Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экология эндофитных дрожжей

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экология эндофитных дрожжей"

005008131

Исаева Ольга Валерьевна

ЭКОЛОГИЯ ЭНДОФИТНЫХ ДРОЖЖЕЙ

Специальность 03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 ЯНЭ 2012

Москва 2012

005008131

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель член-корр. РАН .

Чернов Иван Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Терехова Вера Александровна

кандидат биологических наук Благовещенская Екатерина Юрьевна

Ведущее учреждение Ботанический институт

им. В.Л. Комарова РАН

Защита состоится 14 февраля 2012 г. в 15 часов 30 мин. в аудитории М-2 на заседании Диссертационного совета Д 501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д.1, строение 12, МГУ им. М.В.Ломоносова, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 13 января 2012 г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по вышеуказанному адресу.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Г.М. Зенова

Долгое время считалось, что ассоциированные с растениями микроорганизмы обитают только на поверхности, ткани здорового растения абсолютно стерильны, а размножение микроорганизмов внутри растения свидетельствует об их патогенности. Исключением являются специализированные симбионты такие, как клубеньковые бактерии или грибы эндотрофной микоризы. Однако в последнее время появляется все больше сведений о том, что внутренние ткани растений также заселены самыми различными микроорганизмами. Такие микроорганизмы принято называть «эндофитными», а характер их взаимодействия с растением расценивается не столько как паразитический, сколько как комменсаль-ный или мутуалистический.

Термин «эндофит» в самом общем смысле означает любой организм, развивающийся во внутренних тканях растения. Однако в современном понимании этот термин обычно используют по отношению к микроорганизмам, присутствие которых в растительных тканях бессимптомно и не сопровождается какими-либо патологическими изменениями растений. Растение обеспечивает микроорганизмы питанием и стабильной средой обитания. В свою очередь, метаболиты, выделяемые эндофитами, могут защищать растения от фитопатогенов и фитофагов, а также стимулировать их рост и развитие. Показано, что эндофитные грибы могут увеличивать устойчивость растений к болезням и абиотическим стрессам. Возникновение способности грибов к эндофитному развитию, возможно, связано с переходом растений к наземному образу жизни и представляет собой реализацию стратегии избегания негативного влияния факторов окружающей среды. Постоянное или временное развитие микроорганизмов в относительно стабильных и богатых питательными веществами условиях внутри тканей растения можно рассматривать как следствие их длительной коэволюции. Таким образом, изучение эндофитных микроорганизмов имеет практическую ценность и представляет интерес с позиций фундаментальных вопросов экологии и эволюции.

На настоящий момент опубликовано значительное количество работ, посвященных различным аспектам биологии эндофитных бактерий и грибов, как фундаментального, так и прикладного характера. Значительно меньше известно о способности дрожжевых грибов к эндофитному образу жизни, хотя именно дрожжи относятся к числу наиболее

типичных эпифитных микроорганизмов, обитающих на поверхности растений в качестве эккрисотрофов. Систематических исследований эн-дофитных дрожжей до настоящего времени не проводилось, все имеющиеся данные носят отрывочный характер.

Дрожжи в целом относятся к типичным копиотрофам, для роста и размножения которых требуется относительно высокая концентрация легкодоступных соединений. В отличие от мицелиальных грибов одноклеточные дрожжи не способны распространяться за счет апикального роста по межклеточному пространству. Однако дрожжевые клетки могут попадать внутрь растения через устьичные аппараты, гидатоды, механические микроповреждения кутикулы и эпидермы. Некоторые виды дрожжей обладают липолитической и пектинолитической активностью, что может позволить дрожжевым клеткам проникать во внутренние ткани с поверхности в результате локального разрушения кутикулы. Учитывая эти особенности, можно предположить, что эндофитные дрожжи должны наиболее активно развиваться в таких растительных субстратах, которые характеризуются высоким содержанием легкодоступных питательных веществ, например, в сочных плодах, запасающих вегетативных метаморфозах, крахмалсодержащих семядолях. Микроаэ-рофильные условия внутри растительных тканей могут способствовать росту дрожжевых грибов, многие из которых способны к брожению. Знание масштабов распространения и закономерностей развития эндо-фитных дрожжей может оказаться полезным не только с точки зрения более детальных представлений об особенностях экологии этой группы грибов, но и иметь практический аспект, связанный с разработкой методов хранения и контроля качества сельскохозяйственной продукции, биоконтролем фитопатогенов.

В данной работе была предпринята попытка оценки распространения и видового разнообразия дрожжевых грибов в запасающих тканях плодов, семян, вегетативных метаморфозов различных диких и культурных растений.

Цель настоящей работы - оценить масштабы и значимость такого явления, как эндофитное развитие дрожжей в запасающих тканях растений.

Конкретные задами работы: охарактеризовать таксономическое разнообразие эндофитных дрожжей; изучить особенности динамики их численности и видового состава; сравнить эпнфитные и эндофитные дрожжевые сообщества; определить возможные механизмы формирования эндофитных дрожжевых сообществ; оценить характер взаимодействия эндофитных дрожжей с растениями.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые проведено детальное исследование динамики численности и разнообразия эндофитных дрожжевых сообществ в запасающих растительных тканях с использованием современных методов видовой идентификации. Обнаружено, что растительные ткани с запасающими функциями в сочных сахаросодержащих плодах, подземных метамор-физированных органах, крахмалсодержащих семядолях содержат дрожжи, способные к активному размножению в этих тканях без их видимых повреждений. Дрожжевые клетки в запасающих тканях располагаются как в межклеточном пространстве, так и внутри крупных растительных клеток. Выявлены характерные особенности таксономического состава эндофитных дрожжевых сообществ в разных типах растительных субстратов. В тканях сочных плодов эндофитные дрожжи представлены теми же видами, что и эпифитные, с доминированием филобазидиевых криптококков и аскомицетов из родов Hanseniaspora и Metsclmikowia. Для крахмалсодержащих запасающих тканей семян характерно избирательное развитие одного вида Candida railenensis. В подземных вегетативных органах преимущественное развитие получают краснопиг-ментированные базидиомицетовые дрожжи Rhodotomla tmtcilaginosa. Показано, что эти дрожжи способны продуцировать стимуляторы роста растений, среди которых была идентифицирована индолил-3-уксусная кислота (ИУК).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Полученные в работе сведения по биологии эндофитных дрожжей могут быть использованы при разработке механизмов биологической защиты культурных растений от фитопатогенных грибов. Выявление индивидуальных циклов численности эндофитных дрожжей позволит более эффективно осуществлять поиск в природе штаммов, представляющих

интерес для биотехнологии. Особый интерес представляет обнаружение фитогормональной активности эндофитных дрожжей, связанной с синтезом ИУК, что может быть использовано для разработки биологических стимуляторов роста растений. Коллекция дрожжей КБП пополнена новыми изолятами редких видов, которые могут быть использованы для скрининга и в учебном процессе. Результаты работы могут быть использованы в лекционных курсах по общей экологии, экологии организмов, биологии дрожжей.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Результаты работы были представлены на заседаниях кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ, заседаниях Всероссийского общества почвоведов им. В.В.Докучаева, II съезде микологов России (Москва, 2008), XII Международном конгрессе по дрожжам (Киев, 2008), Междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009). По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 3 тезисов.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов экспериментов и их обсуждения, выводов и списка упоминаемых в тексте литературных источников. Работа изложена на 110 страницах текста, иллюстрирована 22 рисунками, включает 7 таблиц. Список литературы состоит из 157 наименований.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю И.Ю.Чернову и A.M. Глушаковой за внимание и помощь в работе. Автор благодарит A.B.Качалкина, И.А.Максимову, А.М.Юркова, а также В.В.Демина и Ю.А.Завгороднюю за помощь в проведении хроматогра-фических анализов и весь коллектив кафедры биологии почв за ценные советы и рекомендации.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В качестве объектов исследования были выбраны растения, включающие типичные для умеренной полосы дикие и культурные виды. Объектами для анализов служили растительные субстраты с высокой

концентрацией углеводов: сочные плоды, крахмалсодержащие семядоли, а также подземные вегетативные метаморфозы с запасающей функцией (табл. 1).

Сбор образцов проводили на территории Москвы и Московской области: в ботаническом саду МГУ, национальном парке Лосиный Остров, Измайловском парке, в окрестностях деревни Бурцево Шаховского района, а также вблизи станции Лобня Мытищинского района.

Анализ образцов проводили непосредственно в день сбора или в течение ближайших 2-3 дней. Учет и выделение дрожжевых грибов осуществляли стандартным методом посева на глюкозо-пептонную среду, подкисленную молочной кислотой для подавления роста бактерий. Для учета эпифитных дрожжей анализировали покровные ткани образцов.

Таблица 1. Характеристика объектов исследования.

Вид растения Исследованные органы

Allium сера L. (лук) Луковицы

Anthriscus sylvestris L. (купырь) Запасающие корни

Arctium tomentosum Mill, (лопух) Запасающие корни

Armoracia rusticana Gaertn., В. Mey. et Schreb. (хрен) Запасающие корни

Aronia melanocarpa (Michx.) Elliot (арония) Плоды

Cichorium intybus L. (цикорий) Корневища

Crataegus oxyacantha L. (боярышник) Плоды

Euonymas verrucosa Scop, (бересклет) Плоды

Ficaria verna Huds. (чистяк) Корневые шишки

Helianthus tubemsus L. (топинамбур) Клубни

Heracleum sosnowskyi Manden, (борщевик) Корневища

Hippophae rhanmoides L. (облепиха) Плоды

Impatiens noli-tangere L. (недотрога) Корни

Lonicera xylosteum L. (жимолость) Плоды

Malus domestica Borkh. (яблоня) Плоды

Orchis macúlala L. (ятрышник) Клубни

Prunus domestica L. (слива) Плоды

Quercus robur L. (дуб) Плоды

Rosa canina L. (шиповник) Плоды

Solanum tuberosum L. (картофель) Клубни

Sorbus aucuparia L. (рябина) Плоды

Viburnum opulus L. (калина) Плоды

Для выделения эндофитных дрожжей образцы предварительно промывали водой и поверхностно стерилизовали 96% этанолом. Затем удаляли покровные ткани стерильным скальпелем, участки внутренних запасающих тканей вырезали и измельчали. Выросшие колонии дрожжей разделяли на морфологические типы с помощью бинокулярной лупы. В чистую культуру выделяли не менее 3-х колоний каждого типа. Чистые культуры идентифицировали по стандартному набору морфологических и физиологических признаков (Kurtzman, Fell, 1998) с использованием расширенного физиологического спектра (Fonseca et al., 2000). Окончательную идентификацию дрожжевых грибов проводили анализом нук-леотидных последовательностей региона ITS1-5.8S-ITS2 и D1/D2 домена 26S (LSU) рДНК.

Микроскопирование эндофитных дрожжей проводили после окрашивания срезов растительных тканей 0.1% толуидиновым синим в течение 5-10 минут.

Для получения культуральной жидкости дрожжи выращивали на качалке в жидкой питательной среде (стандартная азотная основа Difco 6,7 г/л, глюкоза 5 г/л) в стандартных условиях при комнатной температуре в течение 5 дней. Культуральную жидкость дрожжей исследовали на способность влиять на прорастание семян и рост проростков горчицы белой. Для этого на дно стерильных чашек Петри помещали фильтровальную бумагу, равномерно распределяли семена, пипеткой вносили по 10 мл отцентрифугированной культуральной жидкости (неразведен-ной или в разведениях 1/10,1/100,1/1000), воды или питательной среды. В качестве контроля использовали воду и жидкую питательную среду. Чашки с семенами помещали в термостат при 26°С.

Наличие ИУК в культуральной жидкости дрожжей определяли с помощью высокоспецифичной качественной реакции. К 1мл суперна-танта добавляли 1мл реагента Сальковского (12г FeClj/л 7,9М H2S04), выдерживали в течение 30 минут в темном месте и отмечали изменение окраски.

Количественное определение ИУК проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1100 series с УФ-детектором (длина волны детектирования - 222 нм). Использовались предколонка Security Guard Catridges С18 4x3.0мм и аналитическая колонка ВЭЖХ

Диасфер 110-С18 5мкм 4.0x250мм. Подвижная фаза- вода, ацетонитрил, 0,05% трифторуксусная кислота (45:54:1% v/v). Для калибровки прибора использовали растворы стандартного образца индолил-3-уксусной кислоты фирмы ДиаМ в ацетонитриле.

РЕЗУЛЬТАТЫ PI ОБСУЖДЕНИЕ

Полученные результаты показали, что дрожжи постоянно присутствуют не только на поверхности растений, но и внутри запасающих растительных тканей. При этом можно выделить, по крайней мере, три типа эндофитных дрожжевых группировок: в сочных плодах, крахмал-содержащих семядолях и в вегетативных метаморфозах с запасающей функцией.

Сочные плоды

Дрожжевые грибы были выделены с поверхности и из внутренних запасающих тканей большинства проанализированных плодов. На поверхности плодов дрожжи присутствовали практически всегда (встречаемость по видам растений - 100%, по отдельным плодам - 90%). Их средняя численность здесь составляла порядка 10' КОЕ/г. Встречаемость дрожжей во внутренних тканях плодов была существенно ниже и варьировала у разных видов растений в пределах от 20 до 94% (по отдельным плодам), в среднем составляя около 55%. При этом на поверхности и внутри плодов распределение дрожжей существенно различалось (рис. 1). На поверхности распределение численности по образцам нормальное, тогда как во внутренних тканях - сильно агрегированное.

Плоды трех видов растений: шиповника (Rosa canina), сливы (Primus domestica) и яблони (Malus domestrica) были исследованы в динамике, начиная с периода их формирования и заканчивая почти полным их разложением осенью-зимой. На поверхности плодов дрожжи обнаруживались во все сроки анализа в средней численности I О4—10б КОЕ/г. Внутри молодых формирующихся и незрелых плодов дрожжи обнаруживались редко, но по мере созревания их численность закономерно увеличивалась (рис. 2). В старых высохших или разлагающихся плодах численность дрожжей на поверхности и внутри была практически одинаковой.

S? 40

Снаружи

Внутри

о а

Ö D.

«5 О

30

3 20 о П

10

НО2 Ю2 10' 104 Ю5 10б Ю7 <102 10г 103 104 И)5 106 107

Рис. 1. Распределение численности дрожжей по отдельным образцам на поверхности и внутри сочных плодов.

Rosa canina

Pnmus domestica

1 7 o

a, t-

4 а<

¡2 O 5

Й * -

ею

и

к

sr1

6 7 8 9 10 11 12 1 2 3

.-f-f-i'

10 и

Месяц

Рис. 2. Динамика общей численности дрожжей на поверхности (1) и внутри (2) плодов, иа примере шиповника и сливы; точки - среднемесячные значения, вертикальные отрезки - ошибки среднего.

Всего с поверхности и из внутренних тканей плодов было выделено 29 видов дрожжей (табл. 2). Выделенные виды являются преимущественно типичными эпифитными и эврибионтными формами. Особенно типично для сочных плодов сочетание доминирования филобазидие-вых криптококков (СгурЮсоссия тсщпия), которые очень часто обнаруживается на любых растительных субстратах, апикулятных аскомице-товых дрожжей из рода Иткаисщюуа, которые чаще всего встречаются

Таблица 2. Среднее относительное обилие видов дрожжей на поверхности и внутри сочных плодов, %

Вид На поверхности Внутри

Спр/оеосс/ю та^ия 38.15 24.71

Натетайрога татт 15.46 35.91

Ме^сИ/пко^ча риккетта 12.48 12.68

СапсШа о1еорИИа 2.77 4.22

ОеЬагуотусея ИатепИ 0.69 5.28

ЮюсШоги1а со1оэ1п 2.77 3.16

СапЛс/а яр. 2.77 3.16

Шюс}оГоп11с1 nn^cilaginosa 4.16 1.06

Зскм'аптотусея гапгуше 0.69 4.22

Шюс1о1ог111а /1ф$апеп.Ч1я 3.47 1.06

Сгур1ососсиз У1С!опае 3.47 0.00

ТгетеНа епсер}ю1а 2.08 0.00

Суз1о]НоЬаз1<Иит сарИаПпп 1.39 0.42

1Уккегкатотусез апотакк 1.39 0.42

СтнИс]а кит\че!тз 0.9 0.74

Меуеюгута цшШегтопсШ 1.04 0.21

ОурШсоссш■ аШс1ш 0.69 0.53

РкЫа тетЬгат/ааепя 0.35 0.85'

БрогоЬоктусез гояеиз 0.83 0.11

Шгос1о1оги]а §ратШэ 0.70 0.21

Ю>ос1о1оги1а Ьщето.ча 0.69 0.11

Шюс1о(ог111а гашШса 0.07 0.63

С/ур'ососст \vieringae 0.69 0.10

Я.1гос1о1оп11а gllllims 0.69 0.10

ТпсИоярогоп роюзит 0.69 0.00

Шюс!о1оги1а хр. 1 0.28 0.11

БрогоЬоЬтусез яр. 0.36 0.00

ШюсШогикх яр.2 0.14 0.00

РкЫа кЫул'еп 0.14 0.00

именно на сахаристых плодах, и Ме1зсЬткоша ри!сЬетта - типичных обитателей цветочного нектара. Эндофитные дрожжи, выделенные из внутренних тканей представлены в основном теми же видами, что и на поверхности плодов.

Месяц ! -о-- 2

Рис. 3. Динамика относительного обилия доминирующих видов дрожжей на поверхности (!) и внутри (2) плодов шиповника.

Тем не менее, определенные различия в соотношении доминирующих видов эпифитных и эндофитных дрожжей имеются. Так, фило-базидиевые криптококки, в основном представленные видом Оур1осос-с«5 magnus, были более обильны на поверхности плодов. В то же время, среднее относительное обилие апикулятных аскомицетовых дрожжей Натетаьрога \ivarum было выше именно внутри плодов.

Анализ динамики обилия доминирующих видов дрожжей на примере шиповника и сливы показал, что их относительное обилие существенно изменяется по мере созревания плодов (рис. 3,4). Так, филобази-диевые криптококки были наиболее обильны на поверхности молодых и зрелых плодов в течение лета, затем их доля снижалась. Относительное обилие Напэешазрога иуагиш, напротив, закономерно возрастало в ходе онтогенеза плодов и достигало максимума в октябре-ноябре ме-

Рис. 4. Динамика относительного обилия доминирующих видов дрожжей на поверхности (1) и внутри (2) плодов сливы.

сяцах. При этом характер динамики относительного обилия видов на поверхности и внутри плодов был сходным. Сходство видового состава эпифитных и эндофитных дрожжей, а также одинаковый характер динамики отдельных видов снаружи и внутри плода говорит о том, что основной механизм попадания дрожжей в плоды - достаточно частое проникновение дрожжевых клеток через микроповреждения покровов, устьица и т.п. Известно, что случайное попадание микробных клеток в растительные ткани - достаточно обычный процесс. Очевидно, попавшие в плод дрожжевые клетки способны к дальнейшему размножению в межклеточном пространстве и внутри растительных клеток. Отсутствие при этом видимых повреждений тканей плода говорит о том, что основная функция таких дрожжей - «подбор» простых Сахаров без гидролиза растительных полимеров.

Следует отметить, что виды дрожжей, обилие которых на поверхности плодов несколько больше, чем внутри, относятся к типичным эпифитам и обладают адаптациями к эпифитному образу жизни такими,

как каротиноидная пигментация или формирование мощных полисаха-ридных капсул. Это говорит о том, что эндофитное развитие дрожжей можно также рассматривать как проявление адаптивной стратегии избегания. Считается, что возникновение истинного эндофитного образа жизни у некоторых бактерии и мицелиальных грибов связано именно с избеганием негативного влияния факторов, лимитирующих рост эпи-фитных микроорганизмов, прежде всего иссушения и инсоляции. С другой стороны, виды, преобладающие на поверхности - строгие аэробы, и, в отличие от способных к брожению аскомицетовых дрожжей, должны хуже развиваться в микроаэрофильных условиях в тканях плодов.

Запасающие ткани семян

Представленные выше результаты показывают, что поверхностные покровы сочных плодов не являются серьезным препятствием для проникновения дрожжевых клеток во внутренние запасающие ткани. В то же время, нам удалось установить, что в плодах с толстыми плотными покровами также могут присутствовать дрожжевые грибы. В частности, было показано, что в семядолях целых неповрежденных желудей дуба на определенных стадиях их развития обнаруживаются дрожжи, численность которых может достигать 107 КОЕ/г. Нами была изучена динамика численности и видового состава дрожжей, начиная с момента формирования желудей на плодоножках и заканчивая их прорастанием в почве весной будущего года.

В семядолях целых желудей в течение всего периода от их формирования до опадания осенью дрожжи практически не обнаруживались. В перезимовавших целых желудях дрожжи встречались чаще и в большей численности, которая достигала 103 КОЕ/г. Однако в мае, непосредственно перед началом прорастания желудей, дрожжи были обнаружены практически во всех проанализированных семядолях, причем их средняя численность резко возросла и в отдельных семядолях достигала 107 КОЕ/г (рис. 5). После периода прорастания численность дрожжей начала уменьшаться и к концу осени снизилась до минимума, несмотря на разрушение покровов желудей. Таким образом, возрастание численности эндофитных дрожжевых грибов в семядолях соответствовало тому периоду, когда в запасающих паренхимных тканях семядолей происходил активный гидролиз крахмала и высвобождение простых Сахаров,

о

5

О

£ 5

i

Q

2

Ш

A.

6 9 12 3 6

Месяцы

9

12

Рис. 5. Динамика общей численности дрожжей в семядолях желудей;

типы желудей: 1 - на дереве, 2 - опавшие, 3 - опавшие прорастающие.

необходимых для развития зародыша семени. По-видимому, повышение количества доступных питательных веществ стимулировало интенсивное размножение дрожжей, клетки которых присутствовали в семядолях желудей.

В отличие от сочных плодов, эндофитные дрожжи в желудях оказались представлены в основном только одним аскомицетовым видом, который был идентифицирован по физиологическим признакам и последовательности D1D2 региона рДНК как Candida railenensis. Этот вид филогенетически наиболее близок к виду Candida oleophila, который широко распространен в филлосфере растений. Из молодых желудей на дереве удавалось выделить дрожжи лишь этого вида. Он же был также обнаружен в качестве абсолютного доминанта в опавших перезимовавших желудях до периода их прорастания. Постепенно, по мере прорастания или разложения желудей относительное обилие С. railenensis в них уменьшалось, и после нарушения экзокарпия они заселялись типичными эпи-фитными и подстилочными базидиомицетовыми видами, среди которых преобладали Cryptococcns magnus и Cystofilobasidium capitation (рис. 6).

Очевидно, плотные кожистые покровы желудей являются более серьезным препятствием для проникновения дрожжевых клеток, чем пок-

ЕЖЗ i И 2 в з спи

Рис. 6. Динамика относительного обилия доминирующих видов дрожжей в семядолях желудей. 1 - Candida railenensis, 2 - Cryptococcus magnus, 3 - Cysto-filobasidium capitatum, 4 - прочие.

ровы большинства сочных плодов. Поэтому наряду со случайным проникновением клеток дрожжей через микроповреждения покровов можно допустить, что дрожжи попадают в желудь в процессе его формирования с цветка дуба, сохраняются в семядолях и размножаются при активизации процесса развития зародыша, который, как известно, сопровождается гидролизом крахмала. В любом случае, к активному размножению внутри семядолей способен лишь один вид Candida railenensis.

Вегетативные метаморфозы с запасающей функцией Другим типом растительных субстратов, в которых обнаруживаются эндофитные дрожжи, являются подземные запасающие метаморфи-зированные органы растений (клубни, запасающие корни, корневища, корневые шишки, луковицы). На поверхности корней, также как и на поверхности метаморфозов дрожжи присутствуют практически всегда. При этом состав доминирующих видов дрожжей в ризоплане существенно иной по сравнению с филлопланой. На поверхности корней и в ризосфере наиболее часто встречаются типичные педобионтные (Cryptococcus terricola, Cr. podzolicus) виды. При этом последние практически не обнаруживаются на надземных органах растений, тогда как эпифит-ные дрожжи постоянно выделяются также и с поверхности подземных вегетативных органов.

Средняя численность дрожжевых грибов во внутренних тканях подземных запасающих органов обычно не превышала 103 КОЕ/г. Показатель встречаемости эндофитных дрожжей по отдельным образцам варьировал в зависимости от вида растения и не превышал 40%. Видовое разнообразие дрожжей во внутренних тканях также было значительно более низким, чем на поверхности метаморфозов (табл. 3). В большинстве случаев из каждого образца выделялось не более одного-двух видов эндофитных дрожжей. Всего из внутренних запасающих тканей было выделено 6 видов дрожжей, тогда как с поверхности - 14. Все виды, обнаруженные внутри, встречались и на поверхности метаморфозов. Как на поверхности, так и внутри доминировали краснопигментирован-ные анаморфные споридиоболовые дрожжи Ююс1о1оги1а mucilaginosa. При этом встречаемость этого вида внутри вегетативных органов была в полтора, а среднее относительное обилие в два раза выше, чем на поверхности. В то же время, типичные педобионтные виды дрожжей в запасающих тканях обнаружены не были.

Таблица 3. Встречаемость видов дрожжей на поверхности и внутри подземных запасающих вегетативных метаморфозов, %.

Вид

На поверхности

Внутри

Rhodotorula mucilaginosa Debaryomyces hansenii Cryptococcus magnus Candida oleophila Cryptococcus terrícola Rhodotorula glutinis Cystofilobasidium macerans Schwanniomyces vanrijiae Pichia membranaefaciens Rhodotorula minuta Trichosporon sp. Cryptococcus podzolicus Metschnikowia pulcherrima Sporobolomyces roseus

10.2 5.1 10.2

5.1 1.6 3.1 2.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

8.5

8.2

13.3

3.9 0.0 0.0 0.0 1.2 0.0 0.0 1.6 0.0 0.0 0.0

0.8

3.8

Фитогормональная активность эндофитных дрожжей

Известно, что эндофитные микроорганизмы могут оказывать прямой положительный эффект на хозяина за счет синтеза различных метаболитов, полезных для растений, в том числе различных регуляторов роста. Сведения о способности дрожжевых грибов к синтезу регуляторов роста растений немногочисленны. Показано, что некоторые виды дрожжей, в частности ЬМпега яШитш, обнаруженные в корнях кукурузы, способны продуцировать фитогормоны, стимулирующие развитие корневой системы. В связи с этим нами было проведено исследование влияния доминирующих в подземных метаморфозах видов дрожжей на прорастание семян и рост проростков.

При проращивании семян в культуральных жидкостях дрожжей ВеЬапотусез Ъапяепи и С,}ур1ососсш та^иаз длина проростков во всех разведениях не превышала длину в контрольном опыте с водой. Однако для вида Шюс1ок)г111а пшсНсщ1поха в ряде случаев показатели превышали контрольные значения.

Наибольшая длина проростков была отмечена при прорастании семян в разведенной культуральной жидкости дрожжей Як. тисИа%1по$а. Данный показатель возрастал по мере увеличения степени разбавления, минимальные значения были отмечены в неразведенной культуральной жидкости. Следует отметить, что прорастание семян в разведенной культуральной жидкости Шг. тисИа&пойа начиналось раньше по сравнению с контрольным опытом в воде.

На основании этих данных было сделано предположение, что доминирующий в подземных мстаморфизированных органах растений вид Я/г. тиа^тоза, возможно, способен к синтезу фитогормона ауксина, который стимулирует развитие корневой системы и индуцирует рост растений путем растяжения клеток. Для подтверждения этой гипотезы были использованы химико-аналитические методы.

Все штаммы дрожжей, выделенные из подземных запасающих мстаморфизированных органов, были исследованы на способность продуцировать ауксин с помощью высокоспецифичной качественной реакции. Появление красной окраски фильтрата после добавления реагента Саль-ковского и соответственно способность продуцировать ИУК продемонстрировали штаммы дрожжей относящиеся исключительно к доминиру-

ющему виду НИ. mucilaginosa. Аналогично появление красной окраски также было отмечено в стандартных растворах ИУК (контроль).При добавлении реагента в культуральные экстракты других видов дрожжей и в стерильную среду (контроль) изменения окраски не происходило. Способность эндофитных дрожжей Ш1. тисИа°тоза синтезировать ин-долил-3-уксусную кислоту была также подтверждена с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). По результатам высокоспецифичной качественной реакции был выбран один из штаммов, способных к биосинтезу ИУК. Была проведена идентификация и количественное определение ауксина в культуральной жидкости этого штамма дрожжей. На хроматограмме испытуемого образца наблюдается отчетливый пик, совпадающий по времени удержания со стандартным образцом ИУК (рис. 7). При проведении соответствующих пересчетов была определена концентрация ИУК в исследуемом образце культуральной жидкости, которая составила 0,9 мкг/мл.

400 300200" 100 0

400 300 200

0 -Л...... 2 1' ..... 1 4 6 8 1 10 12 14

2

/ V-

4 6 8

Время удержания, мин

10

12

14

Рис. 7. Хроматограммы: 1 - испытуемого раствора (экстракт культуральной жидкости дрожжей Ююс1о1оги1а тиа^тоза), 2 - раствора стандартного образца ИУК.

Таким образом, эндофитные дрожжи обладают фитогормонально» активностью и способны стимулировать рост растений. Максимальная стимулирующая активность выявлена у штаммов Як. тис\1а^тояа, синтезирующих ауксин, который индуцирует развитие корневой системы и рост проростков. У большинства исследованных штаммов стимулирующий эффект проявлялся в опытах с разбавленной культуральной жидкостью, тогда как неразбавленная культуральная жидкость, как правило, оказывала ингибирующее действие. По всей видимости, в неразведен-ной культуральной жидкости концентрация ИУК оказалась достаточно велика. Как известно, в больших концентрациях индолилуксусная кислота может действовать как ингибитор роста растений. Рост растяжением растительных клеток осуществляется главным образом тургорными процессами и сопровождается усилением поглощения воды и солей. В малых концентрациях ИУК усиливает поглощение воды, при дальнейшем увеличении концентрации наблюдается торможение поступления воды, а при больших - полное прекращение.

Прямые микроскопические наблюдения эндофитных дрожжей

Непосредственным микроскопированием дрожжевые клетки удалось обнаружить в тканях большинства видов проанализированных растений (рис. 8). На срезах запасающих тканей были видны круглые и короткоовальные дрожжевые клетки диаметром до 2-3 мкм. Реже обнаруживались псевдомицелиальные нити и цепочки клеток. В период созревания плодов, когда численность эндофитных дрожжей увеличивалась, большинство клеток почковалось, часто встречались скопления клеток, что свидетельствует об их активном размножении в тканях. В незрелых плодах дрожжевые клетки наиболее часто встречались в поверхностных слоях или непосредственно под экзокарпием. В зрелых плодах, в которых начиналась мацерация внутренних тканей, встречались большие скопления активно почкующихся клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные данные показывают, что эндофитное развитие дрожжей следует рассматривать как широко распространенное явление. Дрожжевые грибы регулярно выделяются не только с поверхности растений, но и из внутренних запасающих тканей с высоким содержанием

Рис. 8. Клетки дрожжей в плодах бересклета (а), в клубнях картофеля (б), в клетках корня недотроги (в), в семядолях желудей (г).

легкодоступных питательных веществ. Эндофитные дрожжи способны к активному размножению в таких тканях без проявления видимых признаков их повреждения.

Численность дрожжей в запасающих тканях растений в среднем ниже, чем на поверхности, однако в некоторых случаях может достигать значительных величин (до 106-107 КОЕ/г). При этом можно выделить, по крайней мере, три типа эндофитных дрожжевых группировок: 1) в сочных сахаристых плодах, 2) в крахмалсодержащих семядолях, 3) в вегетативных метаморфозах с запасающей функцией (клубнях, корневищах, запасающих корнях и т.п.).

Эндофитные дрожжевые группировки в тканях сочных плодов неспецифичны по составу и представлены теми же видами, что и эпифит-ные, с доминированием филобазидиевых криптококков и аскомицетов из родов Нткетаврога и \ietschnikowia. Однако филобазидиевые крипто-кокки и краснопигментированные виды рода Шюс1о1от1а более обильны

на поверхности, а бродящие аскомицетовые дрожжи - внутри плодов. Сходство видового состава эпифитных и эндофитных дрожжей, а также одинаковый характер динамики отдельных видов снаружи и внутри плода говорит о том, что основной механизм попадания дрожжей в плоды - достаточно частое проникновение дрожжевых клеток через микроповреждения покровов. По-видимому, «уход» во внутренние ткани плода способствует лучшему выживанию эпифитных дрожжей, особенно ас-комицетовых, не имеющих таких адаптаций, как каротиноидная пигментация или капсульные полисахариды. Способность к эндофитному развитию дрожжей можно рассматривать как проявление стратегии избегания неблагоприятных факторов, которые лимитируют рост микроорганизмов на поверхности растений.

Эндофитные дрожжевые группировки в крахмалсодержащих семядолях специфичны по составу и характеризуются избирательным развитием преимущественно одного вида дрожжей. В семядолях желудей эндофитные дрожжи представлены в основном одним видом - Candida railenensis. Численность эндофитных дрожжей резко возрастает перед прорастанием желудей, когда в запасающих паренхимных тканях семядолей идет активный гидролиз крахмала, и достигает 107 КОЕ/г. После прорастания или разрушения экзокарпия семядоли заселяются обычными эпифитными и подстилочными базидиомицетовыми видами, среди которых преобладают Cryptococcus magnus и Cystofilobasidhun capitatum.

Эндофитные дрожжевые группировки в запасающих тканях вегетативных метаморфозов так же, как и в сочных плодах, неспецифичны по таксономическому составу, для них характерно доминирование красно-пигментированных анаморфных споридиоболовых дрожжей Rhodotom-la mncilaginosa. Встречаемость этого вида внутри запасающих метаморфозов в полтора, а среднее относительное обилие в два раза выше, чем на поверхности. Показано, что эти дрожжи обладают фитогормональ-ной активностью и способны стимулировать рост растения. В частности, методом ВЭЖХ было установлено присутствие индолил-3-уксусной кислоты в культуральной жидкости Rh. mncilaginosa.

Микроскопические исследования подтверждают, что дрожжи, выделенные из запасающих растительных тканей, действительно являются эндофитными, то есть существуют как в межклеточном пространс-

тве, так и внутри крупных растительных клеток. В тканях растений они способны к активному размножению в период высвобождения Сахаров при созревании плода: в этот период дрожжевые клетки почкуются и образуют скопления.

Полученные результаты корректируют сложившиеся представления об особенностях распространения дрожжевых грибов в природных местообитаниях и позволяют рассматривать внутренние запасающие ткани растений как достаточно обычное местообитание дрожжей, как перспективный источник для поиска новых таксонов и как новую интересную модель для исследования коэволюционирующих микробно-раститель-ных ассоциаций. Знание масштабов распространения и особенностей биологии эндофитных дрожжей важно с практической точки зрения в связи с разработкой методов биоконтроля фитопатогенов, хранения и контроля качества сельскохозяйственной продукции.

ВЫВОДЫ

1. Дрожжевые грибы постоянно присутствуют не только на поверхности растений, в качестве типичных эккрисотрофных эпифитов, но и во внутренних тканях, которые характеризуются высокой концентрацией легкодоступных соединений, в сочных плодах, крахмалсодержащих семядолях и в вегетативных метаморфозах с запасающей функцией.

2. Эндофитные дрожжи в тканях сочных плодов представлены теми же видами, что и на поверхности, с доминированием филобазидиевых криптококков и аскомицетов из родов Hanseniaspora и Metschnikowia, но с некоторым преобладанием аскомицетов и с меньшим обилием бази-диомицетов. Наиболее вероятный механизм формирования эндофитных сообществ - регулярное попадание дрожжевых клеток внутрь плода через микроповреждения покровных тканей.

3. Численность эндофитных дрожжей внутри плодов в среднем меньше, чем на поверхности, она закономерно возрастает в ходе онтогенеза плодов, достигая максимума после их полного созревания.

4. Дрожжевые грибы активно размножаются в запасающих тканях крахмалсодержащих семядолей в период, предшествующий прорастанию семени. В семядолях целых неповрежденных желудей эндофитные дрожжи представлены в основном одним видом - Candida railenensis.

После прорастания или разрушения экзокарпия семядоли заселяются типичными эпифитными и подстилочными дрожжами.

5. Эндофитные дрожжи также регулярно обнаруживаются в подземных запасающих метаморфизированных органах (клубнях, корневищах и т.п.). Эти группировки неспецифичны по таксономическому составу, для них характерно доминирование краснопигментированных анаморф-ных споридиоболовых дрожжей }(1юс1о!от!а тисИа§ию$а.

6. Доминирующие в подземных запасающих метаморфозах дрожжи ШюсЫоги1а тисПадшоза продуцируют ауксин (индолил-3-уксусную кислоту) и способны стимулировать рост растения за счет прямого влияния на его метаболические процессы.

7. Микроскопические исследования показали, что дрожжи, обнаруживаемые в запасающих тканях, действительно являются эндофитны-ми, то есть существуют как в межклеточном пространстве, так и внутри крупных растительных клеток.

8. Полученные данные меняют представления о формах взаимодействия дрожжевых грибов и растений и позволяют расценивать внутренние запасающие ткани растений в качестве достаточно обычного местообитания как широко распространенных, так и экологически специализированных видов дрожжей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Исаева О.В. Эндофитные дрожжевые грибы в плодах дуба че-решчатого. Современная микология в России. Том 2. Материалы 2-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия микологии, 2008, с. 275.

2. Isaeva O.V. Yeasts in storage tissues of plants. Abstracts of 12th International Congress on Yeasts. Kyiv, 2008, p. 38.

3. Исаева О.В. Эндофитные дрожжевые грибы в запасающих тканях растений. Материалы Междисциплинарного микологического форума. Иммунопатология, аллергология, инфектология, 2009, № 1, с. 29.

4. Исаева О.В.,Глушакова A.M., Юрков A.M., Чернов И.Ю. Дрожжи Candida railenensis в плодах дуба черешчатого (Quercus robitr L.). Микробиология, 2009, т. 78, № 3, с. 399-403.

5. Исаева О.В., Глушакова A.M., Гарбуз С.А., Качалкин А.В., Чернов И.Ю. Эндофитные дрожжевые грибы в запасающих тканях растений. Известия РАН, серия биологическая, 2010, № 1, с. 1-10.

Заказ №02-р/01/2012 Подписано в печать 11.01.2012 Тираж 130 экз. Усл. п.л. 1.2

'ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 Г« }, www.cfr.ru ; e-maihzak@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Исаева, Ольга Валерьевна, Москва

61 12-3/483

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова

Факультет почвоведения

ИСАЕВА Ольга Валерьевна

ЭКОЛОГИЯ ЭНДОФИТНЫХ ДРОЖЖЕЙ

Специальность 03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель член-корр. РАН И.Ю.Чернов

Москва-2012 г.

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................7

Эпифитные дрожжи..................................................................................7

Филлосфера как среда обитания дрожжевых грибов.............................9

Таксономический состав дрожжей в филлосфере................................13

Адаптации эпифитных дрожжей............................................................13

Пространственная дифференциация эпифитных дрожжевых

сообществ.................................................................................................15

Органы растения...............................................................................15

Виды растений..................................................................................15

Жизненные формы растения............................................................16

Биогеоценотические различия.........................................................18

Географические закономерности распространения

эпифитных дрожжей.........................................................................20

Взаимодействия эпифитных дрожжей и растений...............................21

Адгезия на поверхности листьев.....................................................21

Взаимодействия между эпифитами.................................................22

Динамика эпифитных дрожжевых сообществ......................................23

Сезонная динамика численности эпифитных дрожжей................26

Сезонная динамика структуры эпифитных сообществ

дрожжей.............................................................................................29

Эндофитные дрожжи...............................................................................32

Фитогормоны и их физиологические эффекты.....................................34

Ауксины — гормоны апекса побега..................................................35

Цитокинины — гормоны корневого апекса......................................37

Гиббереллины - гормоны листа.......................................................39

Фитогормональная активность дрожжей..............................................40

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ...............................................................................42

Объекты....................................................................................................42

Сочные плоды..................................... .....................................................43

Крахмалосодержащие семядоли............................................................44

Подземные вегетативные метаморфозы с запасающей функцией......44

Методы выделения и идентификации дрожжей...................................45

Идентификация индолил-3-уксусной кислоты (ИУК)

в культуральной жидкости дрожжей........................................................46

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................48

Сочные плоды..........................................................................................48

Шиповник..........................:...............................................................48

Слива..................................................................................................54

Яблоня................................................................................................58

Общая характеристика эндофитных дрожжевых сообществ

сочных плодов..................................................................................63

Запасающие ткани семян........................................................................69

Вегетативные метаморфозы с запасающей функцией.........................74

Фитогормональная активность эндофитных дрожжей .......................77

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................84

ВЫВОДЫ......................................................................................................87

ЛИТЕРАТУРА............................!...........................................................89

ВВЕДЕНИЕ

Долгое время считалось, что ассоциированные с растениями микроорганизмы обитают только на поверхности, ткани здорового растения абсолютно стерильны, а размножение микроорганизмов внутри растения свидетельствует об их патогенности. Исключением являются специализированные симбионты такие, как клубеньковые бактерии или грибы эндотрофной микоризы. Однако в последнее время появляется все больше сведений о том, что внутренние ткани растений также заселены самыми различными микроорганизмами. Такие микроорганизмы принято называть «эндофитными», а характер их взаимодействия с растением расценивается не столько как паразитический, сколько как комменсальный или мутуалис-тический.

Термин «эндофит» в самом общем смысле означает любой организм, развивающийся во внутренних тканях растения. Однако в современном понимании этот термин обычно используют по отношению к микроорганизмам, присутствие которых в растительных тканях бессимптомно и не сопровождается какими-либо патологическими изменениями растений (Schulz, Boyle, 2005). Растение обеспечивает микроорганизмы питанием и стабильной средой обитания. В свою очередь, метаболиты, выделяемые эндофитами, могут защищать растения от фитопатогенов и фитофагов, а также стимулировать их рост и развитие. Показано, что эндофитные грибы могут увеличивать устойчивость растений к болезням и абиотическим стрессам (Arachevaleta et al., 1989; Гельцер, 1990; Bush et al., 1997; Благовещенская, 2006). Возникновение способности грибов к эндофитному развитию, возможно, связано с переходом растений к наземному образу жизни (Каратыгин, 1993) и представляет собой реализацию стратегии избегания негативного влияния факторов окружающей среды. Постоянное или временное развитие микроорганизмов в относительно стабильных и богатых питательными веществами условиях внутри тканей растения можно рассматривать как следствие их длительной коэволюции (Hirano, Upper, 2000). Таким образом, изучение эндофитных микроорганизмов имеет практическую ценность и представляет интерес с позиций фундаментальных вопросов экологии и эволюции.

На настоящий момент опубликовано значительное количество работ, посвященных различным аспектам биологии эндофитных бактерий и гри-

бов, как фундаментального, так и прикладного характера (Baert et al., 1994; Malinowski et al., 1997; Mathews, Clay, 2001; Rosenblueth, Martinez-Romero, 2006; Благовещенская, Дьяков, 2005). Особенно это касается эндофитных грибов злаков, активное изучение которых началось в 70-х гг XX века в связи с массовыми отравлениями скота (Bacon et al., 1977). Значительно меньше известно о способности дрожжевых грибов к эндофитному образу жизни, хотя именно дрожжи относятся к числу наиболее типичных эпи-фитных микроорганизмов, обитающих на поверхности растений в качестве эккрисотрофов. Систематических исследований эндофитных дрожжей до настоящего времени не проводилось, все имеющиеся данные носят отрывочный характер.

Дрожжи в целом относятся к типичным копиотрофам, для роста и размножения которых требуется относительно высокая концентрация легкодоступных соединений. В отличие от мицелиальных грибов одноклеточные дрожжи не способны распространяться за счет апикального роста по межклеточному пространству. Однако дрожжевые клетки могут попадать внутрь растения через устьичные аппараты, гидатоды, механические микроповреждения кутикулы и эпидермы. Некоторые виды дрожжей обладают липолитической и пектинолитической активностью, что может позволить дрожжевым клеткам проникать во внутренние ткани с поверхности в результате локального разрушения кутикулы. Учитывая эти особенности, можно предположить, что эндофитные дрожжи должны наиболее активно развиваться в таких растительных субстратах, которые характеризуются высоким содержанием легкодоступных питательных веществ, например, в сочных плодах, запасающих вегетативных метаморфозах, крахмалсо-держащих семядолях. Микроаэрофильные условия внутри растительных тканей могут способствовать росту дрожжевых грибов, многие из которых способны к брожению. Знание масштабов распространения и закономерностей развития эндофитных дрожжей может оказаться полезным не только с точки зрения более детальных представлений об особенностях экологии этой группы грибов, но и иметь практический аспект, связанный с разработкой методов хранения и контроля качества сельскохозяйственной продукции, биоконтролем фитопатогенов.

В данной работе была предпринята попытка оценки распространения и видового разнообразия дрожжевых грибов в запасающих тканях плодов, семян, вегетативных метаморфозов различных диких и культурных растений.

Цель настоящей работы - оценить масштабы и значимость такого явления, как эндофитное развитие дрожжей в запасающих тканях растений.

Конкретные задачи работы: охарактеризовать таксономическое разнообразие эндофитных дрожжей; изучить особенности динамики их численности и видового состава; сравнить эпифитные и эндофитные дрожжевые сообщества; определить возможные механизмы формирования эндофитных дрожжевых сообществ; оценить характер взаимодействия эндофитных дрожжей с растениями.

Автор выражает глубокую признательность научному руководителю И.Ю. Чернову и A.M. Глушаковой за внимание и помощь в работе. Автор благодарит A.B. Качалкина, И.А. Максимову, A.M. Юркова, а также В.В. Демина и Ю.А. Завгороднюю за помощь в проведении хро-матографических анализов и весь коллектив кафедры биологии почв за ценные советы и рекомендации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Эпифитные дрожжи

Известно, что основным местообитанием дрожжевых грибов в природе являются растения и растительные остатки. Особенно многочисленные и разнообразные дрожжевые сообщества формируются на поверхности живых частей растений (Бабьева, Чернов, 2004). Основой питания таких эпифитных дрожжей являются экссудаты - прижизненные выделения растений, в состав которых входят простые сахара, органические кислоты и другие, легко утилизируемые дрожжами соединения (Рощи-на, Рощина, 1989). В свою очередь, эпифитные дрожжи, потребляя экссудаты, стимулируют ассимиляционные процессы растений. Некоторые виды дрожжей могут выступать в качестве агентов биоконтроля развития фитопатогенных микроорганизмов, выделяя вещества, подавляющие их рост. Эпифитные дрожжи и растения вместе образуют единую симбио-тическую коэволюционирующую систему, которая может служить хорошей моделью для изучения многих фундаментальных вопросов экологии и эволюции. Сообщества эпифитных дрожжей филлосферы и сопряженных с ней растительных субстратов (цветов, плодов, почек) являются постоянной и неотъемлемой частью любого растения, перестраивающейся в процессе его онтогенеза. По мере развития и постепенного отмирания растительных субстратов эпифитные виды дрожжевых грибов закономерно оказываются в подстилке и верхних почвенных горизонтах, где формируются специфические дрожжевые сообщества, в состав которых, кроме типичных эпифитов, входят также и автохтонные виды почвенных дрожжей (Бабьева, Горин, 1973). Если на поверхности растений дрожжевые грибы существуют в основном как копиотрофы, за счет потребления легкодоступных соединений из поверхностных экссудатов, то в подстилке и почвенных горизонтах в большей степени проявляется их гидролитическая активность, а также способность некоторых видов существовать в условиях олиготрофии (Полякова, Чернов, 2002).

С момента появления первых работ, посвященных изучению именно

эпифитных дрожжевых грибов, прошло чуть более полувека (di Menna, 1959). За этот период исследования экологии дрожжей, населяющих фил-лосферу и сопряженные с ней субстраты (цветки, плоды, подстилку) развивались как в направлении оценки общей численности и разнообразия эпифитных дрожжевых грибов в различных природно-географичес-ких зонах, так и в направлении изучения специфических особенностей структуры эпифитного дрожжевого населения конкретных видов растений. Исследования, посвященные анализу численности и видового состава эпифитных дрожжей на разных растениях, достаточно многочисленны (Бабьева и др., 1985; Бабьева и др., 1999; Бабьева, Картинцев, 1974; Бабьева, Садыков, 1980; Возняковская, 1969; Гузев и др., 1980; Гукасян, Аюнц, 1971; Делова, Кузнецова, 1973; Картинцев, 1974; Квасников и др., 1975; Максимова, 2001; Чернов, Бабьева, 1989; Bab'eva, Chernov, 1995; di Menna, 1959; Bai et al., 2002; Banno, Mikata, 1981; Golubev et al., 2003, 2004; de Azeredo et al., 1998; de Jager et al., 2001; Fleet, 2001; Foda et al., 1987; Fokkema, Scchippers, 1986; Hamamoto, Nakase, 1995, 1996; Hogg, Hudson, 1966; Kecskes, Dobolyi, 1987; Last, Price, 1991; McBride, Hayes, 1977; Mukerji, Gupta, 1981; Phaff et al., 1972; Richardson, Dowding, 1989; Sugita, Canete-Gibas, 1999; Sugita et al., 2000; Takashima, Nakase, 2000; Takashima et al., 2001, 2003; Warren, 1976).

Известно, что эпифитное дрожжевое население растений включает как аскомицетовые, так и базидиомицетовые виды. Преобладающими в большинстве случаев на листьях оказываются базидиомицетовые виды из родов Cryptococciis, Rhodotoriila, Rhodosporidhim, Sporobolomyces, которые по своим морфофизиологическим характеристикам в целом более адаптированы к периодически возникающим достаточно неблагоприятным условиям обитания на поверхности растений. Такие адаптации включают синтез каротиноидных пигментов, образование хламидоспор и активно отстреливающихся баллистоспор, формирование полисахаридных капсул, широкие ассимиляционные возможности. Аскомицетовые дрожжи из родов Metschnikowia, Debaryorriyces, Pichia, не обладающие перечисленными морфологическими особенностями, и, как правило, способные ассимилировать или анаэробно сбраживать более узкий набор соединений,

обычно преобладают в растительных субстратах с повышенным содержанием простых Сахаров, например в цветочном нектаре. В разлагающихся растительных остатках также доминируют базидиомицетовые дрожжи, но среди них уже большую долю составляют виды с относительно высокой для дрожжевых грибов гидролитической активностью. В основном это представители родов С^оут/обш'/б/шт, ТпсИозрогоп, Сгур1ососсш\ Оие-котусез и др.

Особая заслуга в изучении дрожжевых группировок разлагающихся растительных остатков, а именно в лесных подстилках принадлежит школе советских и впоследствии российских почвенных зимологов, сформировавшейся под руководством И.П.Бабьевой (Бабьева и др., 1977; Бабьева и др., 1980; Бабьева, Решетова, 1984; Бабьева, Россихина, 1983; Гукасян и др., 1980; Зайцев и др., 1979). Кроме того, наследием советско-российской школы является впервые предложенная классификация жизненных форм дрожжевых грибов из природных субстратов (Бабьева, Чернов, 2004). И хотя она вызывает достаточное количество вопросов, тем не менее, это первая попытка выделения экологических группировок в микробиологии, которые были бы сравнимы с аналогичными типами группировок среди растений и животных и сделали бы дрожжевые грибы не менее удачной, чем растения и животные, моделью для синэкологических исследований.

Филлосфера как среда, обитания дрожжевых грибов

Впервые к изучению микробных сообществ филлосферы приступили в 50-х годах прошлого столетия. Начинаяс 1970-хгг. этатемасталапостояннойи одной из самых актуальных в микробиологических исследованиях. Изучение дрожжевого компонента эпифитных микробных ценозов началось с работ новозеландской исследовательницы М.Е.ди Менны в конце 50-х годов (сН Меппа, 1959). Как уже отмечалось, именно в ее работах впервые говорилось, что существуют эпифитные и почвенные дрожжи, хорошо адаптированные к обитанию в этих средах.

Филлосфера является достаточно гетерогенным местообитанием для микроорганизмов. Она характеризуется сложной пространственной

структурой, разнообразием микроклиматических условий, как на листьях разных ярусов, так и по поверхности отдельного листа (Andrews, Harris, 2000; Hirano, Upper, 2000; Jacques et al., 1995; Juniper, 1991; Kinkel et al., 2000; Last, 1970; Lindow, Brandl, 2003; Leveau, Lindow, 2001; Monier, Lindow, 2003; Monier, Lindow, 2004; Morris, 2001; Morris et al., 1998).

На развитии дрожжевых грибов гетерогенность сказывается, прежде всего, в неравномерном распределении по поверхности листовой пластинки питательных веществ и свободной воды. Больше всего локусов выделения находится вдоль жилок, на черешке, в районе устьичных клеток, а также по краю листовой пластинки. Соответственно локусам выделения питательных веществ на поверхности листа распределяются и клеточные агрегаты дрожжей и других эпифитных микроорганизмов (Andrews et al., 2002; Brodie, Blakeman, 1975; Li et al., 1997; Mercier, Lindow, 2000; Morris, 2001; Spear et al., 1999; Woody, et al., 2003). Источниками необходимой свободной воды в филлосфере являются роса, осадки в виде дождя, туман, гуттация.

Эпифитные дрожжи являются эккрисотрофами, то есть используют в качестве источника питания растительные экссудаты. В состав растительных экссудатов входят в основном простые сахара (глюкоза, сахароза, раффиноза, галактоза, сорбоза), сахароспирты (маннит, инозит), органические кислоты (щавелевая, лимонная и др.), а также аминокислоты. Состав экссудатов соответствует составу флоэмного сока растений, и является гипертоническим по отношению к нему (Рощина, Рощина, 1989; Tukey, 1971; Leveau, Lindow, 2001; Morris, 2001; Rumpf et al., 1994). На поверхность листовой пластинки экссудаты выделяются через экстрафлоральные нектарники с помощью экзоцитоза, а также через устьица, через гидатоды, в результате повреждения трихом и кутикулы. Экстрафлоральные нектарники, в отличие от флоральных, расположены преимущественно не на репродуктивных, а на вегетативных органах растения (листья и листовые черешки, зеленые стебли и др.).

На молодых листьях весной нектарники еще не вполне сформированы. Вероятно, именно с этим связан тот факт, чис