Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние участников гексокиназной реакции на взаимодействие и изозима гексокиназы с митохондриями

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние участников гексокиназной реакции на взаимодействие и изозима гексокиназы с митохондриями"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Р Г В О Л Биологический факультет

На правах рукописи

АБРАМОВА Лариса Викторовна

УДК 577.325.6 : 577.325.3 : 577.352.334

ВЛИЯНИЕ УЧАСТНИКОВ ГЕКСОКИНАЗНОЙ РЕАКЦИИ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ II ИЗОЗИМА ГЕКСОКИНАЗЫ С МИТОХОНДРИЯМИ

03.00.04— Биологическая химия

А втор ефер ат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва1994

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный

сотрудник Н.Ю. Гончарова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

главный научный сотрудник Н. Б. Ливанова

доктор химических наук

старший научный сотрудник Л. М. Гинодман

Ведущая организация — Институт биологической и медицинской химии РАМН.

Защита состоится » ^'ЛсрЛ- 1994 г

в !& час. 30 мин. на заседании специализированного совета Д.053.05.32 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: г. Москва 119899, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ.

Автореферат разослан 1994 г

/ Ученый секретарь ( специализированного совета кандидат биологических наук

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. -

Актуальность проблемы. Современный этап в развитии энзшюло-гии связан с пересмотром представления о ферменте как о самостоятельной функциональной единице в клетке. Индивидуальные характеристики ферментов, отражающие их каталитические возможности, рассматриваются в зависимости от реальных внутриклеточных условий, к которым прежде всего относят функционирование ферментов в составе обратимых комплексов с субклеточными структурами. В связи с этим мембранные образования клетки могут рассматриваться в качестве необходимых участников каталитического акта. Вследствие взаимодействия ферментов с биологическими мембранами полнее реализуется связь между структурой и функцией ферментов, тем самым открываются дополнительные возможности и для реализации их функциональных проявлений [Wilson,1978,1985; Курганов,1986].

К ферментам такого типа относится гексокиназа тканей млекопитающих. Как полагают, на основании взаимодействия различных изозиыов гексокиназы с митохондриями возможна адаптация гексоки-назной реакции к особенностям энергетического и углеводного обмена в различных тканях. В случае II изозима гексокиназы (гексокиназа II) иммобилизация фермента на мембранах рассматривается как способ регуляции активности фермента in vivo (адсорбционный механизм регуляции активности гексокиназы) [Мунтян, 1987: Зеленина, 1990]. В основе такого механизма, с одной стороны, леяит обратимость этого явления в физиологических условиях, поскольку образование гексокиназа II- митохондриального комплекса происходит при участии адсорбирующего реагента глюкозы, а диссоциация - под действием оолюбилизирущего реагента глюкозо-6-фосфата. С другой стороны, вследствие образования гексокиназа II-мембранного комплекса происходит активация фермента, в основе которой лежит из-

менение его кинетических параметров. Реализацию адсорбционного механизма регуляции активности гекеокиназы II связывают с переменной интенсивностью углеводного обмена, характерной для скелетной мышцы. Полагают, что вследствие активации гексокиназной реакции происходит интенсификация биосинтеза гликогена после интенсивного мышечного сокращения, а также быстрая утилизация глюкозы крови при участии инсулина в случае углеводного стресса. Следует отметить, что по своему адсорбционному поведению гексоки-наза II резко отличается от других изозимов, в частности, от I изозима гекеокиназы (гекеокиназы I) из мозга. В последнем случае высокопрочное связывание фермента с - митохондриями происходит по специфическим центрам (пориновые каналы), без участия посредников и не сопровождается изменением кинетических параметров фермента.

Проявление адсорбционных свойств гекеокиназы обеспечивается, по-видимому, существованием у изозимов фермента специфической структурной зоны, условно называемой адсорбционным доменом. С наличием такого домена связывают полную потерю ферментом его способности к адсорбции на митохондриях вследствие ограниченного про-теолиза. В случае гекеокиназы I предпринимались попытки исследовать структурные особенности адсорбционного домена с помощьр метода избирательного протеолиза и техники моноклинальных антител [Ш1воп, 1991,1992]. Применительно к гексокиназе II структурные исследования адсорбционного домена не проводились.

Цель работы. В целях исследования механизма характерного адсорбционного поведения гекеокиназы II в диссертационной работе предполагалось получить структурно-функциональные характеристики адсорбционного домена втой молекулярной формы фермента.

Однако использование общепринятых методов структурного анализа при решении втой проблемы следует считать превдевременным без

наличия четких критериев, с помощью которых можно адекватно идентифицировать границы и функциональную полноценность адсорбционного домена в его натиьном состоянии. С учетом этого для исследования структуры адсорбционного домена гексокиназы II решено било использовать косвенный подход, предполагающий детальный анализ условий образования и распада гексокиназа П-мембранного комплекса в сочетании с изучением особенностей функционирования фермента в его составе.

В работе использовали частично очищенный препарат II изози-ма гексокиназы из скелетных мышц крысы, а также препарат митохондрия из того же источника после солюбилизации периферических белков с целью удаления эндогенной гексокиназы. В качестве основных эффекторов, влияющих на образование и распад гексокиназа 11-мито-хондриального комплекса использовались участники гексокиназной реакции.

Научная новизна. Проведено сравнительное исследование адсорбционных свойств различных молекулярных форм гексокиназы из разных тканей крысы при их взаимодействии с митохондриальными мембранами. Получены приоритетные данные, указывающие на то, что II изозим гексокиназы из скелетных мышц является особой формой фермента в отношении его адсорбционных возможностей. Предполагается, что сущность адсорбционного поведения гексокиназы II сводится к тесной взаимосвязи его с особенностями кинетического механизма катализируемой ферментом реакции. В основе такой связи лежит, очевидно, тесное структурное взаимодействие адсорбционного и каталитического доменов. Реализация этого взаимодействия возможна при фиксировании в активном центре фермента не только специфического адсорбирующего реагента - субстрата реакции глюкозы, но и специфического солюбилизирувдего эффектора - продукта реакции

глюкозо-6-фосфата. Роль второго субстрата гексокиназной реакции -MgATP сводится к блокированию деструктивного действия глмкозо-б-фосфата. С учетом полученной информации в работе предлагается схема функционирования гексокиназа П-митохондриального комплекса в скелетной мышце ln vivo в условиях протекания гекоокиназной реакции. Полученные в работе данные рассматриваются как во многом дополняющие положения концепции адсорбционного механизма регуляции активности гексокиназы II.

Практическое значение. Помимо теоретического полученные в работе данные имеют и практическое значение. Так, они были положены в основу нового оригинального метода получения высокоочищен-ного препарата нативной гексокиназы II с выраженными адсорбционными свойствами из мышечной ткани крыс. Исследованные особенности адсорбционного поведения гексокиназы II могут быть использованы при прямых ■структурных исследованиях втого изозима, обеспечивая возможность идентификации границ и функциональной полноценности адсорбционного домена фермента. Кроме того, особенности взаимодействия аномальных молекулярных фopa гексокиназы е митохондриями могут быть использованы в целях практической медицины в качестве биохимического теота при исследовании различных патологических состояний, а также могут служить контролем ' за »фиктивностью их лечения.

Апробация работы. Результаты исследования Ошш доложены на семинаре кафедры биохимии Биологического факультета МГУ; на X Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности" (Ташкент,1939); На VI Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси,1989); на IX Всесоюзном симпозиуме "Биофизика и биохишя биологической подвижности (мышечное сокращение)(Тбилиси,1990); на Всесоюзной конференции по клинической витаминологии (Москва,1991); на Международном симпозиуме "Биологическая -подвижность" (Луврюо, 1994).

Публика1?1и-. Результаты исследования изложены в 10 печатных работах"!

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, приложения, выводов и

списка цитируемой литературы (192 источника).Работа изложена на 149 стр. машинописного текста и включает 8 таблиц и 18 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Некоторые особенности адсорбционного поведения различных молекулярных форм гексокиназы.

На предварительном втапе работы с целью получения дополнительной информации о выраженных структурных особенностях адсорбционного домена гексокиназы II решено было, с одной стороны, исследовать адсорбционные свойства молекулярных фор! гексокиназы, ранее практически не привлекавшихся к подобного рода исследованиям. С другой стороны,- проЕесги сравнительный анализ гексокиназы I и II в отношении некоторых адсорбционных свойств, не получивших оценки в литературе.

В качестве первого объекта исследования был выбран IV изозим гексокиназы печени крысы (глюкокиназа). Характерной особенностью глюкокиназы, согласно литературным данным, является неспособность к взаимодействию с мембранами из-за утраты адсорбционного домена вследствие возможного ограниченного протеолиза под действием ли-зосомалышх протеаз [РДЗкзеп, 1935, Уокоуата, 19873. Однако, по нашему мнению, эта особенность может быть объяснена не отсутствием адсорбционного домена, а несоблюдением возможных специфических условий для реализации его функциональных свойств. Такими условиями может быть, например, необходимое присутствие глюкозы или ионов % в качестве посредников при образовании глюкокиназа-мембранного комплекса, как это описано для гексокиназы II. Поскольку глюкоза как адсорбирующий реагент действует, фиксируясь в углеводсвязива-адей площадке активного центра гексокиназы II [Гончарова, 1991]. то и при исследовании адсорбционного поведения глюкокиназы, естественным требованием к препарату фермента следует счнтатаь на-

- б -

тивность ее активного центра- Об этом может свидетельствовать стабильность активности глюкокиназы в процессе выделения, а также данные кинетического анализа, указывающие на специфическую структуру углеводсвязывагацей площадки етой молекулярной формы фермента. Полученный в работе препарат глюкокиназы по своим кинетическим характеристикам полностью соответствовал препарату ферменте, описанному в груше Согп1вЬ-Воугйеп [Егогег е1 а1,1976]. Так, глюко-киназа характеризуется сигмоидальной зависимостью скорости реакции от концентрации глюкозы при насыщающих (5 мМ) концентрациях М£АТР, ^=8,9 мМ. Степень выраженности Б-образности зависит от концентрации Ы^ТР, т.к. величины коэффициентов Хилла по глюкозе при 5 и 0,5 мМ %АЕР соответственно равны 1,7 и 1,3.

Взаимодействие нативного препарата глюкокиназы с митохондриями из печени и скелетных мышц крысы изучали в отсутствие и в

О 4

присутствии адсорбирующих реагентов - Ме (10 мМ) или глюкоза в насыщащей концентрации (100 мМ). Однако в указанных условиях глю-кокиназа-митохондриальный комплекс практически яе формируется, т.е. емкость митохондриальных мембран в отношении глюкозсиназы реализуется не более, чем на 1036 по сравнению со случаем образования гексокиназа П-митохондриального комплекса в аналогичных условиях. Кроме того, не удалось обнаружить глюкокиназу и ендоген- •" носвязанную о штохондрияш печени, выделенными в среде, содержащей адсорбирующие реагенты в указанных выше количествах.

В качестве следующего объекта сравнительного анализа адсорбционного поведения изофоры гексокиназы была выбрана молекулярная форма фермента, функционирующая в скелетных мышцах при дефиците витамина Д (гексокиназа Д). При идентификации втой формы оказалось, что она пополняет список полиморфных форм гексокиназы, обнаруженных в тканях при патологических изменениях. В частности.

применительно к мышечной ткани есть основания полагать, что гек-киназа Д напоминает достаточно исследованную аномальную форму гек-сокиназу М-1, характерную для скелетной мышцы при злокачественном перерождении ткани (саркома М-1). Об втом свидетельствуют результаты анализа хроматографических и кинетических свойств молекулярных форм гексокиназы (табл.1).

Таблица 1. Свойства молекулярных форм гексокиназы.

Свойства гексокиназа II гексокиназа М-1 [Гаркуша,1989] гексокиназа Д

Эффективность

элюции о ДЭАЭ- 100 65-5 б0±5

целлюлозы (200 11=30 п=5 п=3

KCl), %

Активность 55-3 78±5 73-3

pH 6,0/рН7,5, % п=5 п=5 п=3

V глюкоза)^ 1,80^, 10* Ю-4 1,00±0,08*10~4 1,22-0,05*Ю~4

гексокиназы, М п=30 n=60 п=6

Кт(глокоза)для гексокиназа-ми- 0,60±0,03*10~4 0,68±0,03*10~4 1,05^0,05*10"'

тохондриального п=30 п=22 11=3

комплекса, М

При исследовании условий адсорбции изоформ на митохондриях оказалось, что образование гексокиназа Д - митохондриального комплекса происходит абсолютно независимо от глюкозы как адсорбирующего реагента. Этим гексокиназа Д отличается от гексокиназы II и гехсо-назы М-1, зависящих, соответственно, полностью и частично от ето-го реагента. Кроме того, в отличие от гексокиназы II гексокиназа Д щи переходе в связанное с митохондриями состояние не меняет

- а -

сродства к глюкозе.

Следующий объектом сравнительного исследования условий образования гексокиназа-митохондриальных комплексов был выбран I изб-зим гексокиназы из сердечной мышцы крысы. С втой целью в работе проводили оценку прочности Фермент-мембранных комплексов (0°С), образованных в случае гексокиназы Н в присутствии глюкозы или как специфического, так и неспецифического адсорбирующих ре-фгентов, соответственно. В случае образования гексокиназа 1-мито-хондриального комплекса присутствия посредников не требуется. Как оказалось, гексокиназа II - иитохондриальные комплексы обладают меньшей прочностью. Об втом свидетельствуют, о одной стороны, результаты анализа изотеры адсорбции: величины коеффициентов распределения для гексокигазы II и I соответственно равны 1,0 и 4,3 (рис.1). С другой стороны, на вто указывают результаты' анализа

Рис.1. Изотермы адсорбции гексокиназы I (1) и гексокиназы II (2,3) на митохондриальных мембранах в присутствии 5 мМ глюкозы (2) и 10 мМ МёС12 (3).

диссоциации фермент-мембранных комплексов под действием КС1 и глюкозо-6-фосфата (рис.2). Эти реагенты являются более аффективными при солюбхишзации гексокиназы II из комплекса с мембранами по сравнению со случаем гексокиназы I.

2

2

2,0 3,0 ¡глякозо-б-фосфат]

a> H

500~*fe0 (JCCQ.mM

u 0

100

300

Рис.2. Солюбилизация адсорбированной на ыитохондриальных мембранах гексокиназы I (1) и II (2) под действием КС1 (л) и глюко-зо-6-фоофата (•). Фермент-мембранные комплексы образованы без адсорбирующих реагентов (1) и в присутствии 5 мМ глхжозы (2).

В связи оо всем вышеизложенным, результаты сравнительного анализа условий образования и распада фермент-мембранных комплексов применительно к расширенному кругу молекулярных форм гексоки-назы подтверждают предположение об уникальности адсорбционного поведения гекоокиппгш ТТ. Кстсстпоппо предположить, что вто связано оо своеобразной пространственной организацией адсорбционного доыэна II изозима гекооишазы. При попытке получить конкретнее представление об "архитектурном" своеобразии этого домена решено было проанализировать механизмы действия адсорбирующих и солю-билизирунщих гексокиназу II реагентов.

Как известно, образование гекоокиназа II - мембранного комплекса происходит при необходимом участии различных по химической природе адоорсирувдих реагентов (глюкоза, бивалентные катионы, биогенные ашшы), действие которых обращается рядом солюбилизиру-щих эффекторов (глвкозо-6-фосфат, КС1, АТР4") (Зеленина, 1990]. В связи о втим, щи характеристике адсорбционного домена гексоки-

назы II на первый план выдвигается проблема "множественности зон" в его структуре, предполагающая наличие различных центров связывания такого рода вффекторов. При попытке оценить примерное количество таких центров связывания решено было привлечь к исследованию субстрат реакции глюкозу и ионы как адсорбирующие реагенты и в качестве антагонистов их действия - продукт реакции глюкозо-6-фосфзт и КС1. Кроме того, список втих реагентов решено было дополнить другим потенциально возможным вффектором, а именно, вторым субстратом реакции - М^АТР. Как известно, его структурные компоненты являются аффективными участниками процесса образования

О!

и распада гексокиназа II- митохондриального комплекса: % как адсорбирующий и АТ?^~как солюбилизируюций реагент. Однако оказалось, что МцАТР, который бил взят в насыщающих концентрациях, не .влияет на взаимодействие гексокиназы II о мембранами митохондрий.

2. Характеристика действия адсорбирующих реагентов при образовании гексокиназа II- митохондриального комплекса.

В связи со всем вышесказанным исследование проблемы "множественности" структурных зон адсорбционного домена гексокиназы II начали с анализа эффективности действия глюкозы и ионов Ы& как адсорбирующих реагентов. С одной стороны с втой целью изучали зависимость количества связанной гексокиназы II с митохондриаль-ными мембранами от дозы адсорбирующего реагента в условиях избытка мембранного материала. Оказалось, что оба эффектора в оптимально действующих концентрациях вызывают практически одинаковую по степени выраженности адсорбцию гексокиназы II. Об втом свидетельствуют значения максимальной емкости митохондрий при адсорбции в присутствии глюкозы и ионов равные, соответственно, 4,8 и 3,9 ыкг/мг белка митохондрий (рис.3). В соответст-

■3 0,6-

Рис.З. Влияние глюкозы (*) 2+

и Mg (•) на адсорбционную способность гексокиназы II в отношении митохондриаль-ных мембран.

ет се

о о

1,0

2,, 0 . [МдССгГ1, ыЫ

0

4

12

20 (гллкоза]-!, м?Л

вии с высказанным предположением находятся и данные об идентичности характера изотерм адсорбции гексокиназы II на митохондриях в присутствии глюкозы и ионов Мй(рио.1). По-видимому, полученные результаты свидетельствуют о том, что при образовании гексоюшаза II- митохондриальных комплексов с участием ионов Щ и глюкозы потенциальная адсорбционная способность фермента реализуется в равной степени. Кроме того, одинаковая эффективность их действия проявляется и в том, что образованные при их участии комплексы обладают одинаковой прочностью, поскольку распадаются практически полностью как под действием глюкозо-6-фосфата, так и под влиянием КС1(рио.2). Более того, глюкоза и ионы Мб оказываются равновффак-тивными и как индукторы структурных изменений гексокиназы II после включения ее в состав комплекса о мембранами. Об этом свидетельствуют результаты анализа кинетических свойств гексокиназы II цри переходе из свободного в связанное о митохондриями состояние (табл.2).Независимо от способа образования комплекса (глюкоза или ионы Щ как адсорбирующий реагент) наблюдается однозначное и специфическое изменение ряда кинетических параметров. Эти изменения

Таблица 2 .Кинетические свойствз свободной и связанной с митохондриалышми мембранами гексокиназы II в присутствии различных по природе адсорбируют« реагентов.

Свойства Свободная форма Связанная форма гексокиназы II в присутствии

гексокиназы II 10 Mi.! Mg2+ 5 мМ глюкозы

Число оборотов сек-1 190±11.4 r-i 570±30.3 570-32.2 п=4

Параметры в отношении глюкозы Kß глюкоза, II Ki,ESir"6-*' М К^ Е12-дезокси-глюкоза, М Kj иН-ацетил-глюкозаман, Н ■ 1.82-0.09x10"^ П=28 0.0б±0.01х10~3 П=5 1.85-О.ЗОхЮ-3 15=5 0.25-0.02Х10"3 п-4 0.60*0. 10х10~4 п=6 0.21*0.05х10-3 п=5 0.40*0.00х10~3 П=6 0.091*0.002х10~3 П=5 0.б8*0.04х10~4 П=8 0.13*0.09х10~3 п=3 0.58*0.21х10_3 15=4 0.072*0.013х10~3 п=5

Параметры в отношении MgATP Kß HgATP, М К1.Е1Г-6"4' М 7.5±o.wxio-4 п=10 . 2.71*0.481 ю-5 п=4 6.4*0.0х10~4 11=6 6.4*0.02х10~4 л-4 2.1-0.21Х10"5 п=3

Ki Е512-лезокси-глюкоза, М Ki цц^-ацетил-глюкозамин. М ъл^о.гхю'3 п=4 3.0*0.04x1О-3 п=5 12.0*0.2х10~3 п=4 2.4-0.28x1О-3 п=4 10. 7-0.7x1 О*"3 П=5 2.7*0.20хю~3 п=б

( Условные обозначения типа ингибирования: El - конкурентный, EIS - неконкурентный )

являются, вероятно, отражением конформационных перестроек непосредственно в области активного центра гексокиназы II, о чем свидетельствует увеличение числа оборотов в 3 раза. Очевидно, кон-формациояные изменения происходят и в области глккозосвязывакцей площадки, поскольку в 3 раза увеличивается сродство к глюкозе и изменяются К^ конкурентных ингибиторов гексокиназы II по отношению к глюкозе - 2-дезоксиглюкозы и №-ацетилглюкозамина. Эти перестройки касаются, вероятно и областей, функционально связанных с углеводсвязыващей площадкой, о чем свидетельствует изменение величины К^ для глюкозо-б-фосфата, определенной по отношению к глюкозе (неконкурентный ингибитор гексокиназы II). При втом в результате образования гексокиназа И-митохондриальных комплексов о участием и глюкозы и ионов по-видимому, не затрагивается АТР-связывавдая площадка, согласно данным о неизменности соответствующих кинетических параметров, определенных; по отношению к %АТР. Таким образом, результаты многопланового анализа эффективности действия адсорбирующих гексокиназу II реагентов следует трактовать как указывающие на наличие единственной структурной зоны, явяяедеЛея шшеныо действия всех исследованных в этих экспериментах вффекторов.

Однако, ето предяодояение находится в противоречии е результатами специального анализа топологии и способов действия отдельных оффекторов. Как было показано ранее, в случае глюкозы как адсорбирующего реагента центр ее связывания находится в углеводсвязыващей площадке активного центра фермента, т.е. располагается вне пределов адсорбционного домена. В соответствии о таким представлением находится характеристика образования гексокиназа II -глюкоза - митохондриального комплекса. С одной стороны, время установления равновесия фермент-мембрана очень мало (в условиях

эксперимента достигается практически мгновенно). С другой стороны, дозозависимость степени адсорбции гексокиназы II от концентрации глюкозы носит гиперболический характер, точно также, как и зависимость скорости гекооюшазной реакции от концентрации

глюкозы [Зеленина,1990, Гончарова и др.,1991]. 2+

В случае Мй как адсорбирующего реагента непосредственным

центром его связывания на ферменте, по-видимому, должен быть

" 2+ адсорбционный домен, поскольку трудно представить, чтобы ,

фиксируясь в углеводсвязываюцей площадке активного центра, вызывал бы в конечном счете абсолютно однозначный глюкозе адсорбционный эффект. Об этом ке свидетельствуют и результаты анализа мёха-2+

низма действия в процессе образования гексокиназа II- митохондриального комплекса. Время образования такого комплекса значительно превышает время формирования гексокиназа II - глюкоза -митохондриального асеоциата (рис.4). Представленный график от-

Рис.4. Динамика адсорбции гексокиназы II на митохон-дриальных мембранах в присутствии 10 мМ Ы§012.

1о оО мин

раиает бифазный характер втой временной зависимости. Также би-фазным является и график завис мооти степени адсорбции гекоокина-аы II от концентрации ионов представленный в двойных обратных координатах (рио.З). Более того, в соответствии о текил характером формирования гексокиназа II- %2+- митохондриального комплекса находятся и данные о трм, что • фермент-мембранные комплексы, образованные в присутствии малых (1мМ) и насыщающих (10мМ) концентраций ионов % обладают различной прочностью. Об втом еви-

детельствуют результаты эксперимента по солюбилизации гексокиназы

II из таких комплексов под действием КС1. Рассчитанные значения

Кд, характеризующие взаимодействие ионов К о гексокиназа II- ыи-

тохондриальными комплексами, образованными при разных концентра-2+

циях , соответственно равны 16 и 38 мМ (рис.5). Полученные

Рис.5. Солюбилизация адсорбированной на ыитохондриальных мембранах гексокиназы II под действием КС! в координатах Скэт-чарда. Ферыент-мембранный комплекс образован в присутствии 1 мМ (1) и 10 МЫ (2) %С12. лХ - доля солюбилизированного фермента, %

данные находятся в соответствии о традиционными представлениями о механизме взаимодействия бивалентных катионов с ферментами, т.е. в данном случае о формировании солевых мостиков между поверхностями адсорбционного домена и мембран.

Таким образом, суммируя результаты анализа эффективности и способа действия, а также локализации адсорбирующих реагентов, можно отчасти представить пространственную организацию адсорбционного домена следующим образом. На поверхности адсорбционного домена существует специфическая конформационно подвижная зона, принимающая непосредственное участие б формировании контакта гексокиназы II с мембраной. Функциональная полноценность этой контз-хтной зоны, связанная о формированием специфической "активной" конформации, обеспечивается участием адсорбирующих реагентов. Наличие такой зоны было выявлено, по-видимому, при исследовании в атом качестве ионов Щ. В случае действия глюкозы как адсорбирующего реагента структурная "активация" контактной зоны ядсорбцион-%

А

ного домена происходит опосредовано - о участием активного центра фермента. В связи о втим, естественно предположить наличие другого участка на адсорбционном домене, структурно контактирующего с каталитическим доменом. По-видимому, через втот участок осуществляется трансмиссия специфического конформационного сигнала от угле-водсвязыващей площадки активного центра после фиксации в нем глюкозы, приводящая к структурной "активации" контактной зоны адсорбционного домена. Такое представление о структурной организации адсорбционного домена свидетельствует о его функциональной неавтономности. Более того, и каталитический домен, в свою очередь, находится в' структурной и функциональной зависимости от структурного состояния адсорбционного домена (табл.2). В связи с втим, дальнейшее изучение структурных особенностей адсорбционного доме-аа гекоокиназы II решено было проводить применительно к отой более сложной модели, учитывающей структурно-функциональное взаимодействие адсорбционного и каталитического доменов. В соответствии с поставленной задачей исследование центров связывания солюбилн-зирувдих гексошшазу II реагентов проводили, анализируя взаимодействие гдюкозо-6-фосфата о фермент-мембранным комплексом, образованным при участии глюкозы. Кроме того, как было показано ранее, такой комплекс является реально образующимся н функционирующем в мышечной ткани 1п у1то.

3. Механизм сашойишзирухщего действия глмкозо-6-фосфата в отношении гексоишаза И-митохондриального комплекса.

При характеристике глюкозо-6-фосфата .как солюбилизирующего реагента следует отметить,что направленность его дейотвия связана о гексокиназой II, поскольку он не взаимодействует оо свободным от фермента мембранным материалом. При втом действие глюкоза-

-6-фоефата вряд ли направлено непосредственно на контактную зону адсорбционного домена, поскольку этот реагент эффективен при низких концентрациях (рис.2-2) и, следовательно, комплекс распадается в условиях низкой ионной силы. Следует отметить, что глюкозо--6-фосфат вызывает полную диссоциацию фермента из комплекса с мембранами, при этом график дозозависиыости степени солюбилизации гексокиназы II носит гиперболический характер. Более того, дейст-ствие глюкозо-6-фосфата высокоспефично, поскольку его достаточно близкие структурные аналоги - фруктозо-6-фосфат, глюкозо-1-фосфат, глюкозо-1,6-дифоофат, взятые в концентрации, когда.эффект глюко-зо-б-фосфата выражен максимально полно, оказываются абсолютно неэффективными в качестве солюбилизирущих реагентов. Таким образом, учитывая все вышеизложенное и то, что глюкозо-6-фосфзт является продуктом гексокиназной реакции, естественно предположить, что единственным и специфическим центром связывания его как есдахйии-зирующего реагента может быть активный центр фермента.

Для проверки этого, о одной стороны, сопоставляли эффективности действия глюкозо-6-фосфата как солюбилизирующего реагента и как неконкурентного по отношению к глюкозе ингибитора гексокиназной реакции. В связи с этим исследовали зависимость степени солю-билизации гексокиназы II из мембранного комплекса от концентрации глшозо-б-фосфата. Обработка полученных данных(рис.б-1) позволила оценить величину константа диссоциации глюкозо-6-фосфата из гек-сокиназа II - митохондриального комплекса, как равную 0,122 иМ. Приведенное значение практически полностью совпадает с величиной константы ингибирования гексокиназы II е составе комплекса с мембранами, определенной по отношению к глюкозб и равной 0,130 мМ.

с другой стороны, логично было оценить эффектиность солюбилизирующего действия глюкозо-6-фосфэта в присутствии второго суб-

Рис.6. Влияние глюкозо-6-фосфата на стабильность гекеокиназа II-мембранного комплекса в отсутствие (1) и в присутствии 0.3(2) и 0,6 (3) мМ М£АТР.

[глщкозо-6-^осфатЗ

страта реакции М^АТР. Как известно, глюкозо-6-фосфат является эффективным конкурентным ингибитором гексокиназной реакции в отношении этого субстрата. Оказалось, что в значительной степени предотвращает солюбшизирущий эффект глюкозо-6-фосфата, реализуя свое действие также по конкурентному типу (рис.6-2,3). Более то-' го, одинаковой оказывается и эффективность связывания )^ТР .с гекеокиназа II - митохондриальным комплексом как блокатором солюби-лизирующего эффекта глюкозо-6-фосфата и как субстратом гексокиназной реакции. Об этом свидетельствуют близкие значения К^ как блокатора солюбилизирующего действия глюкозо-6-фосфата и его Кв, соответственно'равные 0,21 и 0,64 мМ. На основании полученных результатов можно более точно определить центр связывания глюкозо-6-фосфато как солюбилизирующего реагента. По-видимому, им является АТР-связываюцая площадка активного центра гексокиназы II. В связи о втиы действие глюкозо-6-фосфата на адсорбционный домен гексокиназы II является опосредованным. Его конечный итог - разрушение "активной" конформации контактной зоны - реализуется, по-видимому, через влияние на структуру глзокозосвязыванцей площадки активного центра фермента.

Таким образом, после анализа механизма солюбилизирущего действия глюкозо-б-фосфата еще более очевидной становится неавтономность функционирования адсорбционного домена, поскольку практически всем участникам гексокиназной реакции отводится определенная роль в процессе образования и распада гексокиназа II - ми-тохондриального комплекса. Следовательно, на данном этапе рассмотрения такая сложная модель устройства адсорбционного домена предполагает существование фермента в гексокиназа II- митохондри-альном комплексе в функционально активном состоянии. А это значит, что, согласно этой модели, функциональная полноценность адсорбционного домена, т.е. его способность к образованию и разрушению контакта с мембранами, требует функционально активного состояния каталитического домена. В соответствии с таким представлением возникает естественный вопрос о вероятности распада гексокиназа II- митохондриального комплекса в результате каждого каталитического акта вследствие появления глюкозо-б-фосфата в активном центре фермента. Анализ такой ситуации возможен при синхронном исследовании динамики реакции, катализируемой гексокиназа II -ми-тохондриальным комплексом, и стабильности комплекса. О предполагаемом распаде гексокиназа И-митохондриального комплекса судили после быстрого отделения фермент-мембранного ассоциата от среды инкубации через определенные промежутки времени по ходу гексокиназной реакции. В случае'использования глюкозо-6-фосфат- утилизирующей системы для регистрации реакции (рис.7-1) распада гексокиназа П-митохондриального комплекса не наблюдалось. Следовательно, просто появления глюкозо-6-фосфата в активном центре ферменте в результате катализа недостаточно для распада фермент-мембранного комплекса. По-видимому, время действия глюкозо-б-фосфата как солюбилизирующего реагента, связанное с образованием и транслока-

•О

1

2 Рис.7. Ход гексокиназной реакции во времени в при-, сутствии (1) и в отсутствие (2) глюкозо-б-фосфат-утилизирующей системы.

3 § 9 12 мин

цией конформационного сигнала от каталитического к адсорбционному домену, существенно больше времени каталитического акта. Отчасти, увеличение времени нахоадения глюкозо-6-фосфата в активном центре фермента может быть достигнуто созданием условий для существования равновесной системы гексокиназа II - глюкозо-б-фосфат при ненасыщающих концентрациях глюкозо-б-фосфата. Такие условия могут быть обеспечены накоплением глюкозо-б-фосфата по ходу гексокиназ--ной реакции в среде в отсутствие глюкозо-ё-фосфат - утилизирующей системы (рис.7-2). Однако и в втом случае не происходит распада гексокиназа II - митохондриального комплекса, хотя были созданы условия для прохождения конформационного сигнала, по крайней мере, в области активного центра фермента. Об в том свидетельствует1 явно выраженный йнгибиторный вффект глюкозо-б-фосфата в отношении гексокиназа II - митохондриального комплекса. По-видимому, временной интервал, необходимый для паяного проявления солюбилизируюцего действия глюкозо-б-фосфата измеряется минутами. Об втом свидетельствует тот факт, что в случае предобразованного гексокиназа II -митохондриального комплекса в функционально неактивном состоянии для его диссоциации под действием глюкозо-б-фосфата требуется не менее 10 мин.

- 21 -ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Специфическая направленность анализа особенностей адсорбционного поведения гексокиназы II при взаимодействии с митохондриями, предложенная в настоящей работе, привела в конечном счете к анализу действия модели гексокиназа II - митохондриального комплекса, в котором фермент находится в функционально активном состоянии. Это связано с тем, что в качестве необходимых компонентов такой модели рассматривались субстраты и продукт гексокиназной реакции, действующие при физиологических концентрациях. Схему функционирования такой модели в условиях протекания гексокиназной реакции можно представить следующим образом- По-видимому, при образовании и распаде фермент-мембранного комплекса между пространственно разобщенными адсорбционным домансм и областью активного центра возможно временное образование специфической двусторонней связи. Со стороны активного центра ату связь можно представить 'следующим образом. Глюкоза как жвязуюций реагент, фиксируясь .¡в ■активном центре, вероятно так модифицирует структуру субстрат-'евязывающей площадки, что становится возможным образование специфической структурной связи с адсорбционным доменом. В результате формируется "активная" конформация поверхности адсорбционного домена (контактная зона), что обеспечивает образование первичной связи гексокиназы II с мембраной.Можно полагать, что окончательно гексокиназа П-мембранныЙ комплекс сформирован только после того, как,вга первичная односторонняя связь приобретет обратный характер, т.е. вследствие закрепления домена на мембране произойдет соответствующее изменение глюкозосвязывахщей площадки активного центра. Как отмечалось ранее, об этом свидетельствуют данные о специфическом изменении кинетических параметров связанной формы гексокиназы II (табл.2). В случае распада комплекса под действием

глюкозо-6-фосфата солюбилизирующий реагент фиксируется в АТР-свя-зыващей площадке активного центра фермента. Следствием втого может быть возникновение деструктивного конформанионного сигнала в область глюкозосвязывающей площадки, что приводит к разрушению первичной составляющей связи между доменами и, следовательно, к распаду комплекса. Участие второго субстрата реакции Ы§АТР сводится к предотвращению фиксирования глюкозо-6-фосфата в активном центре фермента.

ПРИЛОЖЕНИЕ.

Полученные в работе данные по изучению механизма адсорбционного поведения гексокиназы II имеют практическое значение. На их основе разработан новый метод получения высоко очищенного препарата нативной гексокиназы II с выраженными адсорбционными свойствами из скелетных мышц крысы. В качестве основных стадий очистки предложена афинно-адсорбционная хроматография с использованием и глюкозы как адсорбирующих гексокиназу II реагентов, а АТР4-и глюкозо-6-фосфата как влюирующих реагентов. В качестве естественного носителя фермента использовали митохондриальную фракцию и препараты митохондриальных мембран, полученные из того же тканевого источника. В результате очистки- из 100 г мышечной ткани получают 1,4 мг белка, представляющего собой нативную гексокиназу II о выходом по активности 2156 и степенью очистки по белку 3500 раз.

выгода.

1. Проведено сравнительное исследование адсорбционной способности изозимов гексокиназы при их взаимодействии с наружной мембраной митохондрия из различных тканей крысы.

Установлено, что гдакокиназа печени (I? изозим) в исследуемых условиях не адсорбируется на митохондриях, а I и II изозимы из

сердечной и скелетной мышцы характеризуются различными изотермами адсорбции при 0°С.

2. Образование комплекса II изозима гексокиназы,о митохондриями происходит при необходимом участии глюкозы или ионов Mg о одинаковой вффективноетъю. Независимо от механизма действия адсорбирующих реагентов при образовании комплекса гекеокиназа II одинаково изменяет кинетические свойства. Независимо от состава комплекса его диссоциация происходит с одинаковой эффективностью под действием растворов КС1 высокой ионной силы или глюкозо-6-фосфа-та в физиологических концентрациях.

3- Исследован механизм специфической диссоциации гекеокиназа II - глюкоза - митохондриального комплекса под действием глюкозо-6-фосфата. Показано, что солюбилизирующее действие глюкозо-6-фос-фата блокируется MgATP по конкурентному типу. Эффективность солхшлизирухщего действия глюкозо-б-фосфата по отношению к гексокиназе II совпадает с его еффективностью как ингибитора гексокиназной реакции.

4. На основании данных о механизмах действия субстратов и глюкозо-б-фосфата как продукта гексокиназной реакции при образовании гекеокиназа И-митохондриального комплекса предложена схема функционирования гексокиназы в скелетных мышцах in vivo, лежащая в основе адсорбционного механизма регуляции активности фермента.

■ 5- На основании данных о специфичности адсорбционных свойств гексокиназы II разработан метод получения нативного препарата фермента из скелетных мынц крысы с использованием в качестве естественного адсорбента штохондриальных мембран из того же источника.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТИЛЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Гончарова Н.Ю., Аврамова Л.В., Зеленина Е.В."Роль Mg и глюкозы в реализации адсорбционного механизма регуляции

активности гекеокиназы скелетных мышц". 6 Всесоюзная конференция по биохимии мышц. Тезисы докладов. 1999, с.45-46.

2. Зеленина Е.В., Гончарова Н.Ю., Аврамова Л.В. "Регуляция утилизации глюкозы в скелетной мышце крысы". 10 Объединенный симпозиум биохимических обществ СССР-ГДР. Тезисы докладов. 1989, С.31-32.

3. Аврамова Л.В., Гончарова Н.Ю., Гаркуша Н.Ф., Зеленина Е.В., Коденцоъа В.М., Сокольников A.A. и Нарушение регуляции активности гекеокиназы при различных мышечных патологиях". 9 Всесоюзный симпозиум "Биофизика и биохимия биологической подвижности (мышечное сокращение)". Тезисы докладов. 1990, с. 105.

4. Зеленина Е.В., Аврамова Л.В., Гончарова Н.Ю. "Получение изозима II гекеокиназы с выраженными адсорбционными свойствами". Биохимия. 1991- Т.56, N.6, 0.1096-1103.

5. Аврамова JI.B., Гончарова Н.Ю. " Особенности гексокиназной реакции в скелетных мышцах крыс при дефиците витаминов К и Д". Всесоюзная конференция по клинической витаминологии. Тезисы докладов. 1991, с.57-58.

6. Гончарова Н.Ю., Аврамова Л.В. " Регуляция фосфорилирования глюкозы, осуществляемого различными формами гекеокиназы". 2 Всесоюзный симпозиум " Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии". Теэисы докладов. 1991, с.53.

7. Сокольников A.A., Аврамова Л.В., . Вркееинская O.A., Коденцова В.М., Гончарова Н.Ю., Спиричев В.Б. "Кинетические характеристики креатинкиназы и гекеокиназы в скелетных мышцах крысы при пищевом дефиците витамина К и введении пелентана". Укр. биох.журнал. 1992. Т.64, N1, С.72-77.

8. Аврамова Л.В., Гончарова Н.Ю. "Солюбилизация связанного о митохондриями II иэозима гекеокиназы скелетных мышц крысы под действием глюкозо-б-фосфаФа". Биохимия. 1994. Т.59, N 3, 0.462-474.

9. Гончарова Н.Ю., Зеленина Е.В., Аврамова Л.В. "II изозим Гекеокиназы имеет участок, ответственный за взаимодействие фермента с митохондриальными мембранами". Биохимия. 1994. Т.59, Я 6, 0.826-837.

10. Gonoharova N.Yu., Avramova L.V. "Functioning of hexokinase in skeletal mueole". international Bympoeium "Biologioal Mobility". Absotraots. Puehoino. 1994. P.93-94.

MpuMiHxi