении и обсуждении работы.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа проводилась на растениях пшеницы Triticum aestiviim L. сортов Жница, Башкирская 24, Омская 35, Омская 36, Башкирская 26, Симбирка, Казахстанская 10 и Волжская Качественная. Семена исследуемых образцов пшеницы получены от сотрудников Чишминского опытно-производственного хозяйства Башкирского НИИ сельского хозяйства. Экспериментальный материал был собран в лаборатории биохимии иммунитета растений ФГБУН Института биохимии и генетики УНЦ РАН (г. Уфа) в 2011-2014 г.г. Для инфицирования растений пшеницы использовали конидии грибов-возбудителей корневых гнилей Bipolaris sorokiniana (Sass.) Shoenaker., телиоспоры возбудителя твердой головни Tillelia caries (DC.) Tul., пикноспоры возбудителя септориоза Septoria nodorum Berk., выделенных из производственных посевов пшеницы в Чишминском ОПХ. Споры штаммов гриба Septoria nodorum Berk, различной агрессивности были любезно предоставлены сотрудниками Института экспериментальной ботаники им. В.Ф. Купревича HAH Беларусии. Ежегодно инфекционный материал проверяли на

жизнеспособность спор.

Семена стерилизовали 80%-ным этанолом (2 мин) и промывали стерильной водой. Часть семян обрабатывали путем замачивания (3 ч) в растворах CK (10"5 М), ЖК (10"7 М) и ХОС со степенью ацетилирования (CA) 65% и 30% (10"6 М). Растения выращивали на светоплощадке с 16-ти часовым световым периодом. Полностью развернутые листья 7-суточных проростков срезали, помешали во влажную камеру на фильтровальную бумагу, срезы прикрывали ватой, смоченной в растворе бензимидазола (40 мг/л) (Пыжикова, Карасева, 1985). Отрезки листьев инокулировали микрокаплей объемом 5 мкл на лист суспензией пикноспор Septoria nodorum или конидий Bipolaris sorokiniana из расчета 106 спор/мл, и выдерживали при комнатной температуре в темноте в течение 24 ч, после чего переносили на искусственное освещение. Инфицирование семян пшеницы спорами Tilletia caries проводили по традиционной методике (Кривченко, 1984).

Растительный материал перед фиксацией промывали и подсушивали на фильтровальной бумаге, взвешивали и растирали в фарфоровой ступке с добавлением 0,05 M Na-фосфатного буфера (ФБ) pH 6,2 в соотношении 1:5. Дня определения концентрации белка в растворах использовали метод М. Бредфорд (Bradford, 1976). Активность протеиназ и их ингибиторов определяли спектрофотометрически по гидролизу хромогенного синтетического субстрата БАПНА (Erlanger et al., 1961; Гофман, Вайсблай, 1975) и по гидролизу желатина, активность амилаз, пектиназ, целлюлаз и их ингибиторов - по гидролизу крахмала, яблочного пектина и карбоксиметилцеллюлозы соответственно, иммобилизованных в геле агарозы (Шпирная, 2006).

Концентрацию 1Ь02 определяли с использованием красителя ксиленоловый оранжевый по предварительно построенной калибровочной кривой (Bindschedler et al., 2001).

Для выделения РНК из растений использовали видоизмененный метод Chomezynski (Chomezynski, Sacchi, 1987). Для получения кДНК на основе мРНК изучаемых образцов проводили реакцию обратной транскрипции с использованием M-MuLV обратной транскриптазы согласно протоколу фирмы-поставщика. Полимеразно-цепную реакцию (ОТ-ГГЦР) проводили в амплификаторе типа ТП4-ПЦР-01-«Терцик». После амплификации фрагменты ДНК фракционировали методом электрофореза в 7% ПААГ в электрофоретической камере S2 («Хеликон», Россия). В качестве положительного контроля использовали ПЦР гена, кодирующего конститутивно экспресснрующийся тубулин. С помощью программы «Primer Select» (DNAStar) были подобраны высокоспецифичные праймеры к гену ингибитора протеииазы EU 293132.1, фланкирующие фрагмент ДНК размером 106 п.н. Исследования проведены на оборудовании ЦКП «Биомика» и УНУ «Кодинк». Эксперименты включали не менее трех биологических повторностей при анализе биохимических показателей и не менее 15 при анализе экспрессии гена. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ фирмы Stat Soft («Statistica 6.0»),

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Активность гидролаз и их белковых ингибиторов в растениях пшеницы при инфицировании некротрофом Bipolaris sorokiniana и обработке сигнальными молекулами. Bipolaris sorokiniana, возбудитель гельминтоспориозной корневой гнили зерновых, является широко распространенным патогеном с некротрофным типом паразитизма. Ввиду ухудшающейся экологической обстановки и снижения эффективности применяемых химических средств защиты пшеницы от корневой гнили, большую значимость в последнее время приобретает поиск препаратов, индуцирующих естественные защитные механизмы растений. В связи с этим, исследование влияния СК и ЖК на формирование защитного ответа пшеницы с участием гидролаз и их ингибиторов при инфицировании Bipolaris sorokiniana представляет несомненный интерес.

Симптомы гельминтоспориозной корневой гнили помимо корней, проявляются на колеоптиле, эпикотиле, в основании стебля и прикорневых листьев, причем пораженные органы различаются по степени инфицированности. Визуальное проявление симптомов заболевания при инфицировании В. sorokiniana в контроле регистрировали через 5 сут после инокуляции (рис. 1А). В листьях, предобработанных СК и ЖК растений, симптомы болезни проявлялись позже и были менее выражены, чем в контроле. Так, в листьях, предобработанных ЖК и инфицированных В. sorokiniana, признаки заболевания проявлялись в виде локальных темно-бурых пятен (рис.

1 А). При этом в листьях, предобработанных СК, некрозы имели светло-бурый тон и занимали большую площадь заражения, чем при обработке ЖК.

Микроскопические наблюдения показали, что через 24 ч после инокуляции споры В. эогокгтапа прорастали, образуя на эпидермисе листьев длинные гифы (рис. 1Б). В дальнейшем, через 48 и 72 ч после инокуляции, рост гифов продолжался. Предобработка растений СК и ЖК заметно тормозила рост гриба на протяжении всего периода наблюдений (рис. 1Б).

.111 11 рШМШ

(А) (Б)

Рис. 1. Ограничение роста В. зогоИтапа на листьях пшеницы сорта Жница под влиянием СК и ЖК: А) развитие симптомов в листьях пшеницы. I -3 сут, II - 5 сут, Ш - 6 сут после инокуляции; Б) микроскопические наблюдения развития гриба в эпидермисе листьев. Ув.: ок. 10х. об. 10х. I - 24 ч, II - 48 ч, III — 72 ч после инокуляции.

Таким образом, наблюдения за развитием гриба В. эогокМапа в листьях предобработанных и контрольных растений свидетельствуют о том, что сигнальные молекулы индуцируют устойчивость пшеницы восприимчивого сорта Жница к возбудителю корневой гнили.

Грибные патогены обладают различными механизмами преодоления защитных барьеров растения, в частности, используют для этого гидролитические ферменты. Результаты исследований показали, что через 24 ч после заражения В. яогоктапа наблюдалось повышение в листьях пшеницы активности амилаз (рис. 2А) и протеиназ (рис. 2Б). Нарастание активности гидролаз в ходе патогенеза свидетельствует об интенсивном развитии патогена в тканях восприимчивой пшеницы. Предобработка СК и ЖК снижала активность гидролаз как в инфицированных, так и неинфицированных листьях (рис. 2, А, Б). Причем, наибольшее понижение гидролитической активности происходило в варианте с предобработкой ЖК.

Существенным механизмом регуляции активности гидролитических ферментов является система белковых ингибиторов. Растительные ингибиторы гидролаз могут подавлять активность как собственных ферментов, так и

чужеродных, в частности, патогенных грибов и бактерий (Иевлева и др., 2006; Kim et al., 2009; Ибрагимов и др., 2010).

Рис. 2. Активность амилаз (А) и прогеиназ (Б) в листьях пшеницы сорта Жница при инфицировании В. sorokiniana. 1 - контроль; 2 - В. sorokiniana: 3 -обработка СК; 4 - обработка СК + В. sorokiniana; 5 - обработка ЖК; 6 -обработка ЖК + В. sorokiniana. I - 24 ч, II - 48 ч, Ш - 72 ч после инокуляции соответственно.

В наших экспериментах инфицирование В. sorokiniana сопровождалось изменением антигидролитической активности в растительных тканях, в частности, снижением активности ингибиторов амилаз (рис. ЗА) и повышением антипротеолитической активности (рис. ЗБ). Ингибиторы гидролаз функционируют путем образования с ферментами устойчивых комплексов. В этих комплексах фермент и ингибитор полностью или частично теряют свою активность (Huma, Khalid, 2007; Ибрагимов и др., 2010). В связи с этим, снижение активности ингибиторов амилаз (рис. ЗА) могло быть результатом образования таких неактивных комплексов между молекулами фермента и ингибитора.

« тА IS 1Í

Рис. 3. Активность ингибиторов амилаз (А) и ингибиторов прогеиназ (Б) в листьях пшеницы сорта Жница при инфицировании В. яогокгтапа. 1 -контроль; 2 - В. 50Г0ктапа\ 3 - обработка СК; 4 - обработка СК + В. яогоМтапа; 5 - обработка ЖК; 6 - обработка ЖК + В. зогокМапа. I — 24 ч, П -48 ч, III - 72 ч после инокуляции соответственно.

Нами был проанализирован уровень экспрессии гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 в листьях пшеницы при инфицировании В. sorokiniana и обработке СК и ЖК (рис. 4). Выявлено, что инфицирование пшеницы возбудителем корневой гнили сопровождалось усилением экспрессии гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 (рис. 4), что отражалось на активности белкового продукта (рис. ЗБ).

Рис. 4. Экспрессия гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 в листьях пшеницы сорта Жница, инфицированных В. sorokiniana. 1 -контроль; 2 - В. sorokiniana-, 3 -обработка СК; 4 - обработка СК + В. sorokiniana; 5 - обработка ЖК; 6 -обработка ЖК + В. sorokiniana. - 1-24 ч, II - 48 ч. III - 72 ч после инокуляции соответственно.

Предобработка СК или ЖК оказывала индуцирующее влияние на экспрессию гена ингибитора протеиназы, как в зараженных, так и незараженных растениях (рис. 4). Таким образом, повышение устойчивости растений пшеницы к некротрофному патогену Bipolaris sorokiniana под воздействием обработки СК и ЖК сопряжено с существенными изменениями в активности гидролаз и их ингибиторов.

Активность гидролаз и их белковых ингибиторов в растениях пшеницы при инфицировании биотрофом Tilletia caries и обработке сигнальными молекулами. Обнаружено, что на 7 сутки после инокуляции спорами Т. caries акгивность протеиназ в колеоптилях пшеницы незначительно понижалась (рис. 5).

Рис. 5. Активность протеиназ в колеоптилях пшеницы сорта Жница при заражении Т. caries и обработке сигнальными молекулами. 7 сутки после инокуляции. 1 - контроль; 2 -Т. caries; 3 — обработка СК; 4 -обработка СК + Т. caries; 5 -обработка ЖК; 6 - обработка ЖК + Т. caries.

Известно, что биотрофные патогены обладают более низким разнообразием и концентрацией токсичных для растения метаболитов, в

частности, гидролитических ферментов, по сравнению с некротрофами. При предобработке сигнальными молекулами гидролитическая активность также снижалась, что могло быть обусловлено повышением активности ингибиторов в растительных тканях под их влиянием (рис. 6А). Изменение активности амилаз в инфицированных тканях при обработке СК и ЖК происходило аналогично.

Исследования показали, что на 7 сутки после заражения активность ингибиторов протеиназ возрастала (рис. 6А). Предобработка семян пшеницы СК или ЖК стимулировала повышение уровня антипротеолитической активности в колеоптиле как зараженных, так и незараженных растений. Причем, наибольшее возрастание активности ингибиторов протеиназ наблюдалось в варианте с обработкой ЖК. Сопоставление литературных данных об этапах инфекционного процесса, вызванного грибом Т. caries (Каратыгин, 1981), и полученных результатов активности ингибиторов протеиназ в колеоптиле пшеницы (рис. 6), позволяет говорить о том, что повышение функциональной активности исследованной группы белков является ответной реакцией на проникновение патогена в ткани хозяина.

5 12 | 1»

£ 5

22(1

■ ш 1

В • г t

Uo» j 18« Z 160

S S1J» | ? 120 100

pfa

Г*Д

(А) (Б)

Рис. 6. Активность ингибиторов протеиназ (А) и экспрессия гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 (Б) в колеоптилях пшеницы сорта Жница при заражении Т. caries и обработке сигнальными молекулами. 7 сутки после инокуляции. 1 - контроль; 2 -Т. caries; 3 - обработка СК; 4 - обработка СК + Т. caries; 5 - обработка ЖК; 6 - обработка ЖК + Т. caries.

Значительное повышение активности ингибиторов протеиназ в инфицированных тканях под воздействием обработки СК и ЖК было обусловлено усилением экспрессии гена ингибитора протеиназы Еи 293132.1 (рис. 6Б). Так, в растениях, предобработанных ЖК, экспрессия гена исследуемого белка была в 2 раз выше, чем в необработанных и зараженных растениях.

Активность гидролаз и их белковых ингибиторов в растениях пшеницы при инфицировании гемибиотрофом БерЮпа пойогит и обработке сигнальными молекулами. В естественных условиях популяции

патогенов состоят из смеси изолятов, отличающихся степенью агрессивности. От соотношения различных по агрессивности форм гриба во многом зависит степень поражения растений (Кобыльский, 2005). В исследовании были использованы контрастные по агрессивности штаммы гриба 5. по/Лотт: штамм 9МН проявлял высокую, а штамм 4ВД низкую степень агрессивности к сортам яровой мягкой пшеницы Башкирская 24, Саратовская 29, Жница, Омская 9.

Инфицирование штаммами возбудителя септориоза различной агрессивности сопровождалось повышением уровня активности амилаз и протеиназ в растительных тканях (рис. 7). При этом наибольшее возрастание активности гидролаз происходило при заражении листьев пшеницы высоко агрессивным штаммом (рис. 7Б). Вероятно, усиление гидролитической активности в листьях инфицированных растений обусловлено не только изменениями в метаболизме растения-хозяина под воздействием патогена, но и секрецией гидролитических ферментов патогеном.

12 3 4 5 6

2 3 4 5 6 12345«

123456 123456 12 3 456

Рис. 7. Активность амилаз (1) и протеиназ (2) в листьях пшеницы сорта Жница при инфицировании штаммом 5. пос1огит с низкой (А) и высокой (Б) агрессивностью. I - контроль: 2-5. пос1огит; 3 - обработка СК; 4 - обработка СК + Я. пос/огит; 5 - обработка ЖК; 6 - обработка ЖК + & по(1огит. I - 24 ч, II - 48 ч, Ш - 72 ч после инокуляции соответственно.

Заражение листьев пшеницы изменяло и уровень активности ингибиторов гидролаз. В инфицированных листьях активность ингибиторов амилаз понижалась, особенно при инфицировании высоко агрессивным штаммом (рис. 8, /), что могло быть обусловлено образованием неактивных комплексов между

молекулами ингибитора и фермента. Вероятно, снижение активности ингибиторов амилаз уменьшает сопротивляемость растений к действию внеклеточных ферментов патогена и способствует его развитию и распространению в тканях. Напротив, активность ингибиторов протеиназ при инфицировании возрастала (рис. 8, 2). Причем, максимальный прирост антипротеолитической активности наблюдали в растениях, инфицированных низко агрессивным штаммом. Возможно, что высоко агрессивные штаммы через подавление продукции ингибиторов протеиназ обеспечивают свое успешное развитие в растительных тканях. Предобработка сигнальными молекулами способствовала повышению активности ингибиторов гидролаз при заражении различными по агрессивности штаммами 5. пос1огг1т. При этом наибольший индуцирующий эффект на активацию защитных белков оказывала ЖК.

Рис. 8. Активность ингибиторов амилаз (1) и ингибиторов протеиназ (2) в листьях пшеницы сорта Жница при инфицировании штаммом 5. посЬгит с низкой (А) и высокой (Б) агрессивностью. Обозначения как на рис. 7.

Возможным механизмом повышения активности ингибиторов протеиназ может служить усиление экспрессии гена этого белка. Результаты исследований показали, что в ответ на инфицирование 5. пос1огит, экспрессия гена Еи 293132.1 усиливалась (рис. 9).

Рис. 9. Экспрессия гена ингибитора протеиназы Еи 293132.1 в листьях пшеницы сорта Жница при заражении штаммом 5. пос!огит с низкой (А) и высокой (Б) агрессивностью. Обозначения как на рис. 7.

СК оказывала более высокий стимулирующий эффект на экспрессию гена ингибитора протеиназы в здоровых растениях, чем при инфицировании как низко, так и высоко агрессивным штаммами. В обработанных ЖК растениях уровень экспрессии гена Еи 293132.1 был максимальным по сравнению со всеми другими вариантами опыта.

Влияние ХОС с различной СА на экспрессию гена ингибитора протеиназы ЕБ 293132.1 в растениях пшеницы при инфицировании возбудителями грибных болезней различной грофносги. Одним из перспективных и экологически безопасных подходов к снижению повреждающего действия возбудителей грибных болезней на урожайность сельскохозяйственных культур является применение в растениеводстве иммуномодуляторов, стимулирующих естественные защитные механизмы растительного организма. Наиболее эффективными эяиситорами являются низкомолекулярные производные хитина - ХОС. Определенную роль в специфичности проявления биологической активности производных ХОС имеет степень ацетилирования биополимера. Однако литературные данные о влиянии ХОС на защитный потенциал растений в зависимости от трофности патогена весьма ограничены.

Как видно из рисунка 10А, предобработка ХОС и инфицирование некротрофом В эогоШтапа приводили к усилению экспрессии гена ингибитора протеиназы Еи 293132.1. Причем, предобработка семян ХОС со СА 65% приводила к усилению экспрессионной активности гена ингибитора протеиназы в 1,5 и более раз, как в неинфицированных растениях, гак и при заражении на всем протяжении опыта. Действие ХОС со СА 30% на экспрессию гена инг ибитора протеиназы в корнях здоровых и инфицированных растений было не столь значительным. Усиление транскрипционной активности гена ингибитора протеиназы Еи 293132.1 коррелировало с повышением активности ингибиторов протеиназ. Интересно, что в усилении экспрессии гена ингибитора протеиназы Еи 293132.1 при инфицировании

растений пшеницы гемибиотрофом Я. пойогит максимальную эффективность оказывали ХОС со СА 30% (рис. 10Б).

^ .<: 1 2 3 4 5 " 6

(А) (Б)

Рис. 10. Влияние ХОС с различной С А на экспрессию гена ингибитора протеиназы Е11 293132.1 в растениях пшеницы при инфицировании В. ьогоМтапа (А) и 5. пос1огит (Б). А: 1 — контроль; 2 - ХОС со СА 30%; 3 - ХОС со СА 65%; 4 - инфицирование, 5 -ХОС со СА 30% + инфицирование; 6 - ХОС со СА 65% + инфицирование. Б: 1 — контроль; 2 - инфицирование; 3 - ХОС со СА 30%; 4 - ХОС со СА 30% + инфицирование; 5 - ХОС со СА 65%; 6 - ХОС со СА 65% + инфицирование. Цифрами представлен нормализованный против экспрессии гена Р-тубулина уровень экспрессии гена ингибитора протеиназы (в % контролю).

Таким образом, нами выявлено, что ХОС оказывают различный индуцирующий эффект на транскрипционную активность гена ингибитора протеиназы в зависимости от их СА и трофности патогена. При инфицировании гемибиотрофом 5. поЛогит более значительным было стимулирующее влияние ХОС со СА 30%, при заражении В. иогокМста - ХОС со СА 65%.

Сравнительная оценка экспрессии гена ингибитора протеиназы Е11 293132.1 в растениях пшеницы с различной устойчивостью к возбудителю септориоза. Один из подходов к пониманию механизмов, обеспечивающих устойчивость растений к различным типам возбудителей болезней, может включать сравнение физиологических показателей разных сортов пшеницы. В качестве показателя, характеризующего защитную реакцию растений при заражении, оценивали транскрипционную активность гена ингибитора протеиназы в растениях пшеницы 5 районированных сортов (Омская 35, Омская 36, Симбирка, Башкирская 26 и Казахстанская 10) при инфицировании возбудителем септориоза 5. посЬтт. Интенсивность развития возбудителя септориоза на листьях оценивали по площади инфекционного пятна в растительных тканях. Величина этого показателя оказалась минимальной у пшеницы сортов Омская 35 (7,3±0,3 мм2) и Омская 36 (9,1±0,4 мм2) и максимальной - у сортов Башкирская 26 (15,9±1,1 мм2) и Казахстанская 10

(19,6±1,3 мм2), в то время как сорт Симбирка (12,6±0,9 мм2) занимал по данному показателю промежуточное положение.

Как показали исследования, уровень экспрессии гена ингибитора протеиназы достоверно увеличивался при заражении по сравнению с

Рис. 11. Экспрессия гена ингибитора протеиназы ЕЙ 293132.1 в листьях растений пшеницы разных сортов при инфицировании 5. пос1огит (% от контроля). 1 - Омская 35, 2 -Омская 36, 3 - Симбирка, 4 -Башкирская 26, 5 - Казахстанская 10.

Максимально высокой была экспрессия гена EU 293132.1 у растений сорта Омская 35 (рис. 11, /). Причем, через 48 ч после инфицирования она значительно возрастала в листьях растений всех сортов, кроме Казахстанской 10 (рис. 11, 5). В этот же период наблюдали достоверную отрицательную корреляцию между уровнем экспрессии и поражением листьев (г = - 0,94), что подтверждало участие ингибиторов экзогенных гидролаз в формировании защитных механизмов растений при патогенезе.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования такого показателя как уровень экспрессии гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 в качестве маркера при отборе устойчивых форм пшеницы.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выявлено разнонаправленное изменение активности гидролитических ферментов у пшеницы на инфицирование возбудителями грибных болезней, различающихся типом питания: активация гидролаз - при заражении некротрофом Bipolaris sorokiniana и гемибиотрофом Septoria nodorum и снижение активности - при заражении биотрофом TiUetia caries. Во всех рассмотренных патосистемах активность ингибиторов протеиназ возрастала, что свидетельствует о вовлечении их в формирование устойчивости к патогенам с различным типом трофности.

2. Выявлено, что одним из механизмов подавления защитного ответа в растениях пшеницы при инфицировании высоко агрессивным штаммом Septoria nodorum является снижение экспрессии гена ингибитора протеиназы EU 293132.1.

неинфицированным вариантом (рис. 11).

зоо

« р § 260

5 £"

1 I

S. 1 220

з S

5

i SO

¿ —i

1 $

■Р-В 140

юо

3. Показано, что обработка семян салициловой и жасмоновой кислотами оказывает пролонгированное защитное действие на растения пшеницы к инфицированию грибными патогенами с различной пищевой специализацией (Bipolaris sorokiniana, Tilletia caries, Septoria nodorum). Усиление транскрипционной активности гена ингибитора протеиназы, повышение активности ингибиторов гидролаз, и обусловленное этими процессами снижение гидролитической активности в тканях растений представляет важное звено механизма развития устойчивости растений при действии салициловой и жасмоновой кислот. Наибольший стимулирующий эффект в отношении этой группы защитных соединений проявляет жасмоиовая кислота.

4. Выявлена зависимость индуцирующего действия хитоолигосахаридов на транскрипционную активность гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 пшеницы от степени ацетилирования их молекул и трофности патогена. При инфицировании растений пшеницы гемибиотрофом Septoria nodorum высокий стимулирующий эффект на активность ингибиторов протеиназ оказывали хитоолигосахариды со степенью ацетилирования 30%, а при заражении некротрофом Bipolaris sorokiniana - хитоолигосахариды со степенью ацетилирования 65%.

5. Показана зависимость транскрипционной активности гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 от степени устойчивости растений пшеницы к возбудителю септориоза. Максимальным уровнем экспрессии гена ингибитора протеиназы в инфицированных тканях обладали высокоустойчивые к Septoria nodorum сорта, что свидетельствует о перспективности использования данного показателя в качестве молекулярного маркера для ранней диагностики резистентности растений.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МОП РФ

1. Яруллина, Л.Г. Влияние хитоолигосахаридов с различной степенью ацетилирования на активность защитных белков в листьях пшеницы при инфицировании возбудителем сенториоза / Л.Г. Яруллина, Е.А. Заикина, А.Р. Ахатова, Р.И. Касимова // Агрохимия. - 2013. - № 12. - С. 3-9.

2. Касимова, Р.И. Индукция защитного ответа в растениях пшеницы под воздействием хитоолигосахаридов и глиокладина при инфицировании Bipolaris sorokiniana / Р.И. Касимова, А.Р. Ахатова, Р.И. Ибрагимов, Л.Г. Яруллина // Вестник Башкирского университета. - 2013. - Т. 18. -№ 3. - С. 713-715.

3. Яруллина, Л.Г. Сравнительное изучение устойчивости к сенториозу и физиологических показателей у разных сортов пшеницы / Л.Г. Яруллина, Р.И. Касимова, И.А. Шпирная, А.Р. Ахатова, Р.И. Ибрагимов // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2013. - Т. 15. - № 3 (5).-С. 1536-1540.

4. Яруллина, Л.Г. Активность защитных белков в растениях пшеницы при обработке хитоолигосахаридами с различной степенью ацетилирования и инфицировании Bipolaris sorokiniana / Л.Г. Яруллина, Р.И. Касимова, А.Р. Ахатова //Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50. - № 5. - С. 526-532.

5. Яруллина, Л.Г. Сравнительная оценка транскрипционной активности генов защитных белков у разных сортов пшеницы в связи с устойчивостью к Septoria nodorum Berk / Л.Г. Яруллина, Р.И. Касимова, А.Р. Ахатова // Прикладная биохимия и микробиология. - 2014. - Т. 50. -№ 6. - С. 599-603.

Публикации в других изданиях

6. Yarullina, L.G. Search for molecular markers of wheat resistance to fungal pathogens / L.G. Yarullina, S.V. Veselova, R.I. Ibragimov, I.A. Shpirnaya, R.I. Kasimova, A.R. Akhatova, V.O. Tsvetkov, I.V. Maksimov // Agricultural Sciences. - 2014. - V. 5. - № 8. - P. 722-729.

7. Ахатова, А.Р. Салициловая и жасмоновая кислоты в регуляции экспрессии генов защитных белков пшеницы при инфицировании Tilleíia caries / А.Р. Ахатова, Е.А. Заикина, О.Б. Сурина, Р.И. Касимова, Л.Г. Яруллина // Материалы Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения-2012». - Саратов, 2012. - С. 177-178.

8. Ахатова, А.Р. Влияние салициловой и жасмоновой кислот на уровень активности гидролаз и их ингибиторов в листьях пшеницы при инфицировании различными штаммами возбудителя септориоза / А.Р. Ахатова, Е.А. Заикина, Л.Г. Яруллина // Материалы П Всероссийской с международным участием школы-конференции молодых ученых «Биология будущего: традиции и новации». - Екатеринбург: Изд-во Урал. Ун-ва, 2012. - С. 191-194.

9. Ахатова, А.Р. Экспрессия гена ингибиторов протеиназ EU 293132.1 в растениях пшеницы при обработке сигнальными молекулами и заражении грибными патогенами разной трофности / А.Р. Ахатова, Е.А. Заикина, Р.И. Касимова // Материалы 17-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». - Пущино: Пущ. Науч. центр Рос. акад. наук Пущ. гос. ест.-науч. институт, Админ. г. Пущино, 2013.-С. 175.

10. Яруллина, Л.Г. Индуцирующее действие салициловой и жасмоновой кислот на защитный потенциал клеток пшеницы при инфицировании Bipolaris sorokiniana Pam. / Л.Г. Яруллина, А.Р. Ахатова, Р.И. Касимова // Материалы Всероссийской научной конференщш с международным участием «Инновационные направления современной физиологии растений». Москва, 2013.-С. 359-360.

11. Ахатова, А.Р. Влияние хитоолигосахаридов с различной степенью ацетилирования на экспрессию гена ингибитора протеиназы EU 293132.1 в патосистемах «Tritictim aestivum - Bipolaris sorokiniana», «Triticum aestivum -

Septoria nodortim» / A.P. Ахатова, Р.И. Касимова, Л.Г. Яруллина // Материалы П Всероссийской конференции «Фундаментальная гликобиология». Саратов: ООО «Ракурс», 2014. - С. 99.

12. Ахатова, А.Р. Активность протеиназ и их ингибиторов в листьях пшеницы при обработке индукторами устойчивости и инфицировании различными по агрессивности штаммами Septoria nodortim Berk. / А.Р. Ахатова, Р.И. Касимова, Л.Г. Яруллина // Материалы Всероссийской конференции «Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция». Петрозаводск, 2014. - С. 142.

13. Ахатова, А.Р. Экспрессия генов патоген-индуцируемых белков в растениях пшеницы при обработке индукторами устойчивости и инфицировании возбудителем твердой головни Tilletia caries/ А.Р. Ахатова, Р.1\ Касимова, Л.Г. Яруллина // Материалы Международной научной конференции «Физиология растений - теоретическая основа инновационных arpo- и фитобиотехнологий». Калининград: Аксиос, 2014. - С. 19-21.

14. Ахатова, А.Р. Регуляция активности ингибиторов гидролаз сигнальными молекулами в проростках пшеницы при инфицировании возбудителями корневой гнили и септориоза / А.Р. Ахатова, Р.И. Касимова // Материаты 18-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино: Пущ. науч. центр Рос. академ. наук Пущ. гос. ест. -науч. институт, Админ. Г. Пущино, 2014. - С. 381-382.

15. Ахатова, А.Р. Активность PR-белков пшеницы при обработке сигнальными молекулами и инфицировании грибными патогенами разной трофности / А.Р. Ахатова, Р.И. Касимова, Л.Г. Яруллина // Материалы Международной научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы и перспективы исследований растительного мира». Ялта: Крымский научный центр, 2014. - С. 35.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CK - салициловая кислота; ЖК - жасмоновая кислота; ХОС - хитоолигосахариды; CA — степень ацетилирования;

НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; ФБ - фосфатный буфер;

БАПНА - N, а-бензоил-БЬ-аргинин-4-нитроанилид HCl;

ИЕ - ингибиторная единица;

Е - единица активности фермента;

п.н. — пара нуклеотидов;

ПЦР — полимеразно-цепная реакция.

Подписано в печать 11.05.15 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 066. Гарнитура «Т1те5Ые\\'Котап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 1п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 5, т/ф: 27-27-600, 27-29-123