Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Индукция защитной системы пшеницы и картофеля эндофитными бактериями Bacillus subtilis 26Д

ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Индукция защитной системы пшеницы и картофеля эндофитными бактериями Bacillus subtilis 26Д"

На правах рукописи

005010927 _/)

АБИЗГИЛЬДИНА РЕГИНА РАМИЛЕВНА

ИНДУКЦИЯ ЗАЩИТНОЙ СИСТЕМЫ ПШЕНИЦЫ И КАРТОФЕЛЯ ЭНДОФИТНЫМИ БАКТЕРИЯМИ Bacillus subtilis 26Д

03.01.05. - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 MAP Ш1

Уфа-2012

005010927

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте бнохш...... генетики Уфимского научного центра РАН

Научный руководитель:

Игорь Владимирович Максимов, доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Кудоярова Гюзель Радомесовна,

доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт биологии УНЦ РАН, зав. лабораторией физиологии растений

Гарипова Светлана Равилевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры экологии,

ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится « 15 » марта 2012 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 212.013.11 при ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет по адресу: 450076, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, биологический факультет, ауд. 332.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет».

Автореферат разослан « » февраля 2012 г. Ученый секретарь

Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Шарипова Марина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований. В последние десятилетия растет интерес к биологическим средствам защиты растений (СЗР), которых отличает от химических СЗР экологичность и безопасность при применении. К таким СЗР следует отнести биологически активные соединения и живые эндофитные культуры микроорганизмов, способные стимулировать иммунный потенциал растений против патогенов [Pieterse et al., 2007; Bakker et al., 2007; Barruiso et ai 2008; Saunders, Kohn, 2009; Van der Lelie et al., 2009], который заметен на фоне высокой восприимчивости исходной формы растений [Reva et al., 2004; Compant et al., 2005; Van Loon, 2007; Мелентьев, 2007; Романенко и др., 2008; Berg, 2009; Wu et al., 2009]. Выявлено, что в растениях, под влиянием биологических СЗР запускаются механизмы защитной системы хозяина, обозначенные как «системная индуцированная устойчивость» (СИУ) (induced systemic resistance (1SR) и «системная приобретенная устойчивость» (СПУ) (systemic acquired resistance (SAR) [Van Loon, 2007; Barruiso et al., 2008; De Vleesschauvver et al., 2008], где важную роль играют сигнальные пути, регулируемые жасмоновой (ЖК) и салициловой кислотами (CK), соответственно. Кроме того известно, что некоторые биопрепараты обладают непосредственной антифунгальной активностью [Мелентьев, 2007].

Экологичность биопрепаратов привлекает производителей сельскохозяйственной продукции. Их рынок в 2004 г. составлял примерно 588 млн $ [Bolckmans, 2008], из которых на долю Северной Америки приходилось 50% [http://wwvv.abercade.ru/research/ analy-sis/3194.html]. Хотя на современном этапе биологические меры борьбы с патогенами и фитофагами в России мало применяются, по заключению экспертов, уже к 2012 году биологические СЗР «должны стать конкурентоспособными с пестицидами» [цит. по Монастырский Першакова, 2009].

Еще в прошлом веке идентификацией и токсикологическими исследованиями эндофитных штаммов бактерий, выделенных из различных организмов, в том числе и растений, активно занимались в Институте микробиологии и вирусологии HAH Украины под руководством академика HAH Украины В.В. Смирнова. На основе одного из выделенных штаммов Bacillus subtilis ВНИИСХМ 128 (26Д) в Респ. Башкортостан (РБ), на базе предприятия «Башинком» (г. Уфа), было налажено производство биопрепарата «Фитоспорин-М», успешно прошедшего полевые испытания и запатентованного с участием сотрудников нашего института [Патент РФ №2099947]. Этот биопрепарат рекомендуется для использования на посевах различных сельскохозяйственных культур и активно используется в хозяйствах. Однако следует заметить что фундаментальные основы физиолого-биохимических механизмов формирования устойчивости растений к патогенам под влиянием эндофитных штаммов микроорганизмов, в том числе и В. subtilis ВНИИСХМ 128 (26Д) остаются пока практически не исследованными.

Цель исследования: Определение роли эндофитной бактерии Bacillus subuhs 26Д в запуске механизмов, формирующих устойчивость растений к патогенам, на модели пшеницы и картофеля.

Задачи исследований:

1) определить способность бактериальных клеток В. subtilis 26Д эндофитно сосуществовать в тканях растений;

2) определить влияние В. subtilis 26Д на формирование устойчивости растений пшеницы к грибным патогенам Septoria nodorum и Bipolaris sorokiniana, а также растений картофеля к возбудителю фитофтороза Phytophthora infestans и фузариоза Fusarium oxysporium;

3) оценить влияние В. subtilis 26Д на устойчивость растений картофеля к патогенным грибам во время вегетации и в период осенне-зимнего хранения;

4) оценить характер изменения компонентов про-/антиоксидантной систем в растениях пшеницы и картофеля под влиянием В. subtilis 26Д и инфицирования патогенами;

5) изучить уровень экспрессии гена пероксидазы у инфицированных растений пшеницы и картофеля при обработке В. subtilis 26Д, салициловой и жасмоновой кислотами.

Научная новизна. Доказан эндофитный способ сосуществования бактерии штамма В. subtilis 26Д в тканях растений пшеницы и картофеля и выявлено их участие в запуске молекулярных механизмов индуцированной устойчивости против септориоза и фитофтороза, соответственно. Обнаружена модуляция транскрипционной активности генов пероксидазы у растений пшеницы и картофеля, способствующее как более раннему иммунному ответу, так и супрессии защитного ответа при предварительной предпосевной обработке растений комплексом бактериальной суспензии с CK или ЖК, соответственно. Сравнительный анализ транскрипционного статуса генов пероксидаз Ш1334 картофеля и TC15I917 пшеницы в ответ растений на B.subtilis 26Д и жасмоновую кислоту в норме и при инфицировании патогенами указывает в пользу их участия, как компонентов жасмонатной сигнальной системы, в индуцированной эндофитом устойчивости растений.

Практическая значимость работы. Совокупность полученных данных позволяет расширить современные представления о физиологических и биохимических механизмах устойчивости растений. Доказано, что применение В. subtilis 26Д в композиции с CK индуцирует, а ЖК супрессирует защитную систему растений, что требует внимательного подхода при подборе баковых смесей препаратов, содержащих в качестве действующего начала живые бактериальные культуры и сигнальные молекулы. Иммуностимулирующая активность бактерий В. subtilis 26Д имеет пролонгированное действие, способствуя сохранению защитного потенциала клубней картофеля в период их хранения. Основные результаты работы могут быть использованы в учебно-исследовательской работе.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 10-Й и 14-й Пущинских школах-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века» (2006, 2010) и Всеросс. 2-й школе-конф. по физико-химической биологии и биотехнологии «БИОМИКА - наука XXI века» (Уфа, 2011), на 1-й Всеросс. научно-практической конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Проблемы сохранения биологического разнообразия волжского бассейна и сопредельных территорий» (Чебоксары, 2010), на V-й Всеросс. конф. молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010), на Всеросс. симп. «Растение и стресс» (Москва, 2010), на Международной научно-практической конф. «Научное обеспечение устойчивого ведения сельскохозяйственного производства в условиях глобального изменения климата» (Казань, 2010), на Ш-м Международном симп. "Растения и микроорганизмы» «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011).

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье 10-04-97021, Госконтракта Министерства образования и науки № П339 по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» и договором с Башкирским НИИ сельского хозяйства РАСХН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в журналах из «Перечня ВАК».

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 296 источников. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 таблицами и 17-ю рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работы проводились на растениях пшеницы (Triticum aestivum L.) copra Жница, на растениях и клубнях картофеля (Solatium tuberosum L.) сортов Ред Скарлет и Невский. Стерильные растения картофеля были получены из верхушечной меристемы и культивировались на агаризованной среде Мурасиге-Скуга (МС). Мицелий и споры патогенов - возбудителей септориоза (Septoria nodorum Berk.), гельминтоспориоза (Bipolaris sorokicma (Sacc.) Shoenaker.), фузариоза (Fusarium oxysporium Schlecht.) были отобраны из коллекции патогенов лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН. Штамм бактерии В. subtilis 26Д выделен из коммерческого препарата Фитоспорин-М. Культура оомицета Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу.) (штамм 1.2) предоставлена проф. Ю.Т. Дьяковым (биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова).

Полевые опыты проводили в условиях Предуральской степной зоны в 20082009 гг. (АКХ «Агли» Благоварский район, РБ) на картофеле copra Ред Скарлегг. Опыты закладывались в соответствии с «Методическими указаниями по

государственным испытаниям фунгицидов.....». Биопрепараты вносили в баковых

смесях с гербицидами. В условиях лаборатории суспензией бактериальных клеток бактерии B.^subtilis 26Д (1x10s клеток/мл), сигнальными молекулами (СК - 5х10"5 и ЖК - 1x10" ) и их композициями семена пшеницы обрабатывали перед посевом, а растения картофеля за 14 дней до начала опытов.

Растения инфицировали суспензией конидий гриба В. sorokiniana (103 спор/мл) в Н20 из расчета 10 мл жидкости на сосуд 1 л путем полива основания побега 10-дневных проростков пшеницы в вазонах [Кумачева, Попов, 1976], а суспензии спор гриба S. nodorum (106 спор/мл) в Н20 содержащей 3 мкл/мл твин-20 путем нанесения на лист микропипеткой 4-5 мкл каплей. Для получения зооспор патогена Ph. infestans поверхность 7-сут. культуры оомицета заливали водой, выдерживали 30 мин при 4°С, а затем 30 мин при комнатной температуре. Инфицирование клубней F oxysporum проводили кусочками мицелия гриба, предварительно культивированного на твердой среде Чапека, либо суспензией спор (10 спор/мл).

Активность пероксидазы определяли по методу Бояркина [Ермаков и др., 1987], в качестве субстрата использовали гваякол. Оптическую плотность измеряли на приборе Benchmark Microplate Reader ("BioRad", США) при 490 нм. Изоэлектрофокусирование белков проводили с использованием 7%-ного ПААГ и 2% изолитов рН 3.0-10.0 ("ISN", США). Концентрацию Н202 измеряли с использованием красителя ксиленоловый оранжевый [Bindschedler et al„ 2001].

5

Для выделения РНК из растений использовали метод Chomezynski [1987]. ПЦР проводили в амплификаторе типа ТП4-ПЦР-01-«Терцик» фирмы ДНК-технология. Обратно-транскрипционную ПЦР (от-ПЦР) на основе м-РНК генов пшеницы и картофеля осуществляли в 20 мкл общего объема смеси, содержащей 10|ig выделенного пула общей РНК, 1 ц1 M-MuLV обратной транскриптазы (Fermentas, Литва). Трансформацию клеток В. subtilis генно-инженерной конструкцией, содержащей ген флуоресцирующего зеленным светом белка turboGFP, проводили с использованием бактериальных протопластов, согласно Chang и Cohen [1976]. Для RAPD анализа использовали праймеры Opa 1 и Lmbd8. Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК проводили в электрофоретической камере S2 («Хеликон», Россия) в 1-2% агарозном геле или 7% ПААГ [Маниатис и др., 1984].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Экспериментальное обоснование эндофитного развития бактерии В. subtilis 26Д в тканях растений картофеля и пшеницы

Известно, что многие растения содержат в своем составе микроорганизмы (бактерии, грибы), эндофитно сосуществующие в их тканях. В настоящее время таких видов идентифицировано не менее 220 из более, чем 71 рода [Hallman, Berg, 2006]. Доказано, что они способствуют не только фиксации азота, улучшению усвояемости макро- и микроэлементов, а могут придавать растениям устойчивость к ряду, неблагоприятных условий среды, в том числе к биотическому стрессу. Это свойство эффективно используется растениеводами. Однако со временем обнаруживается снижение защитных свойств препаратов на их основе, что, как полагают связано с их многократным культивированием на богатых питательными веществами средах. В связи с этим нами была проведена попытка восстановления антипатогенных свойств бактериальной культуры с использованием метода реинокуляции штамма В. subtilis 26Д через растение. При этом предполагалось, что из множества популяций содержащихся в исходном штамме, при реинокуляции, будет происходить естественная селекция клеток, способных эндофитно развиваться в растениях.

Бактерии В. subtilis 26Д были реинокулированы через стерильные пробирочные растения картофеля. Для этого прикорневую зону растений картофеля инокулировали клетками бактерий и совместная культура выращивалась в течение 7-10 дней на светоплощадке с 16-ти ч светопериодом. Обнаружено (рис. 1), что бактерии штамма В. subtilis 26Д индуцировали рост растений картофеля, в сравнении с контрольными. Это еще раз подтверждает, что этот штамм - один из представителей стимулирующих рост растений микроорганизмов.

Кусочки тканей из верхней части растений картофеля, инокулированных бактериями, были отделены, поверхностно стерилизованы и высажены в чашки Петри, залитые КГА. Обнаружено, что во всех выбранных образцах, кроме контрольных неинфицированных, наблюдается развитие бактериальных колоний. Идентичность реинокулята исходному штамму была доказана путем РАПД анализа. После получения реинокулятов B.subtilis 26Д была проанализирована их антифунгальная активность против ряда патогенов, таких как S. nodorum, F. oxysporum, P. infestans и В. sorokiniana. Реинокулят, выделенный из растений картофеля, обладал более выраженной фунгицидной активностью по сравнению с исходной культурой (рис. 2).

' 2 3 Рис. 1. Доказательство эндофитности бактерии В ¡иЫШэ 26Д 1 - пробирочные растения картофеля сорта Невский, инокулированные бактериями: а) контрольные растения; б и в - растения, культивированные на средах содержащих клетки В. зиЬиШ 26Д. 2 - выход бактериальных клеток из тканей нижней части пробирочных растений картофеля. 3 - выход бактериальных клеток из тканей верхней части пробирочных растений картофеля (48 ч. культивирования на среде КГА).

Рис 2. Изменение антифунгальной активности бактериальных клеток В. эиЬиШ 26Д до (2) и после (3) реинокулирования через растения картофеля. 1. Контроль' А К оху^рогит (7 дней Культивирования); Б. В. хогоШтапа (7 дней культивирования) В РИ

пфзШт (7 дней культивирования); Г. 5. поЫогит (14 дней культивирования).

Для дополнительного доказательства способности клеток В зиЫШй 26Д проникать в ткани листа нами, совместно с сотрудником лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Баймиевым А.Х., были проведены опыты по получению трансформированных генно-инженерной конструкцией бактерий, содержащих ген флуоресцентного белка ОКР. Как видно (рис. 3), после обработки листьев трансформированными формами В. зиЫШв 26Д они обнаруживались в зоне устьиц. Причем, не все устьичные зоны содержали бактерии, что предполагает наличие у растений определенных регулирующих этот процесс механизмов.

Рис. 3. Локализация бактериальных клеток В. яиЫШз 26Д, трансформированных генно-

инженерной конструкцией,

содержащей ген ОРР, в тканях листьев растений пшеницы. На рисунке представлена фотография после инокуляции листьев пшеницы бактериями после 72 часов после обработки.

II. Влияние В. зиЫШй 26Д н сигнальных молекул на развитие фнтофтороза на листьях картофеля и септориоза на листьях пшеницы

Известно, что растения приобретают устойчивость к патогенам после их предварительной инокуляции слабоагрессивными штаммами или обработки иммунизаторами [НазБт й а!., 2004], а также ризосферными индуцирующими рост растений микроорганизмами [Логинов и др., 2001]. Нами проанализированы особенности развития оомицета РИ. т/еэЫт на листьях растений картофеля, предобработанных В. яиЫШя 26Д. Поскольку в жизненном цикле возбудителя фитофтороза сочетаются и биотрофная и некротрофная фазы развития [НаНгп е1 а1., 2007], интерес представляет защитный эффект на растения обработки СК и ЖК, известных индукторов устойчивости растений к биотрофам и некротрофам, соответственно. На рис. 4 представлены данные по влиянию сигнальных молекул и суспензии бактерий В. зиЫШэ 26Д и их композиций на развитие оомицета РИ. т/еНат.

Как видно, наибольшим защитным эффектом на картофеле обладала ЖК, а также композиция клеток В. зиЫШя 26Д с СК. Использование отдельно СК или суспензии клеток В. ¡иЬПШ 26Д также защищало растения от патогена, но в меньшей степени. ЖК в сочетании с бактериальным препаратом В. яиЫШя 26Д, значительно снижала защитный эффект.

Вероятно, при совместном их применении на отрезках листьев происходит нарушение запускаемых ими сигнальных путей, формирующих устойчивость к патогену, подобно тому, как это показано ранее при совместном использовании СК и ЖК на растениях арабидопсиса [Маих-Маш а а!., 2004].

Рис. 4. Проявление симптомов фитофтороза на листьях растений картофеля, подвергнутых обработке различных комбинаций сигнальных молекул и бактериальной культуры В. 26Д В. зиЬнШ (балл развития болезни). 1 - Контроль (3); 2 - СК (2); 3

- ЖК (0); 4 - В. ¡¡иЬПШ (2); 5 - В. 5иЫШ5 + СК (1); 6 - В. *иЫШ* + ЖК (4). Время наблюдения развития пятен через 3 сут после инфицирования.

Следует заметить, что и при инфицировании грибом 5. поАогит растений пшеницы, иммунизированных сигнальными молекулами и В. виЫШя 26Д, наблюдаются такие же изменения в устойчивости, что говорит об определенной неспецифической реакции растительных клеток на использованные в работе соединения, не зависящей от генотипа хозяина.

Таким образом, в композиции В. .чиЬШи 26Д и СК способствует снижению степени развития болезни и, соответственно, формирует устойчивость. В то же время, композиция бактериальных клеток с ЖК подавляло защитную реакцию, индуцируемую как самими бактериями, так и ЖК. Полученные данные предполагают, что при составлении композитов, содержащих в качестве действующего начала живые бактериальные культуры и сигнальные молекулы или соединения с подобным эффектом необходим внимательный подход.

III. Влияние бактерии В. $иЫНН 26Д на биохимические показатели растений.

1. Генерация перекиси водорода в растениях пшеницы, инфицированных грибом Вфо/ат мгокш 'шпа

Добавление клеток В. эиЫШз 26Д уже к 15 мин опыта индуцировало интенсивную генерацию Н202 в среде культивирования корнями этиолированных 3-х сут проростков пшеницы (табл. 1). Его содержание поднималось с уровня 450 -500 п.М на мл среды до 2030 пМ в течение опыта. Содержание Н202 и в самих проростках под влиянием В. зиЫШх превышало контроль почти в 2 раза (рис. 5). Инфицирование способствовало снижению, индуцированного бактерией В. хиЫШь-26Д, уровня АФК как в корневой части растений, так и в листьях. Полученные

результаты, предполагают системный характер этого процесса. В то же время,

Таблица 1. Влияние В. яиЫШя 26Д на уровень Н202 и активность окисления

Варианты опыта Время культивирования, мин

5 10 15

Контрольные проростки 450±14 470±11 500±21

Проростки, обработанные В. япЬИИя 410±20 480±50 2030±30

Бактериальная суспензия В. ¡иЬНИя 25±2 26±3 39±2

п:

ж

Рис. 5. Изменение содержания Н2О2 в растениях пшеницы, обработанных В. яиЫШз 26Д и инфицированных грибом В. яогоктшпа. 1 — контроль; 2 — инфицирование; 3-Я зиЫШз 26Д; 4 - В. зиЬЧШ 26Д + инфицирование.

способность патогена снижать уровень Н202 в растениях предполагает, что одним из механизмов формирования его агрессивности следует считать изменения в прооксидатном статусе хозяина, чему, по всей вероятности, препятствует эндофит. Подобную реакцию накопления АФК ранее наблюдали при росте растений гороха на культуральном фильтрате ризобиальных и ризосферных бактерий [Логинов, 2005]. Следовательно, В. subtilis или ее метаболиты, способствуют системной иммунизации растений, подобно таковой под влиянием актиномицетов [Conn et al., 2008] и ризосферных бактерий [Логинов, 2005].

2. Активность пероксидазы в растениях пшеницы инфицированных возбудителем корневых гнилей грибом В. sorokiniana

Ранее было показано, что активация изопероксидаз, характеризующихся свойством концентрироваться в зоне инфицирования, коррелирует с устойчивостью растений к патогенам [Бурханова, 2007]. В связи с этим мы проверили способность эндофитов активировать пероксидазу, как один из компонентов защитной системы растений. При добавлении в среду культивирования В. subtilis 26Д происходила кратковременная активация фермента на второй час после начала опыта как в корнях (1,56 раза), так и в надземной части (2,24 раза). Подобную активацию ПО ранее наблюдали при инфицировании растений картофеля патогенной бактерией Clavibacter michiganensis [Граскова и др., 2004].

Интересным фактом, на наш взгляд, можно считать двукратное повышение активности фермента в колеоптилях. Это, во-первых, говорит о системности индуцирования активности фермента, так же как и накопления Н202 под влиянием бактерии, а во-вторых, вероятно, предполагает возможность его участия в формировании у растений под влиянием В. subtilis 26Д устойчивости к ряду патогенов [Исаев, 2003; Кузьмина и др., 2003], в том числе и корневых гнилей [Schrey et al., 2008]. Предварительная предпосевная обработка семян суспензией

Ю.6 р щр

' Рис. 6. Спектр изопероксидаз в

9 4 Щ Щ *? цитоплазматической фракции белка из

¡? проростков пшеницы сорта Жница. 1 -

контроль; 2 -инфицирование грибом В. 8.3 М * #' зогоктита, 3 - В. виЬШи 26Д; 4 - В зиЬпШ

Ш? * 26Д и инфицирование грибом В. ьогокШапа.

7.3 0 2-е сут после инфицирования. Образцы перед

проведением ИЭФ выравнивались по концентрации белка. Время инфицирования -г.: -у; 10 сут после посева. М-маркерные белки.

5.9

¡»¿¿¡^ '"tes»

5.3 Щ ■ ( 4-7 #

4.4 ¡|

3.5

М 1 2 3 4 В. эиЫШз 26Д и последующее инфицирование растений грибом В. .чогок1п1апа определяется всплеском пероксидазной активности к 3-им сут после инфицирования. Полученные данные говорят, что основная доля в повышении общей активности пероксидазы под влиянием бактериального препарата В. яиЫШз 26Д связана с активацией анионных изопероксидаз (рис. 6). Ранее в лаборатории было показано, что эти изоПО взаимодействуют с компонентами клеточной стенки патогенов [Черепанова, 2005], а том числе с хитином [Максимов и др., 2005].

3. Изменения в активности пероксидазы в патогенных системах пшеница - гриб S. nodorum и картофель - оомицет Pli. infestons под влиянием бактерий В. subtilis 26Д и сигнальных молекул

Анализ ПО активности в растениях пшеницы, а также картофеля, предобработанных сигнальными молекулами и суспензией клеток В. subtilis 26Д и впоследствии инфицированных грибом S. nodorum, показал, что ее уровень повышается при иммунизации (рис. 7). Следует при этом обратить внимание на то, что наиболее высокая активность ПО наблюдалась в неинфицированных растениях пшеницы, предобработанных ЖК и растениях картофеля под влиянием бактерий. Полученные данные предполагают способность самой ЖК и В. subtilis 26Д непосредственно воздействовать на активность ПО. О возможности С К индуцировать активность ПО ранее сообщалось [Kawano, Tominori, 2007; Максимов и др., 2011]. Совместное применение суспензии бактерий В. subtilis 26Д и СК, в отличие от обработки только СК, также способствовало активации ПО почти в 3 раза. Однако для нас было удивителен факт снижения активности ПО в варианте с совместным применением ЖК и бактерий В. subtilis 26Д, где ранее наблюдалось супрессия устойчивости к септориозу у пшеницы и фитофторозу у картофеля. Таким образом, активность ПО является одним из индикаторов устойчивости растений.

Рис. 7. Влияние сигнальных молекул и суспензии клеток В. subtilis 26Д на активность пероксидазы в листьях пшеницы, при инфицировании S. nodorum (А), и в растениях картофеля, при инфицировании оомицетом Ph. infestans (Б). 1 - Контроль (вода); 2 - СК; 3 - ЖК; 4 - В. subtilis; 5 - В. subtilis + СК, 6 - В. subtilis + ЖК. / -контроль; II - инфицирование. Время фиксации - 24 часа после инфицирования

IV. Роль бактерий В. subtilis 26Д и сигнальных молекул в регулировании транскрипционной активности генов пероксидазы пшеницы

{ТС¡51917) и картофеля (М21334)

Известно, что СК индуцирует СПУ [Kawano, 2003), а ее структурный аналог бензотиадиазол повышает транскрипционную активность гена анионной ПО арабидопсиса [Katz et ai,, 1998]. Как видно из рис. 8А, инфицирование вызывает повышение уровня экспрессии гена ПО почти на 100 ед. у пшеницы. Ранее подобное изменение наблюдали при инфицировании проростков пшеницы грибом В. sorokiniana [Бурханова и др., 2007]. Предварительная обработка растений СК, точно также как суспензией бактериальных клеток В.subtilis 26Д и их смесью, поддерживала активность гена на уровне 100 - 150 ед. Как и следовало ожидать, и СК и суспензия бактериальных клеток В. subtilis 26Д при инфицировании индуцировали активность гена до уровня 250 ед., что, вероятно, и являлось одним из компонентов, формирующим средний уровень устойчивости таких растений к септориозу. Интересно, что в композиции СК + В subtilis 26Д активность этого гена была также высокой (рис. 8).

Листья растений пшеницы, подвергнутые предпосевной обработке ЖК, характеризовались высокой степенью устойчивости. Однако мы помним, что при составлении композиции этого соединения с бактериальными клетками В. subtilis 26Д его защитный эффект исчезал, также как и в вариантах с использованием растений картофеля (рис. 4). Действительно, в инфицированных растениях пшеницы, предобработатанных перед посевом композицией ЖК и В. subtilis 26Д, уровень транскрипционной активности гена ПО ТС151917 не превышает таковую растений, обработанных СК (рис. 8А).

При совместной обработке растений картофеля суспензией В. subtilis 26Д и СК количество гранскриптов гена пероксидазы было высоким (рис. 8Б), что говорит о сохранении в этих условиях индуцированной бактерией активности гена. При инфицировании таких растений возбудителем фитофтороза транскрипционная активность гена М21334 оказывается высокой, что коррелирует с устойчивостью растений к болезни (рис. 4). Соответственно, нами обнаружена корреляция устойчивости растений к патогенам с экспрессией генов ПО как в растениях пшеницы, так и картофеля.

Рис. 8 Результаты нормализованой против генов актина оценки экспрессии генов пероксидазы пшеницы ТС 151917 (А) и картофеля М21334 (Б), обработанных СК, ЖК и культурой клеток В. subtilis 26Д при инфицировании S. nodorurn и Ph. infestans, соответственно. 1 - Контроль (вода); 2 - СК; 3 - ЖК; 4 - В. subtilis; 5 - В. subtilis + СК; 6 - В. subtilis + ЖК. 1 - контроль; 11 - инфицирование Время фиксации - 24 часа после инфицирования

Полученные данные позволяют сделать ряд выводов. Во-первых, предобработка растении В. subtilis 26Д способствует активизации защитных реакций в растениях, связанное с повышением экспрессионной активности генов ПО пшеницы ТС151917 и картофеля М21334. Во-вторых, что СК и ЖК, точно также, как и бактериальная суспензионная культура В. subtilis 26Д, сенсибилизируют (повышают чувствительность) геном растений и приводят к резкой и многократной активации транскрипционной активности гена ПО в инфицированных растениях. В-третьих, на фоне индукции высокой транскрипционной активности генов ПО пшеницы ТС151917 и картофеля M2I334 в инфицированных растениях при обработке растений композицией СК с клетками В. subtilis 26Д. комбинация бактериальных клеток с ЖК оказывается не эффективной. Таким образом, в растениях и картофеля и пшеницы, при формировании у них защитного ответа к гемибиотрофным патогенам, запускающая СИУ система, вероятно, превалирует над СПУ, что согласуется с данными, полученными в лаборатории на растениях картофеля [Максимов и др., 2011] и пшеницы [Яруллина и др., 2011].

V. Сохранение защитного потенциала в клубнях картофеля в условиях хранения

Протекторный эффект эндофитного штамма В. subtilis 26Д можно использовать для защиты растений от патогенов, не только во время их вегетации, но и их органов в состоянии глубокого покоя, то есть во время хранения. Наиболее удобным объектом для таких работ является картофель, клубни которого в условиях хранения интенсивно поражаются различными возбудителями гнилей, в том числе вызываемыми возбудителями фитофтороза и фузариоза. Биологическая эффективность препаратов в полевых условиях составила от 38 до 79,2%. Так. двукратная обработка растений картофеля комплексом препаратов Фитоспорин-М + Гуми снижало развитие болезней. Как видно, максимальная биологическая эффективность препарата в этом варианте опыта в период вегетации составила 79%, при хранении - 69,8%, что сопоставимо с биологической эффективностью химических СЗР в полевых условиях.

Интересно, что, как в 2008, так и в 2009 годах, биологическая эффективность

13

химических СЗР в период вегетации составила 80%, а в условиях хранения в 2008 г. была на уровне 40%. Заметим, что в 2009 г. фунгициды защищали в условиях хранения картофель от гнилей клубней только на 4,1 %. Это можно связать с отсутствием пролонгированного их защитного действия и, вероятно, формированием в инфекционном фоне резистентных популяций патогена при их многократном использовании. Биопрепараты Альбит и Мивал не обладали высокой поствегетационной биологической эффективностью при хранении, что теоретически было ожидаемо, поскольку они и рекомендуются для защиты посадок картофеля от патогенов во время вегетации, но не при хранении [Список препаратов, 2008] и не обладают пролонгированной иммуностимулирующей активностью. Наиболее высокой антипатогенной защитой обладал препарат Фитоспорин-М, что особо эффективно проявлялось и в условиях осенне-зимнего хранения.

Нами проведена работа по оценке влияния биопрепарата Фитоспорин-М на основе бактерии В. эиЫШз 26Д на устойчивость растений картофеля к РИ. ¡фзиик и Г. охузропит во время вегетации и в период осенне-зимнего хранения в сравнении с другими биопрепаратами (рис. 9). Обнаружено, что этот препарат, в особенности в комплексе с биоудобрением Гуми-20, оказал положительное влияние на устойчивость к патогенам как в полевых условиях, так и в условиях хранения. В опытных вариантах было меньше поражённых сухой фузариозной гнилью и фитофторозом клубней при хранении (рис. 9).

Таким образом, биопрепараты, в отличие от химических СЗР, могут способствовать последующей пролонгированной защите клубней при хранении от патогенов и позволяет рекомендовать их для использования как на семенных, так и производственных посадках. В целях комплексной защиты как растений картофеля в вегетационный период, так и его клубней во время хранения, вероятно, необходимо производить в условиях поля комбинирование защитных мероприятий с использованием химических СЗР и биологических СЗР.

Г I

[ 1 I

—. -Л

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 9. Развитие возбудителей сухой фузариозной гнили (а) и фитофтороза (б) на клубнях картофеля из растений, предварительно обработанных в полевых условиях биопрепаратами: 1 - контроль, 2 - Фитоспорин-М, 3 - Гуми-20, 4 - Фитоспорин-М + Гуми-20, 5 - Борогум, 6 - Альбит, 7 - Мивал,8 - химическая защита (Максим+Ридомил).

Итак, нами обнаружена высокая эффективность биопрепаратов на основе живых бактерий В эиЫШз штамма 26Д в защите растений картофеля и пшеницы от патогенов. Полученные нами данные открывают новые перспективы в изучении механизмов индуцирования биопрепаратами, в том числе и бактериального происхождения, защитных механизмов растений и отмечают необходимость соблюдения определенного регламента в их использовании, связанного с запуском под их влиянием определенных сигнальных защитных систем, зачастую антагонистически относящихся к друг другу.

14

выводы

1. С использованием стерильных растений картофеля, а также трансформированных форм бактерий В. subtilis 26Д, синтезирующих белок GFP, выявлено, что этот штамм обладает свойством проникать в ткани растений и эндофитно сосуществовать в них, стимулируя ростовой и иммунный потенциал.

2. Иммуностимулирующая активность бактерий В. subtilis 26Д имеет пролонгированное действие в онтогенезе растений, способствуя, также сохранению защитного потенциала в клубнях картофеля в период их хранения.

3. Один из механизмов системной иммунизации растений под влиянием эндофитного штамма бактерии В. subtilis 26Д связан с индуцированием активности компонентов про- и антиоксидантной систем (генерация и деградация АФК, пероксидазная активность).

4. Установлено, что под влиянием В. subtilis 26Д в растениях пшеницы происходит активация изопероксидаз с р/ ~ 3.5 - 4.5, 7.3 и 9.9, характеризующихся свойством взаимодействовать с мицелием патогенных грибов и участвующие в последующем в формировании устойчивости пшеницы к корневым гнилям.

5. Один из выявленных механизмов взаимной интерференции защитного ответа под влиянием совместной обработки растений пшеницы и картофеля эндофитным штаммом В. subtilis 26Д и жасмоновой кислотой к возбудителям септориоза и фитофтороза связан с эффектом супрессии функции генов пероксидазы и подавлением активности их белкового продукта.

6. Обнаружено, что комплекс салициловой кислоты и эндофитной культуры В. subtilis 26Д индуцирует в растениях пшеницы и картофеля более высокий защитный эффект, в сравнении с отдельным их применением, сопряженный со специфической экспрессией генов пероксидазы.

7. Сравнительный анализ транскрипционного статуса генов пероксидаз М21334 картофеля и TC15I9I7 пшеницы в ответ на обработку растений суспензионной культурой клеток В. subtilis 26Д и жасмоновую кислоту в норме и при инфицировании патогенами указывает в пользу их участия, как компонентов жасмонагной сигнальной системы, в индуцированной эндофитом устойчивости.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Максимов И.В., Абизгпльдина P.P., Юсупова З.Р., Хайруллин P.M. Влияние бактерий Bacillus subtilis 26Д на содержание пероксида водорода и активность пероксидазы в растениях яровой пшеницы // Агрохимия, 2010, № 1. С. 55-60.

2. Максимов И.В., Абизгпльдина P.P., Пусенкова Л.И.. Стимулирующие рост растений микроорганизмы как альтернатива химическим средствам защиты от патогенов // Прикл. биохимия и микробиология. 2010. Т. 47, № 4, С. 373-385.

3. Пусенкова- Л.И., Абизгпльдина P.P., Максимов И.В. Поствегетационное сохранение защитного потенциала в клубнях картофеля против патогенов биопрепаратами на основе эндофитной бактерии Bacillus subtilis 26D II Агрохимия. 2011, №6, С. 43-48.

4. Абизгпльдина P.P., Сурина О.Б., Хайруллин P.M., Максимов И.В. Реинокуляция как способ повышения вирулентности эндофитной бактерии Bacillus subtilis - основы ряда современных биопрепаратов // Проблемы сохранения биологического разнообразия Волжского бассейна и сопредельных территорий II Сборник материалов, 29 декабря 2009 г., Чебоксары, 2010. С. 113-114.

5. Абизгпльдина P.P., Максимов И.В., Пусенкова Л.И. Влияние биопрепаратов на клубни картофеля в условиях хранения // Сборник тезисов 14-й Международной

Путинской школы-коиф. молодых ученых. Пущино, 2010. С. 368.

6. Пусенкова Л.И., Максимов И.В., Абизгильдина P.P., Умаров И.А. Влияние биопрепаратов на про-/антиоксидантный статус растений картофеля в период хранения // Материалы V Всероссийской конф. Мол. ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов, 2010. С. 27-29.

7. Максимов И.В., Пусенкова Л.И., Абнзгильднна P.P. Сохранение защитного потенциала биопрепаратов в клубнях картофеля в поствегетационный период. // Сборник трудов «Биологическая защита растений - основа стабилизации агроэкосистем» Выпуск 6. Краснодар, 2010. С. 448-451.

8. Пусенкова Л.И., Максимов И.В., Абизгильдина P.P., Умаров И.А. Повышение адаптивности сахарной свеклы к стрессовому воздействию гербицидов в условиях засухи // Сборник тезисов Всероссийского симп. «Растение и стресс», Москва, 2010. С. 293-294.

9. Абнзгильднна P.P., Бурханова Г.Ф., Максимов И.В. Влияние Bacillus subtilis 26D и CK на устойчивость пшеницы к септориозу // Сборник тезисов Всероссийского симп. «Растение и стресс», Москва, 2010. С. 23-24.

10. Умаров И.А., Цветков В.О., Пусенкова Л.И., Абнзгильднна P.P. Стимулирование биохимических механизмов устойчивости в тканях картофеля под влиянием биопрепаратов II Сборник тезисов Всероссийского симпозиума «Растение и стресс», Москва, 2010. С. 363-364.

11. Абнзгильднна P.P., Максимов И.В., Пусенкова Л.И., Умаров И.А. Влияние биопрепаратов на про-/антиоксидантный статус растений картофеля в период хранения // Мат-лы конф. «Научное обеспечение устойчивого ведения сельскохозяйственного производства в условиях глобального изменения климата» посвященный 90-летию Тат НИИСХ. Казань, 2010. С. 8-10.

12. Абизгильдина P.P., Сорокань A.B., Максимов И.В., Влияние эндофитной бактерии Bacillus subtilis 26Д на устойчивость картофеля к фитофторозу при совместном применении с сигнальными молекулами и препаратом борогум // Сборник трудов «Системы высокоурожайного земледелия и биотехнологии как основа инновационной модернизации АПК в условиях климатических изменений». Уфа, 2011.С. 52-56.

13. Абнзгильднна P.P., Сорокань A.B., Бурханова Г.Ф. Регуляция системной устойчивости растений картофеля к возбудителю фитофтороза под влиянием эндофитной бактерии Bacillus subtilis 26Д и сигнальных молекул // Материалы 1-й Международной Интернет-конф. "Растения и микроорганизмы" ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) Федеральный Университет". Казань, 2011. С. 82-87.

14. Сорокань A.B., Абнзгильднна P.P., Бурханова Г.Ф., Черепанова Е.А. Регуляция устойчивости растений картофеля к фитофторозу эндофитной бактерией Bacillus subtilis салициловой и жасмоновой кислотами // Материалы второй всеросс. школы-конф. «Биомика наука 21 века». Уфа, 2011. С. 116-118.

Автор благодарит сотрудников лаборатории биохимии иммунитета растений ИБГ УНЦ РАН к.б.н. Сурину О.Б., к.б.н. Черепанову Е.А., к.б.н. Бурханову Г.Ф., к.б.н. Валеева А.Ш., Сорокань A.B., а также сотрудников лаборатории молекулярной биологии и нанобиотехнологии к.б.н. Баймиева А.Х., и Птицина К.Г. за неоценимую помощь при выполнении физиологических и молекулярно-биологических экспериментов.

Отпечатано с готовых диапозитивов в ООО «Принта», заказ № 295, тираж 100. 450054, пр. Октября, 71.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Абизгильдина, Регина Рамилевна, Уфа

61 12-3/636

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УФИМСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи

АБИЗГИЛЬДИНА РЕГИНА РАМИЛЕВНА

ИНДУКЦИЯ ЗАЩИТНОЙ СИСТЕМЫ ПШЕНИЦЫ И КАРТОФЕЛЯ ЭНДОФИТНЫМИ БАКТЕРИЯМИ Bacillus subtilis 26Д

03.01.05. - Физиология и биохимия растений

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Максимов И.В.

Уфа-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр

ВВЕДЕНИЕ 6 ГЛАВА 1. РОЛЬ СТИМУЛИРУЮЩИХ РОСТ РАСТЕНИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ (СРРМ) В РЕГУЛЯЦИИ УСТОЙЧИВОСТИ

К ПАТОГЕНАМ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)..........................................................................11

1.1 Классификация современных средств защиты растений..............................11

1.2 Участие сигнальных молекул, запускающих СПУ и СИУ, в функционировании про-антиоксидантной системы растений........................14

1.3 Биопрепараты на основе СРРМ............................................................................................23

1.4 Механизмы защитных эффектов СРРМ........................................................................27

1.4.1 Синтез антибиотиков..................................................................................................................27

1.4.2 Гидролазы............................................................................................................................................32

1.4.3 Фитогормоны и сигнальные молекулы....................................................................34

1.4.4 Сидерофоры......................................................................................................................................37

1.4.5 Улучшение фосфорного и азотного питания растений............................38

1.5 Особенности симбиотического взаимодействия СРРМ в

формировании защитной системы растений....................................................................39

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 48

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 48

2.1 Объекты исследований..................................................................................................................48

2.1.1 Возбудители болезней пшеницы и картофеля и методы работы с ними........................................................................................................................................................................48

2.1.2 Средства защиты растений и иммунизаторы, использованные для обработки растений....................................................................................................................................................54

2.2 Условия проведения опытов....................................................................................................56

2.2.1 Лабораторные испытания......................................................................................................56

2.2.2 Полевые опыты................................................................................................................................56

2.3. Методы биохимических исследований........................................................................58

2.3.1 Получение белковых экстрактов и измерение активности перокси дазы........................................................................................................58

2.3.2 Измерение уровня Н202............................................................................................................59

2.3.3 Колориметрический метод определения белка по Bradford..................59

2.3.4 Изоэлектричесское фокусирование белков..........................................................60

2.4 Молекулярно-биологические методы..............................................................................60

2.4.1 Выделение и очистка РНК из растений....................................................................60

2.4.2 Полимеразная цепная реакция ДНК............................................................................61

2.4.3 Олигонуклеотидные праймеры, использованные в работе....................61

2.4.4 Реакция обратной транскрипцонной ПЦР на основе матричной РНК и полуколичественный анализ экспрессии гена пероксидазы..............62

2.4.5 Проведение RAPD анализа..................................................................................................63

2.4.6 Электрофорез ДНК и РНК в агарозных и полиакриламидных гелях........................................................................................................................................................................63

2.4.7 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей..............64

2.4.8 Получение протопластов В. subtilis 26Д и их трансформация плазмидной конструкцией, содержащей ген GFP................................64

2.5 Статистическая обработка результатов..........................................................................66

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 67

3.1 Экспериментальное обоснование эндофитного развития бактерии

В. subtilis 26Д в тканях растений картофеля и пшеницы........................................67

3.2 Влияние В. subtilis 26Д на проявление симптомов болезней

пшеницы и картофеля..............................................................................................................................74

3.2.1. Развитие корневых гнилей в растениях пшеницы..........................................74

3.2.2 Развитие возбудителя септориоза S. nodorum на отрезках листьев

пшеницы..............................................................................................................................................................75

3.2.3. Развитие фитофтороза на листьях картофеля....................................................78

3.3. Влияние бактерии В. яиЫШя 26Д на биохимические показатели растений................................................................................ 80

3.3.1 Генерация перекиси водорода в растениях пшеницы, инфицированных грибом Шро1ап8 зогокМапа............................... 81

3.3.2 Активность пероксидазы в растениях пшеницы инфицированных грибом В1ро1аш Богокшапа........................................................ 83

3.3.3 Активность пероксидазы в растениях пшеницы при инфицировании грибом & пос1огит............................................. 88

3.3.4 Активность пероксидазы в растениях картофеля при инфицировании Рк .......................................................... 90

3.4 Роль бактерии В. япЫШв 26Д и сигнальных молекул в регулировании транскрипционной активности генов пероксидазы в растениях пшеницы и картофеля................................................ 91

3.4.1 Транскрипционная активность гена пероксидазы ТС151917, в растениях пшеницы, инфицированных возбудителем септориоза........ 93

3.4.2 Регуляция экспрессии гена пероксидазы М21334 в растениях картофеля под воздействием возбудителя фитофтороза.................... 95

3.5 Сохранение защитного потенциала в клубнях картофеля при

обработке растений В. яиЫШз 26Д................................................... 99

Заключение........................................................................... 106

Выводы................................................................................ 110

Список литературы................................................................. 112

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода; ЖК - жасмоновая кислота; ИЭФ - изоэлектрофокусирование; КГА - картофельно-глюкозный агар; ЛПС - липополисахариды;

НАДФН - никотинамидадениндинуклеофосфат восстановленный;

ПААГ - полиакриламидный гель;

ПО - пероксидаза;

ПЦР - полимеразно-цепная реакция;

СВЧ-реакция - сверхчувствительная реакция;

СЗР - средства защиты растений;

СИГУ - системная индуцированная устойчивость;

СК - салициловая кислота;

СПУ - системная приобретенная устойчивость;

СРРМ (PGPR) - стимулирующие рост растений микроорганизмы;

ФА - фитоалексины;

ФБ - Na-фосфатный буфер;

ХОС - хитоолигосахариды;

Н202 - пероксид водорода;

НРПС - нерибосомальный пептидный синтез;

ФАЛ - фенилаланин-аммиак-лиаза;

HR (hypersensitive response) - гиперчувтсвительный ответ;

GFP (green fluorescent protein) - зелёный флуоресцентный белок;

р/- изоэлектрическая точка;

PR-белки - патоген-индуцированные белки;

RAPD (Random Amplified Polymophic DNA) - праймер с произвольной случайной последовательностью ДНК.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований. В последние десятилетия растет интерес к биологическим средствам защиты растений (СЗР), которых отличает от химических СЗР экологичность и безопасность при применении. К таким СЗР следует отнести биологически активные соединения и живые эндофитные культуры микроорганизмов, способные стимулировать иммунный потенциал растений против патогенов [Pieterse et al., 2007; Bakker et al., 2007; Barruiso et al., 2008; Saunders, Kohn, 2009; Van der Lelie et al., 2009], который заметен на фоне высокой восприимчивости исходной формы растений [Reva et al., 2004; Compant et al., 2005; Van Loon, 2007; Мелентьев, 2007; Романенко и др., 2008; Berg, 2009; Wu et al., 2009]. Выявлено, что в растениях, под их влиянием запускаются механизмы защитной системы хозяина, обозначенные как «системная индуцированная устойчивость» (СИУ) (induced systemic resistance (ISR) и «системная приобретенная устойчивость» (СПУ) (systemic acquired resistance (SAR) [Van Loon, 2007; Barruiso et al., 2008; De Vleesschauwer et al., 2008], где важную роль играют сигнальные пути, регулируемые жасмоновой (ЖК) и салициловой кислотами (СК), соответственно. Кроме того известно, что некоторые биопрепараты обладают непосредственной антифунгальной активностью [Мелентьев, 2007].

Экологичность биопрепаратов привлекает производителей сельскохозяйственной продукции. Их рынок в 2004 г. составлял примерно 588 млн. USD [Bolckmans, 2008], из которых на долю Северной Америки приходилось 50% [http://www.abercade.ru/research/ analy-sis/3194.html]. Хотя на современном этапе биологические меры борьбы с патогенами и фитофагами в России мало применяются, по заключению экспертов, уже к 2012 году они «должны стать конкурентоспособными с пестицидами» [цит. по Монастырский, Першакова, 2009].

Еще в прошлом веке идентификацией и токсикологическими

исследованиями эндофитных штаммов бактерий, выделенных из различных организмов, в том числе и растений, активно занимались в Институте микробиологии и вирусологии НАН Украины под руководством академика НАН Украины В.В. Смирнова. На основе одного из выделенных штаммов Bacillus subtiîis ВНИИСХМ 128 (26Д) в Респ. Башкортостан (РБ), на базе предприятия «Башинком» (г. Уфа), было налажено производство биопрепарата «Фитоспорин-М», успешно прошедшего полевые испытания и запатентованного с участием сотрудников нашего института [Патент РФ №2099947]. Этот биопрепарат рекомендуется для использования на посевах различных сельскохозяйственных культур и активно используется в хозяйствах. Однако следует заметить, что фундаментальные основы физиолого-биохимических механизмов формирования устойчивости растений к патогенам под влиянием эндофитных штаммов микроорганизмов, в том числе и В. subtiîis ВНИИСХМ 128 (26Д) остаются пока практически не исследованными.

Цель исследования: Определение роли эндофитной бактерии Bacillus subtiîis 26Д в запуске механизмов, формирующих устойчивость растений к патогенам, на модели пшеницы и картофеля.

Задачи исследований:

1) определить способность бактериальных клеток В. subtiîis 26Д эндофитно сосуществовать в тканях растений;

2) определить влияние В. subtiîis 26Д на формирование устойчивости растений пшеницы к грибным патогенам Septoria nodorum и Bipolaris sorokiniana, а также растений картофеля к возбудителю фитофтороза Phytophthora infestons и фузариоза Fusarium oxysporium;

3) оценить влияние В. subtiîis 26Д на устойчивость растений картофеля к патогенным грибам во время вегетации и в период осенне-зимнего хранения;

4) оценить характер изменения компонентов про-/антиоксидантной

систем в растениях пшеницы и картофеля под влиянием В. БиЬНШ 26Д и инфицирования патогенами;

5) изучить уровень экспрессии гена пероксидазы у инфицированных растений пшеницы и картофеля при обработке В. яиЫШз 26Д, салициловой и жасмоновой кислотами.

Научная новизна. Доказан эндофитный способ сосуществования бактерии штамма В. виЫШя 26Д в тканях растений пшеницы и картофеля и выявлено их участие в запуске молекулярных механизмов индуцированной устойчивости против септориоза и фитофтороза, соответственно. Обнаружена модуляция транскрипционной активности генов пероксидазы у растений пшеницы и картофеля, способствующая как более раннему иммунному ответу, так и супрессии защитного ответа при предварительной предпосевной обработке растений комплексом бактериальной суспензии с СК или ЖК, соответственно. Сравнительный анализ транскрипционного статуса генов пероксидаз М21334 картофеля и ТС 151917 пшеницы в ответ растений на В.яиЫШя 26Д и жасмоновую кислоту в норме и при инфицировании патогенами указывает в пользу их участия, как компонентов жасмонатной сигнальной системы, в индуцированной эндофитом устойчивости растений.

Практическая значимость работы. Совокупность полученных данных позволяет расширить современные представления о физиологических и биохимических механизмах устойчивости растений. Доказано, что применение В. БиЫШя 26Д в композиции с СК индуцирует, а ЖК супрессирует защитную систему растений, что требует внимательного подхода при подборе баковых смесей препаратов, содержащих в качестве действующего начала живые бактериальные культуры и сигнальные молекулы. Иммуностимулирующая активность бактерий В. зиЫШй 26Д имеет пролонгированное действие, способствуя сохранению защитного потенциала клубней картофеля в период их хранения. Основные результаты работы

могут быть использованы в учебно-исследовательской работе.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 10-й и 14-й Пущинских школах-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века» (2006, 2010) и Всероссийской 2-й школе-конф. по физико-химической биологии и биотехнологии «БИОМИКА - наука XXI века» (Уфа, 2011), на I-й Всероссийской научно-практической конф. студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием «Проблемы сохранения биологического разнообразия волжского бассейна и сопредельных территорий» (Чебоксары, 2010), на У-й Всероссийской конф. молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010), на Всероссийском симп. «Растение и стресс» (Москва, 2010), на Международной научно-практической конф. «Научное обеспечение устойчивого ведения сельскохозяйственного производства в условиях глобального изменения климата» (Казань, 2010), на Ш-м Международном симп. "Растения и микроорганизмы» «Клеточная сигнализация у растений» (Казань, 2011).

Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье 10-04-97021 «Эффективность экологически безопасных препаратов с иммуностимулирующей активностью на картофеле», государственного контракта Министерства образования и науки № П339 по ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. "Структурно-функциональная характеристика полисахарид-специфичных пероксидаз" и договором с Башкирским НИИ сельского хозяйства РАСХН «Влияние биопрепаратов с иммуностимулирующей активностью на устойчивость клубней картофеля к фитофторозу» в рамках государственного контракта по региональной ГНТП «Развитие научной и инновационной деятельности в сельском хозяйстве, биологии и медицине. Оптимизация функционирования биологических систем в РБ».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 3 статьи в журналах из «Перечня ВАК».

ГЛАВА 1. РОЛЬ СТИМУЛИРУЮЩИХ РОСТ РАСТЕНИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ (СРРМ) В РЕГУЛЯЦИИ УСТОЙЧИВОСТИ к ПАТОГЕНАМ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Классификация современных средств защиты растений

Во всех системах земледелия важнейшим условием получения высоких урожаев является интегрированная защита посевов от вредителей и болезней, включающая организационно-хозяйственные, селекционные и агротехнические мероприятия, использование химических средств защиты растений (ХСЗР) и биопрепаратов. Главное место среди них принадлежит системе ХСЗР, прошедшим сложный путь от чисто эмпирических приемов до научно-обоснованных комплексных мероприятий, таких как протравливание семян и опрыскивание посевов фунгицидами, инсектицидами и гербицидами [Захаренко, 2007].

Современные препараты для защиты растений от вредных организмов можно условно разделить на 3 группы. Первая - это пестициды с явным биоцидным эффектом, уничтожающие целевые «вредные» организмы. Эффективность их применения достаточно высока. Однако они уничтожают и «полезные» в агроценозе виды, что является их основным «минусом», имеют слабую степень утилизации в природных сообществах, накапливаются в продуктах питания и характеризуются высокой канцерогенностью. Согласно данным ФАО-ВОЗ, остатки пестицидов обнаруживаются в почти 40% используемых в пищу продуктах. В связи с этим в растениеводство стали внедряться фунгициды системного действия, менее токсичные и быстро утилизирующиеся в растениях. Однако, их использование сопряжено с материальными затратами, поскольку они дороги, и у патогенов к ним со временем формируется резистентность. Это вынуждает искать для защиты растений все более новые ХСЗР, расширяя их ассортимент, с неизбежной потерей контроля над их использованием.

Ко второй группе средств защиты растений следует отнести низкомолекулярные вещества, способные стимулировать иммунный потенциал растений. По одной из классификаций [Дьяков и др., 2001] такие препараты условно делятся на:

1) повышающие устойчивость клеточных стенок растений к атаке патогена за счет накопления в инфицированных тканях кремния или лигнина;

2) активирующие фенольный метаболизм;

3) индуцирующие синтез фитоалексинов;

4) приводящие к сенсибилизации растений, то есть подготавливающие их к атаке патогена;

5) усиливающие чувствительность клеток гриба к внешним воздействиям, в том числе со стороны гидролаз растений.

Согласно О. Л. Озерецковской и Н.И. Васюковой [2002], индуцирование системной болезнеустойчивости растений с помощью природных элиситоров обладает рядом преимуществ перед ХСЗР. К их числу следует отнести:

- низкую степень опасности для людей, организмов, не являющихся мишенями действия препарата, и окружающей среды;

способность индуцировать устойчивость у растений-хозяев, лишенных генов устойчивости, к болезнетворным агентам, за счет наличия альтернативных сигнальных путей;

- способность