Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль глюкозы в адсорбционном механизме регуляции активности II изозима гексокиназы в мышце

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль глюкозы в адсорбционном механизме регуляции активности II изозима гексокиназы в мышце"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЩИИ И ОРДЕНА .ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи Зеленина Екатерина Васильевна

УДК 577.325.6:577.325.3:577.352.334

Роль глюкозы в адсорбционном механизме регуляции активности II изозима гексокиназы в мышце

03.00.04 - Биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - '1991

Работа выполнена на кафедре биохимии Биологического факультета Московского государственного Университета имени Ы.В.Ломоносова

Научный руководитель: академик С.Е.СЕВЕРИН Официальные оппоненты: .

- доктор биологических наук

ведущий научный сотрудник Н.Б.Ливанова

- доктор химических наук

отерший научный сотрудник Л.М.Гинодмвн

Ведущая организация - Институт биологической и медицинской химии АМН СССР

Защита состоится "¿8" 1991 г.. в час, ¿о мин,

на заседании.специализированного совета Д.053.05.32 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московском государственном Университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 'г.Москва 119899, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

Автореферат разослан "¿9" сс/т7сеЦЛ 1991 года. ■

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Ю.Н.Лейкин

• - 1 -ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

• Актуальность проблемы. Современный этап в развитии внзимоло-гаи связан с пересмотром представлений о ферменте как о самостоятельной функциональной единице в клетке. Знания индивидуальных свойств ферментов, характеризующих его каталитические возможности, все чаще ставят в зависимость от реальных внутриклеточных условий. К таким условиям относят, например, функционирование ферментов в составе обратимых комплексов с субклеточными структурами. В связи о втим мебранные образования клетки могут рассматриваться в качестве необходимых участников каталитического акта. Вследствие взаимодействия ферментов о биологическими мембранами полнее реализуется связь меаду структурой и Функцией ферментов, тем самым открываются дополнительны» возможности и для реализации их регуляторных свойств.

Среди механизмов регуляции активности ферментов, широко об-еувдаемых последние годы, следует выделить адсорбционный регулятор-ный механизм. Такой механизм распространяется на особую группу ферментов, характеризующихся переменной внутриклеточной локализацией ( "атМфШоив епгутев" ) (Курганов и др., 1986; ИПвоп, 1978, 1980). В основе данного механизма легиг способность таких ферментов к обратимой нековалентной иммобилизации на биологических матрицах в определенных условиях. При этом, связываясь с мембраной, фермент временно входит в состав ее периферического белкового слоя. В результате иммобилизации возможно такое изменение кинетических параметров фермента, что связанная и свободная формы белка будут отличаться по каталитической эффективности.

К числу ферментов, наиболее изученных в атом аспекте отно-

сится гексокиназа и, в чаотности, II изозиы гексокиназы ( гексо-ккназа II ) мышечной ткани (Гаркуша и др., 1990; Гончарова и др., 1931; Ыунтян.и др.,'1986; Щербатых и др.,1977). Многоплановый подход к наследованию взаимодействия гексокиназы II с митохондриаль-ным" мембранами при необходимом участии бивалентных катионов в качестве адсорбирущих реагентов, позволил сформулировать ряд положений современной концепции адсорбционного регуляторного механизма. Так, при анализе адсорбционного поведения фермента в тканях о различной функциональной и метаболической нагрузкой ( мышца, злокачественная опухоль саркома М-1 ) были описаны условия образования и диссоциации комплекса фермента с мембраной, лежащие в основе регуляции соотношения свободной и связанной форм гексокиназы. Исследовалась роль каждого из участников образования комплекса в втом процессе. Обсуадалась проблема вффективности адсорбционного регуляторного механизма, а также возможное участие такого механизма в адаптации гексокиназной реакции к метаболическим потребностям различных тканей. Однако многие из указанных вопросов решены в недостаточной степени и требуют детального рассмотрения. Кроме того, очевидна необходимость постановки и решения ранее не рассматриваемых проблем. В честности, вто касается проблемы множественности адсорбирующих гексокиназу II реагентов ( бивалентные катионы, субстрат гексокиназной реакции глюкоза ). С указанной проблемой теоно связана и другая - реальность реализации адсорбционного механизма регуляции активности гексокйназы ln vivo. Без решения сформулированных вопросов физиологическое значение адсорбционного ■регуляторного механизма может быть поставлено под сомнение.

Цель работу. Б целях дальнейшей разработки концепции адсорбционного механизма регулкцга активности гексокиназы II в работе

предполагали провести многоплановое исследование специфического взаимодействия гексокиназы II о митохондриальными мембранами скелетных мышц крысы при использовании глюкозы в качестве необходимого адсорбирующего реагента.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований с привлечением экспериментов in vivo получены приоритетные данные об особенностях адсорбционного поведения гексокиназы II 1 мышечной ткани. С использованием различных по химической природе адсорбирующих реагентов было показано наличие у гексокиназы II специфического структурного домена, ответственного за формирование контакта фермента с мембранами митохондрий. Установлено, что обратимая иммобилизация гексокиназы II реализуется при необходимом участии субстрата реакции глюкозы, выполняющего роль высоко специфичного адсорбирующего реагента. Мэханизм действия глюкозы связан при втом с ее фиксацией в активном центре гексокиназы II, т.е. необходимым условием проявления ферментом адсорбционной способности является его существование в виде комплекса с субстратом. В специальных экспериментах с участием инсулина показано, что действие глюкозы как специфичного регулятора соотношения свободной и связанной форм гексокиназы II эффективно и в физиологических условиях. При втом установлено, что вследствие изменения ряда кинетических параметров гексокиназы II каталитическая эффективность связанной с мембранами формы фермента в 100 раз выше, чем свободной. С учетом полученной информации в работе дается количественная оценка роли гексокиназной реакции в мышечной ткани. Результаты настоящей работы рассматриваются, как во многом дополняющие концепцию адсорбционного механизма регуляции активности гексокиназы ii. Кроме того, они вносят существенный вклад;в предложенную

ранее "акцепторную теорию действия инсулина" на стимуляцию тканевого дыхания (Beseman et al 1980).

Практическое значение. Помимо теоретического полученные в работе данные имеют и практическое значение. Так, они были положены в сзнову нового оригинального метода получения высоко очищенного препарата нативной гексокиназы II с выраженными адсорбционными свойствами из мышечной ткани крыс. Разработанные методологические приемы, связанные с использованием биологических мембран с иммобилизованным на них ферментом могут служить целям экспериментальной биологии при изучении моделей органов кивотных и человека. Особенности адсорбционного поведения гексокиназы могут ■ быть использованы в целях практической медицины в качестве биохимического теста при исследовании различных патологических состояний, а также могут'служить контролем за эффективностью их лечения. Кроме того, теоретические, практические и методологические вопросы, рассмотренные в работе используются в разделе "Регуляция активности ферментов" на Большом практикуме для обучения студентов на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Результаты исследования были дололены на семинаре кафедры биохимии Биологического факультета МГУ; на 17-ой конференции молодых ученых Биологического факультета МГУ (Мооквв, 1986); на Всесоюзном симпозиуме по медицинской внёимологии (Махачкала , 1986); на Всесоюзной научной конференции "Биохимия медицине. Молекулярные механизмы формирования патологических состояний"(Ленинград, 1988); на X Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности" (Ташкент,1989); на VI —ой Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1989)5 на' IX Всесоюзном симпозиума биофизика и био.ш>тая биологической

подвижности (мышечное сокращение) (Тбилиси, 1990).

Публикации. Результаты исследования изложены в 8 печатных работах, 1 статья находится в печати.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, полученных результатов и их обсуждения, заключения и списка цитируемой литературы (192 источника). Работа изложена на 164 стр. машинописного текста и включает 10 таблиц и 23 рисунка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОбСУВДЕНИЕ

I.Влияние глюкозы на взаимодействие гексокиназы II о митохондриальними мембранами.

Поставленную задачу решали в сравнительном плане в рамках концепции , разработанной для случая, когда в качестве адсорбирующего реагента использовали ионы % (Гончарова и др., 1986а, 19866, Мунтян и др., 1986).

Первым указанием на значение субстрата гексокиназной реакции глюкозы в проявлении адсорбционных свойств гексогашазы II послужили данные по зависимости степени адсорбции фермента на митохондри-альных и искусственных фосфолипидных мембранах от концентрации глюкозы. Полученные графики носят аналогично выраженный гиперболический характер о насыщением в области милимолярных концентраций адсорбирующего реагента. Выбор модельной системы с использованием лнпосом для изучения адсорбционных свойств гексокиназы II в данном случае является не случайным. В свое время такая система использовалась для выяснения роли фоефолипидного компонента мембран при адсорбции гексокиназы II в присутствии ионов Структурные и функ-

циональные особенности гекоокиназы II при иммобилизации на мембра-

2+

нах различной природы в присутствии Mg и глюкозы проявлялись абсолютно в равной отепени. На вто указывает полная взаимозаменяемость митохондриальной и искусственой мембран как матриц для адсорбции фермента, е также абсолютная идентичность кинетических свойств

гекоокиназы II при связывании с мембраной различной природы в при-pi.

оутотвии глюкозы и Mg. Данные для случая адсорбции гекоокиназы II на митохондриальных.мембранах приведены в таблице 1 и однозначно свидетельствуют в пользу неспецифического участия фосфолшшдных компонентов мембран в связывании гекоокиназы II. Кроме того, на отсутствие специфических центров связывания гекоокиназы на мембране

митохондрий указывает и выраженный линейный характер изотерм ад-

2+

оорбции фермента с участием глюкозы и Mg v

Идентичность адсорбционных свойств гекоокиназы II в присут-2+

ствии Ug и глюкозы проявляется и при анализе прочности связи фермента о митохондриальными мембранами. По-видимому, в обоих случаях образуются фермент-мембранные комплексы достаточно высокой прочности, поскольку их диссоциация становится возможной только вследствие обработки различными солюбилизирующими реагентами. Так, действие неспецифического солюбилизирущего реагента КС1 при увеличение его концентрации до 250 мМ приводит к высвобождению с мембран практически одинакового количества гексокина^л II, а именно, до 70% при адсорбции фермента в присутствии ионов Mg и до 605É - при адсорбции в присутствии глюкозы. Зависимость солюбилизирую-щего действия КС1 от ионной силы раствора свидетельствует о достаточно большем вкладе елетростатических сил взаимодействия при образовании фермент-мембранного комплекса. Следует отметить, что в отличие от КС1 действие другого солюбилизируицего гексокиназу II pea-

Таблица 1.Кинетические свойства свободной и связанной с митохондриальными мембранами гексокина-зы II в присутствии различных по природе адсорбирующих реагентов.

• Свойства Свободная форда Связшшая форма гексокиназы II в присутствии

гексокиназы II 10 Ш М32+ 5 иМ глюкозы • 10 мМ путресцина

Число оборотов, сек-1 190—11.4 ■ п=4 570±30.3 п=5 570-32.2 п=4 665-25.0 п=4

Параметры в отношении глюкозы глюкоза ,11 Г-6-Ф, М К^ 2-дезокси-гликсза, м К^ №-ацетил-глвкозамин, М 1.82*0.09x1О-4 п=28 0.06±0.01Х10~3 П=5 1.85-0.30X10""3 п=5 о.гб^о.огхю-3 п=4 О.бО^О.ЮхЮ-4 п=б „ 0,21±0.05П0"3 п=5 0.40*0.00x1О-3 П=6 0.091-0.002x1О-3 п=5 0.68*0.04x1О-4 п=8 0.15*0.09хЮ~4 п=3 0.58*0.21хЮ~3 п=4 0.072*0.013х10~3 п=5 0.73*0.07x1О-4 п=6 0.59*0.02х10-3 п=5

Параметры в отношении АТФ Кд АТФ, М К^ 2-дезокси-глюкоза, М К^ Ы-ацетил-глюксаыин, М 7.5-0.10х10~4 п=10 ж 13.4±0.2х10~3 п=4 3.0*0.04x1О-3 п=5 6.4*0.0х10~4 11=6 12.0-0.2i10-3 п=4 2.4.±0.28х10~~3 п=4 б.4-0.02x1О-4 . п=4 10.7*0.7хЮ~3 п=5 2.7-0.20x1О-3 п=6 7.2*0.40х10~4 п=3 16.3-0.3X10"3 п=4

* - цит. по Мунтян, 1987.

гента - Г-6-Ф носит, по-видимому, специфический характер. Данный реагент является продуктом гексокиназной реакции и высоко аффективен ( степень солюбилизации фермента составляет 8035 ) при низких концентрациях ( до 1 мМ ).

Таким образом, из предварительного анализа адсорбционных свойств гексокиназы II, проявляющихся в присутствии глюкозы, следует, что взаимодействие фермента о митохондриями подчиняется тем ке закономерностям, что и в присутствии ионов Mg. Это касается общих представлений образования гекоокиназа П-мембранного комплекса, достаточно пассивной роли митохондриальных мембран в втом процессе , а также перехода фермента в "новое качество" при иммобилизации вследствие изменения его кинетических свойств. Как оказалось, зависимость адсорбционной способности гексокиназы II от субстрата реакции является специфическим свойством фермента, поскольку не ■ проявляется,у таких.близкородственных белков,.как гекоокиназа I и молекулярная форма ферм!внта ( гексокиназы М-1 ), характерная для злокачественной.,опухоли саркомы М-1. Поэтому;вполне естественным представляется детальное рассмотрение вопроса о связи доменной структуры гексокиназы II и множественности адсорбирующих реагентов л участвующих в образовании комплекса фермента о мито-хондриальными мембранами.

II.Структурные особенности гексокиназы II при реализации ее ад-сореционной способности в отношении митохондриальных мембран. Очевидным указанием на наличие у гексокиназы II особой зоны ( домена ), ответственной за ее адсорбционную способность служат результаты влияния автолиза на свойства фермента. Так, было пока-■зало, что инкубация гексокиназы II в составе растворимой клеточной

фракции при 37 С сопровождается специфической модификацией белка (рио. 1).В результате неглубокого протеолиза при достаточно долгом сохранении активности ( по крайней мере в течение часа) на 10% утрачивается адсорбционная способность фермента как в присутствии гло-24-

козы, так и % в качестве адсорбирующего реагента.

100 75

л 50. н о о

S 25

13 Е-» W

Ш

100 - ^

)-i Рис.1 Влияние автолиза

Ь-1

75 g на активность ( Д ) и

g адсорбционную способ-В

50 р, ность гексокиназы II в о

м присутствии 5 ММ глю-25 03

g козы ( о ) и 10 Ш Mg

ш '

g ( О )• |->

о

О Г 2 часы

С целью получения дополнительных доказательств однонаправленности действия мнокественных адсорбирующих реагентов при образовании комплекса гэсоюшазы II о митохондриальными мембранами дальнейшее сравнение адсорбционных свойств фермента проводили с привлечением еще одного адсорбирующего реагента - путресцина. Для количественной оценки адсорбционной способности гексокиназы II в присутствии различных связующих реагентов исследовали доза-зависимость адсорбционной емкости митохондриальных мембран в отношении фермента от концентрации ионов Мд, глюкозы и путресцина в условиях избытка гексокиназы II (рис.2). Установлено, что максимальная емкость мембран в отношении фермента имеет практически сходное значение независимо от способа иммобилизации. Полученные данные свидетельствуют, о равной степени реализации адсорбционной способности гексокиназы II при связывании с митохондриальными мембранами в

в присутствии различных по структуре реагентов.

1.2

§

0.9

тт* м

■е

«

л

л 0.6

0.3

2;0 [МдСЕ^"1, [путресци^"1

1. • (глюкоз а} , мМ"

Рис. 2. Влияние глюкозы (д. ), ( о ) и путресцина ( х ) на адсорбционную способность гексокиназы II в отношении митохондриальных мембран.

Прл еиошюа оссЕгинсстсй <£ц.!;;цшн<шы1сго посз^шш

ГСКСОГ.!!-

назы II в составе различит комплексов о мембраной проводили сравнительное исследование некоторых кинетических свойств свободной и связанной форм фермента. Значения кинетических параметров, определенных по отношению к оубстратам и ингибиторам гексокиназной реакции, для различных форм гексокиназы II приведени в таблице 1. Как свидетельствуют полученные данные, при переходе гексокиназы II из свободного в связанное с митохондриями оостояние независимо от природы адсорбирующего реагента происходит увеличение чиола оборотов фермента ( Коа^ ) и существенно изменяются кинетические параметры, определенные по отношению к глюкозе. При этом параметры, определенные по отношению к АТФ, практически не изменяются. Полученные данные рассматриваются как указывающие на возможную тонкую конформационную перестройку адсорбированного фермента, затрягива-г пцую углевод-связывапцую площадку его активного центра.

Таким образом, проведенный в работе анализ особенностей адсорбционного поведения гексокиназы II при связывании с митохон-дриальными и искусственными фоофолипидными мембранами в присутствии различных по природе реагентов указывает на его идентичность при разных способах адсорбции. По-видимому, такая идентичность адсорбционного поведения гексокиназы II о участием различных связующих реагентов возможна лишь в случае направленности их действия на одну и ту не специфическую зону на поверхности белка, участвующую в образовании контакта фермента о мембраной и достаточно тесно связанную о активным центром гексокиназы II. С целью дальнейшего исследования специфического адсорбционного домена гексокиназы II была предпринята попытка проанализировать особенности механизма действия различных связующих реагентов на фермент при его адсорбции митохондриальными мембранами. Поскольку при изуче-

нии иммобилизации гекоокиназы II в работе установлен факт взаимозаменяемости биологических и искусственных мембран, по-гвидимому, мембране в втом процессе принадлежит пассивная роль матрицы. В связи с етим есть основание полагать, что главное в механизме действия каждого из адсорбирующих реагентов заключается во взаимодействии втих реагентов именно с ферментом, а не с мембраной. ?+

мй как адсорбирующий реагент. При характеристике механизма

24-

действия Щ как адсорбирующего реагента исходили из общепринятых представлений о взаимодействии бивалентных катионов о биологическими полимерами. Кроме того, учитывали результаты, полученные

2+ 2+

ранее при сравнительном исследовании вффективности и Са как адсорбирующих гексокиназу II реагентов (Гончарова и др., 1986а). Было показано, что при специфическом взаимодействии гекоокиназы II о митохондриальными мембранами в присутствии бивалентных катионов в значительной степени реализуется схема контакта: ферыент-металл-мембрана, т.е. связь фермента о мембраной осуществляется посредством катиона по типу оолевого мостика.

Однако при детальном анализе зависимости адсорбционной способности гекоокиназы II от концентрации ионов очевидно, что она носит слокный характер, имея по крайней мере одну точку перегиба (рис.2). По-видимому, вто связано с тем,, что при постепенном насыщении гекоокиназы II адсорбирующим реагентом, в образовании ферыент--мембранного комплекса, задействованы различные группы центров связывания на белке. Об втом свидетельствуют результаты анализа исследуемой зависимости в координатах Хилла. Взаимодействие ионов с адоорбционным доменом гекоокиназы II характеризуется величиной ко- . вффщиент 8 Хилла, равной 1.5» что укззывяет на существование, по крайней иере, двух различных групп центров овязизания на белке при

формировании фермент-мембранного комплекса. По-видимому, отмеченная особенность, а следовательно, и наблюдаемая специфическая зависимость адсорбционной способности гекоокиназы II обусловлены характером структуры адсорбционного домена. Так, при низких концентрациях ионов связывание- происходит за очет легко доступных центров, находящихся на поверхности белка. При втои задействована только одна группа центров связывания фермента с мембраной, например, по типу солевых мостиков. По мере заполнения данных центров возмон-ны конформационные изменения адсорбционного домена, сопрововдающие-ся появлением на нем дополнительных центров связывания фермента на мембране. Таким образом, постепенное появление дополнительней группы центров связывания и обусловливает "кажущийся" вффект положитель-

2+

ной кооперативное™ при связывании мй по мере образования фер-мент-меыбранного комплекса. Демаскировка вторичной группы центров связывания, по-видимому, пролонгирована, поскольку время образования гексокиназа 11-мембранного комплекса в присутствии низких

р I

(1 мМ ) и насыщающих ( 10-ыМ ) концентраций ионов Щ различно и соответственно составляет не более 1 минуты и 15 минут.

Кроме того, важной характеристикой указанных типов комплексов является их различная прочность, что было установлено при исследовании диссоциации комплексов в присутствии солюбилизирупцего гексокиназу II реагента - КС1. При втом полагали, что "внедрение" ионов К в различные по прочности участки связывания фермента о мембраной должно сопровождаться образованием аосоциатов, характеризующихся различными по величине Кд. Рассчитанные в езязи о этим методом Скетчарда величины Кд оказались равными 16 мМ (в случае 1 мЫ Нз2+) и 38 мМ (в случае 10 ыМ

Глюкоза как адсорбирующий реагент. В отличие от ионов

адоорбирующее действие глюкозы, являющейся субстратом гексокиназ-ной реакции, специфично, поскольку опосредовано, по-видимому, через активный центр фермента. Поэтому действие глюкозы как адсорбирующего реагента естественно связать с образованием субстрат-ферментного комплекса, происходящим практически мгновенно. В соответствии о втим находятся полученные в работе данные о времени максимально полного образования гексокиназа П-мембранного комплекса в присутствии глюкозы, не превышающем 30 сек. Временные интервалы

менее 30 сек. зафиксировать не удалось по техническим причинам.

I правильности^

Доказательством ^сделанного предположения служат данные о сходстве значений величин К^ по глюкозе для гексокиназы II и Кд по глюкозе для комплекса гекоокиназа И-глюкоза-мембрана, соответственно равных 1.82-0.1бх10-4М (таблица 1) и З.в^.гхЮ-'^! (рис.2).

Кроме того, веское доказательство действия глюкозы как адсорбирующего реагента через активный центр гексокиназы II было получено методом ингибиторного анализа о использованием аналога субстрата - 2-дезоксиглюкозы. Данный, аналог является конкурентным ингибитором гексокиназы по отношению к глюкозе и при. втом не обладает адсорбирующим в отношении фермента действием. Как оказалось, 2-дез-окоиглюкоза ингибирует гексокиназу II и в отношении адсорбционной способности фермента при взаимодействии о митохондриальными мембранами в присутствии глюкозы по конкурентному талу ( рис. 3 ).

Таким образом, из анализа данных о механизме адсорбирующего действия Mg2+ и глюкозы в отношении гексокиназы II следует, что адсорбционный домен фермента должен характеризоваться наличием большого количества заряженных груш и выраженной конформационной подвижностью. По-видимому, только щи этом условии он способен . обеопечивать необходимые центры связывания для различных по своей

гексокиназы II в отношении митохондриальных мембран в присутствии глюкозы: I- в отсутствие 2-дезоксиглюко-зы; 2- в присутствии Зх10_3М 2-дезоксиглюкозы.

структуре адсорбирующих реагентов. Однако в ходе образования фермент-мембранного комплекса, вта подвижность оказывается заключенной в определенные рамки. Об этой свидетельствует однотипный, специфический, не зависящий от природы адсорбирующего реагента характер структурной связи, возникающей мекду адсорбционным доменом и активным центром фермента (таблица 1). Ограничения, накладываемые при втом на реализацию конформационной подвижнооти домена, контролируется, по-видимому, фиксацией фермента на мембране.

Следует отметить, что специфичность действия глюкозы как адсорбирующего реагента обусловливает, по-видимому, высокую степень ее конкурентноспособности в атом отношении по сравнению с другими внутриклеточными метаболитами мышечной ткани (таблица 2). Сравнительный анализ эффективности потенциальных адсорбирующих и солюби-

Таблица 2. Влияние внутриклеточных метаболитов на связывание гексокиназы II с митохондриальными мембранами.

Реагенты Характер ___Эффект^__ Физиологическая

действия Концентрация,М концентрация,М

глюкоза адсорбирующий 100 5х10"5-2х10_3

Mg2+ 1х10~5

-/-/- о до 1х10_3

Са2+ 1x10

__40____ до 1х10~5

1x10"^

путресцин 100 6х10~6

1Х10"2

спермин __80____ 6х10~5

5x1

глюкозо- солюбилизирующий __80___ . 2х10~4-2х10~3

6-фосфат 5x1О-*

К01 -1-1- 40___ 1,5х10~1

1,5х10-1

фосфат ' __10____ 2х10~2

неорг. 2х10"2

АТФ4- -/-/- 19 следы

1х10~2

фруктозо- не влияет 0 6хЮ"5

6-фосфат 2x10

ГЛЮКОЗ0- -1-1- ___о____ 1,7х10-5

1-фосфат 2х10~3 с

фруктозо-1, ___0__ __ 1,2x10"

6-дифосфат 2х10"3 О

MgATO 0____ 5x10 3

1х10"2 '

лизирущих гекоокиназу II агентов, а также их структурных аналогов ' свидетельствует о том, что реально действующими при физиологических концентрация! могут быть только глюкоза и ее антагонист. - Г-6-Ф.

В модельных экспериментах при условии одновременного присутствия в среде инкубации исследуемых эффекторов в различных соотношениях степень адсорбции гексокиназы II митохондриальными мембра- " нами действительно определялась глюкозой. При этом эффективность глюкозы в присутствии высоких концентраций Г-6-Ф оказывалась более выраженной.

III. Реальность реализации адсорбционного механизма регуляции активности гексокиназы II ln vivo.

Данные о специфичности и высокой конкурентноспособности глюкозы как адсорбирующего реагента косвенно указывают на реальность ее участия в регуляции соотношения свободной и связанной о митохондриями форм гексокиназы II в клетке. Как известно, положение о такого рода регуляции составляет основу адсорбционного механизма регуляции активности гексокиназы II. В связи с этим проверка реальности изменения внутриклеточной локализации гексокиназы II в клетке необходима для доказательства реальности реализации обсуз-даемого механизма ln vivo.

Для решения поставленной задачи в качестве естественной модельной системы слукили иивотные после введения им инсулина (рас. 4). Инъекция гормона сытым крысам приводила к быстрому снижению уровня сахара плазмы крови, что сопровокдалось постепенным увеличением концентрации глюкозы в мышечной ткани. При этом на фоне неизменного общего содержания гексокиназы II в ткани происходило парораспределение фермента между цитозолем и митохондриальной фракцией в пользу связанной формы гексокиназы II. Следует отметить, что в связанное состояние при этом переходил вес запас гексокиназы II пышечной ткани. Более того, адсорбционные кривые, полученные в зависи-

о

ё

3 со со

ф хэ

О 60 120 160 240

время после введения гормона, мин

Рио.4. Физиологическая активность иноулина при внутримышечном

введение гормона Крысам.

1.- концентрация глюкозы в плазме крови.

2.- концентрация глюкозы в скелетных мышцах.

3.- количество гекоокиназы II в митохоццриальной фракции.

мости от концентрации глюкозы in vitro и In vivo практически совпадали (рис 5). В специальных вкспериментах в работе было показано, что инсулин не принимает непосредственного участия в связывании гекоокиназы II о митохондриальными мембранами, а концентрация Г-6-Ф (1.5x10~\l) соответствует его минимальному вффекторному действую. Таким образом, вследствие всего выше сказанного остается допустить, что реальное изменение соотношения свободной и связанной форм гекоокиназы II in vivo обеспечивается исключительно глюкозой.

0.4 • 0.8

2.0 5.0

0

[глюка па] , мМ

Рис. 5. Связывание гекоокивазы II о митохондриальными

мембранами в зависимости от концентрации глюкозы в среде in vitro ( о ) и in vivo ( о ).

IV. Физиологическое значение адсорбционного механизма регуляции активности гексокиназы II.

Указанная характеристика адсорбционного механизма связана през-де всего о оценкой каталитической эффективности фермента при переходе гексокиназы II из свободного в связанное о митохондриями ооо-тояние в присутствии реально действующего адсорбирующего реагента.

Для количественного решения проблемы использовали общепринятый критерий каталитической эффективности (К^ ) о поправкой на действие высокоэффективного неконкурентного ингибитора гексокиназы II - Г-6-Ф. в связи о этим формула для расчета К„. имеет оледу-

При расчете использовали приведенные в таблице 4,. кинетические параметры для соответствующих форл гексокиназы II, а такке

(глюкоза)

х

определенную в работе величину концентрации Г-6-Ф в покоящейся

шлице. Рассчитанные значения К^ для свободной и связанной форм

гекоокиназы II оказались соответственно равными 2.98х105 М-1сек-1 7-1-1

и 2.79x10 М сек . Таким образом, на основании реализации адсорбционного регуляторного механизма становятся возможными 100-кратные изменения активности гекоокиназы II.

Указанные изменения становятся причиной аналогичных по величине колебаний в интенсивности гексокиназной реакции в мышечной ткани. В работе были рассчитаны скорости гексокиназной реакции о учетом реализации адсорбционного регуляторного механизма, а также с учетом собственных данных и данных литературы о содержании ряда внутриклеточных метаболитов в мышечной ткани при различных физиологических состояниях In vivo (Piras et al, 1969). В результате приведены строгие количественные доказательства существущего теоретического положения о роли гексокиназной реакции в мнаце как участника биосинтеза гликогена в восстановительном периоде после интенсивного кратковременного сокращения. Таким образом, полученные данные о корреляции между интенсивностью гексокиназной реакции и метаболическими потребностями мышечной ткани свидетельствуют об адаптивной природе адсорбционного регуляторного механизма.

Кроме того, из экспериментов с использованием инсулина следует, что гормон, обеспечивающий транспорт глюкозы в клетку, опосредовано участвует в регуляции соотношения различных по каталитической эффективности форм гекоокиназы II. Таким образом, адсорбционный регуляторный механизм становится основой для гормональной регуляции активности фермента в мышце. В связи с етим следует отметить, что на базе реализации указанного выше механизма возможно осуществление неосновной функции мышечной ткани - участие в регу-

ляции уровня сахара крови.

V. Прилоаение.

Полученные в работе данные по изучению адсорбционного механизма регуляции активности гекоокиназы II имеют практическое значение, На их основе разработан новый метод получения высокоочищен-ного препарата гексокиназы II'о выраненными адсорбционными свойствами из скелетных мышц крысы. В качестве основных стадий очистки предложена аЗфинно-адсорбционная хроматография о использованием

глюкозы как адсорбирующих, гексокшазу II реагентов, а и Г-6-Ф как влхввдпощих реагентов. В качестве естественного носителя фермента использовали митохондриальную фракцию н. препарата мито-хондриальнш. мембран, полученные из того ке тканевого источника. Очистку проводили в присутствии ДТТ и ЭДТА как необходимых стабилизаторов адсорбционных свойств гексокиназы II. В результате очистка из 100 г мышечной ткани получают 1.4 ыг белка, представляющего оо-бой нативную гексокиназу II о выходом по активности 213 п степенью очистки по белку 3.500 раз.

ВЫВОД Ы.

1. Проведено сравнительное исследование влияния глюкозы,

2+

% и путресцина на способность II изозима гексокиназы ( гексокиназы II ) к взаимодействию с митохондряальными мембранами скелетных мышц крысы. Установлено, что независимо от химической природы указанных реагентов гексокиназа II при; образовании комплекса с мембранами характеризуется специфическими адсорбционными свойствами.

2. При исследовании механизма действия глюкозы как вдсорбп-

рующего гексокиназу II реагента установлено, что влияние глюкозы высоко специфично, поскольку опосредовано через активный центр фермента. При втом глюкоза высоко кокурентноспособяа по сравнению о другими внутриклеточными метаболитами мышечной ткани. Антагонистом глюкозы является продукт гексокиназной. реакции - Г-6-Ф.

3. Исследовано влияние инсулина in vivo на внутриклеточную локализацию гексокиназы II в скелетных мышцах крысы. Показано, что под действием гормона происходит перераспределение фермента мекду цитозолем и митохондриальной фракцией мышц в пользу связанной формы фермента. Установлена корреляция между меняющимся под влиянием инсулина уровнем глюкозы в ткани и долей связанной с митохондриями гексокиназы II. При втом гормоа не оказывает непосредственного влияния на адсорбционную способность гексокиназы II.

4. С учетом величин кинетических параметров гексокиназы II, а также физиологических концентраций глюкозы и Г-6-Ф в мышце проведена оценка каталитической ефиктивности свободной и связанной с митохондриями в присутствии глюкозы форм фермента.С втих позиций оценивается роль гексокиназной реакции при различных функциональных нагрузках мышечной ткани.

5. На основании данных о специфичности адсорбционных свойств гексокиназы II предложен метод получения высокоочищенного натив-ного препарата гексокиназы II из мышц крысы с использованием в качестве естественного носителя фермента препарата митохондаиаль-ных мембран из того ке источника.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зеленина Е.В., Гончарова Н.Ю. Влияние глюкозы на взаимодействие II изозима гексокиназы с митохондриальными мембранами из

скелетных мышц крысы // Труды 17-ой конференции молодых ученых Биологического факультета Московского государственного Университета. ВИНИТИ ( деп.15.09.86, N 6661-В ).- 1986.- С.37-41.

2. Гончарова Н.Ю., Гаркуша Н.Ф., Зеленина Е.В. Изозимный состав и особенности взаимодействия гвксокиназы в саркоме Ы-1 крыс // Тезисы докладов на Всесоюзной конференции по медицинской ензтго-логии.- Махачкала, 1986.- С.107.

3. Гончарова Н.Ю., Гаркуша Н.Ф., Зеленина Е.В. Роль гекооки-назной реакции в саркоме М-1 крыс // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции "Биохимия медицине. Молекулярные механизмы формирования патологических состояний".- Ленинград, 1988.- С!.68-69.

4. Зеленина Е.В., Гончарова Н.Ю., Аврамова Л.В. Регуляция утилизации глюкозы в скелетных мышцах крыс // Тезисы докладов X Объединенного симпозиума биохимических обществ СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности".- Ташкент, -1989.- С.31-32.

5- Гончарова Н.Ю., Аврамова Л.В., Зеленина Е.В. Роль и

глюкозы в реализации адсорбционного механизма регуляции активности гексокиназы скелетных мышц // Тезисы докладов 71-ой Всесоюзной конференции по биохимии мышц.- Тбилиси, 1989.- С.46.

6. Аврамова Л.В., Гаркуша Н.Ф., Гончарова Н.Ю., Зеленина Е.В., Кодинцова В.М., Сокольников А.А. Нарушение регуляции активности гексокиназы при различных мышечных патологиях // Тезисы докладов IX Всесоюзного симпозиума биофизика и биохимия биологической подвижности (мышечное сокращение).- Тбилиси, 1990.- С.105.

7. Гончарова Н.Ю., Зеленина Е.В. Влияние инсулина на каталитическую эффективность II изозима гексокиназы в скелетных мышцах крысы // Биохимия,- 1991.- Т.56, N 5.- С. 913-922.

8. Зеленина Е.В..Аврамова Л.В., Гончарова Н.Ю. Получение

изозима II гексокиназы о выраженными адсорбционными свойствами // Биохимия.- 1991.- Т.56, N 6.- С. 1096-1103.