Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности формирования и развития арбускулярной микоризы в условиях in vitro

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Карандашов, Владимир Евгеньевич, Москва

Российская Академия Наук Институт Физиологии Растений им. К. А. Тимирязева

На правах рукописи

КАРАНДАШОВ Владимир Евгеньевич

ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ И РАЗВИТИЯ АРБУСКУЛЯРНОЙ МИКОРИЗЫ В УСЛОВИЯХ in vitro

03.00.12 - физиология растений

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

научный руководитель: к.б.н. И. Н. Кузовкина

Москва 1999г.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений 6

Введение 7

Глава 1. Обзор литературы 10

1.1. Понятие арбускулярной микоризы 10

1.2. Компоненты арбускулярной микоризы 12

1.3. Жизненный цикл грибов АМ 15

1.3.1. Грибной инокулюм 17

1.3.2. Прорастание грибов АМ 18

1.3.2.1. Влияние эксудатов корней на прорастание 19 грибов АМ

1.3.2.2. Влияние летучих соединений на прораста- 23

ние грибов АМ

1.3.3. Первичная колонизация корней грибами АМ 24

1.3.4. Развитие внутреннего мицелия 26

1.3.5. Развитие наружного мицелия 27

1.3.6. Ауксилярные клетки 27

1.3.7. Спороношение 28

1.4. Факторы, влияющие на формирование и развитие АМ 28

1.5. Немикотрофные растения 30

1.6. Культивирование грибов АМ в условиях in vitro 32

Глава 2. Материалы и методы 42

2.1. Грибной материал 42

2.1.1. Грибные изоляты 42

2.1.2. Выделение грибных спор 42

2.1.3. Стерилизация грибных спор 42

2.1.4. Использование фрагментов корней с микоризой в 44 качестве источника грибного инокулюма

2.2. Растительный материал 44

2.3. Питательная среда 45

2.4. Изменение рН питательной среды в культурах трансфор- 49 мированных корней

2.5. Влияние рН на прорастание спор и развитие про- 49 ростковых трубочек Glomus caledonium

2.6. Установление двойной культуры грибов AM и 49 трансформированных корней растений

2.7. Сбор и анализ данных 50

2.7.1. Извлечение корней растений и грибных структур 50 из питательных сред

2.7.2. Окрашивание корней с микоризой 51

2.7.3. Параметры развития грибов AM в двойных 51 культурах

2.7.4. Параметры развития трансформированных корней 54

2.7.5. Микроскопическое наблюдение и фотографи- 55 рование

2.7.6. Статистическая обработка данных 55

Глава 3. Результаты 56

3.1. Жизненный цикл гриба AM Gl. caledonium на 56 трансформированных корнях моркови

3.1.1. Морфологические особенности наружного 58 мицелия Gl. caledonium

3.1.2. Микроскопическое подтверждение формирования 59 микоризы

3.1.3. Спороношение 61

3.2. Развитие других грибов AM в двойной культуре 66

3.3. Влияние факторов питательной среды на формирование и 70 развитие AM

3.3.1. Влияние рН питательной среды на прорастание 70 покоящихся спор С1. ссйейотит

3.3.2. Факторы, вызывающие изменение рН питательной 71 среды

3.3.3. Влияние концентрации фосфора в питательной 74 среде на формирование и развитие микоризы грибом АМ а. са1ес!оптт на трансформированных корнях моркови

3.3.4. Влияние концентрации сахарозы в питательной 76 среде на формирование и развитие микориз грибами АМ на трансформированных корнях моркови

3.4. Влияние возраста растения-хозяина на формирование 79

микоризы

Глава 4. Обсуждение 81

4.1. Моноксеничная культура 01. са1ес!отит 81

4.1.1. Состав питательной среды 81

4.1.2. Выбор желирующего агента при культивировании 82 АМ в стерильных условиях

4.1.3. Влияние рН питательной среды на формирование 84 и развитие АМ в стерильных условиях

4.2. Морфологические особенности наружного мицелия 01. 86

са1ес1општ при культивировании на трансформированных

корнях моркови

4.2.1. Arum и Para-типы АМ в условиях in vitro 86

4.2.2. «Наружные арбускулы» 87 4.3. Спороношение в моноксеничных культурах грибов АМ 89

4.3.1. Продуктивность моноксеничных культур GI. 89 caledonium и Gl. intraradices

4.3.2. Особенности спороношения а. ссйес1општ на 90 трансформированных корнях моркови

4.4. Моноксеничная культура гриба АМ Сг/. еЫтсаЫт 94

Выводы 95

Благодарности 97

Список Литературы 98

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AM арбускулярная микориза

ВАМ везикулярно-арбускулярная микориза

грибы AM грибы арбускулярной микоризы

грибы ВАМ грибы везикулярно-арбускулярной микоризы

МЕС (3-морфолино-этансульфоновая кислота

МОПС 3-(7У-морфолино)-пропансульфоновая кислота

«НА» «наружные арбускулы»

Трис Трис-(гидроксиметил)-аминометан

ALS-BAS от англ. arbuscule-like structures-branched absorbing

structures

pRi плазмиды (от англ. root inducing) Agrobacterium

rhizogenes

Т-ДНК трансформирующая ДНК Ri-плазмид

ВВЕДЕНИЕ

Арбускулярная микориза (далее АМ) является самым распространенным симбиозом на Земле. В его формировании принимают участие облигатно симбиотрофные грибы из пор. 01оша1ез (Zygomycotina) и корни 80 % видов высших растений. Интерес к АМ вызван тем, что растения демонстрируют ярко выраженный положительный ростовой ответ на колонизацию корней грибным мицелием. Улучшение роста растений сопровождается повышением устойчивости к стрессовым ситуациям и патогенам. Эти эффекты обусловлены активностью грибного мицелия, который поглощает минеральные элементы, особенно малоподвижные (Р, Си, 2п), и переносит их в корни ассоциированного растения-хозяина, получая взамен органические формы углерода.

Многочисленные эксперименты, проведенные в полевых условиях и с использованием горшечной культуры, привели к некоторому прогрессу в области физиологии минерального питания растений с микоризой и к осознанию того, что инокуляция культурных растений грибами арбускулярной микоризы (далее грибы АМ) является естественной альтернативой внесению больших количеств удобрений, в первую очередь фосфорных, и что АМ может быть использована для восстановления нарушенных естественных экосистем, рекультивации эродированных, загрязненных и выпаханных почв. Возрастающий уровень понимания актуальности данной проблемы выражается словами, являющимися девизом ВЕС* - органа, координирующего работу с АМ в Европе: «большинство растений, строго говоря, имеют не корни, а микоризы» и «изучение растений без их микориз есть изучение артефактов».

Значительно меньше известно о механизмах регуляции взаимоотношений растения-хозяина и гриба АМ. Сложные взаимодействия

* La Banque Européenne des Glomales

микроорганизмов ризосферы, варьирующие физико-химические характеристики субстрата, комплексная взаимосвязь надземной и подземной частей растения значительно затрудняют изучение AM. Кроме того, существующие методы выделения компонентов микоризы из почвы не позволяют сохранить целостность системы корень-гриб. С этой точки зрения стерильная культура грибов AM на корнях растений является удобным инструментом для исследования разнообразных сторон жизнедеятельности AM, поскольку позволяет прослеживать динамику процессов ее формирования и развития без нарушения целостности системы. Для этих целей наиболее целесообразно использование pRi Т-ДНК трансформированных корней растений в качестве растений-хозяев, поскольку они характеризуются хорошим развитием на сильно обедненных питательных средах, что является необходимым условием получения AM in vitro.

Культивирование AM в стерильных условиях вызывает особый интерес в связи с возможностями широкомасштабного получения качественного грибного инокулюма, свободного от бактериального и грибного заражения, который может быть использован в растениеводстве, в т. ч. для повышения приживаемости трансгенных растений и растений, полученных методом клонального микроразмножения, при переносе их из стерильных условий в естественные.

Использование стерильных культур AM ограничено трудностями введения грибных изолятов в культуру, что обусловлено их облигатным симбиотрофным статусом и высокой требовательностью к условиям культивирования. С 1959 г., когда были предприняты первые попытки проращивания спор грибов в условиях in vitro (Mosse, 1959), и до настоящего времени в стерильную культуру на корнях растений были введены только пять видов грибов AM, что, естественно, не отражает всего многообразия существующих форм грибов и формируемых ими микориз.

В связи со сказанным, введение в стерильную культуру новых изолятов грибов АМ позволит определить факторы, обуславливающие успешное формирование и развитие АМ, исследовать особенности взаимоотношений компонентов симбиоза и предложить методы получения чистого грибного инокулюма.

В связи с этим целью данной работы было введение новых видов грибов АМ и изучение формирования и развития АМ на корнях растений. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. определение основных факторов среды, обуславливающих формирование и развитие АМ на трансформированных корнях растений;

2. оптимизация условий культивирования грибов АМ, направленная на интенсификацию развития грибного мицелия и повышение продуктивности спороношения;

3. определение морфологических особенностей развития грибного мицелия в стерильных условиях;

4. определение видоспецифических особенностей взаимоотношений грибов и растений-хозяев;

5. долговременное поддержание двойных культур грибов и трансформированных корней растений и получение качественного жизнеспособного грибного инокулюма.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Понятие арбускулярной микоризы

Везикулярно-арбускулярная микориза (ВАМ) - самый распространенный симбиоз на Земле. В его формировании принимают участие облигатно симбиотрофные грибы из порядка Glomales (Zygomycotina) и корни 80% видов высших растений (Simon et al., 1993), среди которых растения, образующие истинные корни (голосеменные, покрытосеменные, папоротники) и гаметофиты некоторых мхов, плауновидных и псилотофитов. ВАМ встречается на корнях травянистых растений, кустарников и деревьев, произрастающих как в тропических районах, так и в средних широтах.

Грибы, формирующие ВАМ (грибы ВАМ), появились предположительно 353-462 миллиона лет назад и, вероятно, играли важную роль в процессе освоения суши сосудистыми растениями (Simon et а/., 1993; Remy et al., 1994).

Ha настоящий момент грибы ВАМ (примерно 150 видов) отнесены к порядку Glomales, где они образуют три семейства и шесть родов: Glomus, Sclerocystis (Glomaceae), Entrophospora, Acaulospora (Acaulosporaceae), Gigaspora и Scutellospora (Gigasporaceae)(Morton, 1988; Morton & Benny, 1990; Smith & Read, 1997).

ВАМ получила свое название вследствие образования грибными гифами характерных структур - арбускул и везикул, которые формируются внутри корней во время симбиотрофной стадии развития гриба (рис. 1). Арбускулы представляют собой обильно ветвящиеся гаустории, развивающиеся в клетках коры корней микотрофных растений. Функции, выполняемые арбускулами, до конца не определены. Везикулы, заполненные многочисленными липидными каплями формируются как в клетках коры корня, так и между ними и выполняют запасающие функции.

Рисунок I. Структуры, характеризующие симбиотическую стадию развития грибов AM: а — арбускула, сформированная грибом AM Glomus mosseae в клетке коры корня лука-порея (из Brundrett et а/., 1984); б — везикулы, сформированные грибом AM Glomus intrarcidices в корнях лука.

В настоящий момент термин «ВАМ» не совсем точно отображает существующее многообразие форм данного типа микориз. С одной стороны, грибы из семейства Gigasporaceae не образуют везикул внутри корней растений-хозяев во время симбиотрофной стадии развития, и, строго говоря, такая микориза должна называться «арбускулярной микоризой» (Smith & Read, 1997). С другой стороны, определенные сочетания микотрофных растений и грибов ВАМ приводят к формированию активно функционирующей микоризы без образования внутриклеточных арбускул (Smith & Smith, 1997). Таким образом, термин «ВАМ» используется, скорее по инерции, для обозначения представленной группы грибов, общей характеристикой которых является формирование мутуалистического симбиоза с корнями растений и способность образовывать внутриклеточные арбускулы. Данное определение подразумевает, что некоторые виды никогда не продуцируют везикул, а развитие грибов внутри корней растений существенно варьирует (Smith & Read, 1997). Поскольку в современной научной литературе просматривается тенденция замещения термина «везикулярно-арбускулярная микориза» термином «арбускулярная микориза», то далее будет использоваться термин «арбускулярная микориза» (AM, грибы AM).

1.2. Компоненты арбускулярной микоризы

Арбускулярная микориза состоит из трех основных компонентов: корня растения и двух ассоциированных с ним мицелиев, один из которых развивается в апопласте корня, другой - в почве. Рост и развитие мицелиев происходит в абсолютно разных условиях. Стабильность первых определяется гомеостазом апопласта корня, вариабельность вторых -постоянно изменяющимися характеристиками почвы (Smith & Read, 1997).

AM характеризуется отсутствием специфичности во взаимодействии корней микотрофных растений и грибов AM. Это значит, что любой грибной изолят, выделенный из одного вида микотрофного растения, в принципе, может колонизовать любой другой вид растений, который способен формировать AM (Smith & Read, 1997). Однако степень, с которой виды растений и, даже, различные генотипы в пределах одного вида становятся колонизованными микоризными грибами, существенно варьирует. Справедливо и утверждение о том, что разные виды и отдельные изоляты грибов AM колонизуют корни одного и того же вида микотрофного растения в различной степени (Hayman, 1983; van Nuffelen & Schenck, 1984; Giovannetti & Hepper, 1985; Blaschke, 1991; Habte & Manjunath, 1991; Ianson & Linderman, 1993; Pearson & Jakobsen, 1993; Smith & Read, 1997; Douds et al., 1998).

Длительное существование AM как биотрофного, мутуалистического симбиоза основывается на двунаправленном транспорте питательных веществ. Наружный мицелий гриба поглощает из почвы и переносит в корни растений ряд питательных элементов (Р, N (NH4+), К, Са, Zn, Си, S и, возможно, Mg, Mn, N (N03~) и пр.). В экспериментах, проведенных в ростовых камерах, было установлено, что до 80% Р, 60% Си, 25%> N, 25% Zn и 10%) К, содержащихся в растительных тканях, может быть доставлено грибными гифами (Li et ah, 1991а, b; Marschner & Dell, 1994, Marschner,

1995). Особенную роль грибной мицелий играет в поглощении малоподвижных элементов (Р, Zn и Си).

Источники питательных элементов в почве и механизмы их поглощения на настоящий момент точно не установлены. Предполагается, что растущие корни создают вокруг себя зону, обедненную ортофосфатом и другими малоподвижными ионами. Грибные гифы, отрастающие от поверхности корня, проникают далеко за пределы этой зоны и значительно увеличивают, тем самым, площадь всасывающей поверхности (рис. 2; Hayman, 1983). Кроме того, гифы проникают в почвенные поры, недоступные для корней растений, где они эффективно конкурируют с почвенными микроорганизмами за минерализованные питательные вещества (Smith & Read, 1997). Таким образом, наружный мицелий грибов AM в значительной степени выполняет функции корневой системы растения-хозяина по поглощению и транспорту питательных элементов. Установлена обратная зависимость между способностью корней растений

Рисунок 2. Схема, иллюстрирующая возможный механизм поглощения питательных веществ из субстрата гифами наружного мицелия грибов АМ (по Наутап, 1983).

формировать корневые волоски и восприимчивостью к колонизации грибами AM (Baylis, 1970; Schweiger et al., 1995).

В свою очередь, грибы AM облигатно зависят от поступления органического С из фотосинтезирующего растения-хозяина. Установлено, что в растениях с микоризой от 4 до 20% продуктов фотосинтеза переходит в эндосимбионт. Поступающий С расходуется на построение грибных структур, поддержание роста и развития гриба и выполнение наружным мицелием функций по поглощению и транспорту питательных веществ (Smith & Read, 1997). В растениях, интенсивно колонизованных грибами AM, биомасса грибного компонента может достигать 20% от общей биомассы корней. Обычно это соотношение составляет около 10% (Fitter, 1991). Дыхание «корней» растений с микоризой на 20-30% выше, чем дыхание растений без нее, причем 87% от этого повышения приходится на эндосимбионт (Baas et al., 1989).

Колонизация грибами AM микотрофных растений, как правило, замедляет развитие корневой системы, а так же влияет на морфологические и анатомические характеристики их корней. Наблюдается усиленное ветвление корней, интенсифицируется развитие боковых корней, уменьшаются апикальная меристема и корневой чехлик, тканевая дифференциация осуществляется ближе к апексу. При более широком распространении микоризной колонизации кончики корней становятся неактивными или вообще отмирают, постепенно утрачивается зона поглощения, и ее функции переходят к наружному мицелию эндосимбионта (Bonfante-Fasolo & Perotto, 1992; Berta et al., 1993; Giovannetti et al., 1993a; Marschner, 1995; Yano et al., 1996).

1.3. Жизненный цикл грибов AM

Жизненный цикл гриба AM включает следующие стадии: прорастание грибного инокулюма (споры, везикулы), рост и развитие проростковой трубочки, взаимодействие с поверхностью корня, формирование аппрессориев, прорастание аппрессориев в корень с последующим развитием внутреннего мицелия, развитие наружного мицелия, вторичная колонизация корней, спороношение (рис. 3).

В процессе формирования и развития AM могут быть выделены два этапа, характеризующиеся принципиально разными источниками органического С, используемого грибным компонентом (Bécard & Piché, 1989а). На первом этапе (период от прорастания грибного инокулюма до проникновения первых гиф в корень растения-хозяина) развитие грибного мицелия определяется �