Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОСОБЕННОСТИ ДЕЙСТВИЯ ДРОЖЖЕВОЙ ГЕКСОКИНАЗЫ В ГОМОГЕННЫХ И ГЕТЕРОГЕННЫХ УСЛОВИЯХ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ОСОБЕННОСТИ ДЕЙСТВИЯ ДРОЖЖЕВОЙ ГЕКСОКИНАЗЫ В ГОМОГЕННЫХ И ГЕТЕРОГЕННЫХ УСЛОВИЯХ"

А-ч Щь

. На правах рукописи

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. И. БАХА

ГОГИЛАШВНЛИ Ламара Захарьевна

ОСОБЕННОСТИ ДЕЙСТВИЯ ДРОЖЖЕВОЙ ГЕКСОКИНАЗЫ В ГОМОГЕННЫХ И ГЕТЕРОГЕННЫХ

УСЛОВИЯХ

(Специальность 03. 00. 04 — биологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени* кандидата биологических наук

Москва, 1975

АКЛДШШ НАУК СССР 0РД2НА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЕИОШШ им.А.Н.БАХА

На правах рукописи

ГОИШШЭДЛИ Лаыара Захарьевна

ОСОБЕННОСТИ ДЕЙСТВИЯ ДРОШЕБОЙ ШСОКШАШ В ГОМОГЕННЫХ И ГЕТЕРОГЕННЫХ УСЛОВИЯХ

(Специальность ОЗ.ОО.О^.биологическая химия)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ,

Москва,1975

Работа выполнена в лаборатории эволюционной биохимии и .субклеточных структур ордена Ленина Института биохимии им. А.Н.Баха АН СССР

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

И.С.КШКВ кандидат биологических наук Р.А.ЗВЯГШШСКАЯ

На официальный отвыв работа направлена во Всес.научно-исслед,витаминный институт (ЩИЗИ).

Автореферат разослан МО^Я 1975 г. .

на заседании ученого совета Ордена їй

им.А.Н.Ьзха АН СССР (Москва,В-7І,Ленинский проспект,33).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Научный руководитель : академик Д.И.ОПАРИН

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь

Проявление многих визнеиных функций связано с гетерогенностью протоплазмы, возникающей за сч«т наличия разнообразных суо'клеточних структур, ограниченных поверхностями раздела. На роль структурной организации протоплазмы, пак важнейшего фактора в регуляции активности фериентов в живой клетке, указывал академик А.И.Опарин еще в 1934 году /Опарин , 1934/' Поэтому, естественно считать моделирование ъ гетерогенных условиях как современного ферментативного катализа, так и широкого круга предбиологических процессов, более оптимальным. подходом, по сравнению с изучением этих ке явлений в гомогенных условиях.

В литературе, наряду с другими моделями доклеточной организации ^широко обсуждается использование фазовообособ-ленных коацерватиых структур в качестве предшественников, жизни - пробионтов, организованных по типу открытых систем, что является одним из положений естественно-научной тео-ршвозникновений еизни »выдвинутой А.й.Опариным в 1224 году. Эта теория получила своё экспериментальное развитие как в трудах самого А.И.Опарина и его сотрудников, так и в работах ряда иностранных учёных.

Однако, одна из менее изученных возможностей коацерва-тов ( в частности фосфолипидных), как . физико-химических структур, заключается в использовании их в качестве белковых адсорбентов, допускающих модификацию фосфолипкда под влиянием внешних условий и, в связи с эт1ш, регуляцию активности фериентов, адсорбировании» на их. поверхности.

С этой целью, в настоящей работе предпринято сравнитель-

ное пиитическое изучение дернен та дрокаевой гексокикагы в гомогенна;: и гетерогенных (ксацерзатних) уедозиях. '

В работе бііла поставлена задача иссдедовагь;

1) рель гетерогенной (кэацерзатной) структуры з регуляции активности дро:-шевой гексокінази при сопряжении её действия с глюкозо-б-йосфаг-дегидрогеназой.

2) влияние концентрации фермента, субстрата (ЛЇФ) и иокоз неорганического фосфата на регуляцию каталитической активності: гекеокиназы б гомогенных и гетерогенних (козцер-ваз) условиях.

Г^АТЕРЮШ И ¡¿ССЛіДОІІЛНІЇЯ

Аденозі-інтріїфосфоркаа кислота (натриевая соль) анализировалась на содержание неорганического фосфата ыегодои фаске-Оуббароу, на куклеогидшгй состав методом высоковольтного электрофореза с четиреххлористыы углеродоы , а їїзкїж методом б у шин ой хроматографии -

За единицу активности гексокіназа (А'£Ф:Д-гексоза- б -фосфотрансфераза 2.ЇІ.І) (Е) б^ло принято то его количество, которое катализирует нрезр;неллз одного іллхро^оля А То в кинуту г.р:і ; опита рН 7,6 и температуре 37°С. В работе использовался кристаллический препарат гекеокиназы

^ЗсіьисАсого^" с удельной активность» 5,4 _ Є

ііг оелка кристаллического препарата

Определение белка б препарате фермента проводилось по методу Лоури.

Глакоза-б-фосфаг дегідрогеназа (д-глюко за-фс ефа т : іІАДФ-оіісидоредукгаза 1.1.1.49) выделена по методу Корнберга

и Хоррекера.Люциферин-лэди&еразную систему шделлли і:з свет-лячкошх гостов. Светлячки б и да ^¿U^öoicL t7ti.n.c£/i&tccil-

Препарат фоофолипидов виделпли из иозга крупного рогатого скота по иетоду, предложенному на кафедрз физики і/.еди-щшского института в г.Тьергу-^уреа (Руишіпя) и опцсанпо^ и работе Корнеевоії и др. (1372 ). Препарат,согласно анализу, содержал лецптлл ,кейаліш и лзолецлиш.

досфолипцдный золь (компонент коацераатной системи) готовили по методу Бунгенберг де Ыонга и Вестеркашіа.В раствор, содержащий компоненты реакционно:-; сие си (глпноза, АЇО^СЇ^, трис-будер О, 5iL pH 7,4, гл-6-фосфат дегідрогеназу),добавлялся фосфолишідішй золь, которым, к а к известно, из литературных дащшх, образует структуры, сходные с липо совами. Дальнейшее ісоацервировашзе систеш происходило в солевой среде под действием U^CI-, .Реакция инициировалась добавлением гекоокинази.

Для характеристики степени окисле наос ти лецитішового золя был применен метод электронного парамагнитного резонанса, основании'! на с преде лекал с всс'о дно-радикального .состояния систем. В эксперпиептах попользовалась установка ЭПР-2, разработанная в ІІХО АН СССР.

При измерении кинетики фосфоршшрозашія глюкози при по-иощи АТф-гексоккназиой системи попользовались три ыетодэ:

І.спектрофотометричесішіі метод, сскозашш» на фзсфоуи-'лировании глакоэы посредством АТО в присутствии дрожжевой гекоокинази и послздующем окислении образовавшегося гл-6-фосфата, при наличии в реакционной среде избиткз глюкэзо-б-

- б -

фосфат дегпдрогеназы и койериента НАДО. Х.од процесса измерялся по эквивалентному количеству восстановленной формы НАДф-при 340 ни.

2. метод Еейли и BeОба, основанный на измерении убыли легкогмдролизуемого <? фосфора ATO в ходе реакции.

3, биолюминесцентный метод (люциферин-люциферазный )(ое-иозацний на специфической омолюиинееценгной реакций кислорода с оксидазнш субетратоы-люциферином, Реакция катализируется ферментом люцифаразой. Люцнферин в процессе окисления быстро реагирует с АТФ с высвечиванием в области 560 шг.

Измерения проводили на специальной хе¿^люминесцентной установке, собранной б институте микробиологии АН СССР в лаборатории академика А.А.Имшенецкого.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I, Изучение кинетики сонрянеиного Ферментативного процесса в гомогенной и гетерогенной системе.

Иа первом этапе работы была сделана псштка выяснить влияние структуры йоацерватной системы на кииетику сопряксн-ного ферментативного процесса, протекающего в их поверхностном слое. Для этого сопряженная ферментативная активность гексо-каназы и глюкозо-б-фосфат дегидрогеназы, адсорбированных на фосфолипидных коацерватах, сравнивалась с поведением этих же ферментов с гомогенном растворе. Измерения проводились спектрофотометрическом методом, позволившим в гомогенной

системе , луи вобранных условиях опыта, получить обычную монотонную зависимость накопления продукта реакции 20 времени (рис.X,кривая 4) .

Рис.1. Кинетика сопряженного ферментативного процесса в

присутствии и отсутствии фосфолштдного золя в реакционной срёде; X - свежеприготовленный фосфолипидный золь; 2 - фосфолпгтдшй золь, окисленный в течение 48 часов при t = 20°С; 5 - фосфолинидный 3t>jib,окисленный в теченние 5 часов при t- =57°; 4 - золь отсутствуем (контроль в гомогенных уелоаиях.).

Эхо давало основание предположитьj что все изменения скорости реакции, полученные при тех ке условиях(рН,температуре, концентрации субстратов),но в гегерогенной сисвеие, иокно отнести только за счет влияния фосфолипидного коацер-ватного адсорбента.Действительно, как видно из того se ри-

ч г i 1 s

fepevifl, MUH.

сунка I, при проведении реакции в гетерогенных (коацерзат-ных) условиях скорость процесса возрастала (кривые^1,2,3, рис,1), по сравнению с гомогенными условиями (кривая 4,рис. 1).Б этих случаях в качестве компонента коацерватной системы использовались три образца фосфолипидного золя.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что степень активации определялась интактностью коацер-ватной структуры. При окислении фосфолщшдов наблюдалось уменьшение степени активации (сравнить кривые I с 2,3 рис.А).

Так как из литературных данных известно, что оба фермента принадлежат к числу тех,максимальная актизкость которых проявляется лишь при условии прикрепления их к ¡.¡еморане, то мо:;шо полагать, что адсорбция изученных ферментов на поверхности коацерватов моделирует процесс регуляции активности этих ферментов в клетке.

Установив факт активации сопряженной реакции в присутствии фосфслилидной гетерогенной системы, ив, руководствуясь данными ряда авторов о процессах переписного окисления, липидоб в биологических системах, попытались связать уменьшение скорости реакции с наличием перекисных радикалов в модифицированном фосфолипидноы золе. С этой целью использовался метод ЭПР. Согласно нашим данным любое окисление фос-фолипидного золя, сопровождающееся появлением перекисных сигналов, регистрируемым методом ЭПР, приводило к уменьшению скорости сопряжённой реакции (свежеприготовленный фосфолипид-яый золь характеризовался отсутствием сигналов ЭПР). На рис. 2 приведены спектры ЭПР свежеприготовленного и окисленного фосфолипидного зеля(спектры ЭПР рис2 -1,2,3 соответствуют

кривыы 1,2,3 рисунка I)

Рис.2. Спектры ЬПР образцов фэсфолшшдиого золя

1 - исходццй с ве г.р иго т сш ее н:шй

2 - окисление при £ = 20° з течении 48 часов

3 - окисление при £ = 37° в течении 5 часов

4 - уф - облучение (А - I минута, Б - 5 шшуты»

В - 5 икнуг).

Анализ полученных данных даеї основание сделать вывод о том, что в коацерватной системе, при модификации фосфолипид-кого компонента происходят, очевидно, изменения структуры, Отвёйтвеншш звеном в этом процессе являются свободыо-радикальные реакции, возникающие не только под воздействием такого мощного фактора, как У5-облучение, но и при спонтанном окислении при 20° и при 37°. Тесная взаимосвязь «оделируеио-го фераенгатйвного процесса с изменение«, очевидно, структуры коацерватз, проявляется в изменении активности ферментов» воэшано, через стадию окисления £>И групп/ Та^орёС 496 4/ а соответствующем уменьшении скорости реакции.

Таким образом,как было показано нашими опытами, на свежеприготовленной фосфоллшдном золе наблюдалась активация со прякённого ферментативного процесса. Изменение структури,свя завноЯ с появлением перенисных радикалов, тормозило сопряжён ный ферментативный процесс и тем больше, чем была больше степень окпсленности системы.

Сопряженный ферментативный процесс не давал возможности определить, какой именно из двух ферментов зависит от изменения структуры . Позїоілу, в следующей части било предпринято изучение только одного фериентз- дроееєбой гексокиназы .в условиях аналогичных описанным (гомогенной и гетерогенной системах).

2. Немонотонное изменение активности геисокикезы в гомогенной и гетерогенной системе.

Для вияснення особенностей регуляции каталитической ак-

і

тивкости дрошевой гексокиназы в геїерогенной (коацервагной) сисїеііе по сравнению с гомогенной, определяли зависимость скорости реакции от концентрации фермента, суо'страта(АТФ) и ионов неорганического фосфата. Скорость реакции измерялась методой Бейли и Вебба по легкогидролизуейому фосфору АТФ.

Как в гомогенной, їак л в гетерогенной оистеиах били по-■ лечены кинетические зависимости при 4-х различных концентрациях фермента 0^=0,24 иг/ші, Сг=0,І2 иг/ил, 0^=0,06 ыг/ил, С^а0,03 иг/мл и одной и топ ае наборе концентраций АТФ М .*

1,4Л0~5 ; 2,в.к/3; 4,2.КГ5; 5.6.І0"5; 7.ІСҐ3; 9,8Л0*"3; II,2.Ю-3 (обозначенных на кривых 1-8 соответственна Концентрация второго субстрата - глюкозы во всех опытах была постоянной и превкиала концентрацию АТФ максимально в 10 раз. Неорганический фосфаг (Фн) вносился в реакционную среду з виде примесей к препаратам АТФ, заведоыо содержащих Фн и АДФ что было установлено в специальных контрольных опытах;

Анализ реакционной сыеси по методу Бсйли и Вебба проводили в координатах £ ), где ^ -оптическая плотность, остаточного легкогидролизуемого фосфора АТФ после определенного вреыени инкубации с ферментом; -исходное значение оптической нлогносеи легкогидролизуемого фосфора АТФ до инкубации ¿ -время. В значение входит такие концентрация он, находящегося я реакционной среде в качестве примеси.

Получена серия кинетических зависимостей при использовании различных препаратов ДТФ не содержащих и содержащих принеси Фн.

На рисунке 3 приведены кинетические зависимости в описанных условиях при использовании препаратов АТФ, практически свободных от примеси АДФ и Фн/АТФ-94,^АДФ-3,3^ фн:: -1,2%)

Рис.3. Кинетика реакции в гомогенной (а) и в гетерогенной

—3

(б) системах концентрация АТФ : 5,4.10 Концентрация фермента 1 С£

Аналогичные зависимости были получены для всех четырёх концентраций фермента.

Как видно из рисунка 3 в этих условиях наблюдается монотонная кинетика гексокиназной реакции.При этом в гетерогенных условиях происходит активация гексошшазной реакции

(кривая б) , за счет структурированности коацерБзтнон системы, что подтверждает данные предыдущей части.

Таким образом, как в гомогенной, гак и в гетерогенной снстеие уменьшение величины относительной оптической плотности при реализации гсксскиназноЙ функции фармента» на наших кинетических графиках адэкватно количеству фосфора ЛК> затрачиваемого на фосфорилиреванше глюкозы и пропорционально скорости реакции.

и даЕьнзйпах опытах использовали препараты ЛИ заведомо содер^ацме ЛДФ а Он. ~

На рис. 4 ( Cj С2 Cj С^) представлены результату изиере ннй активное2к гексокилазы в гомогенных условиях при концентрациях дер^еива Cj , G^ , С^ :: С-, соответственно.

При рассмотрении группы кривых активности гексокнпазы во времени с использованием максимальной концентрации фермеи та ыг/:.:л отчетливо прослеал^аегся тенденция к пеиопо

тоиноиу протеканию процесса во времени и неподчинение данной реакции классической кинетике Ипхоэлиса-^ентеи при всех вось ми концентрациях субстрата.

с

Результаты, полученные концентрацией фермента 12 мг/мл не i*o лыс о подтверждают вывод о немонотонности процесса, но и выявляют, что условием для торможения реакции фосфо рплированил глюкозы явлнстся увеличение соотношения АТФ/фер-мент. Тсрыоленпе (¿осфорилирования обнаруживается по возрас-таш-1ю Он в реакционной среде.

Не исключено, что указанное увеличение содержания Фи

л X

£

_ __

о ? ¿0 '' 4Г

1

с*

Рис.4. Кинетика реакции в гомогенных условиях при концентрации фермента Сд-; С^; С^ и различных концентрациях АХФ (1-8)

связано не только с торможением гексокиназной реакции, но и со стимуляцией АТФ-ой активности гексокиназы.

При сравнении кривых С^ С£ рис.4 обращает на себя внимание уменьшение скорости реакции фосфорилирования глюкозц для всех исследованных концентраций АТС при уменьшении концентрации фермента. В ещё более яркой форме эта тенденция прослешшеется при анализе кривых, полученных при концентрации С^ и С^ (рис.4).

Интересно отметить, что при концентрации С3 фермента и* концентрациях АТС б , * ? и 8 уровень Фн в среде уке оказался вше исходного. Дальнейшее изучение кинетики реакции при концентрации С^ фермента показало тормокение реакции при использовании всех концентраций Л1'ф.

При данных соотношениях АТФ/фермент, все особенности процесса отмеченные выше, проявляются в наиболее рельефном, виде, а именно: а)немонотонное протекание процесса вбвреые-ни, связанное с попеременно« изменением скороета реакции как в сторону её увеличения, так и в сторону уменьшения, наблюдаемое для 4-х концентраций фермента ; б) уменьшение скорости реакции фосфорилирования глюкозы с возрастанием соотношения АТФ/фермеит, в) увеличение в содерианш Фн(о£ + Фн среды) в реакционной среде, связанное с торможением гексокиназной реакции фосфорилирования глюкозы и проявлением, очевидно, АТФ-азной функции фермента.

Аналогичные параметры исследовались в гетерогенноЕ(ко-ацерватной) системе. Проверялись зависимости при тех ие 4-х концентрациях фермента и 8-и концентрациях АТФ. Ка рис. $

(С1 С2 С5 С^) представлены результаты этих оштол.

Анализируя данные, касоюднесл кинетики гексокиназной реакции в гетерогенных условиях, иошш отметить: а)немонотон-нссть процесса наблюдается для какдо& из 4-х концентраций фер^еитз. б) немонотонность процесса сопровождается накоплением Он в реакционной смеси вюе исходного уровня, в) максимальное накопление фн имеет место при использовании Сц и Сд концентрации фермента, г) з отличие от гомогенной системы, где максимальное значение Фн достигалось при 8-ой наивысшей концентрации суостра'-'а, в гетерогенной системе тот-се эффект наблюдается при минимальной концентрации АТО, д) создание ге-терогенео.1 системы способствует активации как процесса накопления он, свнзаиного с проявлением АТФ-азнсй функции, гак и процесса фОСфОрНЛКрОБЕШНЯ глюкозы

Сравнивая кривее зависимости скорости от концентрации фермента псг::з 5 минут инкубации в гомогенны;: и гетерогенных условиях (ряс.6) монно сделать вывод: тормоьюшш реакции фос-форпкнэованип глюкозы в гомогенных условиях увеличивается при изменении концентрации фермента от большей к меньшей. Количество Фн прсвиаает исходный уровень при минимальной концентрации фермента. Структурированная систеьта активирует как фо сформирование глюкозы, так и процесс его тормокеиия. Активация процесса накопления фосфора в гетерогенной системе особенно ярко выражена при использовании концентрации фермента С^ .

о £

____ , ¿м

о ~ .г " ' ^

I_;_______/>-.;

^ 1 гй ь

V-

- - -------* - I ^ о Ь Л

о ¿ ¿7 0 у а &

% С*

Рис.5. Кинетика реакции, катализируемой дролыевой гекоони-назой а гетерогенных (коацерват) условиях при концентрации фермента С]-; С^; С^; С^ а различных концентра-*циях АТФ (1-6)

Рис.б. Зависимость скорости реакции от концентрации фермента в гомогенных (а) и гетерогенных (б) условиях и различных концентрациях АТО (1-8)*

Из анализа полученных данных как в гомогенных, так и видно,что

в гетерогенных условиях , при использовании препаратов АТО, 'заведомо содеркацих прл^еси Фн, наблвдался колебательный характер клнетики. подобный колебательный характер кинетики бал показан также и для других ферментов; миозиновой АТФ-азы (£нодъ,1У7[)), и фоефйкреатищшказы (Четверикова,1967).

шонно допустить, что попеременное обращение направленности процесса обусловлено периодическим изменением конфор-

мации фермента. В нашем случав помимо АДФ, в качестве агента, индуцирующего изменения конфордоции, мо&бт Мавтук'/;*ъ неорганический фосфаг, которой вносится В среду в качестве при-

в

меси АТФ и может также образоваться из АТФ при стимуляции АТФ-ной активности гексокшшзы.

Исследование кинетики реакции с использованием метода Бейли и Вебо при определении легкогидролизуеиого Фн в ходе гексокнназной реакции, позволило выявить ряд специфических особенностей в кинетическом поведении дрожжевой гексокиназы,' Полученные данные являются ецё одним подтверадением уникальных кинетических свойств фермента, обусловленных его сложной структурой, подробно опис-а-мной в литератур

и а& /Жз; Со-£о^(Хг ¿¿¿¿¿К /М;

¿¿£¿1% Л си №3; ^тЖялы <и

¿гус-, Л^е -УаЛ 4Ш её

аЛ ■ Уее-^

Расшифрована первичная структура гексоканаэн; описан её изо-ферментний состав и различия в информации её изоферменгных фор»; выявлены свойства кооперативнооти, в присоединении субстратов к фериенту и аллостерический характер регуляции активности,кесно связанный со сложной четвертичной структурой белковой молекулы. Все это является основой тех парциальных реакций, которые обнаружены у фермента,а именно: глюко-зо-глюкозо-6-фосфатний обмен независимый от нуклеогидов

глюкозой и глюкозо-

-6-фосфатоц в присутствии каталитических количеств А'ТФ,АДФ (возможность обращения прямой реакции

/9М; то].

ЛТЗ-АД'і 0<J:.:eu хіотсутствии с ахи ро в//

Cotow&c jvßttet /Щ-Soio^

АТЗ-азпая au Тіііі "ОС 5,'L [JUsfJatui /Щ- 0£о\?сс*Щ-

Способность reiteокяі:ази катализировать указанные парциальные. реакции послу;їУла основанием для предположения о включении з ;.:ехан::з:,! реакции прс;леіу точного фосфзрилпрован- ' пого фермента

предполагаем, чго в данном комплексе неорганический фосфат связан с фер^сяіїоч в двух качественно различных центрах: з *;кт;івііо:л аллеі терпче с і;о;л.

Согласно дЕ.нииа ряда авторов, а также последний данным Косова и Роза, было показано, что в активном центре за счет ^ -фосдорильной группы АТФ образуется реакционноспоеоо'ная фосфосерпновая связь. В то ке время, как нам представляется, в аллостернчеокои центре нековалентно, но достаточно прочно связывается ¿осфор из реакционной среды. Связь эта настолько прочна, что не гндролизуется при определении легко гидроли-зуекого Фн з и/ HCl. Именно образование Ji-Ф комплекса с варьирующим, з зависимости от конформационного состояния фермента количеством связанного фосфора в аллостеркчеоком центре, аоало объяснить периодические колебания содержания <3н в реакционной среде.

Ь ряде опытов, в особенности в гетерогенной системе,мы наблюдали превышение исходного уровня Фн. В качестве возможней причины ш вначале предположили, что ислользозашшй наші препарат фермента содержит связанный Фн негидролизуеиый в І її HCl и, следовательно, не определяемый в нулевой точке. Б ходе реакций он мог бы превращаться в фосфорильную группу

ЛТФ, открываемую при гидролизе. Однако простой расчет показал, что даяе при условии, что весь фермент находится в форме фосфо-ферыеита этого количества фосфора недостаточно,чтобы объяснить появление избытка фосфора. Мы предположили,что при семиминутном гидролизе имеет место кедо оIкрив анке лабильного фосфорильных групп АТФ. Лишь действием АТФ-ной активности, заявляемой в условиях нашего опыта, монет быть объяснено, что сумма лабильного фосфора + неорганический молит быть выше исходного уровнн. Следовательно, условием для проявления АТФ-ной активности гексокиназы является увеличение соотношения Фн/фермент. 3 опытах Де Ла Фюэнте и Солза А'ГФ-ная активность была выявлена при модификации фермента ликсо-зой и ксилозой /^^.Фрому для выявлений

АТФ-ной активности причлось увеличить концентрацию АТО в 500

Это явление объясняется теорией индуцированного соответствия Кошшнда, согласно которой аллоотеричеокие эжекторы индуцируют нонформационкые изменения в ферменте. В све-

ферыентоы вызывает такие нонформационные изменения, которые изменяют характер связывания субстрата в нашем случае АТФ с ферментом.

Ташш образом, особенностью процесса как в гомогенной, так и в гетерогенной системе является немонотонный характер протекания реакции, обусловленнВД ролью неорганического фосфата в регуляции активности гексокиназы.

раз, внося в среду полтора молярную

те этой теории связывание аллоетерических модификаторов с

Из анализа полученных данных видао, что для гетерогенной система характерно как резкое ускорение прямой генеокика зной реакции, так и ее торможение с ускорением АТФ-азиой функции.

3. Научение кцнетики дрс^.езо.Ч гекеокиназы бпзлминесцентяыц методом.

С целью подтвердить немонотонный характер процесса по другому показателю - по количеству АТФ применили (¿пол амине с-центний метод. Измерения проводились в Институте микробиологии АН сои? з лаборатории академика А. А. И.мшенецкого.

Опытц вели только в гомогенной среде и использовали те Ее 8 концентрации субстрата ц концентрации фермента С2» С^ и С^, при которых проводили измерения, описанные в главе 2.

Так как з серии вышеописанных опытов, где ход процесса регистрировали по методу Бейли и Бзбба, мы уне ответили корреляцию иекду немонотонностью процесса и количеством Фн, вносимого в среду вместе с АТФ и АДФ, то и в опытах где реакция регистрировалась методом биолюминесценции, мы таете использозали различные препараты АТФ в том числе заведомо содержание фосфат.

При использовании свенеприготовленных растворов препарата АТФ »содержавшим всего около ■{Он при концентрации фермента С2 имеет место монотонное уменьшение содержания АТФ в ходе инкубации, при использовашш всех 8-и концентраций АТФ.

Следует ответить некоторое тормоаение люциферш-люци-феразной реакции ьцеокиии исходными концентрациями субстрата .Затем мы провели опыты с теми се растворами

АТФ, но после предварительного гидролиза при различных, условиях. Кинетика реакции, измеренная на низкой концентрации АТФ (соответственно фн и ЛДО) характеризуется монотонным снижение и амплитуды биолюминесцентного сигнала.

Вместе с тем при 'высокой концентрации АТФ (Он и АДО) и ■ .той нее концентрации фермента С^ амплитуда биолюминесцентного сигнала Шзпеременно изменяется. Таким образом наблюдав-

\

мое различие кинетики реакции обусловлено варьированием концентрации Фн и соответственно АДФ.

Еще в большей степени зависимость амплитуды сигнала от

I

концентрации ш и АДФ прослеживается при использовании меньших концентраций фермента (С3 и С^) различных растворов АТФ, в том числе и содержащих больше Фн,и АДФ чем в опытах с С^-

концентрацией фермента. В этоы случае наряду с гидролизата-ш! АТФ мы использовали препараты АТФ (Иваново)и фирмы

содериацпе все три пуклеотида.Наблюдаемое при регистрации биолшинесцентного сигнала поперемецное обращение направленности процесса в присутствии высоких концентраций Фи обусловлено вероятно, конфоршционыыми изменениями гексокинаэы а ,воз:.;ошю, и всей системы гексокиназа-л'оцифе-раза под.влиянием как Фи так и АЛО.

Увеличение концентрации Фн в препарате или вернее,соотношения Фн/фермепт приводит к ингнбированиш гексою:пазной реакции, что согласуется с предыдущими выводами. Таким образом ,амплитуда_колебаний тем больше, чем меньше концентрация фермента и больше соответственно отношение АТФ(Фн)/фермент.

Данное, позученкиє в ато*; главе при інхюцк биолкмипос-центиого ода с зі ласуюте« с даныыач-:, по лу чешімо при измерении кода реакции по легко гидролизу ем ому фосфору А'ІЧ> н показывают казать моделирования гексекпназкой реакции з зависимости от состава пнкуОацкоішоа среди, от классической кинет;:.:;: к немонотонному колебательному процессу.

ОБІДІВ ШЗОдУ.

1. Исследована кинетика солря;;;епної: реакції;; ¿чзкосшша-за-г;::зі;сзс-о-.!)С0'::а'і* дегпдрогензза з го:"огс;шо!1 и гетероген-нсї: системе. [¡оказано, чїо її г«еро?екпол снстсме (коацер-затноіі структура) имеет место значительное увеличение скорости фермэнгатнвного процесса.

2. Представлены доказательства, что структура фосфол:;-нпдкогс ііО..;;:анаіі2з коацерваїно;' системы оказывает существеннее глшп:::е па скорость сопряженного фкрментатнзного процесса. Регистрируемое с помокъи метода аП? переккспсе окисление фос-фолиппда, индуцированное различном;: условиями, сопровождается уменьшением скорости сопряженной фермента тиин с 1І реакции.

5. С ломощьм 2-х независимых методов изучена кинетика гсксокнн^. биоіі реакції л в гомогенных и гетерогенных условиях. ¡1 оказана возможность моделирования гсксокпназной реакции в зависимости от состава инкубационной среды - от классической кинетики к немонотонному колебательному процессу.

Выявлена роль -й и ЛД-і в качестве факторов,индуци-руіадпх кемолотолнм;; характер процесса. ¡Іредлогено объяснение возможного участиш неорганического фосфата в моделирований кинетики гексокиназной реакции.

5. ^¡явлены ¿-слонин дли проявления АТ^азцой активности гексокниазы, как в гомогенной, тан и в гетерогенной системах.

6. Обмочен "гипертрофированиый" немонотонный характер протекания процесса в гетерогенной (коацерзатной) системе, выражающийся как в резком увеличении, так и в торможении скорости реакции.

СПИСОК РАБОТ опубликованных но материалам диссертации

1. Васильева Н.В., Ьалаевская Т.О. »Гогилаавили Л.З.л Uepeti-

ровская К.Б..1969. Сравнительное изучение кинетики сопряженной реакции на коллоидных модедях(ко~ ацерватах).Биохимия,34, й 4, 795.

2. Сереброаскан К.Б., Гогил&швияи Л.Ь.,Андриадзе 5.U..1569.

Роль модельной дмпядной поверхности в регуляции, активности гексокиназц.&ур.эЕОЛЮц.биохкц.и физиол. 5,!й6, 583.

3. Опарин A.il., Сереоровская К.Б.,Гог:;лашвил;-1 Л.3.1969.Обра-

щение реакции переноса фосфата на глюкозу в кса-

i

цервзтиой системе гексо:шказа/лецитин. ДАН СССР, 185. & 4, 952.

4. Гогйлашвилп Л.о. ,Ссреьроьская il, Б. 1971. !!с;.;01Шти:3пое из-

менение активности гексскиназы в гомогенных и гетерогенных условиях. В cti. : "¿колебательное процессы в биологических системах" 2,37,Пущино-на-Оке.

5. Го^'илашвиии Л.З. 1971. Применение метода электронного парамагнитного резонанса при исследовании лн-пидного компонента коацерватной систеш белок-л;:пкд-вода. Сообщения АиГрССР.62. Г' 3, 693.6. Гогилашвшш Л.З..Сотников Г.Г. 1973. Изучение кинетики дро:шевой гекоокинази биолюминесцентным методом. ДАН СССР, 208, К 2, 460.

Материалы диссертации доложены чт:

1. Всесоюзной школе-конференции по эволюционной биохимии,

¡¡оэаинкэ ,1959г.

2. Всесоюзной школе-конференции по' эволюционной биохимии,

иозкинка,1971.

______________Эак^816____£иЕ._200

Иипография Х030 Госплана СССР