Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

ИЗМЕНЕНИЕ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ЭНДОСПЕРМАЗЕРНА ОБЫЧНОЙ КУКУРУЗЫ И ЕЕ ВЫСОКОЛИЗИНОВОГО АНАЛОГА В ПРОЦЕССЕ СОЗРЕВАНИЯ

ВАК РФ 06.01.04, Агрохимия

Автореферат диссертации по теме "ИЗМЕНЕНИЕ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ЭНДОСПЕРМАЗЕРНА ОБЫЧНОЙ КУКУРУЗЫ И ЕЕ ВЫСОКОЛИЗИНОВОГО АНАЛОГА В ПРОЦЕССЕ СОЗРЕВАНИЯ"

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА СССР

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА . И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА

[ —^ (э /¿3 Яа правах рукописи

Валентина Федоровна ВОЛОБУЕВА

ИЗМЕНЕНИЕ БЕЛКОВОГО КОМПЛЕКСА ЭНДОСПЕРМА ЗЕРНА ОБЫЧНОЙ КУКУРУЗЫ И ЕЕ ВЫСОКОЛИЗИНОВОГО АНАЛОГА В ПРОЦЕССЕ СОЗРЕВАНИЯ

(Специальность — 06.01.04 — агрохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА — 1979

Работа выполнена на -кафедре агрономическое и биологической химии Московской ордена Ленина и ордена-Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии им. К. А. Тимирязева.

Научный руководитель — доктор биологических наук профессор Б. П. Плешков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук А, Б. Вакар, кандидат биологических наук В. Ф. Лысенко.

Ведущее предприятие — Краснодарский научно-исслсдова-.тельскнй институт сельского хозяйства им: П, П, Лукьяненко.

Защита диссертации состоится с ./Р» '¿¿¿О/Ск^ 1979 г. в «/<£ ^^часов на заседании Специализированного совета Д-120.35,02 пр(1 Московской сельскохозяйственной " академии ■ им. К. А. Тимирязева, Адрес: 127550, ггМосква, Н-550, ул. Тимирязевская, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА (корпус 10). :

Автореферат разослан »■ — 1979 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

Л. А. Дорожкина

t

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Увеличение производства растительного белка и повышение его качества является одной из наиболее важных проблем нашего времени, что особенно подчеркивается в решениях XXV съезда КПСС, а также последующих пленумов ЦК КПСС по вопросам сельского хозяйства.

Успешное решение проблемы увеличения производства кормового белка имеет первостепенное значение для дальнейшего развития животноводства. В решениях партии и правительства большая роль в создании прочной кормовой базы для животноводства: отводится кукурузе, которая является одной из основных зернофуражных, культур. Однако по содержанию белка {9—12%) кукуруза значительно уступает зернобобовым и многим зерновым культурам. Кроме того, белки данной культуры имеют низкую биологическую ценность-из-за невысокого содержания лизина, метионина, триптофана.

С открытием биохимического действия мутантлых генов опейк-2 и флаурн-2 (Mertz Е. Т. et al., 1964; Nelson 04.Е, et al., 1965) в селекционной работе с кукурузой определилось.новое направление, связанное с увеличением содержания и улучшением качественного состава белков этой культуры. Успехи селекции в этой области выдвинули задачу глубокого изучения тех изменений, которые происходят при введении гена опейк-2 в генотипы обычной кукурузы. Закономерности формирования и накопления азотистых соединений в белковом комплексе эндосперма зерна кукурузы под влиянием гена опейк-2 изучены недостаточно и их исследование позволит вести направленный отбор гибридных форм кукурузы на основе данной мутации по биохимическим показателям — аминокислотному составу, содержанию и составу отдельных белковых фракций.

Одним из главных факторов повышения продуктивности сельскохозяйственных растений являются удобрения. Данные о влиянии удобрений на содержание и качество белка кукурузы нового типа практически отсутствуют. Изучение этих вопро-

сов явится весьма важным и актуальным для дальнейшего использования высоколизиновой кукурузы в производстве.

Цель н задачи исследовании. Исследования проводились с целью получения более полных теоретических представлений об особенностям проявления действия гена опейк-2 в различных генотипах кукурузы, .характере изменены» в белковом комплексе эндосперма зерна, что необходимо для успешного использования источников гена опейк-2 в селекционной работе.

В задачу наших исследований входило изучение следующих вопросов:

,— содержание азотистых соединений в эндосперме зерна обычной кукурузы ¡и, ее опейк-2 аналога в! процессе, созревания;

— компонентный и аминокислотный состав белкового комплекса эндосперма^ернаобычнойкукурузы л ее опенк-2 ана-логав процессе'созревания;

— влияние:различных условий минерального питания на содержание и: качество белков эндосперма лерна обычной;ку-

. курузыи ее опейк-2 аналога.

Научная:новизна:работы. Научная новизна и значимость <работы заключается в'том, что впервые дана детальная-биохимическая характеристика изменения содержания и качественного состава азотистых соединении в белковом комплексе эн»досперма зерна различных гибридов кукурузы в процессе •созревания под влияниемгена опейк-2.

Установлено, что при внесении разлнчиыхдоз минеральных удобрений н повышении содержания белка генотипнческие различия во фракционном и аминокислотном составе белков эндосперма зерна.обычного гибрлда и его оленк-2 аналогаста-бнльно сохраняются. .

С помощью гель-хроматографии жа сефадексе 0-100"впер-вые'показано, что.в легкорастворнмых белках опейк-2 аналога наибольшее количество Лизина содержится во фракции с мо-лскулярноймассой около 24 тыс., а у обычного гибрида—■ во фракции с молекулярной массой около 45 тыс. Кроме того, введение генаопенк-2 в генотип обычной;кукурузы обуславливает синтез белковых фракций в легкорастворнмых белках; близ-1 кнх по молекулярной массе к белкам обычной кукурузы, но отличающихся от таковых, по электрофорешческнм свойствам: н аминокислотному составу.

Практическая ценность. Результаты исследований могут служить для дальнейшего-перспективного н целенаправленного использования источников гена опейк-2 : в'селекции кукуру-' зыпрн создании сортов, гибридов'и линий кукурузы, сочетающих высокую урожайность и другие хозяйственные признаки с повышенным содержанием белков в зерне к лизина1 вбелках.

Апробация работы. Материалы диссертации . доложены на

научных конференциях ТСХА в 1974 и 1978 годах, а также на Всесоюзном симпозиуме по азотному н белковому обмену растений'в г, Тбилиси в 1978 году.

Объем работы. Диссертация изложенана 156 страницах машинописного текста, включает 37 таблиц н 17 рисунков. Вспомогательный материал представлен в 19 приложениях. Список использованной литературы состоит из 290 наименований, в том числе 141 иностранного.

Объекты ti методы исследований. При изучении влияния гена опеЙк-2 на состав и свойства белков эндосперма зерна кукурузы в процессе созревания в качестве объекта было взято зерно среднеспелого двойного межлинейного гибрида кукурузы Кубанской опытной станции ВИРа — ВИР 42 -f /4-, средне-позднего двойного межлинейного гибрида кукурузы КНИИСХ—Краснодарский 309 +/+, а также зерно их. опейк-2 аналогов — ВИР 42 ói/o2 и Краснодарский 309 о«/ог, выращенных в селекционном питомнике КНИИСХ в одинаковых ночвенно-кл им этических условиях в 1971—1972 гг. Пробы зёрна брали через 15, 20, 25, 30, 35 и 40 дней после опыления, а также в фазу полной спелости, фиксировали жидким азотом, отделяли зерно от початка и лиофильно высушивали. Зерно_ после лиофнлизацпн запаивали в стеклянные ампулы без воз-' духа и хранили в холодильнике, *

Для изучения влияния различного уровня минерального питания на содержание и качество запасных белков зерна кукурузы использовали зерно двойного межлинейного гибрида Краснодарский 303 -f/+ и его опейк-2 аналога — Краснодар-скин 303 o2fo2 с полевого опыта КНИИСХ, заложенного по схеме: без внесения удобрений — контроль; а использованием ограниченных доз удобрений NeoPeoKeo 11 при применении минеральных удобрений в оптимальных количествах (согласно данным КНИИСХ)—N150P530K110, Азот в форме аммиачной селитры вносился под предпосевную культивацию, фосфор ir калий в форме гранулированного суперфосфата н хлористого калия — осенью под вспашку. Почвы опыта — западно-пред-кавказский выщелоченный чернозем. Содержание подвижного фосфора—12—14 мг, обменного калия — 25—27 мг на 100 г почвы. Сумма поглощенных оснований 48 мгэкв на 100 г сухой почвы. Содержание гумуса в пахотном горизонте 3,7—4,3%, валовое содержание азота 0,22—0,33%. Пахотный и подпахотный слон этих почв имеют нейтральную реакцию (рН 6,8), Площадь опытной делянки 60 ма, учетной — 40 м5. Повторность опыта 4-кратная. Сроки посева и уборка кукурузы,, а также агротехника возделывания общепринятая для хозяйства КНИИСХ.

В* связи с тем,-что изучали влияние* гена оиейк-2 на белко-

выи комплекс эндосперма зерна кукурузы, зародыш отделяли от эндосперма. Эндосперм измельчали на мельнице, муку просеивали черед сито с ячейками 0,2 мм и обезжиривали петро-лейным эфиром.

Общий азот определяли мнкрометодом Кьельдаля, белковый и небелковый азот — по Барнштейну. Для пересчета.азота »а белок использовали коэффициент 6,25. Фракционирование, белков проводили по Осборну (Osborn Т., 1892). Суммарные белки извлекали по методике, описанной Б. П. Пдешковым (1968). При изучении компонентного состава водорастворимых и сол ер а створи мы.х белков использовали метод дискового вертикального электрофореза в поли акрила ми дном геле (Raymond S: et al„, 1959; Davis В. J., 1962) с некоторыми изменениями {Сафоноц В. И., Сафонова .М. П., 1969)-. Разделе^ ние проводили как в щелочных, так и в кислых буферных системах {Reisfeld R. Л. et al., 1962). Электрофорез зеина проводили в 7,5%-ном полнакриламидном геле в кислой буферной системе (Catstmpoolas N, et al.. 1968; Конарев В: Г. и др., 1969; Гаврнлюк И. П. и др., 1973). Препараты суммарных белков, альбуминов и глобулинов получали по методике, описанной Б. П. Пдешковым (1968); препараты зеина — по методике, предложенной Конарепым В, Г, и др. (1969) и Паврилкж И1 П. и др. (1973), Гидролиз белков проводили 6н HCl при 105"С в течение 24 часов в запаянных ампулах. Параллельно в препаратах белков определяли общий азот по микрометоду-Кьельдаля. Содержание аминокислот в гидролизатах белков определяли на анализаторе ЛАД-1200Е. Триптофан в суммарных белках определяли отдельно (Плешков Б. П., 1968); Гель-хро-. матографню легкорастворимых белков в 0,005 М фосфатном буфере (pH" 7,4) проводили на сверхтонком сефадексе G-100, используя колонку размером 2,5Х 120 см при t 2—4°С. При набивке колонки, а также се градуировке использовали методы Флоднна (Flodin Р., 1962). Болотиной Т. Т. (1968), Кочетова Г, Л. (1971). Элюирующнм раствором служил .0,5 М NaCl. в 0,005 М фосфатном буфере (pH 7,4), скорость элюции составляла 10 мл/час. В отдельных хроматографических фракциях определяли компонентный и аминокислотный состав бел-, ков по методикам, описанным выше.

Цифровой материал но массе зерна и аминокислотному составу суммарных белков эндосперма зерна кукурузы разных генотипов был обработан статистически с использованием ме*. тода. дисперсионного анализа по программе на ЭВМ: «Мннск-22». Биологическую ценность суммарных белков определяли расчетным методом по аминокислотному составу в сравненнн с белками курнного яйца (Korpaszy J. et al„ I960). ' 4

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

СОДЕРЖАНИЕ: И КАЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ- БЕЛКОВ'

ЭНДОСПЕРМА ЗЕРНА КУКУРУЗЫ РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ В ПРОЦЕССЕ СОЗРЕВАНИЯ. ВЛИЯНИЕ УДОБРЕНИЙ НА СОДЕРЖАНИЕ И,КАЧЕСТВО БЕЛКОВ^ ЭНДОСПЕРМА ЗЕРНА КУКУРУЗЫ РАЗНЫХ ГЕНОТИПОВ; ТЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИЯ ЛЕГКОРАСТВОРИМЫХ;БЕЛКОВ НА,СЕФАДЕКСЕ в-МО

Ь- Изменение массы зерна и форм азота эндосперма зерна -кукурузы разных генотипов^'

Наши исследования показали, что при введении гена опейк-2 в генотнпы изучаемых гибридов снижение абсолютной массы зерна у оиенк-2 аналогов происходит неодинаково (табл. 1),

Таблица 1

Изменение массы зерна>кукурузы,разных-генотипов в процессе созревания ■■

(абсолютная масса 100 зерен в граммах)

Дни нос.-;с «пи.иния

Гежшш 10 21 26 31 36 41 v - 0 0 п ¿Г5

Сн 1 _ о fl п

1971 год.

ВИР 42 +/+

Oj/Oi

Краснодарский 309 +/+

Oj/OJ

ВИР 42 ■ +/+ С;/ог

Краснодарский 309 +/+

"J/oj

8,2 8,5 11,6 11.3 17,1 16,1 20,6 22.3 — 18,9 21.3 19.2 23.3 0,095.

5.2 5,4 10,3 9.9 16,1 14,6 17.2. 16.2 21 2 20*1 18,8 17,1 21,8 20,5 0,177

1972 год

9.1 9.2 12.5 12,9 15,6 14,8 20.6 18,9 23.0 24.3 25.5 23.9 17,5 25.2 0,004

6.5 6.6 11,9 10,1 12,9 13,1 16.2 16,1. 21,5 17,0 23.0 19,6 20,8 17,5 0,121

У аналога Краснодарский 309 о2/оа снижение массы зерна было выражено сильнее, чем у аналога BMP 42 02/02, у которого в первый год опыта масса зерна по сравнению с исходным гибридом, начиная с 31 дня после опыления н до конца созревания, была выше. Таким образом, степень депрессии массы

зерна опейк-2 аналогов изучаемых гибридов-записи? как от генотипа исходной формы кукурузы, используемой для насыщений, так и от условий выращивания:

Изменение содержания форм азота в эндосперме зерна изучаемых генотипов в процессе развития, имеет сходный характер (рис, 1). По мери созревания зерна в-эндосперме отмечается снижение доли азотистых соединении.. Относительное содержание белкового азота, начнная,с26*-годня после опыления, изменялось незначительно как у опейк-2 аналога, так и у исходного гибрида. Количество небелкового азота уменьшалось, до конца созревания, причем опейк-2 аналог, начиная с 21-го дня: после опыления, характеризовался большим количеством этой формы азота, чем исходный'гибрид. Общее содержание азота снижалось по мере созревания зерна в основном за счет снижения доли небелкового азота.

Такая же закономерность в изменении форм азота отмечалась и у среднепозднего опейк-2 аналога по сравнению с исходным гибридом Краснодарский 309 -г/ + .

Сравнительное изучение двух исходных гибридов и их высо-колиэиновых аналогов показало, что содержание белка у опенк-2'аналогов определяется генотипом материнского расте-ниян в значительной степени зависит от условий выращивания, растений; влияние этого фактора может при определенных условиях перекрывать различия .между генотипами.

2. Изменение соотношения, белковых фракции в эндосперме.

зерна кукурузы разных генотипов в процессе.созревания

Изучение изменчивости при созревании различных но растворимости фракций белков эндосперма зерна кукурузы показало, что общая картина этих изменений аналогична у обоих генотипов (рлс. 2). В-процессе созревания происходит снижение количества альбуминов, наблюдаются некоторые колебав ния в содержании глобулинов при одновременном накоплении зеина и глютелинов.

На ранних этапах, развития эндосперма в белковом комплексе преобладает фракция альбуминов, на долю которой приходится 43—46% белкового азота. По мере созревания происходит снижение количества это к фракции,: причем у опейк-2 аналога содержание альбуминов несколько выше и эта закономерность сохраняется во все периоды зрелости зерна: Динамика- накопления глобулинов у изучаемых форм кукурузы имеет сходную картину, ко у опейк-2 аналога, начиная с 21-го дня после опыления, их содержание выше, чем у обычного гибрида.'

Введение гена-опейк-2 в генотип обычной кукурузы приводит к резкому сокращению накопления зеина уже на ранних

стадиях развития зерна. В зрелом зерне количество этих белков у онеик-2'аналога было в 2,5 разя меньше л составляло 13,3% белкового азота против 34,7% у обычного гибрида. Содержание глютелинов быстро увеличивалось при созревании у обеих форм кукурузы, причем синтез этой фракции у опепк-2 аналога был более интенсивным и к полному созреванию зер-на.содержание глютелинов составляло 58,3% белкового азота против 41,3% у обычного гибрида.

Наши исследования показали, что действие гена опейк-2 на фракционный состав белков эндосперма зерна проявляется.независимо от генотипа исходной формы кукурузы и условий выраншвання.

3. Электрофоретическне исследования альбуминов, глобулинов и пениа

Электрофоретическне исследовании отдельных белковых фракций эндосперма зерна изучаемых генотипов кукурузы показали различную картину изменчивости их компонентного состава в процессе созревания..В период созревания происходят не только количественные, но,и качественные изменения состава белковых компонентов. При электрофорезе в щелочном геле изменения компонентного состава водорастворимых белков в процессе созревания идентичны у обоих генотипов. Через 15'днен после опыления у обоих генотипов было обнаружено 8 компонентов, а в зрелом зерне количество их достигло 16 (рис. 3), В кислом геле (рН 1,3) некоторые различия обнаружены лишь в количественном содержании отдельных компонентов. Компонентны!^состав водорастворимых белков высоко-лпзикового аналога при электрофорезе в кислом геле (рН 2,9) отличается от обычного гибрида наличием 2-х основных белковых компонентов, которые обнаруживаются через 25 и 40 дней после опыления. Таким образом, установлено, что ген о2 существенно изменяет состав водорастворимых щелочных белков эндосперма зерна кукурузы. Введение гена Од в генотип обычной кукурузы не вызывает существенных изменений в компонентном составе глобулинов при разделении как в щелочном, так и в кислом геле, Электрофоретическнй спектр данной фракции у обоих генотипов отличается большой стабильностью по всем фазам созревания. Уменьшение числа электрофоретнче-скнх компонентов зеина у 02-аналога объясняется репрессией синтеза некоторых белковых компонентов, вызнанной геном о2 уже на ранних этапах развития зерна. У обычного гибрида на 16- и 21-й день после опыления обнаружено 7 компонентов, на 31-й день появляется 8-й быстроподвнжный компонент, в то время как у опейк-2 аналога но все фазы созревания присутствует 5 компонентов.

4. Изменение аминокислотного состава суммарных белков-и отдельных-белковых фракций, эндосперм а; зернакукурузы разных генотипов -

Лминокнслотный состав суммарных белков эндосперма в период формирования зерна значительно изменялся (табл. 2). Как показывают наши данные, в процессе созревания происходит снижение количества лизина, аспарагиновой кислоты и триптофана, причем содержание этих аминокислот выше уопейк-2 аналога на всех этапах развития эндосперма. Коли* чество гнстидина и глицнна также было более высоким, однако заметных изменений в содержании этих аминокислот в процессе созревания не происходит. У обычного гибрида в ходе созревания зерна снижается- количество аргинина, валика, вследствие этого у опейк-2 аналога в зрелом зерне их количество несколько выше.

По сравнению с 16-м днем после опыления к концу созревания у всех генотипов увеличивается содержание глутамшовой кислоты, пролнна, аланина, лейцина, но у опейк-2'аналога это увеличение происходит в меньшей степени, чем у соответствующего гибрида. По содержанию других аминокислот данные генотипы различались незначительно или же вообще не имели существенных различий. Несмотря на имеющиеся колебания в содержании отдельных аминокислот, сумма незаменимых аминокислот по генотипам н фазам созревания изменяется незначительно. К концу созреванля она уменьшается у обычного гибрида на 9,9%, а у опейк-2 аналога — на 5,8%. Следует отметить также, что у высоколизинового аналога меньше отношение лейиин: изоленцнн, вследствие пониженного содержания лейцина. Введение гена опейк-2 н генотип обычной кукурузы значительно улучшает биологическую ценность (БЦБ) суммарных белков эндосперма зерна кукурузы (табл. 2).

Было установлено, что аминокислотный состав одноименных белковых фракций суммарных белков эндосперма зерна кукурузы изучаемых генотипов сходен, но содержание различных аминокислот в отдельных фракциях сильно отличается, то есть каждая фракция имеет свой специфичный аминокислотный состав {табл. 3).

Наши исследования показали, что введение гена оиеик-2 в генотипы обычных гибридов не приводит к существенному изменению аминокислотного состава альбуминов, глобулинов и особенно зеина,

Глютелнны опейк-2 аналога отличаются от глютелннов исходного гибрида повышенным содержанием лизина, гистиди-на, аргинина, аспарагиновой кислоты, и пониженным количеством глутамнновой кислоты, нролина, аланнна и лейцина. 8

Аминокислотный состав м биологическая ценность суммарных белков эндосперма зерна кукурузы разных генотипов в процессе созревания (1971) (г аминокислоту на 100 г белка)

Лии после опыления

Аминокислот и 16 21 31 41 зрелое 16 21 31 41 зрелое НСРо,м

зерно зерно генотипа

ВИР 42 +/+ ВНР 42 01/02

Лизин 45 3,5 2,4 2,2 2,0 5,1 4,2 3<) 3,3 3,6 0,00

Гистндшс 2,8 2,5 2,6 2,4 22 3,1 2,9 3,0 3,3 3,1 0,07

Аргинин 5.1 4,3 4,2 3,5 3 ,4 5,0 4.9 5,2 5,3 5,3 0,22

Аспарагнновая

кислота 8,0 0,5 0,4 5,2 5,5 9,8 8.3 7,2 6,8 7.2 0.18

Треонин 4,4 3.5 3,5 4,1 3.7 4,3 3,9 3.9 4.0 3,9 —

Серки 5,1 4.8 5,3 4,9 5,3 4,9 5,2 4,9 5,0 5,2 —

Глутамнновая кис-

лота 15,7 17,8 18,5 21,6 22,3 14,9 10,2 ■16 л 18,1 18,5 0,20

Прояви 0,0 7.9 9.0 10,0 10,2 6,9 8,2 9,2 8,7 8,9 0,28

Глнции 4,1 ЗЛ 3,3 3,4 3,3 4,5 4,6 4.1 4,7 4,5 0,09

Алании 6,6 7,6 7,7 8,5 8.7 6,7 6,9 6,7 6,8 7,4 0.20

Цист(с)ш1 2,1 1.9 2,0 1.4 1.9 2,4 2,0 1,9 1.9 1,9 —

Валнн 5.4 4.6 4,5 4.2 3,8 4,7 4,5 4.7 4,9 4.4 0,11

Метнокик 1,2 1,1 12 и и 22 1,7 1.5 1.7 —

Иэолейшш 3,5 3,3 3,3 3.2 3,1 3,0 3,1 3.3 3.1 3,3 _

Лейцин 10,2 10,3 12,2 12,2 12,9 7,9 8,6 8.9 . 9,3 8.7 0,16

Тирозин 4,3 4,2 4,4 4,9 4,6 4.1 4,0 3,9 ' 4,1 4,0' —

Фен ила лап ни 5,5 5,5 5,6 5,5 5,5 4,9 4,8 5,2 4,9 5.1 0,22

Триптофан 1,7 1,4 1,3 1,0 0,9 1,9 1,0 1,5 1,7 1,7 —

БЦБ 82,3 76,7 72,6 70.3 67,1 84,0 78,0 78.0 . 75,9 79,6

Аминокислотный состав отдельных-белковых фракций эндосперма зерна-кукурузы (ВНР 42) (г аминокислоты на 100 г бедка)

Альбумины Глобулины Зеин Глютелииы.

Аминокислоты I +/+ Oj/O, +/+ Ог/ог

+/+ Ol/Oj о г/оа

Лизин ~ Г>,7 5,7 5.2* 5,0 0.4 0.2 2,3 3,8

Гистидик. .2.4 2.7 3,3 2,8 U 0.9 3.0 3,6

АрГНЩШ:- 7.4 6,8 8,8 8.8 1.5 1,8 3,6 5.2

Аспэрагнноадя

кислота в,С 7.2 7.5 8,7 5,0 5,4 5,0 6,8

Треонин^ 5.2 4.9 5.0 4,0 3.1 2.6 3,7 4,0

Серии т 5,8 4.6 5.0 4,9 5,3 5.7 5.2 5,6

Глутамшюаая

кислота 12,6 12,8 12.5 13.8 23,6 21,5 22.4 18,4

Пролик 7.0 6.4 6,3 5.9 10.4. 10.4 12,3 ЮЛ

Глицин 6.6 5.4 6.9 6.9 1.3 1.3 4.5 4.7

Алании 7,8- 7,2 7,8- 6,7 8.8 9,4 8.9 6,5

Иист/е/нн сл. 2.1 1.8 2,4 сл. сл. 1,8 1 2

Валик 6,9 5.2 4,7 4,9 3.6 3,1 4.2

Мсти о ни и 0.5 1,3 1,4 1,2 0.8 сл. 1.1 1,6

ИзолеГшнн 4,7 4,2 3,1 2,9 4,1 3,9 2.9 3,1

ЛеГишк 9.4 7.1 7,0 6.0 17,3 16,0 11.7 7.6

Тирозин £ 4 ■3,2 3.8 4,5 4,9 4,2 4,9 3.9

Фенилаланин 4.» 4,0 5,5 5.6 7,5 8.0 4,6 4.4

Предполагается* что фракция глютелинов в период созревания зерна кукурузы с нормальным эндоспермом- постепенно разбавляется белками, подобными - зенну' (Murphy «Ц J„ Dal-by Л., 197l,.Wall J. S., Paulis J. W., 1972).

При изучении изменения содержания, лизина в отдельных белковых фракциях и процессе созревания зерна нами было установлено, что количество лизина в альбуминах, глобулинах и зепне как у обычного, так и у опейк-2 гибрида изменяется в одинаковой степени или остается на одном и том же уровне. В то же время отмечены заметные различия в динамике содержания лизнна во фракции глютелннов. Концентрация лизина в глютелинах опейк-2 аналога остается постоянной до конца созревания и составляет 3,6—3,8 г на 100 г белка. У обычного гибрида в этой фракции количество лизина при созревании снижается с 3,6' г до 2,3 г и в зрелом зерне в глютелинах опейк-2 аналога лизина на 65,2% больше, чем в глютелинах исходного гибрида.

Изучение баланса лизина показало, что на ранних-этапах развития эндосперма зерна кукурузы большая часть суммарного лизина приходится на долю альбуминов (табл. 5). По мере созревания распределение этой аминокислоты по отдельным белковым фракциям резко меняется, В зрелом зерне у обоих

10

V

г.о

и 2 ье

ь 1Л

и 1.4

1,2

1 <9 1.0

"г 0,в

0,6

я

О 0,4

ю

0,2

1Г 5Г 2Г зГ зГ ЗГ

д ни п о ел в о л ыл о кия

Рис Л.. Содержание форм азоте .в яндоспсрие зерна

разных генотипов в процессе созревания (I (-

зрелое . зерно

Д.

1 I -

ю 100

о

V во

й

«Б Я/. е 60

Е8

40

1е 20

-) ВИР 42 +/+; <-------V ШР 42 о^.

I езотI 2 велковый азот; 3 — нейелковий озот, ВИР 42:+/+ _ * ВИР 42 0^2

16 21 Ш 31 36 41 ярем» . ДМфМР

д н и - и о <е д * <о (В « л л * * я

Рис ,2. Фрикционный состав «^»нерных ¿»«юз «нпоспериа аерна кукурузы раэкык |тмо*шк>ляпрО№Сэе созревания (1971

41 зрелое зерно

- вльвумины - глобулины. гоф — зеин

| И1П р - глютелини - остаток

Рис.З. Олектрофорвтичесиий состав вльбуиинов <11. глойулино» <ПЭ, звива <Ш)яндосперма зерне кукуруэн разных генотипов.

в - Краснодарский-309 +/+•, б - Краснодарский 309 Од/од*

А - щелочной гель<рН 8.9); Б - кислый гель (рН 4,3); В - кислый гель (рН 2,9); С - кислиЯ гель (рН 3,1).

Краснодарский 309 */+

В

Краснодарский 309

н в

\ш

I

иЛ

□ В

Рно.4, КоипонантиыЙсостав Селконих Фракций легкораствориимх белков энцоспериа зерна кукурузы резных генотинов, получении* - гель-хроматографией не сефадвксв <3- - 100; щелочной гваь(рН 8,9).

Рис.5. Гель-хроиатогрМия *»гкорлстворичых белков

знпоегсрмя пргнп гибрида куурулыКраснолар-, сикП ЗЭЭ »/+ (——1 и пнеоколилинового оюг.огя Краснодарский 309 о ч/о-, (— — — —) не

___________...__л___- _ *

сверхтонкой сефпдрясо С"- 100.^

Распределение лизкна по белковым фракциям эндосперма зерна кукурузы разных генотипов в процессе созревания (в % от аминокислоты суммарных белков)

Генотип Дни после- опыления

Белковые 16 21 26 31 36 41 эре. лое м-рно

Альбумины. +/+ 70,7 68.2: 53.0 54,6 50.2 45,6 38,7 32,0 22 2 22,5 15.9 19,7 16.3 13.9

Глобулины +/+ <>г/ог ■ 6,1 6.6- 9.1 10.3 12.5 10.4 14,4 10,7 16.7 13,9 16,6 14,9 17,8 13.4

Зенн: +/+ Оа/Оа- 1.3 0.7 2.7 1,0 3,3 1,0 4.4 1.1 7,6 1.2 7.3 1.3 7,8 : о.»

Гл юте липы +/+ с^/оз 21,9 24,5" 35,2 34,1 34,0 43.0 42,5 56.2 53.5 62,4 60,2 64,1 ."»8.) 71.9

генотипов наибольшее количество лизина приходится на фракцию- глютелинов; причем у опейк-2 аналога эта доля значительно выше.

Таким образом, более высокое содержание лизина в суммарных белках эндосперма зерна опейк-2 аналога обусловлено не только относительно низким количеством зеина и более высоким содержанием других фракций, но и более высокой концентрацией лизина в глютелинах- опейк-2 аналога по сравнению с глютелинамн обычного гибрида, что может быть связано с ннгнбнрованием геном-опейк-2 синтеза зеииоподобных компонентов в глютелинах. опейк-2 аналога;

5.' Действие; удобрений на - качество -белков - эндосперма зерна обычной кукурузы « ее высоколизннового аналога

Представляло интерес выяснить, сохраняются ли показатели качества суммарных белков эндосперма зерна.оненк-2 аналогов кукурузы: (низкое содержание зеина л высокое — л нэп- • на) лри различной обеспеченности растений элементами минерального питания.

Проведенные исследования показали, что содержание белка при внесении различных доз минеральных удобрений увеличивается в одинаковой -степени независимо от генотипа (табл.6).

Увеличение количества белка под влиянием .минеральных удобрений сопровождается.изменением соотношения.белковых

Содержание и фракционный состав суммарных белков эндосперма зерна кукурузы разных генотипов

(азот фракций в % от белкового азота) .

О ,

Генотип Варианты X * о О и о . ¡2* 2-х1 =

1С (£>" З'З ' £ ; —■ <5 Я = = г; з 5— с: о го О _ г* & <- 5 и о : : >1 ойё

Краснодарский 6,12'

303 +/+ Контроль 6,1 5,1' 30,6 41,8 16,3 0,73

7,87 5.5 4,8 39,7 35,7 14,3 1,11

МзяРззоКно . 7.94 6.3 4,7 40,2 34,6 14,2 1,16

Краснодарский

303 оа/о2 Контроль 5.87 11.7 8.5 13,8 51,1 14.9 0,27

7,75 11,3 8,1 16.1 49.2 15,3 0.33

МисРясКпо 7,69 12 2 7,9 16,3 48,8 14,8 0,33

фракций в эндосперме. Данные изменения во фракционном составе белков имеют сходный, характер и выражаются в относительном увеличении доли зеина н уменьшении глютели-нов, но проявляются у изучаемых генотипов в разной степени.

При внесении азота, фосфора и калия в дозе 60 кг/га содержание зеина в белковом комплексе:эндосперма зерна гибрида Краснодарский 303 4-/+ увеличивается в 1,3 раза по сравнению с контролем, содержание глютелинов уменьшается почти в 1,2 раза. У опейк-2 аналога эти изменения выражены менее резко: количество зеина повышается в 1,17 раза, а количество глютелинов практически остается на одном уровне. В результате отмеченных изменений отношение зеина к глютелинам у обычного гибрида возрастает в значительно большей степени, чем у опейк-2 аналога: соответственно в-1,5 и 1,2 раза. Содержание альбуминов и глобулинов при этом изменяется незначительно у обоих генотипов.

Дальнейшее увеличение уровня минерального: питания не оказало заметного влияния на соотношение белковых фракций у данных генотипов.

Поскольку основным биохимическим показателем опейк-2, аналога является повышенное содержание лизина в белках зерна, большой интерес представляло проследить стабильность этого признака при увеличении количества белка под влиянием различных доз минеральных удобрений.

Изменение уровня минерального питания приводит к значительному снижению относительного содержания лизина в суммарных белках эндосперма гибрида Краснодар-

ский 303 т/-К Его количество уменьшается .на- 31% но сравнению с контролем, что вызывает ухудшение биологической ценности белка,.у опейк-2 "гибрида содержание данной аминокислоты при всех уровнях минерального питания снижается в меньшей степени, всего на-7—10% (табл. 7) . В контрольном варианте разница по содержанию.литна. между. генотипами составляла 45%, а в вариантах с внесением минеральных удобрений она достигала 90%.

Таблица 7

Аминокислотный состав-суммарных белков эндосперма зерна кукурузы -разных генотипов (г аминокислоты на 100 г Селка)

Краснодарский 303 +/+ Краснодарский 303 о?/ог

Варианты .3 - 2 О % Л Л т- V 2 л.

Аминокислоты О. 1 ■А О С. и Ж а 1

О ¿й - '-Л 1 О К к •л

Лизин 2.9 2.0 2.1 4.2: '3,8 3,9

Гисткднн 2.3 1,8 2.0 3,4 3,2 С.З

Аргинин 3,8 3.1 3,2 5,9 5,5 5,7

Аспарагииовая 6.2

кислота 5,3 4,8 4.9 6,5 6,0

Треоннн 2,8 2,5- 2,8 3.3 3.0 3.3

Серия 4.3 4.1 4,5 4,2 4,1 4,6

Глутам»новая 17,3

кислота 20.2 21,9- 22.0 17,8 17,8

Пролип . 9.5 10,9- 11.1 7,1 7.9 7,8

Глшшк 2,8 2.3 О о • 3,3 3,4 • 3,2

Алании - 8.1 9.2 9,5 6,9 7,1 7.2

Цист/е/нн сл. сл. сл. сл. 0.13 сл.

Валик 3,7 3,2 3,1 4.5 4,0 4,3

Метионнн 1,1 0.8 0.7 0.9 и 0.8

Иэолейшш 3.0 2,8 2.9 3,4 3,6 3.3

Лейцин- 14,9 16.1 16,5 11,3 12,1 12.3

Тирозин . 4,9 5,0 5,1 4,7 4,2 4,-1

Фенил а ля ннн 5.7 6.5 6,1 5,6 5.4 5,5

Триптофан 0.8 0.6 0,6 1,1 М

Из приведенных исследований можно заключить, что белковый комплекс эндосперма зерна высоколнзиновои кукурузы отличается достаточно высокой устойчивостью по основным показателям качества белка (низкое содержание зеина и высокое— лизина) при увеличении его количества под влиянием различных уровней минерального питания. Это позволит использовать новые формы кукурузы для дальнейшей селекции на повышение-содержания белка при-сохранении его высокого качества.

в.' Гель-хроматография легкорастворимых белков! на сефадексе 0-100. Аминокислотный и компонентный состав отдельных фракций -

Гель-хроматография на сефадексе й-ЮО легкорастворимых белков эндосперма зерна- обычного гибрида Краснодар-скпГ| 309 4-/+ и его опейк-2 аналога позволила выделить 5 основных фракций А, Б, В, Г, Д, которые различались по молекулярной массе (рис. 5). При сравнении хроматограм.ч видно, что у опейк-2 аналога присутствует белковая фракция Б с молекулярной массой около 50 тыс,, которая не найдена у исходного гибрида. Кроме того, введение гена опейк-2 в генотип обычной кукурузы обуславливает синтез белковых фраКцйй легкорастворимых белков, близких по молекулярной массе к белкам обычной кукурузы, но отличающихся от таковых по аминокислотному составу и электрофоретическим свойствам.

Содержание аминокислот варьировало не только в белках с различной молекулярной массой внутри каждого генотипа, но и во фракциях с одинаковой молекулярной массой, которые присутствуют как у обычного гибрида, так у его опейк-2 аналога (табл. 5). Наиболее высокое количество лизина было обнаружено у опейк-2 аналога во фракции В с молекулярной мае* сой около 24 тыс., а у исходного гибрида:— во фракции Б с молекулярной массой около 45 тыс. Повышенное содержание лизина в этих фракциях, возможно, обуславливается наличием в их электрофоретическом спектре по крайней мере 2-х характерных, преобладающих по количеству, среднеподвижных компонентов, отсутствующих востальных фракциях (рис. 4). Электрофорезом в полиакрмламидном геле было показано, что полученные гель-хроматографические фракции характеризуются большой гетерогенностью. Было установлено, что полученные фракции имеют 4—12 белковых компонентов при разделении в щелочном геле (рН 8,9) и 2—9 компонентов при разделении в кислом геле (рИ 2,9). При сравнении электрофоре-грамм обнаружены различия по компонентному составу не только внутрн каждого генотипа, но и между однотипными фракциями разных генотипов. Таким образом каждая фракция представляет собой комплекс белков, близких по молекулярной массе, но различающихся: по электрофоретическим свойствам. На основании полученных данных можно сказать, что действие мутантного гена проявляется в регуляции синтеза не всего белка.в целом, а вполне определенных белковых.компонентов.

Аминокислотный состав гель-хроматографнческих фра кии б легкорастворимы* белков эндосперма зерна кукурузы разных генотипов

Элктноииий объем фракций (мл)

Аминокислоты А-170 5-235 | В-2Э0 Г-337 Д-455 А-170 £>■219 В-296 Г-337 Д-455

Краснодарский 303 +/+ Краснодарский 309 оа/о(

Лизин...... Гнетиди) 1 . . , , Аргишш " '. Аспар а типовая кислота . . . . Треонин Серии ...... Глутам«новая кислота . . , , . . Иролин Ц(!ст(е)шг .... Палии ... . . . Метисшш .... .И золей шж. . . . Лейцин ,...'.' Тирозин . , . . . Фенилала и !Ш .' . . Сумка незаменимых аминокислот . 5,9 <1,9 4,7 10.3 7.1 8.2 12,7 4,3 юз 13.5 сл. 6,3 1,7 3,7 4.7 13 2,3 33.6 6.4 3.0 4.1 10,2 6,4 0,0 13,0 7,0 10,6 И.О сл. 6.9 0.2 2,4 7,8 13 3.2 36,3 . 5,4 I.9 5,8 II,8 5.8 53 11,1 6,6 163 12,1 сл. 6.7 0.6 2,6 4.7 2.9 3,7 31,4 4.9 13 5.6 93 73 6.7 10,6 11.4 12,1 11,3 сл.: 5.6 0.5 3,1 63 13 13 31,2 2,2 13 ' 13 42,2 2.4 1.5 18,7 9,1 6,0 6,! сл. 23 0.6 0,4 1,4 2.0 1,0 12,6 5,2 13 3,6 10,7 53 6,0 12,0 . 4,1 17,5 13,2 сл. 6,0 13 23 63 13 2,1 31,4 43 33 5.1 10,2 63 63 12,2 53 ИЗ . 13,1 сл. 6,0 03 -25 53 2,8 2,7 32,8 . 6,2 23 43 123 5,4 . 6,4 11,1 5.6 нз 11.5 сл. 55 0.2 23 4.7 33 4,1 30.6 43 13 6,5 9,4 7,2 7,4 9,0 7,4 123 ИЗ сл. 53 05 33 7,0 2.4 2,9 33,2 33 13 °-5 443 2,9 1.1 22,0 '7.2 5.2 4,7 ' сл. 2,4 0,2 0,4 0,7 2,2 1.3 12,7

Выводы

1. Введение гена опей к-2 в генотипы обычных гибридов кукурузы приводит, к некоторому снижению абсолютной массы зерна. Степень депрессии абсолютной массы зерна зависит как от генотипа обычных гибридов кукурузы, используемых для насыщений, так и от условий выращивания растений.

2. Динамика накопления-форм азота в эндосперме зерна обычных гибридов кукурузы и их высоколнзнновых аналогов носит сходный характер. Содержание белка у опейк-2 аналогов определяется генотипом материнского растения и зависит от условий выращивания.

3. Общие закономерности накопления отдельных белковых фракций в эндосперме обычных гибридов и их опейк-2 аналогов в процессе.формирования зерна имеют одинаковую направленность— происходит заметное снижение содержания альбуминов,, увеличение доли зеина и глютелинов. Введение гена опейк-2 в генотипы обычных гибридов приводит к существенному изменению соотношения^белковых.фракций в эндосперме зерна. У высоколнзиновых аналогов происходит резкое снижение содержания зеина и увеличение количества альбуминов, глобулинов и особенно глютелинов.

4. Введение гена опейк-2 в генотип обычного гибрида кукурузы не вызывает существенных изменений в компонентном составе водорастворимых белков при электрофорезе в щелочном (рН 8,9) и кислом (рН 4,3) гелях. При разделении в кислом геле (рН 2,9) было установлено, что данные белки опейк-2. аналога отличаются от белков исходной формы наличием 2-х дополнительных компонентов, которые обнаруживаются через 25 и 40,дней после опыления. Компонентный состав.глобулинов изучаемых генотипов не имел сушественных;разлнчий. Элек-трофоретический спектр зеина опейк-2 аналога состоит из 5 белковых компонентов против 8 у обычного гибрида.

■ 5. Аминокислотный состав суммарных белков-эндосперма обычных гибридов кукурузы и их опейк-2 аналогов в период формирования зерна значительно изменяется. Происходит снижение количества лизина, аспарагиновой кислоты, триптофана и увеличение содержания глутамнновой кислоты, пролина, ала-нина и лейцина, У обычного гибрида уменьшается также количество аргинина и валина. Введение гена опейк-2 в генотипы обычных гибридов кукурузы приводит к повышению в суммарном белке эндосперма зерна содержания лизина, гистиднна, аргинина, аспарагиновой кислоты, глицина, триптофана и к снижению количества глутаминовой кислоты, пролина, алани* на и лейцина.

6. Аминокислотный состав альбуминов, глобулинов и зеина 16

обычных гибридов кукурузы и их опейк-2 аналогов существенных различий не имеет. Глютелииы о пен к-2 аналогов отличаются ог. глютелинов исходных форм повышенной концентрацией л изнна, гистиднна, аргинина, асиарагиновой кислоты и пониженной концентрацией глутаминовой кислоты, л рол ни а, 4 аланпна, лейцина.

7.. Высокое содержание лизина в.суммарных белках эндосперма зерна опейк-2 аналогов обусловлено-не только относи-, тёдько низким содержанием аеина к более высоким содержа ни-, ем других фракций, но и более высокой'концентрацисй лизина в глютелннах опейк-2 аналогов, по сравнению е. глютелннами обычных гибридов,

8., Под влиянием различного уровня минерального питания между обычным гибридом к его опейк-2:аналогом при одинаковом повышении содержания белка устойчиво сохраняются генотипическпе различия во фракционном и аминокислотном составе суммарного белка эндосперма зерна. Независимо от уровня минерального питания доля зеина в белковом комплексе у высоколизинового гибрида была в 2—2,5 раза ниже, а содержание лизнна в суммарном белке в 1,8 раза выше, чем у исходной формы.

9. Введение гена опейк-2 в генотип обычного гибрида кукурузы приводит к качественным изменениям состава легкорастворимых белков эндосперма зерна. Гель-хроматографией на сефадексе С-100 у опейк-2 аналога была идентифицирована новая белковая фракция с молекулярной массой около 50 тыс. У обычного гибрида и у его опейк-2 аналога в составе легкорастворимых белков обнаружены фракции с близкими молекулярными массами, но различающиеся по электрофоретиче-ским свойствам и аминокислотному составу.

10. Повышенное содержание лизина во фракции легкорастворимых белков с молекулярной массой около тыс. у обычного гибрида и в белках с молекулярной массой около 24 тыс, у опейк-2 аналога обусловлено в основном наличием у них 2-х электрофоретическнх компонентов, обнаруженных при разделении в щелочном геле (рН 8.9), и 3-х компонентов, обнаруженных в кислом геле (рН 2,9).

М. Изучение белкового комплекса эндосперма зерна обычных гибридов и их высоколизнновых аналогов показывает, что введение гена опейк-2 в генотипы высокопродуктивных гибридов и сортов послужит основой для создания новых ценных форм кукурузы с повышенным содержанием белка и улучшенными биохимическими показателями качества зерна.

Список опубликованных работ по теме диссертаций

1, Изменчивость состава белков обычной кукурузы и ее вы-околнзннового аналога в процессе' созревания. Вестник с.-х. 1ауки, № 4, 1975, с. 68—74 (в соавторстве, с Плешковым Б. П„ -ннягиным Е. И.).

2, Электрофоретические исследования' состава водораство-|Нмых белков эндосперма зерна обычной-кукурузы и ее вы-:околизинового аналога. Доклады ВАСХНИЛ, № 2, 1977, с. 5— V (в соавторстве с Плешковым Б. П.)..

3, Изменение белкового комплекса эндосперма зерна обыч-юй кукурузы и ее высоколизи нового аналога в процессе соЗ' евания. Тезисы докладов Всесоюзного' симпозиума по азот-юму и белковому обмену растений.-Тбилиси;-1978 (в соавтор-тве с Б. П. Плешковым).

Л 69530 7/У—79 г.

Объем I1/» п. л.

Заказ 847.

Тираж 100

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 127550, Москва И-550. Тимирязевская ул„ 44