Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эндофитные сообщества сфагновых мхов как источник бактерий - эффективных ассоциантов сельскохозяйственных культур

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Эндофитные сообщества сфагновых мхов как источник бактерий - эффективных ассоциантов сельскохозяйственных культур"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЩЕРБАКОВ Андрей Васильевич

ЭНДОФИТНЫЕ СООБЩЕСТВА СФАГНОВЫХ МХОВ КАК ИСТОЧНИК БАКТЕРИЙ -ЭФФЕКТИВНЫХ АССОЦИАНТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР

03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 4 СЕН 2014

Санкт-Петербург - 2014

005552154

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСХМ)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук

Чеботарь Владимир Кузьмич (ГНУ ВНИИСХМ)

Официальные оппоненты:

д.б.н., проф., зав. кафедрой микробиологии Сопрунова Ольга Борисовна. (Астраханский ГТУ)

к.б.н., с.н.с лаборатории гидробиологии

Капустина Лариса Леонидовна.

(Институт озероведения РАН, г. Санкт-Петербург)

Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (ГНУ ВИЗР)

Защита состоится «¿Г» ъу-'г?^ 2014 г. в/^Засов на заседании диссертационного совета ДМ212.232.07 по защите докторских и кандидатских, диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Биолого-почвенный факультет, аудитория. ¡45?.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. М.Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан »а^уя-- 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.И.Шарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К настоящему времени в литературе накоплен достаточно обширный материал о бактериях, ассоциированных с высшими растениями и способных стимулировать их рост и развитие за счет синтеза необходимых для растения фигогормонов и витаминов, фиксации молекулярного азота, а также подавлять развитие бактериальных и грибных заболеваний. Клеппером с со авт. (Kloepper et al., 1980) для обозначения такой группы бактерий был предложен термин PGPR (от англ. plant growth-promoting rhizobacteria), который включает почвенные микроорганизмы, активно колонизирующие ризосферу и ризоплану растений и стимулирующие их рост. Однако, в последнее время появилось большое число работ, касающихся эндофитных бактерий (Stçpniewska, Kuzniar, 2013; Nair, Padmavathy, 2014; Brader et al., 2014). В данной работе мы придерживались именно классического определения термина «эндофитные бактерии», который включает в себя микроорганизмы, населяющие внутренние ткани здоровых растений, не вызывающие морфологические изменения и не несущие какого либо вреда для хозяина (Holliday, 1989; Schulz, 2006). Эндофитные бактерии были обнаружены внутри тканей и семян важнейших сельскохозяйственных культур, таких как рис (Baldani et aL, 2000; Okunishi et al., 2005), кукуруза (Mclnroy et al., 1995; Rijavec et al., 2007), хлопок (Misaghi, Donndelinger, 1990), картофель (Sturz et aL, 1998; Krechel et aL, 2002), сахарный тростник (Rennie et al., 1982), пшеница (Чеботарь с соавт., 2010; Щербаков с соавт., 2013) и др. Есть предположение, что поддержание эндофитных сообществ микроорганизмов является универсальным свойством всех растений (Hallmann et al., 1997).

Однако, сведения о бактериях, стимулирующих рост и развитие растений, и ассоциированных со сфагновыми мхами, отсутствовали в литературе до настоящего времени. Специфическое строение внутренних тканей сфагновых мхов, представляющее из себя сочетание живых хлорофиллоносных и мертвых гиалиновых клеток, позволяет применить термин «эндофиг» для представителей микробных сообществ, локализованных внутри этих растений.

Ранее, в работах австрийских исследователей группы проф. Берг (Opelt, Berg, 2004; Opelt et al., 2007; Bragina et aL, 2012) было показано, что зеленые части растений сфагнума являются особыми местообитаниями для бактерий, которые, предположительно, играют важную роль как в жизни сфагнов, так и в функционировании болотных экосистем в целом. Проведенный молекулярный анализ микробных сообществ, ассоциированных со сфагновыми мхами, показал, что до 97% всех клонированных последовательностей генов 16S рРНК могли принадлежать некультивируемым формам микроорганизмов. Таксономическое положение и соотношение наиболее многочисленных групп микроорганизмов варьировали в зависимости от вида мха. Исследования были сфокусированы на азотфиксирующих бактериях, которые играли ключевую роль в условиях дефицита элементов минерального питания для растений-хозяев.

Какова же роль эндофитных бактерий, ассоциированных со сфагновыми мхами, в функционировании растений и формировании болотных экосистем? Одной из научных гипотез данной работы стало предположение о том, что уникальная антимикробная активность сфагнов и их экстрактов (Буркина с соавт., 2000; Белоусов с соавт., 2008) связана именно с деятельностью эндофитных бактерий, населяющих их ткани. Кроме того, эндофитные бактерии, населяющие ткани сфагновых мхов, и относящиеся к группе стимуляторов роста растений,

возможно продуцируют метаболиты, оказывающие регуляторное влияние на рост и развитие сфагновых мхов. Аналогичный тип симбиоза был продемонстрирован для метан-окисляющих микроорганизмов, колонизирующих внешнии кортекс стеблей Sphagnum cuspidatum Hoffm. (Raghoebarsing et al., 2005) и снабжающих растение углеродом, полученным при ассимиляции метана, а также для азотфиксирующих цианобактерий (Solheim and Zielke, 2003), поставляющих для растений азот.

В настоящее время ассоциации растений с полезными микроорганизмами привлекают внимание ученых с точки зрения не только изучения фундаментальных основ взаимодействия различных организмов, но и возможного использования данных взаимодействий в практике экологически ориентированного адаптивного растениеводства. Современное высокоэффективное сельское хозяйство невозможно без применения удобрений и средств защиты растений, а использование микробиологических препаратов и удобрений является одной из современных тенденций сельскохозяйственного про-

ГОВОДСИспользование биологического потенциала микроорганизмов, населяющих корни и внутренние ткани бобовых и небобовых растений, позволяет создавать такие высо-коэффеиивные микробные препараты и удобрения (Schippers, 1995; Тихонович с соавт., 2005- Чеботарь с соавт., 2007). В последнее время, в мировой практике разработан ряд микробиологических препаратов, основу которых составляют полезные штаммы эцдо-фигных и ризобакгерий из родов Azospirillum, Pseudomonas, Bacillus Herbaspmllum, Acetobacter iGraner et al., 2003; Compant et al., 2005; Chebotar et al., 2009). Было показано, что инокуляция небобовых растений ризобакгериями способна значительно увеличить продуктивность растений и качество с/х продукции (Okon, Labandera-Gonzalez, 1994). В некоторых случаях применение микробиологических препаратов позволяло защипш, растения от болезней, заменяя таким образом, химические пестициды (Weiler, 1988, Chebotar et aL 2009) Разработка микробных препаратов и удобрений на основе эндофиг-ных бактерий к настоящему времени является одним из основных направлений развития

с/х микробиологии. „ , __

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - изучение пространственной локализации и выделение эндофитных бактерий растений сфагновых мхов различного видового состава и разных мест обитания, изучение таксономического состава бактериальных популяций, их фенотипических свойств, а также отбор перспективных штаммов с комплексом хозяйственно-ценных свойств для дальнейшего создания на их основе высокоэффективных микробиологических препаратов для растениеводства. В соответствии с намеченной целью были поставлены следующие задачи:

1 Изучение пространственной локализации эндофитных бактерий внутри растений мхов двух видов - Sphagnum fallax (Н. Künggr.) Н. Klinggr. и S. magellanicum Bnd m различных географических регионов (Австрийские Альпы, Ленинградская область, Западная Сибирь). „ „

2 Выделение эндофитных бактерий из растений мхов, изучение таксономического состава эндофитных бактериальных популяций, их культурально-морфологических и

физиолого-биохимических свойств.

3 Отбор перспективных штаммов, обладающих хозяйственно-ценными свойствами: фунгицидной, бактерицидной, ростсгамулирующей, ферментативной активно-

стью.

4. Выявление способности перспективных штаммов бактерий активно колонизировать сельскохозяйственные культуры и оказывать положительное влияние на их рост и развитие путем стимуляции роста, фиторпротекторных и других механизмов.

5. Наработка лабораторных образцов микробиологических препаратов на основе перспективных штаммов и их апробация в вегетационных и полевых экспериментах.

Научная новизна. Впервые (в России) проведены исследования микроорганизмов, ассоциированных со сфагновыми мхами, из различных, удаленных географически регионов. Впервые в России, создана коллекция эндофитных бактерий-ассоциантов сфагновых мхов, изучены их культурально-морфолопнеские, физиолого-биохимические и хозяйственно-ценные свойства. Впервые в мире, показано, что более 50% выделяемых эндофитных бактерий, населяющих ткани сфагновых мхов, имеют выраженные антагонистические свойства против широкого спектра фигопагогенных микроорганизмов, что, предположительно, и обеспечивает уникальные свойства сфагновых мхов противостоять развитию бактериальных и грибных заболеваний. Впервые в России проведена молекулярно-генетическая идентификация штаммов широкого географического происхождения. Показано, что доминирующими среди всех изучаемых бактериальных популяций являлись представители родов Pseudomonas, Serratia, Burkholderia, Flavobacteriwn, Collimonas, Stenotrophomonas. Установлено, что одни и те же виды сфагаов, отобранные в различных географических регионах, являются местообитаниями для представителей одних и тех же таксономических групп. Впервые в мире показано, что эндофитные бактерии, выделенные из тканей сфагновых мхов, способны шсгивно взаимодействовать с культивируемыми в сельском хозяйстве растениями и оказывать положительное влияние на их рост и развитие. Впервые в мире, созданы эффективные лабораторные образцы микробиологических препаратов на основе эндофитных бактерий, выделенных из сфагновых мхов.

Практическая значимость работы. Создана коллекция штаммов эндофитных микроорганизмов, характеризующихся наличием важных, хозяйственно-ценных свойств, таких как антагонизм по отношению к фитопатогенным грибам и бактериям, ростстимуляция, способность к мобилизации малодоступных для растения соединений фосфора, ферментативная активность и др. Наиболее перспективные штаммы депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов сельскохозяйственного назначения. Апробирована технология получения и применения лабораторных образцов микробных препаратов на основе эндофитных бактерий сфагновых мхов. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Внутри тканей сфагновых мхов локализуются эндофитные бактериальные сообщества.

2. В компонентном составе гетеротрофных бактериальных сообществ сфагновых мхов различного географического происхождения преобладают представители родов Pseudomonas, Serratia, Burkholderia, Flavobacterium, Collimonas, Stenotrophomonas.

3. Культивируемые гетеротрофные бактерии сфагновых мхов обладают комплексом свойств, которые играют важную роль не только в жизни растения-хозяина, но и могут быть использованы в практических целях.

4. Штаммы бактерий, выделенные из тканей сфагновых мхов, способны активно взаимодействовать с высшими растениями сельскохозяйственного значения и оказывать положительное влияние на их рост и развитие.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы и результаты исследований докладывались на: Всероссийской научной конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в агропромышленном комплексе России» (14-15 апреля 2010 г., г. Москва, Россия); 14-ой Путинской международной школе-конференции молодых ученых (19-23 апреля 2010 года, г. Пущино, Россия); международной конференции «Biological control of fungal and bacterial plant pathogens» (7-10 июня 2010, г. Грац, Австрия); международной научно-практической школе молодых ученых и минисимпозиуме «Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Region: Contributions from Plant and Microbial Biotechnology» (12-17 июля 2010, г. Миккали, Финляндия); международной бриологической конференции, посвященной 110-летию со дня рождения З.Н. Смирновой и К.И. Ладыженской «Бриология: традиции и современность» (2010 г. СЛегербург, Россия); 4-ой международной конференции «Environmental, Industrial and Applied Microbiology» (14-16 сентября 2011, г. Торремолинос, Испания); международной конференции «Cuirent aspects of european endophyte research» (28-30 марта 2012 г Реймс, Франция); 16-ой Путинской международной школе-конференции молодых ученых, (16-21 апреля 2012, г. Пущино, Россия); 7-ой конференции «Перспективы использования новых форм удобрений, средств защшы и регуляторов роста растений в агротехнологиях сельскохозяйственных культур» (2012, г. Анапа, Россия); международной бриологической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Р.Н. Ши-лякова (24-26 июня 2012 г., г. Апатиты, Россия); международной конференции «Endophytes: fromdiscovery to application» (14-16 ноября 2012 г, г. Сан-Мишель, Италия).

Работа выполнена в рамках Российско-Австрийского проекта при финансовой поддержке гранта РФФИ № 09-04-91007_АНФ

Личный вклад соискателя. Представленные экспериментальные и теоретические результаты получены лично автором. Соискатель принимал непосредственное участие в постановке всех задач исследования, подготовке и проведении экспедиций и экспериментов, вегетационных опытов и полевых исследований, обработке и обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций. Идентификация образцов сфагновых мхов выполнялась совместно со специалистами в области ботаники Бергом К. (Ботанический инсппуг, Карл-Франсес университет, Грац, Австрия), Кузьминой Е.Ю. (Ботанический институт им. Комарова РАН, С.Петербург, Россия), Лапшиной Е.Д. (Югорский государственный университет, Ханш-Мансийск, Россия). Методики FISH и CSLM были освоены под руководством и при непосредственном участии Братиной A.B. и Кардинале М. (Институт природоведческой биотехнологии, Технологический университет, Грац, Австрия), а также сотрудников лаборатории молекулярной и клеточной биологии ГНУ ВНИИСХМ. Определение концентрации ауксинов в культуральной жидкости выполнено при участии K.6.H. Шапошникова А.Н. (ГНУ ВНИИСХМ). Часть работ выполнена с использованием оборудования ЦКП "Геномные технологии и клеточная биология" ГНУ

ВНИИСХМ. ,

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 30 работ, в том числе: 9 - в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, из них 3 статьи в ведущих иностранных журналах, 1 глава в книге, получен 1 патент.

Объем и crpyicrypa диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из 400 источников (из них - 376 иностранных) и приложений. Материалы диссертации

изложены на 179 страницах машинописного текста, иллюстрированы 44 таблицами и 31 рисунком.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Представлены сведения об экологической роли, распространённости, видовом составе микроорганизмов болотных экосистем. Обобщены результаты исследований микроорганизмов, ассоциированных с растениями рода Sphagnum.

Рассмотрены материалы о полезных растительно-микробных системах в сельскохозяйственной биотехнологии.

Изложены результаты и перспективы практического использования эндофит-ных бактерий.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Сбор образцов сфагновых мхов. В представленной диссертационной работе эндофитные бактерии выделяли из гаметофитов сфагновых мхов двух видов'. Sphagnum fallax (Н. Klinggr.) Н. Klinggr. и 5. magellamcum Brid. Образцы сфагновых мхов отбирали в ходе экспедиций на территории трех географически удаленных регионов (табл.1): Австрийских Альп, Ленинградской области, Западной Сибири (Ханты-Мансийский автономный округ).

Таблица 1. География отбора образцов сфагновых мхов в 2009-2012 гг.

Регион отбора Точка отбора Географические координаты Дата отбора

Австрийские Альпы "Rootmoos" (Австрия, федеративная земля Шти-рия) "Waasenmoos" (Австрия, федеративная земля Зальцбург) "Piirgschachen" Moor (Австрия, федеративная земля Штирия) N 47°4Г Е 15°09' N 47°18'Е12°24' N 47°34'Е14°20' 02.09.2009 03.09.2009 04.09.2009

Ленинградская область Урочище «Полесье» (Россия, Ленинградская область, Выборгский р-н) Озеро Волоярви (Россия, Ленинградская область, Всеволожский р-н) Урочище «Кордон Кирпичный» (Россия, Ленинградская область, Гатчинский р-н) N 60°44'Е 29°04' N 60°18'Е 30°48' N 59°16'Е 29°54' 19.07.2010 03.10.2009 06.10.2011

Западная Сибирь Болото «Чистое» у п. Шапша (Россия, Ханты-Мансийский АО) Болото «Мухрино» (Россия, Хашы-Мансийский АО) Болото «Кукушкино» у 45 км трассы Ханты-Мансийск - Нефтеюганск (Россия, Ханты-Мансийский АО) N61°03'E69o27' N 60°53'Е 68°41' N 60°57'Е 69°41' 30.08.2012 31.08.2012 01.09.2012

Идентификация видов сфагновых мхов проводилась в полевых условиях по анатомо-морфологическим признакам в соответствии с определителем сфагновых мхов (1§паК>у е1 а1., 2006). В указанных болотных экосистемах образцы мха каждого вида отбирали в четырех точках, удаленных друг от друга на расстоянии 50-100 м. При отборе пучок из 50-100 растений извлекали вручную с помощью стерильных перчаток из растительного массива, помещали в стерильный пластиковый пакет, который в тот

7

же день в охлажденном виде доставляли в лабораторию для дальнейших исследований. Для каждой точки отмечали географические координаты, описывали характер окружающей растительности, температуру и pH воды.

22. Пространственная локализация бактерий, ассоциированных со сфагновыми мхами, при помощи флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) и конфокальной сканирующей лазерной микроскопии (CSLM). Растительный материал (гаметофиты растений) отмывали от частиц посторонних включений и растительных остатков стерильным буфером PBS, разрезали в асептических условиях на секции размером 1,5-2,0 см и фиксировали в течение 18 ч при температуре +4°С. Флуоресцентную in situ гибридизацию проводили по описанной ранее методике (Cardinale et al., 2011; Щербаков с со-авт., 2013) с использованием следующих универсальных и групп-специфичных олиго-нуклеотидных проб: эквимолярную смесь олигонуклеотидных проб EUB338, EUBID38, EUBUI338 (Amann et al., 1990; Daims et al., 1999) - универсальную пробу для всех эубактерий, маркированную флуорохромом СуЗ; ВЕТ42а и GAM42a - специфичные пробы для представителей классов Betaproteobacteria и Gammaproteobacteria (Mauz et al., 1992), маркированные флуорохромами Су-5 и 6FAM, соответственно. Конфокальную сканирующую лазерную микроскопию выполняли с использованием микроскопа Leica TCS SPE (Leica Mycrosystems, Германия). Для детекции олигонуклеотидных проб, меченных флуорохромами 6FAM, СуЗ и Су5, использовали лазеры с длиной волны 488, 532 и 635 нм. Флуоресценцию регистрировали в диапазоне 508-566 нм, 665-607 нм и 657-709 нм соответственно. Трехмерную реконструкцию изображений выполняли с использованием программы Imaris 7.0 (Bitplane, Швейцария).

2.3. Выделение эндофитных бактерий и создание коллекции штаммов с хозяйственно-ценными свойствами. Для выделения изолятов эндофитных бактерий использовали следующую методику. Свежие гаметофиты сфагнума в количестве 5-10 штук общей массой 5 г промывали в стерильном физиологическом растворе дня удаления частиц посторонних включений и растительных остатков. Затем образцы выдерживали 5 мин в 10% растворе перекиси водорода. Образцы трехкратно отмывали от перекиси в стерильном физиологическом растворе и помещали в стерильные керамические ступки. Для контроля качества поверхностной стерилизации физраствор из последней серии высевали на поверхность питательного агара (ПА). К растительному материалу добавляли 10 мл стерильного физраствора и растирали пестиком до получения однородной кашеобразной массы. Полученную массу методом последовательных серийных разведений высевали на поверхность твердой агаризований среды R2A с рН=5,7 (табл. 2.6). Посевы инкубировали в течение 5 суток при 20°С, после инкубации подсчитывали общее число выросших колоний, бактерии из морфологически различных колоний методом истощающего посева отсевали на новые чашки Петри, проверяли чистоту культур, описывали культурально-морфологические свойства. Для хранения культуры пересевали в пробирки со скошенной агаризованной средой R2A, а также замораживали при -80°С в 20% растворе глицерина.

Для молекулярно-генетической идентификации доминантных изолятов бактерий из полученных чистых культур, ДНК выделяли с помощью стандартного метода (лизис лизоцимом и SDS, и последующей фенол-хлороформовой экстракцией). Амплификацию фрагментов гена 16S рРНК проводили с использованием праймеров BD1/FD1 (Коростик с соавт., 2006), амплифицированные фрагменты после очистки из геля секвенировали согласно протоколу фирмы Beckman Coulter (США) для 8-и ка-

нального секвенатора SEQ8000 с коммерческим набором «SEQ Dye Terminator Cycle Sequencing (Dl CS) with Quick Start Kit». Видовую принадлежность изолятов определяли с помощью программы BLAST GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).

В качестве тест-культур при изучении фунгицидных свойств выделенных изолятов использовали штаммы фитопатогенных и токсигенных грибов: Fusarium grammearum, Fusarium culmorum, Fusarium sporotrichioides (штаммы из коллекции ВИЗР, предоставлены к.б.н. Т. Ю. Гагкаевой), Alternaria alternata, Pythium ultimum (из коллекции ГНУ ВНИИСХМ). Культуры бактерий-антагонистов наращивали на жидкой среде R2A стационарно при 20°С в течение 3-х суток, фунгицидную активность определяли с помощью метода «колодцев» (Magnusson и Schnurer, 2001) на карто-фельно-декстрозном агаре (Difco, США).

Бактерицидную активность проверяли на 4-х штаммах фитопатогенных бактерий: Erwinia carotovora var. atroseptica 822, Pseudomonas syringae 213, Pseudomonas syringae 8511, Qavibacter michiganensis pv. sepedonicum 6028 (штаммы го коллекции ВИЗР, предоставлены к.б.н. А. М. Лазаревым) с помощью метода «агаровых блоков» (Зенова с соавт., 2002) на 2% картофельном агаре.

Для изучения способности штаммов к продукции ауксинов исследуемые изоля-ты бактерий культивировали 5 суток стационарно при температуре 28°С на жидкой среде R2A с добавлением 2 гаМ L-триптофана. Качественную реакцию на ИУК и ее производные проводили при помощи реактива Сальковского (Salkowski, 1885; Gordon, Weber, 1951). Количественный анализ ауксинов в экстрактах культуральной жидкости проводили с помощью системы ультрапроизводительной жидкостной хроматографии (УПЖХ, UPLC) Waters ACQUTTY UPLC H-class с флуоресцентным детектором.

Ростстимулируюшую активность определяли на проростках кукурузы и редиса по разнице в длине корешков инокулированых и контрольных растений. Способность выделенных изолятов эндофитных бактерий к растворению соединений фосфора проверяли на модифицированной среде Муромцева, в которую вносили 2 г/л ортофосфата Ca и фосфоритной муки. Протеазную, амилазную и липазную активности выявляли стандартными методами для оценки ферментативной активности бактерий (Теппер 2004; Нетрусов, 2005). Целлюлазную активность выявляли согласно оригинальной методике (Kasana et al., 2008).

2.4. Изучение колонизационной, ростстимулирующей. биоконтрольной, фос-фатмобилизующей активности выделенных штаммов in planta. Для выявления способности исследуемых штаммов эндофитных бактерий мхов к активной колонизации высших растений использовали метод инокуляции семян и последующее выращивание растений в стерильных условиях гнотобиотических систем (Simons et al., 1996). Контрольным штаммом для сравнения колонизационных свойств бактерий выбран штамм Pseudomonas chlororaphis RR228 из коллекции лаборатории технологии микробных препаратов ГНУВНИИСХМ, уже используемый при производстве лабораторных образцов микробиологических препаратов. Растительными объектами для изучения служили следующие сельскохозяйственные культуры: пшеница Triticum aestivum (сорт «Веда», селекции Краснодарского НИИ сельского хозяйства), томаты Solanum lycopersicum (сорт «Персей», агрофирма «Дом семян», Санкт-Петербург) и редис Raphanus sativus L. var. radícula (сорт «Дуро», агрофирма «Дом семян», Санкт-Петербург).

Для изучения пространственной локализации бактерий на корнях растений томатов применяли метод флуоресцентной in situ гибридизации и люминесцентной мик-

.„^мттга томатов подготавливали по методике, роскопии. Для этого, универсальной бакте-

дажг^да-—<—

—инесцентно^и^ ^^ ь.

В РасГтелХГЙк-гами служили растения пшеницы и то-

но-микробные системы^Расгательньш С03давш1ся фитопатогекный фон (нагрузка

ДЛЯ томатов - ош7т£га растения томатов выращивала, в сосу-

® смесь нестерильного торфотрунта

SS

ГГрГвортмые источники фосфора: орхофосфат Ca и фосфоритную »iwv п количестве 5 г/кг субстрата и тщательно перемешивали.

\"ieшю^ штияш¡я це^полозолигической ассоциации, выделенной из сфагновых «К.^"разложения растительных остатков и баланс гумуса в почве вопили в лабооаторно?.! эксперименте Лаборатории микробной экотехнологии ГНУ SScxM iSSSSoM опыте, заложенном осенью 2011 г. после уборк^меия на ОПЫТ1ЮМ поле ГНУ ВНИИОУ (Оиет об испытаниях, приложение дисс. работы).

Карабалыкской сельскохозяйственной опытной станции (Республика Казахстан) в 2012 mS на масличных культурах: масличный лен, подсолнечник масличныи.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

3 1 ^.погЪитные бактерии ^характерные обитатели гаметсфитрв растений Сфапбиологии и конфока^ной сканиру о-щ!Р^1ерной микроскопии, позволяй изучить локализацию ЭВДофи™х бактеРи внуши тканей каптирующих растений сфагнума Использование методов FISH и CSLM воссоздает ™етрехмерную модель (рис. 1, 2) структуры внутренних тканей,

структуре вегетативных частей ний сфагнума, которые представляют из себя сочетание живых хлорофиллоноошх ™^ых гиалоцигов, внутри тканей этих растений Ф W™^ ские микрониши для существования эндофитных багариальных сообществ. В свете ™ иссле;юва1гий, шменяютея и наши представления о ФУ»™

свойствах самих тканей гаметофигов сфагновых мхов. Ранее утверждалось, что бла-года^бчатой структуре и наличию крупных пор, функция гиалоцигов заключается Sia^S ^Хдуюшей ее отдаче растению по мере необходимости. Проведете исследования последнего десятилетия, в том числе и наши, позволяют с уве-¿шостъю сказать, что гиалиновые клетки несут не только водозапасаюшую функ-

цию, но выполняют роль своего рода микрониш для различных микробных сообществ, обеспечивая функционирование особого, специфического типа симбиотических растительно-бактериальных взаимоотношений.

Рисунок 1. Локализация Alphapro-teobacteria и Planctomycetes в гиа-лоцитах сфагнума. Показано внутреннее пространство гиало-цитов S. fallax (а, Ь) и S.magellanicwn (с, d). Гибридизация проводилась с использованием Alphapro-teobacteria- и Planctomycetes- специфичных проб. Желтый: Alphaproteobacteria (а, с) или Planctomycetes (b, d); красный: другие эубактерии. Масштабная линейка: 10 (а, Ь) и 5 (с, d) мкм. (Bragina A., Berg С., Cardinale M., Shcheibàkov A. et al., 2012)

репного пространства гиалиновых клеток сфагнов бактериями классов Ве1арго1еоЬас1епа (А) и С}аттарго1еоЬас1егш (В). Изображения, полученные при помощи конфокального лазерного, сканирующего микроскопа, представлены в 3 проекциях. Масштабная линейка -10 мкм.

Использование универсальных и группспецифичных олигонуклеотидных проб позволило визуализировать представителей Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria, Planctomycetes, населяющих ткани сфагнов (Рис. 1, 2). Бактериальные микроколонии обнаруживались и на внешней поверхности листьев и стеблей растения сфагнума, однако наибольшая плотность микробных популяций была локализована именно внутри гиалиновых клеток растений.

Важным моментом, выявленным в ходе исследований, является формирование бактериальными эндофитами микроколоний внутри гиалоцитов сфагнума, эндофиты не просто находятся внутри гиалоцитов, либо «заплывают» в них с током воды, а именно существуют в тесной взаимосвязи с растением-хозяином, формируя микроколонии активно делящихся клеток.

3.2. Таксономический состав эндофитных бактериальных популяций сфановых мхов. Молекулярно-генетическая идентификация на основании анализа фрагментов гена 168 рРНК позволила определить таксономический состав выделенных бактериальных популяций.

Основу бактериальных популяций, культивируемых, и способных расти на поверхности агаризованых сред, составляют грамотрицательные бактерии (на рис. 3-5 приведен пример состава бактериальных сообществ сфагновых мхов различного географического происхождения).

. З^гсвг-ыа_рЛут 2апвг<>„/зУуп ь" ГЛ1 ЯР 13£

5ЗоЗЭг

Зечтай»и.Шса__Р!М14А

&5

О .&<*

^ В игкЛ сЛ>еп Ь />с>рЛ|1*_ ЯЛЛ

о £*т аг> 5_ 3 О ^и^ГюМаг»ас&.пимп ЯМ 13Б IЛй.« 1В

Я) _/ЧМ1-4С

сЛ«тлал»5_«р 2Н

о-са^пиег! _ЯРИВ

гегоб"?

"ШйГ?

-е~ёзУ

0

Р «Ал© Ю

. Р ееЗоЬ

Вгт\Л>»сшп1Ат др ЯРИВ

£1гвлссгорлояполв» /V

—"у

......0 7Э8

в виопь зсе «Р2 4 С ^ Рдац>5Гольда** ЗО

Рзеис^гч ЗС

Ф ¿з«ем*»0«огм.вЯлгЗЗ С

ОГр^-^ВтехОих ВсЬ&лМэгт ¿х

Рисунок 3. Пример видового состава бактериального сообщества эндофитных бактерий 5. /аИах и magellanicum, отобранных в Ленинградской области (оз. Волоярви, Всеволожский р-н, 2010 г.).

В видовом составе бактериальных сообществ, ассоциированных со сфагновыми мхами, можно выделить следующие основные таксономические ветви. Класс Gammaproteobacteria порядок Enterobacteriales включал представителей родов Serratia, Enterobacter и ряд других. Другой, не менее заметной таксономической ветвью были представители порядка Burkholderiales, разделенной на две основные доминанты: семейство Oxalobacteraceae, представленное Collimonas spp., и семейство Burkholderiaceae, представленное Burkholderia spp. Фила Bacteroidetes представлена родами Flavobacterium, Pedobacter, Chryseobacterium. К наиболее крупной таксономической ветви следует отнести представителей Pseudomonadaceae, численность которых достигает 50% всех выделенных изолятов бактерий. Среди характерных видов Pseudomonas следует отметить Р. роае.

Сравнение таксономического состава природных популяций гетеротрофных бактерий, ассоциированных со сфагновыми мхами, показало наличие общих закономерностей численности различных группировок бактерий (рис. 4, 5). Так одной из общих тенденций являются вариации в численности родов Pseudomonas и Collimonas для разных видов сфагнового мха. Представители рода Pseudomonas составляли наиболее многочисленную группировку эндофитных бактерий S. magellenicum, в то время как для S.fallax популяция псевдомонад была не столь многочисленна, а более выраженной становится численность представители родов Collimonas и Flavobacterium._______

Рисунок 4. Компонентный состав бактериального сообщества эндофитных бактерий 5. /а11ах и S. mageUanicum, отобранных в Ленинградской области (оз. Во-

лоярви, Всеволожский р-н, 2010 г.).____

ч Ы1„. .................... ...........тчеимчсит

Рисунок 5. Компонентный состав бактериального сообщества эндофитных бактерий 5. /а11ах и 5. magellanicum, отобранных у бол. Чистое (Ханты-Мансийский АО, Зап. Сибирь).

3.3. Культивируемые формы бактериальных эндофитов растений сфагнума - обладатели комплекса хозяйственно-ценных свойств. Всего в ходе работы из тканей сфагно-

вых мхов S. fallax н 5. magellanicum, отобранных на территории Австрийских Альп, Ленинградской области, Западной Сибири, было выделено более 400 изолятов культивируемых форм эндофитных бактерий. Были охарактеризованы их культуральные и морфологические свойства. Большинство выделенных бактерий - грамотрицательные (более 98%), округлые, овальные клетки или короткие палочки, очень мелкие (<1.5 мкм), которые формировали на среде R2A быстрорастущие, либо медленнорастущие, плоские и стелящиеся, прозрачные или полупрозрачные колонии, окрашенные тогда довольно ярко, красного, фиолетового, розового, желтого, оранжевого цветов, либо бесцветные, бежевые или мутно-белые. Общая численность микроорганизмов, выделяемых на питательных средах варьировала в диапазоне 10 -10 КОЕ/г растительной ткани.

Изучение фунгицидной активности более чем у 400 изолятов эндофитных бактерий, выделенных га тканей сфагновых мхов, позволило установить, что доля штаммов, способных подавлять развитие фитопатогенных грибов, была очень высокой и составляла около 60% от общего числа бактерий (табл.2). Кроме того, установлено, что более 30% всех выделенных штаммов подавляли развитие ряда важнейших бактериальных фитопатогенов, что было в 24-32 раза больше, чем в почвах.

Ряд штаммов, характеризующихся наличием ярко выраженных фунгицидных и бактерицидных свойств, был отобран для дальнейших исследований. Следует отметить, что из 16 исследуемых штаммов 10 (62,5%) проявили положительную качественную реакцию на продукцию ИУК. Сведения о содержании ауксинов в культуральной жидкости исследуемых штаммов представлены в таблице 2. Анализируя представленные результаты можно отметить способность к продукции всеми отобранными штаммами трех основных ауксинов: индолил-3-молочной кислоты (ИМК), индолил-3-карбоновой кислоты (ИКК) и индолил-3-уксусной кислоты (ИУК). Наиболее, интенсивно ИУК продуцировалась штаммами P. aspleni RF13H (4,1 мкг/мл), Cryseobacterium sp. RM12F (5,8 мкг/мл), Serratia plymuthica АМ24А (5,4 мкг/мл), P. sp. RF14D (8,1 мкг/мл), но особенно активным продуцентом ауксинов был штамм Burkholderia bry-ophiJa АМ31А, у которого суммарный уровень продукции составлял 41 мкг/мл, а степень конверсии L-триптофана для данного штамма достигал 69,3%.

Оптимальные температуры роста для данных бактерий находились в пределах 18-28°С, при температуре +37°С рост изучаемых бактерий полностью подавлялся. Отмечено, что некоторые из изучаемых штаммов характеризовались способностью к психрофильному росту при +4°С, что вероятно объясняется приспособленностью к температурным режимам болотных экосистем в регионах, отличающихся пониженными температурами. Оптимумы pH в питательной среде колебались от 5,5 до 7,0, при рН=8,0 рост всех изучаемых штаммов бактерий существенно уменьшался. Шесть перспективных штаммов эндофитных бактерий характеризовались способностью растворять малорастворимые соединения фосфора, такие как ортофосфат кальция и фосфоритная мука. Данные штаммы (в основном представители р. Pseudomonas) в дальнейшем могут быть использованы для улучшения фосфорного питания растений.

Ростстимул1фующий эффект исследуемых эндофитных бактерий оценивался на проростках сельскохозяйственных растений. Показано, что при уменьшении титра культуры исследуемых штаммов эндофитных бактерий способны стимулировать развитие растений in vitro (табл. 3). Особенно выраженный стимулирующий эффект оказали штаммы RF13H, RF11D, RF14J, АМ24А, который проявился в достоверном увеличении длины корешков редиса по сравнению с кошрольньм вариантом, обработанным стерильной водой (табл.3). Изучение ферментативной активности изучаемых изо-

лятов эндофиткых бактерий показало наличие у них активных гидролитических ферментов. В результате отобраны штаммы, наиболее активно выделявшие протеиназы, амилазы, липазы и целлюлозы (табл.2).

Таблица 2. Таксономическая принадлежность, хозяйственно-ценные и физиологиче ские свойства наиболее перспективных штаммов эндофитных бактерий-ассоциантов сфагновых мхов.

г г

I

= я

с!

— ц Ч -

Pseudomonas brennen RM14B

Pseudomonas poae RF11D

Pseudomonas asplenii RF13H

Serratia pfymuthica AF24A

Pseudomonas poae RM13C

Pseudomonas, sp. RM13D

Pseudomonas fluorescens RF14J

Flavobacterium sp. RM14A

Flavobacterium sp. RF14A

Burkholderia bryophila AM32A

Burkholderia phenazinum RM13B Collimonas sp. RM14C

Stenotrophomonas rhi-zophila RF13C Pseudomonas sp. RF14D Pseudomonas poae RF14H

Chryseobacterium soli

RM12F

+++ ++ +++

+++ ++

++ + ++ ++ +

+++ ++ ++ + + + +++ +++

++

e

Й° s

и

г: ^ 2 «

¡o

. C*

Р(+),Ц» P(++)

A(+++), L(++) P(++),A(+),

Ц++)

P(+), A(+)

P(++)

P(++), L(+) P(++), A(+++), Ц-НЛ

P(+), A(++); .(++), C(++)

A(+)

A(+)

P(+), U+) P(++), A(++) P(+),A(+)

P(++), A(+++),

]m±I

+/+ +/+

-/-

+/+ +/+ -/■I-

+/+

s В 56ч

э g-5

Iis

= й й I

U R-

CL Г

0,11 0,04 4,11 5,43

0,13 6,23

35.1

1,23

1,10

5,82

28 28 28 28 18 28 28 18 28 28 28 18 28 28 28 28

t о

О,

T 11—Д f____' _|__I-'— — -

Примечание. Величина зоны подавления фитопатогсна: «-» - отсутствует, «+»- до 5 мм, «++» - 5-15 <<++ъ>. ^ee 15мм; ферменгапшная активность: «Р» - протеаза, «А» - амилаза, «L» - липаза, «С» - целлю-

лаза.

Таблица 3. Стимулирующий эффект, оказываемый изучаемыми штаммами бактерий, на сельскохозяйственные растения in vitro._

Вариант

Контроль (без обработки)

Pseudomonas chlororaphis 228(ко1прольный штамм из коллекции ВНИИСХМ)

Pseudomonas brennen RM14B RpooeRFllD Р. (кр/ел/RF13H P.fluorescens RF14J Serratia plymuthica AM24A Flavobacterium sp. RM14A P. sp. RF14D Collimonas sp. RF14C HCPps

Средняя длина корешка, мм

13.1

17.2

18,8 28,5* 31,1* 24,8 30,0* 13,8 23,6 22,5 123

Общая сырая масса проростка, мг

50,5 51,3

55.0 593 64,7* 59,6 69,4*

50.1 59,6 68,4* 10,5

Примечание. »Различия достоверны на уровне HCP«

3.4. Эндофитные бактерии сфагновых мхов, как активные колонизаторы ризосферы сельскохозяйственных культур, стимуляторы роста и фитопротекторы.

3.4.1. Приживаемость бактериальных штаммов. Вопрос о способности штаммов эндофитных бактерий, выделенных из тканей сфагновых мхов, успешно колонизировать ризосферу высших растений, имеющих сельскохозяйственное значение, являлся основной особенностью данных исследований. От решения этой проблемы зависело, насколько эффективны будут штаммы, обладающие повышенным ростстимулирую-щим и антагонистическим потенциалом против фигопатогенов, в условиях растительно-микробной системы.

В результате проведенных исследований было показано, что5 перспективных штаммов эндофитных бактерий имели высокий колонизационный потенциал (табл. 4). Тестируемые штаммы хорошо приживались и в ризосфере и на корнях пшеницы, а так же на поверхности корней томатов, не уступая, а в ряде вариантов превосходя соответствующие показатели стандартного штамма Р. chlororaphis RR228. Максимальные значения приживаемости на корнях, как пшеницы, так и томатов были зарегистрированы для штаммов Serratia plymuthica АМ24А и Stenotrophomonas rhizophila RF13C, что превосходило приживаемость стандартного штамма. Численность других штаммов эндофитных бактерий была высока и сопоставима с показателями колонизационной активности стандартного штамма. Средняя численность всех интродуцированных штаммов эндофитных бактерий на корнях томатов в несколько раз превосходила этот показатель на корнях пшеницы.

По данным эпилюминесцентной микроскопии, штаммы бактерий Serratia plymuthica АМ24А, Flavobacterium saccharophilum RM14A, Pseudomonas brennen RM14B, Pseudomons poae RF11D, Collimonas sp. RM14C активно колонизировали поверхность корня томатов (рис. 6), располагаясь в виде микроколоний или биопленок, направленных вдоль оси корня. Было отмечено, что характерной особенностью формирования микроколоний является их локализация в стыках клеток ризодермы.

Таблица 4. Приживаемость типовых штаммов эндофитных бактерий сфагновых мхов на корнях пшеницы и томатов.

Штамм Количество бактерий, 105 КОЕ / растение пшеницы Количество бактерий, 105 КОЕ / растение томатов

Ризосфера Корень

Pseudomonas chlororaphis RR228 (контроль- 67,0 8,2 19,5

ный штамм из коллекции BIМИСХМ)

Serratia plymuthica АМ24А 72,0 102 58,9*

Pseudomonas роае RF11D 56,0 4,6 30,2

Flavobacterium sp. RM14A 50,2 8,0 10,6

P. fluorescens RF13H 102,0* 8,6 4,3

Stenotrophomonas rhizophila RF13C 1093* 15,5* 123,3*

HCP« 32,7 5,6 203

Примечание. 'Различия достоверны на уровне HCP«

^--— ....

, f ' ШШ!

- дав^""*-*'

И V«Ki»?.< -Vi' Ф* в

Рисунок 6.

изучаемых

дофитных

Локализация штаммов эн-бактерий на поверхности корней томатов при помощи флуоресцентной in situ гибридизации и эпилюминесцент-ной микроскопии. А. -Общий вид корня томатов, микроколонии бактерий Pseudomonas роае RF1Ю располагаются вдоль корня. Масштабная линейка - 50 мкм. В. - Микроколонии и отдельные клетки Pseudomonas роае RF11D на поверхности корня томатов. Масштабная линейка - 3 мкм.

При этом, колонии бактерий были вытянуты вдоль продольной оси корня, залегая довольно глубоко в местах соприкосновения растительных клеток. Единичные клетки бактерий обнаружены на поверхности корневых волосков, при этом их количество было значительно меньше, чем непосредственно на поверхности ризодермы.

3.4.2, Ростстимулируюшая активность бактериальных штаммов. Ростсти-мулирующий эффект двух штаммов бактерий Serratia plymuthica АМ24А и Pseudomonas asplenii RF13H был показан в условиях микровегетационного эксперимента на растениях редиса Raphanus sativus L. var. radicula. Обработка семян редиса бактериальной суспензией с титром 10' КОЕ/мл оказала положительное влияние на рост и развитие растений, обеспечив прибавку как средней массы корнеплодов, так и зеленой массы. Так, штамм Р. asplenii RF13H обеспечил прибавку средней сырой массы корнеплодов на 25%, штамм S. plymuthica АМ24А - на 40% (табл. 5). Результаты микровегетационного эксперимента на растениях томатов Solanum lycopersicum показали стимулирующий эффект исследуемых штаммов эндофитных бактерий, заключавшийся в увеличении надземной массы растений (табл. 6). Так, наибольшую эффективность в данном эксперименте продемонстрировали штаммы Pseudomonas brennen RM14B, Р. asplenii RF13H, P.fluorescens RF14J, обеспечившие существенное увеличение надземной массы, превосходящее этот показатель для стандартного штамма Р. chlororaphis RR228.

растениях редиса с. дуро в уел Вариант ЭВИЯА MHKputsci ciauHunriui и Сред няя масса корнеплодов, г Средняя масса зеленой части, г

Контроль Serratia plymutica АМ24А Pseudomonas asplenii RF13H HCPm 7 8 10,9 (+40%)* 9,8 (+25%) 23 24,6 34,9 (+41%)* 29,0 (+17,9%) 63

Примечание. 'Различия достоверны на уровне НСР<

Таблица 6. Стимулирующий эффект исследуемых штаммов эндофитных бактерий на

растениях томатов с. Персей в условиях микровегетационного опыта._

г—--Стимуляция в условиях микровегеташонного экспери

Штамм

Контроль (без обработай) Pseudomonas chlororaphis RR228 (контрольный ипамм из коллекции ВНИИСХМ) Pseudomonas brennen RM14В Pseudomonas роае RF11D Pseudomonas asplenii RF]3H Pseudomonasfluorescens RF14J Serratia plymuihica AM24A Bavobacterium sp. RM14A Stenotrophomonas rhizophila RF13C Collimonas sp. RF14C HCP«

мечта

Средняя сырая масса растения томата, г_

194,1

310,7* 374,2* 275,9 316,6* 321,2* 229,7 252,1 305,9* 2433 96,0

Средняя сухая масса растения томата, г

20,6

24.6 31,1* 23,3 27,8* 29,2*

20.7

21Л 262* 233 4,7

Примечание. »Различия достоверны на уровне НСРм

3.43. Бноконтрольная активность бактериальных штаммов. В микровегетационном эксперименте по биоконтролю корневой гнили пшеницы, вызванной Fusarium culmorum, было показано, что инокуляция семян пшеницы бактериями Р. asplenii RF13H достоверно снижает заболеваемость растений с 90 до 40% (табл. 7).

Таблица 7. Снижение заболеваемости пшеницы корневой гнилью, вызванной F.

Вариант Средняя длина побега, мм Средняя длина корня, мм Всхожесть, % Количество пораженных растений, %

Контроль P. asplenii RF13H Fusarium culmorum Fusarium culmorum + P. asplenii RF13H НСРсв 14,27 14,40 6,78* 10,10* 236 6,85 7,04 5,91 6,60 132 98±2,5 95±4,0 90+53 96±3,6 5049,1** 0 90±53 40±8,9

**внутрисеменная инфекция.

В условиях микровегетационного опыта тестировалось антагонистическое действие штаммов различного таксономического положения (Flavobacterium sp. RM14A, S. plymuthica AM24A, P. asplenii RF13H), продемонстрировавших наибольшую бактерицидную активность in vitro против фитопатогена Pseudomonas syringae pv. tomato,

возбудителя черной пятнистости томатов. Инокуляция семян и последующее опрыскивание 7-и дневных растений бактериальной суспензией штаммов-антагонистов приводило к заметному снижению численности растений с симптомами черной пятнистости (табл. 8.). Инокуляция томатов штаммами 5. р1утШЫса АМ24А и Р. сяр1епи М^ЗН также снижало численность пораженных растений до 11,2 и 15,9 % соответственно.

Таблица 8. Снижение заболеваемости томатов черной пятнистостью при инокуляции изучаемыми штаммами-антагонистами.__

Вариант Количество растений, пораженных черной пятнистостью, %

Контроль (патогенный фон P. syringae pv. tomato) Обработка семян и опрыскивание бактериальной суспензией Р. asplenii RF13H + патогенный фон P. syringae pv. tomato Обработка семян и опрыскивание бактериальной суспензией S. plymuthica АМ24А + патогенный фон P. syringae pv. tomato Обработка семян и опрыскивание бактериальной суспензией F. sp. RM14A + патогенный фон P. syringae pv. tomato 24,4±7,8 15,9±6,7 11,2±5,8 9,7±5,4

3.5. Наработка и апробация лабораторного образца микробиологического препарата на основе эндофитных бактерий сфагновых мхов.

С использованием биореактора «Торнадо» с контролируемыми параметрами культивирования, были отработаны технологические параметры культивирования четырех перспективных штаммов эндофитных бактерий. В качестве оптимальной среды для получения бактериальной суспензии выбрана среда на основе отрубей, режим культивирования составлял 48 ч. Основные параметры культивирования: парциальное давление кислорода в среде - 23,5 кПа, температура 30°С, показатель pH питательной среды -7,0. Средняя численность клеток получаемой бактериальной суспензии составляла- 15x10'КОЕ/мл.

Лабораторные образцы микробиологических препаратов на основе перспективных штаммов эндофитных бактерий были апробированы в независимых полевых испытаниях на базе Карабалыкской сельскохозяйственной опытной станции (Республика Казахстан) в 2012 году на масличных культурах: лен и подсолнечник. В результате проведенных испытаний было показано, что все изучаемые штаммы эндофитных бактерий достоверно увеличили урожай зерна по сравнению с неинокулированным контролем. Однако, максимальная прибавка урожая зерна была получена в варианте со штаммом Pseudomonas asplenii RF13H: лен масличный - 1,5 ц/га, подсолнечник масличный - 3,8 ц/га.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что эндофитные бактериальные сообщества локализуются внутри тканей сфагновых мхов S.fallax и S. magellanicum широкого географического происхождения (Австрийские Альпы, Ленинградская обл., Западная Сибирь), располагаясь одиночно или в виде микроколоний внутри гиалоцитов растения-хозяина, часто в виде многокомпонентных ассоциаций, объединяющих представителей Alpha-, Beta-, Gamma- протеобактерий, цианобактерий, дрожжей, грибов.

2. Установлено, что доминирующими таксономическими группировками, ассоциированными со сфагновыми мхами различного географического происхожде-

ния, являются представители Pseudomonadaceae , численность которых составляет до 50% всей гетеротрофной микрофлоры, а также присутствуют субдоминантные компоненты семейств Flavobacteriaceae, Oxalobacíeraceae, Burkholderiaceae, Entero-bacteriaceae, Bacillaceae, Sphingobacteriaceae и ряд других.

3. Показано, что сфагновые мхи являются депозитарием биотехнологически-ценных бактерий. Из 400 выделенных изолятов -240 штаммов обладали фунгицид-ной и 120 штаммов бактерицидной активностью против широкого спектра фитопа-тогенных микроорганизмов, более 100 штаммов были способны продуцировать ИУК и ее производные, что обеспечивало биоконтрольные и ростстимулирующие эффекты в процессе функционирования симбиоза между сфагновыми мхами и эн-дофитными бактериями, населяющими их ткани.

4. В результате исследований отобрано 10 перспективных штаммов эндофит-ных бактерий, представителей родов Pseudomonas, Collimonas, Flavobacterium, Serratia, обладающих фунгицидной, бактерицидной, ростстимулирующей, фосфат-мобилизующей, ферментативной активностью для создания на их основе высокоэффективных микробиологических препаратов для растениеводства.

5. В модельных экспериментах показано, что отобранные перспективные штаммы эндофитных бактерий способны активно заселять ризосферу и ризоплану сельскохозяйственных культур. Установлено, что интродуцируемые штаммы активно колонизируют поверхность корней растений, располагаясь в виде микроколоний или биопленок, плотно залегая в стыки клеток эпидермиса, направленных вдоль продольной оси. Их численность сопоставима или превосходит численность стандартного штамма, используемого для производства микробиологического препарата, составляя 106-107 КОЕ на 1 мм длинны корня.

6. Эффективность перспективных штаммов эндофитных бактерий Flavobacterium sp. RM14A, Pseudomonas brenneri RM14B, Pseudomonas asplenii RF13H составляла 20-50% в вегетационных опытах и 30^13% в полевых опытах.

7. Изучены технологические параметры культивирования четырех перспективных штаммов эндофитных бактерий. В качестве оптимальной среды для получения лабораторных образцов микробиологических препаратов использована среда на основе отрубей, парциальное давление кислорода в среде - 23,5 кПа, температура 30°С, показатель pH питательной среды -7.0, что обеспечивало титр получаемой бактериальной суспензии 1,50хЮ10 КОЕ/мл.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Чеботарь В. К., Щербаков А. В., Чижевская Е. П., Петров В. Б. Влияние засоления и тяжелых металлов на ростстимулирующую и антагонистическую активность почвенных бактерий и перспективы использования микроорганизмов для биоремедиации почв (аналитический обзор) // Достижения науки и техники АПК. 2011. №7. С. 28-31.

2. Канарская 3. А., Канарский А. В., Дулькин Д. А., Семенов Э. И., Чеботарь В. К., Щербаков А. В. Биоконверсия сточных вод производства бумаги с получением бактериальных полисахоридных энтеросорбентов микотоксинов // Вестник Казанского Технологического университета. 2012. Т.15. №14. С.186-189.

3. Щербаков А. В., Брагина А. В., Кузьмина Е. Ю., Берг К., Мунтян А. Н., Макарова Н. М., Мальфанова Н. В., Кардинале М., Берг Г., Чеботарь В. К., Тихо-

новин И. А. Эндофитные бактерии сфагновых мхов как перспективные объекты сельскохозяйственной микробиологии // Микробиология. 2013. Т.82. №3. С.312-322.

4. Щербаков А.В., Заплаткин А.Н., Чеботарь В.К.. Эндофитные бактерии, населяющие семена пшеницы, перспективные продуценты микробных препаратов для сельского хозяйства // Достижения науки и техники АПК. 2013. №7. С35-38.

5. Гончар Е.Н., Щербаков А.В., Лопатько К.Г., Гончар Л.Н., Чеботарь

B.К., Каленская С.М. Повышение эффективности микробно-растительного симбиоза путем создания композиционных биопрепаратов с использованием нано-частиц биогенных металлов // Достижения науки и техники АПК. 2013. №12.

C.30-35.

6. Щербаков А.В., Русакова И.В., Орлова О.В., Воробьев Н.И., Свиридова О.В., Щербакова Е.Н., Чеботарь В.К. Аэробное целлюлюлозолитическое сообщество ассоциантов сфагнового мха Sphagnum fallax как основа в процессах деструкции пожнивных остатков // Сельскохозяйственная биология. 2014. №1. С.54-62.

Статьи в ведущих рецензируемых иностранных журналах

7. Shcherbakov А. V., Krikovtseva А. V., Kuzmina Е. Yu., Berg С., Malfanova N. V., Cardinale M., Berg G., Chebotar V. K.,Tikhonovich I. A. Endophytic and epiphytic bacteria associated with Sphagnum mosses as perspective objects for agricultural biotechnology // IOBCAVPRS Bulletin. 2012. V. 78. P. 165-171.

8. Bragina A., Berg C„ Cardinale M., Shcherbakov A., Chebotar V., Berg. G. Sphagnum mosses harbour highly specific bacterial diversity during their whole lifecy-cle // The ISME Journal. 2012. V. 6. No. 4. P. 802-813.

9. Malfanova N., Kamilova F., Validov S., Shcherbakov A., Chebotar V., Tikhonovich I., Lugtenberg B. Characterization of Bacillus subtilis HC8, a novel plant-beneficial endophytic strain from giant hogweed // Microbial Biotechnology. 2011. V.4. P.523-532.

Глава в книге

Shcherbakov A.V., Kuzmina E.Yu., Lapshina E.D., Bragina A., Berg C., Berg G., Shcherbakova E.N., Chebotar V. K., Tikhonovich I. A.. Endophytic Bacteria Associated with Sphagnum Mosses: Ecological Diversity and Application for Agricultural Microbiology / In book: Moss: Classification, Development and Growth and Functional Role in Ecosystems // N.Y.: Nova Publishers, 2014. - 245 p. - ISBN 978-1163117-396-7

Патент

№2495119 (зарег. 10 окт. 2013 г.) ((Штамм бактерий Bacillus subtilis 8А в качестве средства повышения продуктивности растений и их защиты от фитопатогенных микроорганизмов» / Чеботарь В.К., Михеева М.А., Чижевская Е.П., Щербаков А.В., Петров В.Б., Быкова Н.В., Орлова Н.А., Темнова О.В.

Публикации в прочих изданиях 1. Щербаков А. В. Ферментативная активность аридных почв Астраханской области // Фундаментальные аспекты биологии в решении актуальных экологических проблем: материалы международной научно-практической конференции, - Астрахань, 2008.- 344с

2. Щербаков А. В. Ферментативная активность аридных почв Астраханской области // Материалы пятого съезда общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова: Москва, 2-4 декабря 2008 г. / Под. Ред. Р. Г. Василова. - М.: ИАЦ, 2008. -408с.

3. Чеботарь В. К., Щербаков А. В., Фадеева М. А., Мальфанова Н. В., Ерофеев С. В., Чижевская Е. П., Гагкаева Т. Ю., Гаврилова О. П., Филипас А. С., Бовдаренко А. М., Тарасов A. JI. Выявление взаимодействия токсигенных грибов и эвдофитных бактерий в зерне пшеницы для создания способов борьбы с токсигенными инфекциями и получения высококачественных продуктов питания. // Материалы Всероссийской научной конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в агропромышленном комплексе России», 14-15 апреля 2010 г. М.:2010. С.35-39.

4. Щербаков А.В., Кузьмина Е. Ю., Мунгян А.Н., Чеботарь В.К. Микроорга-низмы-ассоцианты сфагновых мхов как перспективные объекты сельскохозяйственной микробиологии. // 14-ая Путинская международная школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 19-23 апреля 2010 года). Сборник тезисов. Пущино, 2010. T.I.С.306.

5. Shcherbakov Л., Kuzmina Е., Chebotar V. Microorganisms associated with Sphagnum mosses as perspective objects for agricultural microbiology. // Materials of conference "Biological control of fungal and bacterial plant pathogens (June 7-10,2010, Graz, Austria)". Graz, Austria, 2010. P.79.

6. Fadeeva M., Shcherbakov A^ Chebotar V. Study of interaction between toxigenic fungi and endophytic bacteria in the wheat grain for development of the methods for control of toxigenic infections and production of high quality foodstuffs. // Materials of conference "Biological control of fungal and bacterial plant pathogens (June 7-10,2010, Graz, Austria)". Graz, Austria, 2010. P.80.

7. Shcherbakov A., Kuzmina E., Chebotar V. Microorganisms associated with Sphagnum mosses as perspective objects for agricultural microbiology. // Materials of PhD course and minisymposium: "Adaptation to Climate Change in the Baltic Sea Region: Contributions from Plant and Microbial Biotechnology"(Juty 12-17, 2010, Mikkeli, Finland). Helsinki, Finland, 2010. P. 70.

8. Щербаков А. В., Брагина А. В., Кузьмина E. Ю., Berg С., Malfanova N. V., Cardinale M., Berg G., Чеботарь В. К, Тихонович И. А. Перспективы использования эпи- и эвдофитных бактерий-ассоциантов сфагновых мхов в сельскохозяйственной биотехнологии. // Бриология: традиции и современность: сборник статей по материалам международной конференции, посвященной 110-летию со дня рождения 3. Н. Смирновой и К И. Ладыженской. 2010. СПб.: Атташе. С.152-156.

9. Щербаков А. В., Кузьмина Е. Ю., Брагина А. В., Берг К., Берг Г., Чеботарь В. К., Тихонович И. А. Изучение таксономической структуры популяций эвдофитных бактерий-ассоциантов сфагновых мхов ленинградской области. // 16-ая Путинская международная школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 16-21 апреля 2012 года). Сборник тезисов. Пущино, 2010. Т.1.С. 52.

10. Shcherbakov А. V., Makarova N. М., Muntyan A. N., Bragina А. V., Berg G., Chebotar V. К., Tikhonovich I. A. Isolation and study of endophytic bacteria from Sphagnum fallax and S. magellanicum mosses with high biocontrol activity and PGPR-properties. // 4 international Conference on Environmental, Industrial and Applied microbiology (Torremoli-nos (Spain), 14-16 September 2011). Book of abstract 2011. P. 54.

11. Shcherbakov A. V., Zaplatkin A. N., Malfanova N. V., Chizhevskaya E. P., Chebotar V. K. A new strains of endophytic and rhizobacteria for plant protection and growth stimu-

lation under condition of high concentration of sodium chloride and heavy metals. // 4 international Conference on Environmental, Industrial and Applied microbiology (Toiremolinos (Spain), 14-16 September 2011). Bookofabstract2011.P. 5.

12. Shcherbakov A. V., Kuzmina E. Yu., Malfanova N. V., Bragina A. V., Berg C., Berg G., Chebotar V. 1С, Tikhonovich I. A. Endophytes of Sphagnum mosses: resources for development high-effective biofeitilizers. // International conference "Current aspects of european endophyte research (Reims (France), 28-30 march 2012)". Book of abstract. 2012. P. 62-63.

13. Chebotar V. K., Shcherbakov A. V., Malfanova N. V., Gagkaeva T. Yu., Gavrilova O. P. Study of interaction between toxigenic fungi and endophytic bacteria in the wheat grain for development of the methods for control of toxigenic infections and production of high quality foodstuffs. // International conference "Current aspects of european endophyte research (Reims (France), 28-30 march 2012)". Book of abstract. 2012. P. 7.

14. Щербаков А. В., Кузьмина E. Ю., Мальфанова H. В., Мунтян А. Н., Брагина

A. В., Берг Г., Чеботарь В. К., Тихонович И. А. Эндофитные бактерии сфагновых мхов: ресурс для создания высокоэффективных биопрепаратов для сельского хозяйства. // Перспективы использования новых форм удобрений, средств защигы и регуляторов роста растений в агротехнологиях сельскохозяйственных культур: Материалы докладов участников 7-ой конференции «Анапа-2012»; Под. Ред. Акад. РАСХН В. Г. Сычева. - М.: ВНИИА. 2012. С. 138-140.

15. Заплаткин А. Н., Щербаков А. В., Мальфанова Н. В., Чеботарь В. К., Чижевская Е. П. Применение новых штаммов эндофитных бактерий для минимизации стресса сельскохозяйственных растений в условиях засоления почв и загрязнения тяжелыми металлами. // Перспективы использования новых форм удобрений, средств защиты и регуляторов роста растений в агротехнологиях сельскохозяйственных культур: Материалы докладов участников 7-ой конференции «Анапа-2012»; Под. Ред. Акад. РАСХН

B. Г. Сычева. - М.: ВНИИА. 2012. С. 61-62.

16. Shcherbakov A. V4 Kuzmina Е. Yu., Bragina А. V., Muntian A. N., Berg С., Berg G., Chebotar V. К., Tikhonovich I. A. The endophytic bacteria associated with sphagnum mosses as perspective objects for agricultural microbiology. // International bryological conference dedicated to 100 year anniversary of R. N. Schiljakov. Apatity, Murmansk Province, 24-26* June 2012. Book of abstract 2012. P. 69-71.

17. Shcherbakov A., Kuzmina E., Malfanova N., Brgina A., Berg C., Berg G., Chebotar V. Biodiversity of endophytes from Sphagnum mosses collected from bogs in Russia and Austria. // International conference "Endophytes: from discovery to application". (Fondazione Edmund Mach, Italy, 14-16 November 2012). Book of abstract 2012. P. 52.

18. Chebotar V., Zaplatkin A., Shcherbakov A., Barcheva A., Malfanova N. Microbiological preparation on the basis of of endophytes for bioremediation of polluted and salinated soils. // International conference "Endophytes: from discovery to application". (Fondazione Edmund Mach, Italy, 14-16 November 2012). Book of abstract. 2012. P. 22.

Научное издание. РЕО-печать ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ Лицензия ПЛД № 69-253. Подписано к печати 30 июня 2014 г., тир. 100 экз.