Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА ПРИ СОЗРЕВАНИИ ЗЕРНА У НЕКОТОРЫХ МУТАНТНЫХ ФОРМ КУКУРУЗЫ

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА ПРИ СОЗРЕВАНИИ ЗЕРНА У НЕКОТОРЫХ МУТАНТНЫХ ФОРМ КУКУРУЗЫ"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРОПРОМЫШЛЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

'¿"2/Г -

> МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА

И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи ШЕВЧЕНКО Наталья Петровна

УДК 581.19 (018) : 547.963

особенности белкового обмена при созревании зерна у некоторых мутантных форм кукурузы

Специальность — 03.00.12 — физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1986

".■с/

л-

/ *

С Г ¿Р/ССЫ ССГ С. С-

ГС--'

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте 'биологии Днепропетровского государственного университета им. 300-летия воссоединения Украины с Россией.

Научный руководитель — кандидат биологических наук, доцент А. Н. Винниченко.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А. Н. Павлов, кандидат биологических наук В. Ф. Воло-буева.

Ведущее учреждение — Всесоюзный ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени селекционно-генетический институт.

Зашита диссертации состоится 1986 г.

в «/уДР час. на заседании специализированного Совета Д 120.35.07 при Московской ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Адрес: 127550, Москва, И-550, Тимирязевская ул., 49, корп. 8, Ученый совет ТСХА.

Автореферат разослан . . 1986 г.

Ученый секретарь мг специализированного Совета

. н

-41

М. Н. Кондратьев

(

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема производства белка относится к числу крупнейших проблем в области растениеводства и касается обеспечения населения высококачественными продуктами питания и улучшения сбалансированности кормовых рационов в животноводстве.

.-■- Кукуруза /является ведущей кормовой культурой. По -данным ФАО, за счет нее потребляется 20 млн. т белка в год, в том числе 2,0—2,2 млн. т в нашей стране. Удельный вес кукурузы среди фуражных культур составляет 28%, но из-за низкого содержания белка в ее. зерне (9—11%) и несбалансированности аминокислотного состава питательная ценность кукурузы недостаточно высока.

Наиболее значительные успехи в повышении содержания белка в зерне -кукурузы достигнуты селекционным путем. Вместе с-тем новые-формы отличаются неудовлетворительной сбалансированностью белковых фракций и аминокислот, ■низкой продуктивностью.

Важным стимулом в .развитии селекции на качество белка явилось открытие мутантного гена опейк-2, влияющего на белковый комплекс зерна кукурузы. Однако особенности воздействия^ гена с учетом доз в эндосперме, динамики развития зерна, состава фракций, субфракций и других -компонентов белка изучены недостаточно. В связи с этим •значительный интерес для практической селекции по созданию высоколизиновых форм кукурузы" лредставляет изучение особенностей белкового обмена в динамике формирования и созревания зерна кукурузы, качественной и

- количественной характеристики белков под действием ре. цессива опейк-2. '

Цель и задачи исследований. Работа посвящена изуче-

- нию особенностей изменения белкового комплекса и его отдельных фракций в процессе созревания зерновок в зависимости от наличия одной, двух и трех доз гена опейк-2 в «связи с познанием теоретических основ и разработкой практических рекомендаций по селекции кукурузы на качество белка. - .

НАУЧНАЯ Б,\БЛ. Моск. свльсксх«'г.

141Ж I/ »

^НТРД/ъЙля--

МАЯ в;,5Л.1 ОТЕКА

акадомии

В основные задачи работы входило:

1. Определить специфику накопления сухого вещества и общего белка в созревающей зерновке и влияние на эти параметры одной, двух и трех доз гена опейк-2. »

2. Изучить особенности формирования белкового комплекса — альбуминов, глобулинов, зеинов, истинных глюте-линов, зеино- и тлютелиноподобных белков эндосперма зерна кукурузы в процессе его развития под действием различных доз мутантиого гена.

3. Исследовать характер изменения _ аминокислотного, компонентного и субкомпонентного составов" фракций белков гетеро- и гомозиготного по гену опейк-2 эндоспермов"" зерна при созревании.

4. Дать характеристику влияния доз гена опейк-2 на фракционный состав белка и содержание лизина в эндосперме зрелого зерна кукурузы различных генотипов.

Научная новизна. Впервые удалось дать характеристику физиолого-биохимических процессов, происходящих в эндосперме созревающего зерна в зависимости от .доз хмутантг ного гена: проведено детальное изучение изменения белкового комплекса, его фракционного .состава, аминокислотного, компонентного и субкомпонентного составов отдельных фракций'белка. " ____ : . -:.

Установлено, что накопление сухого вещества и общего белка в* 'зерне не носит стабильного характера и определяется как дозой гена опейк-2, так и генотипом исходной линии.

(Показано, что соотношение некоторых белковых фракций ондосперма' зерна находите^ в' прямой^зависимости от "доз'мутантиого гена. С увеличением" дозы гена... опейк-2 происходит возрастание количества истинных глютелинов, альбуминов и снижение зеиновой фракции. Содержание глобулинов, зеино-' и глютелиноподобных белков остается на уровне оригинальных линий. Изменение аминограмдш незеиновых белков происходит только при гомозиготном; состоянии гена опейк-2 в эндосперме. :

Установлено, что введение гена опейк-2 в генотип эндосперма обычной кукурузы только в трех дозах обусловливает редукцию биосинтеза отдельных субкомпонентов 'зеи-на в* нейтральной области рН (рН 7,25—7,89), 'сокращает концентрацию пептидов в зоне рН 6,63—7,12 уже на ранних фазах развития зерновки. В процессе созревания гетерогенность зеинов возрастает за счет появления субъединиц с .р1 6,73 (линия К168) и с р1 7,80; 7,41; 7,97 '(линия Ш{9).

Практическая ценность. Физиолого-биохимическое изучение^ белков эндосперма кукурузы с 'различными . . по; гену опейк-2 генотипами позволило выявить основные законо-

мерности формирования качественных показателей урожая: белковых фракций и их амшюкислотного •состава, которые могут быть использованы при дальнейшей разработке основ целенаправленной селекции при создании высоколизи-НОВОЙ кукурузы, : . . :

Предложены ¡методы оценкн и отбора мутантных форм кукурузы .на качество белка по физиолого-биохимнческим параметрам ¿и физико-химическим свойствам белков. Зерно мутантов в 'стадии восковой спелости рекомендовано для консервирования в виде зерно-стержневой смеси и широкого использования в животноводстве.

Апробация, работы. Результаты работы доложены и положительно, оценены на III съезде всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н. И. Вавилова (Ленинград, 1977 г.), II и III Всесоюзных научно-технических конференциях молодых. ученых по проблемам кукурузы (Днепропетровск,:: 1978, 1981 гг.), итоговых .научных конференциях ДГУ '(Днепропетровск, 1978, 1979 гг.), V Всесоюзном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов» (Москва, 1983 г.), II Всесоюзном координационном •совещании по физиологии и биохимии кукурузы (Днепропетровск, 1984 г.), на научных семинарах НИИ биологии ДГУ, на объединенном заседании отдела молекулярной биологин и Совета НИИ биологии ДГУ, на объединенном заседании кафедры физиологии растений и кафедры генетики, селекции и.; семеноводства -- полевых культур ТСХА (Москва, 1986 г.) . - > - ' -

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 233 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы,-главы-по материалу и методам исследований, шести глав с анализом экспериментальных материалов, заключения,-выводов, практических рекомендаций и приложения. В работе 17 таблиц и 15 рисунков, 37 таблиц в приложении. Список использованной литературы включа-. ет 256 наименований, в том числе 138 на иностранном языке.

Материал и методы исследований. Исследования по теме выполнялись в НИИ биологии Днепропетровского государственного университета в 1975—1980 гг. Полевые опыты проводились на Опытном хозяйстве ВНИИ кукурузы (г. Днепропетровск).

Опыление початков производили под пергаментными изоляторами во время цветения мужских соцветий. Различные дозы гена опейк-2 получены при внутрилннейном екре-.щивании ( + + + — исходная форма, +!+02 — одна,

0202+ — две, 020202 — три дозы гена опейк-2 в эидо-

сперме). __________: . .. ,

Отбор проб .зерна проводили в фазы: формирования. (15 дней), молочной (22 и 29 дней), молочно-восковой (36 дней), восковой (43 дня), полной спелости (50 дней после

опыления). .................

Для биохимических исследований использовали лиофиль-но высушенный эндосперм. Белки получали из обезжирен-: ной петролешшм эфиром муки. Содержание общего белка' определялось полумакрометодом Кьельдаля. .Белковые фракции выделялись по принципу их избирательной,растворимости в растворителях по методу Ландрн и Моро в''модификации относительно альбуминов. 'Количественную оцё'н-' ку фракций белкового комплекса проводили по методу Лоу-ри в модификации с использованием дезоксихолата натрия и 24% раствора ТХУ для осаждения белка. Аминокислотный состав белков определяли на аминокислотном анализаторе ААА881 .(ЧССР).

Гетерогенность белковых фракций изучалась .методом электрофореза в полиакриламидном" геле (Конарев В. ¡Г. и др., 1969) и методом изоэлектрофокусирования на пластинках с <ПААГ на приборе «Мультифор» , (фирмы. ЛКБ). Пластину с гелем для п ол и м ер из а ции облучали ультрафиолетовой лампой 2114. Препарат; зенна готовили,: растворяя его в 8М мочевине с добавлением 2-меркаптоэтанола. Изо-электрофокусирование проводили в течение 11 час. при напряжении 1400 в и силе тока 4,9 ма (Неудачин В. П., 1979; Краснобаев В^А.,. 1979). Фиксировали и окрашивали белки "в 10% 'растворе ТХУ в течение .3. час.-Денситометри-рование изоэлектрофореграмм осуществляли :.на:;приборе "«СИготовкап 200» при 440 им (ЧССР).

Все анализы проводили в 3—5-кратной повторностн. Статистическая обработка данных 'проведена по Рокнцко-му П. Ф. (1973) и Плохинскому Н. А. (1970).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Накопление сухого вещества и белка в созревающем зерне.

Изучение процесса зернообразования на примере, линий кукурузы 1^168 и их аналогов, переведенных на опейк-2 основу, и у форм с одной и двумя дозами гена показало, что наиболее интенсивное накопление питательных веществ в семенах "изучаемых генотипов линии Ш68 наблюдалось до.восковой, спелости '(табл. 1). Масса зерна обычной формы возросла "в" 6 раз, семян-с одной дозой гена —в 5 раз, . 4 " ' ' '

г ? Л V ■ Таблица 1 Изменение массы 100 зерен, г, и общего белка, %> линий кухурузы И168 и \У/9 с различными по гену опейк-2 генотипами эндосперма при созревании, урожай 1977—1980 гг.__

ДНЯ

после опыле- . 15 22 ' 29 п 36 43 ; 50 Отношение эндо-

к Й . ния .4

в § генотип *8 15 зерно общий белок »3 ♦ »* к % п. а, х а . О) общий белок ¿2. к <» В "3* ц А а я в К § 1 общий белок эндосперм «М II \о 3 эндо- . сперм зародыш, , оболочка сперм : ; зародит

20,15 1,70 13,63 4,53 11,88 8,96 11,33 13,48 11,02 14,66 9,63 15,82 1,48 1,29 10,69 < •

80,04 86,91 92,90 80,91 85,10

19,76 1Д) 13,92 4,52 11,43 8.33 10,73 11,98 10,43 12,69 9,83 15,76 1,11 1,33 • 14,20

79,86 83,97 84,31 77,43 86,36

о 2 ОА+ 17,90 3,70* 12,95 5,95 11,35 8,86 10,67 12,09 9,55 12,82 8,93 . 16,35 1,45 1,05 11,28

82,11 82,57 83,09 82,18 86,51

,о2о2о2 18,58 1,77 10,86 4,17 9,87 8.69 9,34 10,38 8,96 10,53 8,391 10,40 1,36 0,88 7,64

79,58 86,90 83,31 76,47 82,02

.4-+;+ 19,51 1.41 15,13 > 1 .3,30 12,64 7,04 11,98 12,74 11,19 15,39 9,54 18,92 2,27 1,37 ^ -8,33

66,80 71,11 79,18 89,89 84,09

20,09 1,63 16,58 3,61 13,77 6,89 11,56 12,03 10,59 14,95 9,57 21,19 1,98 1,17 • 10,70

О) 70,92 73,38 84,00 81,93 87,20

& ; 18,15 2,10 15,13 3,88 12,66 7,00 11,00 10,81 10.18 ■13,19 9,38 15,54 1,80 1,39 8,63

76,08 77,43 82,27 83,96 82,75

ЛОА 17,89 1,87 13,48 3,64 11,63 6,34 10,83 12,42 9,68 15,01 8,87 •16,97 2,67 1,50 6,36

71,65 74,59 79,51 82,47 80,12

ся *19 дней после опыления.

; — числители — масса задосаерма, г; знаменатель — % эндосперма в зерне.

у высоколизиновой кукурузы — в 5,7 раза. Масса зерна у обычной формы была на 1,7 и 2,5 г выше,с чем у зерна с одной^и двумя дозами гена. К полному созреванию зерно у мутантной формы было на 6% легче, чем у исходной,*5 абсолютная масса зерна с одной и двумя дозамнгенаТв эндосперме была близка к обычной. _ ~

Доля эндосперма возрастает наряду "с увеличением;-аб-, солютной массы зерна до молочно-восковон спелости. обычной формы и.вариантов -с-одной и,-двумя дозами му-' тантного гена. К концу созревания отношение эндосперма к зародышу составляет соответственно 10,7; 14,2; 11,3; 7,6 у обычной линии и у форм с одной, двумя' и тремя дозами1-гена.

У линии увеличение абсолютной массы эндоспермов происходит в ходе всего периода развития зерна, в то время, как у линии Я168 до фазы восковой спелости. Доля эндосперма в зерновках возрастает у всех четырех генотипов'до восковой спелости, затем несколько уменьшается, кроме зерна с одной дозой гена. -С ," - >

Ген опейк-2, как и у линии "И 168, способствует увеличению массы зародыша. ...

Процесс накопления сухого вещества _ в * зерновках1; всех1 четырех генотипов обеих линий ^ имеет одинаковую направленность. Депрессия массы зерна отмечается лишь при трех дозах-тена' опейк-2. Эффект его дозы не носит стабильного .характера и не отражается на накоплении сухого вещества.

Ген опейк-2 при гомозиготном состоянии, и при двух его дозах вызывает ,снижёние~*относительного содержания белка эндосперма-в процессе созревания зерновок. При-одной дозе гена количество белка близко к обычной кукурузе. *.

Резкое уменьшение процентного содержания белка отмечено, в период между формированием зерна и молочной спелостью, что связано с интенсивным приростом сухого вещества созревающей зерновки. Максимальное абсолютное накопление белка, отмечается между фазой, формирования зерна и молочной спелости у всех изучаемых образцов, но скорость его увеличения была у опейк-2 форм ниже, чем у исходных. Темп накопления белка у обычной .и высоколнзиновой линий к концу молочной — началу молочно-воско-вой спелости выравнивается. После этого биосинтез протекает с меньшей интенсивностью по всем генотипам. Таким образом, абсолютное и относительное содержание белка у оиейк-2 форм линии \\'!"9 и И168 ниже, чем у исходных.

В снижении содержания белка эндосперма под влиянием гена опейк-2 определяющее значение имеет генотип ори--" гинальной линии. У мутантного аналога \\!Т9 это снижение проявляется в меньшей степени, чем у аналога I? 168.

15 22 29 36 43 50 15 22 29 36 43 50 15 22 29 36 43 50 15 22 29 36 43 50

■ , Рло.1. Дяяашгса содержзтм отдзлышх белковых фракций при созревании зорна лапа кукурузы Е168, . 5» от вадодяшого бежа, 1977-1979 гг. .

I

- альбуютш

- глобулам

- зеинн

КГ- зелисподсбние

- глютелиноаособяио

- глютелгян

со вертикали - содержите белка по горизонтами! - дна поело сшивная

дня поело опылешш

+ + +

50 1

22 $

35 ^ 1

I

^ 1 -¡в! 1 Г

№ 1! ИНШННШ 1Н1

® 1 в-у&зг£ ш ¡11 .

Е

МИШ1И дщ

11111111'

ШШ11Ш11Ш1П1Ш1ВВМ

шшш

Ж

'ыт' ш'¿»'ли 'в.я'ш'&9 'ея '««^л'еаг ч* 'гсг'ти'т.я "7п ' градзенх рН .. .

+ t +

50 36 22

22 П

Е168

1Ш1Ш!1 иалл

ШПЖПИ

-I—1'"| I"'

I I I <

-I_I ,11.

1Шна ли ив гшшжш

тип и йншиш ■»

50 I 1ЯИН8а ИЯМ Н Я И щи НОШ ! ?-В

тшопп н

грашентрН и' ш «з» дм бот «я «5 «¡г е.ъъ ем ае та

Рао.2. ИЗО - спектры зоивов созрсклсого эоргш ллшё кукурузы и Е168 о разллкшги со гену с-ейк-2 гвноткгмз эндосперма •

II

III

а . • -.WtÉ Í1I ЗМШ' ! i НИ*

V' J / ■ ¿V ' Í ' • . £

V • Il i III i IB i • "1ИПГ

. С'-'». - • . '.'!#. .

a и 0шм. : ; V-'fil ' - - m -

6 ^ 1 J u :

/ , . ' S • - ' - *: - • • ' ^

a» • ^ffi - -nli 1Я 1 шшл ülJD LI

грагаент pSJ"

1У

-11

I

гт

ШЛО

; ts.7i «я su ел к« «к «7» en (ti г.ы по t¿t иг ns ra ?!ч

" ПЖ

. < ®

т i i .fJB Iii Et' ■ i f ■*■■

rucnr?

1№Ш!!1№11!§

градиент f3j",: fJi 4,1 ' i-v's» m «« 's.»'*,)/ css f.» ut' ш гю ■

Ргс.з! - спектра sezsoв jzisíS хуяудгеы: I -WI55; II - A204; III - 0h43; 1У - B37. a - +++; б- 0¿0¿02 " . .

градиент p3j - äsh яеккй WI55, A204 , 0h43; pHXI- SM jaha B37

.. При наличии трех. доз гена отмечается увеличение содержания лизина от 1,8 до 5,0 г на 100 г белка (исходная и опейк-2 форма, соответственно). Возрастает также количество глицина, гистидина, аргинина, аспарагиновой кислоты, снижается содержание глютаминовой кислоты, проли-на, лейцина и феннлаланина. Одна и две дозы гена не оказывают существенного влияния на аминокислотный состав суммарного. белка, кроме некоторого увеличения концентрации лизина;

Накопление и биохимическая характеристика альбуминов - - в процессе созревания зерна

• -Накоплению запасных белков в клетках эндосперма зерна кукурузы, предшествует образование ферментатавно активных белков (рис. 1). Действие мутантного гена проявляется. на" самых ранних фазах развития зерновки в перераспределении белковых фракций в сторону, увеличения синтеза незеиновых белков. По мере созревания зерна относительное содержание альбуминов уменьшается у всех изучаемых- генотипов эндосперма обеих линий. Наиболее резкое снижение зарегистрировано-к 20 дню после опыления. В белковом комплексе эндосперма всех генотипов аль. бум'Ины преобладали до 20 дня после опыления. ..

Одна, две и три дозы гена опейк-2 стимулируют посте-пенное-'повышение"относительного .содержания данных бел-ков'по"сравнению с исходными образцам«: :<г,-

Абсолютное содержание альбуминов у всех "генотипов увеличилось в фазах формирования и молочной спелости зерна. У исходной линии Н168 повышенное количество альбуминов в сравнении с. мутантным зерном сохранилось в течение всего периода созревания. У линии '\У19 аналогичное превышение было на стороне муталта.-

Аминокислотный состав альбуминов созревающего зерна

Для альбуминов эндосперма зрелого зерна обычной линии характерно повышенное содержание лизина (6,6 г), аргинина (7,5 г), аспарагиновой кислоты .(9,0 г), глицина (6,5 г) и валина (7,0 г на 100 г белка).

В фазе формирования зерновки аминограммы альбуминов обычной и высоколизиновой линий очень сходны, но количество лейцина, валина и пролина у обычной формы выше на 6,0; 13,5; 11,5 процента, чем у опейк-2 аналога. В онтогенезе возрастает количество глютаминовой кислоты, пролина, глицина, аланина у исходной линии и ее мутантного - аналога.- В альбуминах обычного зерна увеличивает-

ся содержание изолейцина и лейцина, а количество тирозина и фенилаланнна -снижается.

В процессе созревания происходит изменение аминограм: мы .альбуминов обычной линии и ее высоколизинового аналога. Альбумины эндосперма зерна обычной кукурузы полной спелости содержат больше пролина (на 16,1,%), глицина (на 13,9%), лейцина (16,8%), меньше —тирознна^ала-нина (на 5,9%), чем у опейк-2 аналога. ^^

Альбумины эндосперма кукурузы с одной и двумя до'за'^-ми гена по аминокислотному составу'близки к исходной линии. Тенденция изменения аминограмм. дашгай^фракции в процессе онтогенетического развития сходна у всех Изучаемых генотипов.

Таким образом, аминокислотный состав альбуминов изменяется и в процессе созревания зерна, и под влиянием трех доз гена опейк-2.

Накопление и биохимическая характеристика .глобулинов.

- ..'..¿-в процессе созревания Н^гтк:^

- Направленность динамики относительного содержания глобулинов аналогична динамике накопления'•■альбуминов (рис.1). ■ 7

В зерне линии Я168 с одной ; и - двумя дозами гена опейк-2 относительное и абсолютное количество глобулинов выше, чем у исходного и мутантного образцов. В белковом комплексе зерновок линии \УГ9 глобулины составляют к моменту полной спелости порядка 8% по всем генотипам, а. в. пересчете;на/100;эндоспермов зерно; с^одной^дозой;гена превосходит другие изучаемые формыГ Таким"образомй:ген -опейк-2 неодинаково влияет на специфику синтеза глобулинов у различных линий.

Аминограммы глобулинов исходного и мутантного зерна в период его формирования весьма сходны, за исключением преобладания глютаминовой кислоты и аргинина * у опейк-2 формы. К полной спелостл зерна у обеих форм возрастает содержание аргинина, глицина, аланина, фенилаланина, а количество лизина, аспарагиновой кислоты, пролина, валина, лейцина снижается. В фазе полной спелости глобулины исходной формы содержат больше, чем аналог, треонина, еерина, лейцина и меньше тирозина.

Аминограмма глобулинов эндосперма с одной и двумя дозами гена претерпевает изменения в процессе созревания, оставаясь близкой к обычной кукурузе.

Действие гена опейк-2 затрагивает компонентный состав глобулинов и проявляется при наличии даже одной ,-дозы, однако более ярко, прослеживается в зернах с двумя и тре-

мя дозами. Качественная н количественная характеристики этого процесса неодинаковы. У линии W64A ген вызывает увеличение."количества компонентов глобулинов по мере возрастания доз гена, у линии Wf9 и В37 происходит .неко-^ торая редукция их электрофоретнческого спектра.

Накопление и биохимическая характеристика ^-^-^"зеинов созревающего зерна

Зеиновые; белки появляются в белковом комплексе эндосперма кукурузы в фазе формирования зерна (рис. 1). У ^обычной линии их почти в 4 раза больше, чем у опейк-2 аналога. Интенсивный синтез зеинов у исходных линий Wf9 н R168. продолжается до полной спелости: зерна, у их - опейк-2 форм — до конца молочной, затем тем.пы его снижаются.

Относительное количество зеинов в эндосперме с одной и двумя дозами гена обеих линий на протяжении всего пе-""рйода созревания несколько ниже, чем у обычной кукурузы.

Под влиянием гена оиейк-2 содержание зеина в зерне мутантных „форм снижается у разных линий в 1,7—3,8 раза.

Зеины обладают более стабильным, чем альбумины и глобулины, аминокислотным составом в процессе развития и созревания зерна. У всех четырех образцов независимо от наличия гена в их составе меньше лизина, аргинина, ас-парагиновой.кислоты, глицина, чем глютаминовой кислоты, пролнна,-лейцина; фенилаланина. д -■ -' f Злектрофоретлческие исследования" показали, что действие одной и двух доз гена не затрагивает компонентный состав зеинов, но три дозы оказывают определенное влияние уже на ранних этапах развития зерновки. Зеины исходного зерна линии R168 фазы формирования содержат 35 ■субкомпонентов,;: к- фазе .молочно-восковой спелости гетерогенность „возрастает, синтезируются все субкомпоненты, отмечающиеся вызрел ом зерне. Наибольшее число их фокусируется в области рН 5,54—6,16 и 6,40—7,05. Три дозы гена приводят к редукции изоэлектрофоретического спектра зеинов и области рН 6,63—7,12 (рис. 2).

- :В;зерне линии Wf9 зеины представлены 41 компонентом. В отличие от линии R168, существенных изменений в их •компонентном составе в процессе созревания не отмечается. Изоэлектрофоретический спектр высоколизинового аналога редуцирован относительно исходной линии.

В процессе созревания гетерогенность зеинов мутантно-го аналога усиливается, хотя в фазу полной спелости у него отмечено на 4 компонента меньше, чем у исходной линии. Это свидетельствует о возможной регуляции геном опейк-2 синтеза отдельных компонентов.

Основное .-количество: субкомпонентов -у ряда линий .фокусируется в. области ^рН;;6(04—7,37. Их число колеблется У обычных линий*от.!: 22»:до -34, у опейк-2. аналогов4"—^ от, 16 ! до:32 (рис. 3)._Не:различаются существенно по составу."зе-инов обычная и мутантная-формы. В37 и \№455, хотя отмечается сшжение .концентрациибелка |в отдельных^-зонах;,* Лишь у опёйк-2 формы*:\У155'появляется новый субкомпо-г' нент в области рН-6,25.;* Существенные различия отмечают- •'-■ ся у исходныхглиний: ОН43, А204, -И 168, Wf9 . it , их^ мутант^' ных ; аналогов. У обычной формы ОЬ43:: зарегистрировано 30; зон. против • 27.,у; опёйк-2;.образца, у: линии-А204) с^тремя дозами гена на 5 компонентов меньше/ чем у обычной.'гСо^ кр ащение: - количества, , компонентов у первой линии произо-1 шло за счет зон в области рН 7,37—7,65, у второй'—в области рН 7,30—7,74: ;

^ : НакоплениеЗи биохимическая характеристика

1 -глютёлинов созревающего зерна ---- - -

.^Истинные: глютелины •— :фракция.белка, выделяемая после извлечения зеиноподобного и глютелиноподобного белков;; Относительное ^ содержание их:. в.1динамике1вразвнтняу зерна: исходных- линий сначала несколькогвозрастает^затем" снижается.г.Умутантных «формУ'синтезидет интенсивнее. С конца .фазы, '.молочной !спелости глютелины становятся:.пре-. обладающими, в созревающем зерне обычной ; линии" их содержится 15,4%, у.аналога — на 10% больше (рис. 1). - Абсолютное количество; истинных, глютелиновиудобычных: лнний . \У{91:и.:К168 г возрастает до фазы. восковой' спелости, под: влиянием?гёна:.—.••до^полной'спе^

две дозы гена*: не оказывают, влияния на специфику, спите-': за глютелннов,¿однако , изменяют, их количественную характеристику.: С ; конца) фазы молочной спелости, до, полного созревания зернас количество истинных глютёлинов . у обеих: промежуточных" форм-изменяется: -их становится *"не-" сколько :болъше-'.(на" 5%)';'чем в; зерне исходной линии, .и меньше (на-15%),"чем у мутантной формы. ,. ; Аминограммы: истинных: глютёлинов в процессе созревания зерновки* претерпевают -ряд изменений. У опейк-2 аналога по сравнению '¿"обычной формой больше лизина,-'гис-тидина, глицина' и; меньше глютаминовой кислоты; и ^лейцина. При введении одной, и двух доз гена содержание; аминокислот -данной' фракции: изменяется аналогично '■гомозигот--■ ному мутанту.-'■'"•. ' . •■- ...

-.. •Синтез зеиноподобных белков, которые ранее относили к фракции: глютёлинов;.. у изучаемых генотипов происходит неравномерно. В зерне: исходной, линии Д168 до оконца * мо-

Ш Л * - ' ■.V'4

^.точной спелости их относительное содержание изменяется незначительно. К фазе молочно-восковой спелости количество субфракшш возрастает в 2 раза, а затем стабилизируется к 50 дню после опыления. У мутантной формы на «►« начальных этапах зернообразования зеиноподобные белки накапливаются замедленно, составляя к фазе полной спелости 7,7% от . общего белка, что заметно меньше, чем у исходной,линии: В эндосперме с двумя дозами гена этот процессу обеих линий протекает аналогично. ^¿ргВ абсолютном выражении зеиноподобных белков в зрелом зерне опейк-2 аналогов в 1,5—2 раза меньше, чем у оригинальных линий. Введение одной дозы гена вызывает снижение скорости их биосинтеза в фазах молочной и .мо-лочно-восковой спелости зерна, а двух доз — в фазах мо-лочно-восковой и восковой спелости.

Зеиноподобные белки эндосперма линии И168 изучаемых'генотипов содержат очень мало лизина, гистидина, аргинина, аспарагиновой кислоты и много, аналогично зеинам, глютаминовой кислоты, пролина, лейцина, но в отличие от зеинов, в них больше аргинина, глицина, пролина, мегиони-на, цистина и меньше аланина, лейцина, фенилаланина. Аминокислотный состав зеиноподобных белков исходной и высоколизиновой линий сходен, но опейк-2 аналог превышает обычную форму по количественному содержанию глютаминовой. кислоты :и .уступает по лизину и аланину. В процессе: созревания зерновки изучаемых.. генотипов увеличивается уровень гистидина, тирозина и в 'меньшей мере — аланина, снижается содержание лейцина, валила, глицина. Одна и две дозы не изменяют аминограмму фракции.

Глютелнноподобные белки ранее также относили к фракции глютелннов.. Абсолютное .их содержание у мутант-ньшобразцов обеих линий было в 1,3—1,5 раза меньше, чем в зерне исходных форм. Одна и две дозы не изменяли количество этих белков у обеих линий.

В процессе развития зерновки в глютелйноподобных белках накапливается повышенное количество гистидина, пониженное — аланина. По высокому содержанию глютаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, пролина они сходны со спирторастворимой фракцией. Повышенный уровень лизина, аргинина, валлна и снижение количества аланина, лейцина, фенилаланина указывает на сходство фракции истинных глютелинов и глютелйноподобных белков.

В фазе полной спелости ген опейк-2 вызывает в составе глютелйноподобных белков увеличение содержания лизина, гистидина, аспарагиновой кислоты, глицина и уменьшение глютаминовой кислоты, лейцина, изолейцина. Под влиянием одной и двух доз. гена отмечаются такие же изменения, как

и ^ у, обычно» „кукурузы.^ По г качественным параметрам^они .приближаются:к^сходнойформеГ.::,, . ' .

Влияние: дозы.: гена. опёйк-2 г на 7. качество белков эндосперма?

. В связи, с необходимостью>. более;, глубокого,-'изучения# биохимических; превращений» под-влиянием гена опейк-2|на-/ ми.-проведено исследование, содержания, .общего белка исего> качественного состава в ? эндосперме .зерна линий кукурузы Л204,.ЛУ155,1^64АГ;РЬ43/йОЬ45;^В37£1^их4Мутантных аналогов. ; Ген опейк-2\ в, гомозиготном. состоянии - вызывает, сни-. жениё содержанияс.общегод;белка в зрелом зерне.* Вч<боль-» шей .степени оно отмечается : у . линий <ОЫЗ, 01x45, "№156, "в * меньшей мере~у линии \У64А,В37. Содержание общего, бел-, ка у внутрилинейных' гибридов при гетерозиготном. -состоянии' гена опейк-2 определяется материнским растением. :Ха-* - рактёр; взаимодействия: мутанта? е.- генотипом линии . опреде-, ляется¡особенностями'; генотипа^данной исходной• линииДкж^г »-1 - «Геи. опейк-2; вызывает,; перераспределение-фракций»в * сто-1 •рону снижения}: зеяиа г;И:1'; увеличения ^альбуминов, глобулинов и глютелинов. • ^-г;: ¿„ ... ... " I; .Содержание: альбуминов*, в ^эндосперме,, „ гетерозиготном^ по ;,гену опейк-2;-вЬзрастает^;у,;всех|хизучаемых . .линий;-по сравнению с Обычн0й;кукуру30й.д;~--Д'г" -<-;" . , -^г-Увеличение-количества.; глютелинов " при различных-: дог; зах гена наиболее ярко'наблюдается ©„эндосперме линий ,.ЮЬ43, 01145, и В37. :: ^¿гьО.*. .-

; В зерне .линий Л204 и \\П 55 отмечается постепенное <сни£ женне зейнов^и,; возрастание^ глютелйнов-; ¿при; увеличении ■ Д03Ы-мутанта."№;Н;*г-:-£^^ '

-1-Ген опейк-й вызывает у* различных линий увеличение отношения количества, глютелинов;; к „зенну и общего белка", к зенну. Характером -'этих'« отношений .можно оценивать -с каче? ственный состав запасных белков эндосперма зерна- куку: Рузы... _ \ --С2 ■ . ; "Сг * - „ * '. - - '" - "

'■'Л" .. ^ -Выводы —: : -

'1. Процесс созревания зерновки обычной кукурузной форм "с одной, двумя н^тремя " дозами гена опейк-2 в;;эндо: сперме носит'сходный: характер. Ген опейк-2 влияет на'снит жение массы зерна с;, конца фазы молочной.— молочно-восг ковой-..спелости?/только.¿при „трех его„дозах . в .эндосперме. Степень депрессии, массы зерна, определяется генотипом - ли? нии обычной кукурузы..'.".' . - .2. Содержание . белка^ в гетерозиготном по гену ..олейк-2 эндосперме на всех ; фазах развития в год скрещивания

близко; к материнской форме и определяется ее физнолого-бкохимическими свойствами.

При гомозиготном состоянии гена опейк-2 с фазы молочной спелости снижается концентрация белка в различ: ной .. .мере, что обусловливается генотипом оригинальной линии.

3. В процессе развития зерновок накопление отдельных белковых.фракций в эндосперме характеризуется общей закономерностью и происходит в определенной последователь-ностихнезависимо от изучаемых генотипов кукурузы. В фазе"" формирования белки эндосперма представлены преимущественно альбуминами и глобулинами, содержание которых в процессе созревания снижается. Доля зеинов при этом .увеличивается в разной степени в зависимости от генотипа обычной кукурузы и наличия гена опейк-2.

4. Введение гена опейк-2 в эндосперм обычной кукурузы вызывает резкую трансформацию белкового комплекса. Наличие одной и двух доз мутанта способствует торможению синтеза зеииов уже на ранних этапах развития зерновки. и увеличению количества истинных глютелинов и альбуминов. Наиболее ярко данные изменения отмечаются при трех дозах гена: белковый комплекс эндосперма зрелого зерна опейк-2 аналога в 1,5—2 раза уступает обычным образцам по количеству зеинов и в 2,5—3 раза превышает по содержанию„истинных .глютелинов. Накопление глобулинов, зеино-. и_глютелиноподобных. белков в гетерозиготном эндосперме имеет-сходный характер с исходной.формой.

б. Под влиянием трех доз гена опейк-2'коренным образом изменяется направленность накопления истинных глютелинов независимо от генотипа обычной кукурузы: в процессе созревания у мутантного аналога возрастает доля данной фракции в белковом комплексе,-тогда как у исходных форм отмечается снижение их количества. Характер изменения содержания истинных глютелинов при одной и двух дозах гена опейк-2 близок, а по уровню накопления несколько превышает обычную кукурузу.

.... .6. В процессе созревания изменения аминокислотного -состава отдельных белковых фракций эндосперма с различными" по гену опейк-2 генотипами аналогичны обычной кукурузе и сходны у образцов одинаковых фаз развития. Однако, при развитии зерновки в альбуминах опейк-2 аналога снижается содержание лейцина, валяна и пролина и увеличивается— тирозина и аланина. Аминокислотный состав : зеинов не изменяется под влиянием различных доз гена опейк-2. .

7. Аминокислотный состав истинных глютелинов изме--няется при созревании под влиянием гена опейк-2. В фазе

формирования ;:у,мутанта,: в; данной фракции .. содержится .больше-лизина -И;меньше глютаминовой кислоты и-'лейцина, чем у. о б ы чно й :ку ку р уз ы Под. действием гена опейк-2 1при развитии^ зерна,в:: истинных:;глютелинах происходит ¿увеличение количества..лизина' наряду с ■повышением концентра:-ции треонина и сернна" по сравнению с исходным образцом. Данные хбелкис зрелого ;зерна^мутанта богаче лизином,дгнс-тидином.и глицнном',н;беднее':глютаминовой кислотой: иглей-цином, чем у;оригйнальной:формы. Одна и две дозы£мутан-та; не влияют.'на-содержание'лизина: в истинных ::глюте-линах. ^¿^глгтгдс^Г^'.'а^'.с-. .„¿ч ^.-.¿.^ . ..ам-и^йЬЦуд -8. Наличие однЬй;.н; двух доз гена опейк-2 не оказывает существенного: влияния?на „".субкомпонентный, состав: зеинов,* который ■;.1гзменяется'.'^только яри ---трех дозах в -эндосперме. При гомозиготномг.состоянин : мутантный ген .репрессирует биосинтез отдельных . субъедшшц в нейтральной : зоне рН« (рН' 7,25—7,89)Т; снижает концентрацию пептидов, в области рН .6,63—7,12.-ВЬпроцёссе^созревания гетерогенность зеинов увеличиваетсяпзахсчет ^появления субкомпонентов:,у линии; ^168-с;р1; .6,73 ¿(восковая; спелость) ..и линни[Ш9: с р1ц7,80; .7,41;, и ;7,97Л (молочная-.и"восковая спелость,.:соот-

ветствен1ю).~^..с-х.:-'-./......-

.-*-' 9.- Степень влияния дозы ^гена опейк-2, на фракционный состав белка; и содержание; лизинаэ£ё {Эндосперме зрелого зерна, - изученная г^*на; пр*ймере:! линий . "А204, \У155,.*.АУ64А, ОЬ43, :ОЬ45,^ В37,; А73"!определяется особенностями.;генотипа"^ исходной; формы. ;. При ; гетерозиготном . состоянии:гена л.опейк-2; фиксируется .-уровень" белка, . близкий материнской фррме.;.СиувеличениемсД03ы.гена..'В03растает. количество:ис--тннных ;глютели)10в,-¿альбуминов, ^снижается^.доля'х'зеинов. Содержание* глобулинов,;;зеино-г и^глютелиноподобных^бел-Гков^близко к "обычной кукурузе. _

:: ::Практические рекомендации .: *;: '

" Г. В связи с плеиотропным эффектом. .. действия г гена ,опейк-2, селекционерам /необходимо проводить отбор мутант-Гных^линий кукурузы ..по?.следующим ..параметрам: а) лай-^меньшая депрессия;, сухой г массы ; и общего белка в зерне; ,б)) максимальное возрастание соотношения -незеиновых^бел-/ков^к зеннам;;в) .четко., выраженная*!!.депрессия . субкомпо-Гнёнтного состава зеинов.; (по ИЭФ-спектрам), ,изменение ^количественного..-" содержания;':;, субкомпонентов зеинов:-, лри г_ИЭФ; =г) максималыюе;;изменение ; аминограммы . истинных тлютелинов в сторону повышения содержания незаменимых -аминокислот.-;>. л-.:: . ' -

Г2. .^Изучение; динамики ; накопления -.массы зерна, отдель-

ных;групп, белков и аминокислотного состава позволяет.'рекомендовать для консервирования початков с зерном по ме-тору «corn cob mix» в стадии восковой спелости, когда может быть получен наиболее качественный и питательный ■продукт для кормления животных.

" 3." При переводе самоопыленных линий на высоколизи-новую основу с использованием гена опейк-2 (получение аналогов)селекционерам необходимо учитывать то, что действие-мутантного гена специфически реализуется в зависимости от генотипа исходной линии. В селекционной работе по созданию высоколизиновых гибридов кукурузы необходимо использовать в качестве источников гена опейк-2 формы, гомозиготные по данному гену и проверенные по количеству лизина.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Писанский А. П., Цыганок И. С., Шевченко Н. П. Качество белков зерна эндосиермовых и переведенных на основу опейк-2 линий и гибридов кукурузы. — Вестник с.-х. науки (на укр. яз), № 12, 1975, с. 26—30.

2. Винниченко А. Н., Махно Л. Ю., Поляков А. Е., Шупранова Л. В., Шевченко Н. П. Изучение специфики белка мутантных форм кукурузы с различной степенью насыщения по гену опейк-2. — III съезд Всес. об-ва генетиков л селекционеров им. Н. И. Вавилова (тезисы докл.), Л., 1977, с. 70. -

3. Довгаль Л. И., Коцюбинская Н. П., Шевченко Н. П. Взаимосвязь между активностью нитратредуктазы и содержанием белковых фракций у гибрида ДПГ-50 и его высо-колизинового аналога. — В кн. Вторая Всес. научно-техн. конф. молодых ученых по проблемам кукурузы (тезисы докл.), Днепропетровск, 1978, с. 76—77.

4. Коцюбинская Н. П., Моренец А. А., Довгаль Л. И., Шевченко Н. П., Шупранова Л. В. К вопросу о фракционировании запасных белков кукурузы. — В кн. Вторая Всес. научно-техн. конф. молодых ученых по проблеме кукурузы (тезисы докл.), Днепропетровск, 1978, с. 81—82.

5. Винниченко А. Н., Шевченко Н. П., Шупранова Л. В., Довгаль Л. И. Электрофоретическая характеристика белковых фракций мутантных форм кукурузы. — Укр. ботанич. журнал (на укр. яз.), т. XXXVI, № 4, 1980, с. 95—97.

6. Шевченко Н. П. Влияние гена опейк-2 на фракционный состав и инфракрасную характеристику запасных белков созревающего зерна кукурузы. — В кн. III Всес. научно-техн. конф. молодых ученых по проблеме кукурузы (тезисы докл.) Днепропетровск, 1981, с. 44—45. -

-гс 7у. Шевченко Н.. Л.,: Шупранова Л: В. Генетическая - детерминированность белков;.созревающего зерна кукурузы- с различными по гену опейк-2: генотипам«.— В кн.: Всесоюзный симпозиум : ; «Молекулярные' механизмы - '. генетических процессов» (тезисы докл.). М.-;: 1983, с.\124;. ; • . :

.8. Винниченко°А. Н.,: Шевченко Н. П., Шупранова Л. В., Феденко В. С., Харченко-:В.* И/¡Особенности •биосинтеза -запасных 'белков кукурузы под действием мутантного гена опейк-2. — В кн.: Второе - Всес::: координационное совещание по физиологии.. .и биохимии кукурузы »(тезисы докл.), Днепропетровск,, 1984, с. 99— 100.. . -с... . с

Л-89356,:Л0/1У-8б г.. Объем 1 п. л. Ваказ" 1(163. Тираж:100

Бесплатно