Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительное исследование легкорастворимых белков и некоторых ферментов кукурузы различных генотипов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительное исследование легкорастворимых белков и некоторых ферментов кукурузы различных генотипов"

¿шшршлтрсесшя го<яда?згщ»ьй JE^FCÎHCT

^КОТ'Р'-З P^tíq^^t^.'

03 .СО-Oí - íT-c

Лл'.-арг'гр;? ^соертзддз es 5c~î5;.™3 jvzicü cïcs3s3

Дявпропотрозоя

ISS2

l'cùzta Ë^taoxsbfa s ^soopasopir 6sosa»oa раогатм&шх бгжзсз sassaysapscâ баояэгаа Г-Ж ¿зодогва Дзвзрситрозваого гос-

Ear«saS рухсоедамс.» sosîop йгогсгэтэахпх явук, щк&гооор

ЕШВГШШО Лгахзгадр НмолзезЕЧ.

O^uksj&b;« ошзоавгжп доктор баолагачвошис says, ярофессор ■ ВШШИЕОВ ¿Uiöflpr ИЕейсэач '

доктор Аиологжчеахаг ел ух, c?isa^v. oorp. БОВЧУК СергеЗ Вмдаирэаач.

Всдувдв оргвс£«ецяя> ЧернаашуаЛ roejEasspoaret. Завяте дасоорхши совгсштгя

Ъпа \ г. я

14.00 часов «а ааоахаш Спецваягваромвваго у чад ore coserá :.', 0ci3.24«06 no прадуаде»» y^esoS отеязяв аэндадатв &охот»чеокдх наук ара Диасрспатроазксу rooyeaepeaîete со едреоу: 320625, ГШ, г. Дыепропетроаск, 10. npoenatt Гагарин«, 72, хоро. 17, б&олого-вйологичеслиЛ факу»тв?.

С дассертецав! иокно оатакоамьоя » научной бабдиотехв Дшлропетрозского государственного умавроатета.

Автореферат разоолав * fó 4 1992 г.

Учений оекреторь

онециеллзяровавного ученого совета

Черная Валентина {¿вановна

СШЯ ШАКТЗГЛЛШ РАБОТЫ

¿д^члмюоть пдоаде^ь Ода>з ПЗ рсзягсг-. яуыЯ уд^гг^ля яо~ чвотаз балап я гзряэ дуаурус! етяготся вопоямюзаш» а зрамячео-псЯ оеявяцгя иумщяй, зхяаяах пз пвоь <5оякопй лскакгсл ат.'лчп. Оообевво гарояев рзопроотргзогзо э этой стяоазягл атпдм*сиге опоптаапш «утацалм тапз орпио - 2 (сЯ), зивггу -2 { «и 2), явгу ( ). Мутаптгаа форго дуяурусз харсктераз^итоя погнлем»:* оодергааноц лэгкораотворлшх бзлзоэ, л с тори о а егачдгеяькоЗ игрз определяют качеотао эзршг. Доотосзтл з пзучег-ла бзохглмчаского двйотвая ггпз <Й псаазаля, что уяутазгдз аптдтедхноЛ цг,:у.сста бел-па ойуолсадсао пэ хоасо зоетчсстлвшиш аэргрссирздз«глеи <5ел:о-гих фрагцаЗ, по а глубсаага-азгетс.'^лгс з азтеболап'м йгяг.оз я емзнозаслот. это виразаегзя э язкваосяз фззапо-хямачестах овсЗсув п структура отдвлькз бэлгоэ, эвгаапих опеятрез я егггязпоота р»-о феривптоэ (Иаолаазо, 1978; Хадгакоз, 1978; Штетллдоз, 1905. начато, 1990). Есчьппнотго гмолодозапяИ веээ:г:заэ изучена зж^ра.' беласэ л нутазтп« раатопаях. Сеелзо лзгаорзотззорги.'пх протэз-аах ЕиссголязгловсЯ иутавтвоИ круруга калоггогезш. До гзотсдаго вргиегл отсутствует чзгйаа^пргдегзз.т^аа': о отезгаа Еачсотзап-.сЗ азыгнчасотя логясрастаорлюх бхаол а отдел.?,гл^ сз ао:дюяоктоп, овязапглх о ззотпхи обманен, ::отог(а пгрзпт зпя^аталызуп роль а рагудясм аскгстз я зерпя прз оозргвапла а реалгацпп гзаледотз^п-по" »г^ормзхпа (Кротсгсч, 1972). В светя о аггл азутако хмячвоннх сзсЯотз а атру£тургах еообапвсзтоЯ леглораотзорхгах баллоа а зходтаах э пх оостал алтггпх фаравптса азотного кагсбо-лазмэ у иутзатгах ?<тру з прсдессз оезрзлавая ззрчовха явгяатоя оя-тузлъеш, приобретает лзхпоа гяоратдчооаов п прзктачаонея згачеаао.

Пелт, а задачи аоо.тазсвпгчя. Целью каотозге.! работа &{7.о орчп-кятвдьноз псоладоаалла ооотзгп, ^аа^о-хгня^соппх овейстз а структурах особенностей лсгхорг.отзор:с^х бзлкол г? ггрчептоз пар-загаша-рованяя з-зрпз разлачтгх геп;талса кукуруза. Походя аз цел»." работа била П0СТЗЗЛС1Г! олодуекпв эгс,пгр;''':птглы21э задали:

1. Исслодоаатъ {азлко-зсмическвв овейотга, амаиохисдотшА ооо тал структур!ле сзобзнаостл .чзгдсраотаори;.ы:: бо;иоз иоходшх п нутапиих 0/Ор:.' кукурузч:

2. Изучить с:.г»П1!Ооть а'и'.потрапо^ерез к аг.огтеооо оптогэвсс.; •• шявать коррзляцпоргсю овязп .мы^г бпохаглчеока.'т показаталя,*.':*.

3. Кооледова'л лслйг.'ор|игм аопартатамшютрзас^-ерззи у рэз-иг; • п-потгшоа куи:фугг.

4. Наделать Есаартотаыадотравсфераэ? из зораа исходной а му-тантвой кукурузы £ яеучить ®с ^авдко-хшшчеохио опойстез.

5» Разработать геог ел ¡выявление цугаиткых форм кукуруза по уровню вктквр.оотй фертнтов аереаюкировсиш.

Научна« новизна в практическая певность работы. Исоледовага в сравнительном аоаеете оообевноотв оостава п физико-хЕмачеоких свойоте легкорзотяоримих белков кукурузы различных гопотипов. Впервые установлено, что у мутантов оае£к-2 синтезируются водораатаори-ше белки, отличахгаося от таковых в обычной кукурузе по Цзвхо-хн-кическии свойствам, компонентному к пептидному ооотаву. В! явлена повышенная активность ферментов пореаманврованяя в альбумулах ыу-тантшх фору кукуруаи. Показана во8ИОенооть использования актшзиоо та амннотрансфераз в качество эдопроос-ыотода обнаругзвия андоопер иошх ыутааиЯ. Предлогов мотод оценки качества зерна по ферментативной активности вегетативных органов. Выявлены ранее неизвестные мивнения полиыорфизми аопартатаиияотранс^ораы а оасоясдазинон.'* ыухинхах. Пг-.,»^ чегн новав данные об ектавпоста и паофориентнои оос-твве энзимов переоиакироьыш: гйтерегизотпах по гену опеЙк-2 нута г тов кукурузы. '

Впервые проведено выделение и сравнительное изучение физико-хшыческих свойств азоформ аопартатомлнотранофераЕа зерна обичнух к ыутантных гонотапоя а выявлены причины изменения актпвноотв фермента в аыооиодизнновои еяалоге. 0

Найдено, что повышенная актнвнооть ферментов переаминирешанил сопряжена с изменениями синтеза зеняа в мутантном эндосперма. Поду чешше данные вносят определенный вклад в изучение механизма дей-отвия мутаций типа 'опеЙк-2, расширяют теоретические основа оелогас 1 кукурузы на качесгао зерна.

Апробация работц. Материала диссертации были доложен^ на 3-Я, 4-Я и 5-й конференциях молодых ученых л специалистов по проблемам кукурузы (Днепропетровск, 1981, 1985, 1987 гг.), П Всесоюзном совещании по проблемам кукурузы (Днепропетровск, 1984 г.), У Всесоюзном оъезде генетиков и оелекционеров (Москва, 1987 г.), УП Всесоюэ ном съезде ботанического общества (Киев, 1907 г.). Всесоюзной конференции "Применение низкоэнергетических факторов в биологии и сельском хозяйстве" (Киров, 1989 г.), Всесоюзной конференции "Ли-мп:олтика-39н (Куйбышев, 1989 г.). Всесоюзном совещании "Методы ин тй.чел^икпи/.и селекционного процесса" (Одсоса, 1990 г.), Научно-тех н;'Чс,ско.'1 конференции "Проблем азотистого Метаболизма" (Волгоград, г.), ус 1:сеоозэзиоы сг.миезяуме Молекулярныемеханизма гецсти-

чеоких процессов" (Моема, 1990 гО), П оъааде Всесоюзного обкест-за флэяологов рзотзнай (Urnas, 1990 г.), знездпей сгосгл ЗАCZHïPI (Днепропетровск, 1989 г.), a так» ятогошix научных конференциях Днепропетровского гссунгзерсдтега (I935-I3S2 -т.).

Публикация работа. По тема диооергацил опубликовано jí5 пвчат-Ш2 работ, получено I авторское свидетельство.

Структура и объем работа. Диссертация ооотоаг из вселения, обзора литературы, описания цзтерзалсз п г.:зтодоз доследования. аз-догения результатов а их обсуждения, гаглташш, газсдсв, соксяэ цитированной литература и прилогения. ОонсзноЗ текст чзлогсЕ ría отранидах машинописного текста и шигаэтрзровая ¿1& рноункамя 'a JjQ таблицаки. Спиосл использоваиноД литература состоит из ¿L&f источников, в тси члола f^Z3apyöeans авторов.

НАТЕРНАШ И МЕТОДЫ {ЯСЛНДСЗАЕИ^

Объектом исследования была.сеиена рззллчной стеьета зрелости и вегетативное органа инбредппх линий А204, w 64А,я 155, 9 н хх аутантншс опейк-2 аналогов. Генотипическую зависимость активности а полииорфизыа ферментов перезиинзровандя изучали яа оеиене- .'мутантов Зи 2 и ff* . Растения Ецразщаалл з уолозиях полевого огатз на Днепропетровской опытной станции ВНИИ кукуруза. Зерно а sore-тативные органы, отобранное а различие оташ сейрсгания, фиксировала жидким азотом, лиофильно Е-Чсузавайй и иемольчала нз месьшще » Laboratory Ш.11 3100" ( L КВ.. Швеция).

Альбумины и глобулина гнделяланз сбезгирзяао" муки зо методу Осборна в модификация Ландри, Муро (19*70) а Клименко (1971). Экстракцию протеолитичеслих фериентов проводили зоднына и солезхык растворами в течение 30 мин при +4°С при постоянной' Ьоремепяаз-нии (Вовчук, 1978).

Концентрации белка определяли по ыз'тоду Лсури я сяектрофото-ыетричзски по юглощеяио при 2ь0 п 280. l'A. Азгизнооть аспартатамн-нотрансферазы-(А^т) ц адзтш^анотрадсфзрага оценивали Ко-

лориметрически« с 2,4, /зодтро?,еяалглдраспиоы ( Langer , 1975) а опектрофотокетрачеодиа ( Jinkino , 1959) методом. Удельную активность ;лараг.алй в ыкноль пирувата ка I мг белка. ^ Активность протеолитическях ферментов о использованием субстратов (казеин, азоказеин, гзноглобин) определяли по ( Kunitz f 1946) в модификации Вовчупа (1976). Удельнуп,ятг;:пяостя. гаоочитнва-лй в мкаталах на I яг-бэ.гка.

Препарат аапартатаьшаограаоффэгц вцд&лялд путей скстракцад измельченных оемла ОДЫ грао- KCl буфзроа рН 0,0, оодвржазш 0,002 U ЭДТА, в осотдогешш 1:5 (со seo;) upa +4°С в гечаиле 2 час. Экотрект подвергала фраицаонирсгакгэ сульфатом еыаоянв. Осаждедпио при 40-60« насняонля (1Ш4 J'gSO^ боха двализоведв б разделяла гель-фш>трзцвей ее колонка о се$эдздо<ш о 200 (2,6x£Q oii), уравновешенной 0,05 И sjeo- KOI рН 8,0. Фрахта: о дысоноЯ ферментативной охтштоотью подавргалн воесооСуопноЗ храшографпд es ДЭАЭ-трас-акрилв U,0#G он) в гндаЕяои градазшта кощентрацйа 6: 0,05 до 0,3 М HeCl в 0,05 и тряо- ЕС1 "буфере (рН 8,0). !

Ддл разделе ахи: mhcsscteohkíx фору а с парт а га пел отрв цо£е рз зц использовали препаратьвпое моаяехтрофокусйровапаа но колоико ¡8101 (1 КВ, Швеция) объемом ПО ш в диапазоне рН 3,5-10 о ¿радаенте плотнооти' оахороаа (5-40$) по методу Регеттн CI986). Для ргзделе-ния легкорасхзорнАах белков попользовала хроматогргфячеокоо обору-л«а2?.9 низкого к виоояого гамэнея фир&а LKB (Шващзя).

Содержи, и п^гдоасаль-б фосфате определяли С0Роtorean (1954).

Для определения за -групп нроаодала рзавди о 5,5 датвобдс-2-иат-робонвойной КИСЛОТОЙ по цагоду Зядаака (1959). i

Аминокислотной акалдв нрезодояа ей автоматических анализаторах аыиноклодот Ш.-SQI (ЧССР) и Elotronik MJ-500I (ФРГ) исоло гидролизе С^лкоэ в 6 U ЕОХ при 105^ в течение 24 часов.

Элекгро^ротачеокий анализ белков проводили в 8,2£-ноы поли-акрнломкднон гело, в трио-глициновом буфере рН 8,3 по методу lluvia (1964). Оценку гомогенкоотв белков я их молекулярной массы ооугаеотвляди о поыоаьс электрофореза в присутствии додецилсуль$ата нятрпя а 15 и 12,555 'полявяр?.ламидноы голе по методике La«™ai (1970) в присутствии а отсутствии 2-меркаптоэтпнола на приборе БЭС 2001 (LKB, Швеция). Компонентный состав альбуминов и ¡у;нартат-имкяотранофера8и исследовали методом изоэлектрофокуоированил ш го-тонн х пластинах (12x16 см) на приборе Ыультифор (LKB, Швеция) в соответствии с рекомендациями фир«ц в диапазоне рН 3.5-9,5. Изофер-neimmfl анализ нспартвтаминотрансферазы проводили в 7,5? солиакрал-амилпом гело на приборе Трупеллера (1975) о гистохимическим окрашиванием прочным епшм "ЕБ" при 37°С (Корочиш, 1977). Окрашенные и еггитые гели денситометрировали с помощью сканера для анализа геле;';, установленного на спектрофотометре Сиекорд-ШО (ГДР). ИК-опек-тpfj получали на приборах Спекорд 75 UR и Снекорд М-80 в области 1100-4000 см"1.

Н-опектры легкораотворимых белков-исследовали на спектра{ото-

метре Спекорд Н-40 (ГДР) и Ди -7 (США), спектра флуоресценции - н» спектрофлуориметра ЮТ-4 (Япония). Спектра кругового дихроизма (КД> измеряли на приборе ДХР-2 (СССР). Оптическую плотность КД рас очны вали на поглощение 1#-ного раствора в I ом.клвете. Пептидные кари; трилтичеоких гядролазатов альбуминов получали двууернсЯ тонкослойной хроматографией на плаотинах " Ьиоот " (ЧССР). Окрашивани-.; пластин осуществляли раствором ниягидрина (Девени, 1976).

Статистическуп обработк*- экспериментальных лонных проводили н ЗВМ СМ-4.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЧССЛЕДОЗАНИЙ И ИХ ОБСУЭДЕНИЬ

Харзктб .лютика суммарных легкорзстворлмых балков обычных и мутантных форм кукурузы. Введение гена опейк-2 в генотип кукурузы вызывает повышенное содержание легкорастворимых белков, сбзланси-рсванных по аминокислотному составу. Наряду с количественными изменениями в составе водораотворимйй фракции высоколлзиноэой кукурузы наблюдается ряд качественных отличий. Презде всего это касается компонентного соотава. Методом градиентного электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия установлено, что количество компонентов у мутантов по сравнение о исходной кукурузой снияаетоя по линии А 204 с 31 до 28; иг 9 о 29.до 25;.я 155 с 30 до 28, а у линии к 64А - повышается о 30 до 32. У легкорастворимых белков зрелого зерна в^ .юколизпновой кукурузы всех изучаемых линий наблюдается пов^эние содер.чвния аолипептпдсв о 10000-13000 , 2331 >0, 33000 , 56000 и 76500 Да (рис. I)..

«t» ••» - »

* CJ«*^ ¿ta*- 60000

.....ó ,'»■ '¿

i; ? .. ♦ 'i 45000 - - T. Ck 3300Q

i-i — «i *"• ry.„ Ц.:* 23300

. <H fir i

. 12000

+ i I I I I I I I I 'Г I г 3 4 5 б 7 a 9 I

Рио. I. Градиентный sds электрофорез ' альбушшо-глобулино-вой фракции зрелого зерна с лгшой и му-тантной форм кукурузы;

1 - отан;::ртгщв белки - питохром С, альбумин яичный, каталаза;

2 - А 204 +/к;

3 - А 204 сб/сй;

4 - wf 9 +/+:

5 - Wf 9 о2/о£;

6 - W 155 +/+;

7 - w 155 о;;/с2;

8 - У/ 34А е А •

9 - w 64А с2/о2

Изучение гетерогбпяоота аадсраот®ораках белвоз по дняи оозро-ванил позволило уотавозить, что качеотвашшэ кзчонопея приоутотву-ют уже на раияих стадиях рапвнтия еерлошш ьгуталтных раотаиий. Максимальное оодоркапив белка а ооиах в шестая гетерогешюоть приходятся на 22-29-0 донь пссдо ошланал а ооападзэт о порлодоц интенсивного оиптззз оаяаошх бежеш. 1

Некоторые ра$£пчнл о структура адьбукшов Ешгелоюг ыатадоы пептидного картирования. Пра апелвго пептидна* кар; традтичаскшс ; гидролнаатов обнаружено, что ояьбумшы ьыооподиэиновоё кукуруза 1 отличались количеотвоы. полоягнвсы а вятевсавяоотыо ряда пептидны* фрагментов, что особенно 1лрасапо для пептидов сродней подвахясота (рис. 2).

Рио. 2. Пептидные карты альбуминов «сходной и мутантной кукуруаи: I - А204 + /+: 2 - Л204 о2/с2

Результаты исследований опектроя КД-вльбуьшнов различая генотипов кукуруза указали на различил их пространственной отруктура. Так, у водораотворимух белков нутантнцх растений наблюдали незначительный сдвиг (1-3 ни) основного максимума (200-220 км) в длинноволновую область и изменения положения и интенсивности дополнительного максимума, выраженного в виде плеча, что может быть вызвано модификацией параметров вторично!! отруктура и степени ассоциации с веществами небелковой природа. /

Качественные и количественные изменения в альбуминах внеоколи-¿инозоУ кукуруза подтверждены данными, получешшми при гель-фпльт-г.удии ни скЗадег.ое г, -100 и обраиенио-1,'а&овой. хроматографиа. Иро--л~'я.»гл 1\-чь-с? ильтрацгл: .альбуминов сбичной к опЫ'.к-:-? кунуруэ.у

з сонозноа оходиц, но нйблвдмзто" различия в оодерппплп и молекулярных ыаооах беляоэ в области », "I0000-I3000 п 76COO-77ÛOO, что согласуется о дантга пх ксмяопэнтясго состага, В альбуетшах :г?ку-рузм опейк-2 обнаружено увеяачепяе оодергакяя супэрлдзпяошх фракция, что, по-вадамоиу, кисет вааясо эначенло э удутвзшта качества зерна.

Прзяэнеине Еыооког'йвятглпоД гндкостпоЗ хромзгогрз1ял, обла-дассей Еысояоа разрепзкгоЗ способности, аозволлло гдеятп£яцзро-эать в составе ойачяоЗ пуяурупы 12, з у гиооло-тазяковоЯ 17 беляо-сих ксцпояёдхсэ (ряс. 3).

о.ю -

0.05

I

100 80

S0

jULwLJ

40

2û

\л Я

'j:

О 10 20 30 40 50 GO ,ипл. . 10 20 20 40 50 60 Рпо. 3. Разделение альбуыалсв b3i0c исходной а ыутаятяой нулут лршл А 204. Колонка 20 си; неподвижная $asa Лпхрооорб ЕР-18 (5 ши), злюент адетонитрал в 0,1?» трифторупоуопой киолото. градаш^от 15 до gg<? ацетонятршгэ а течение 60 ¡>2Ш. I - +/+,

Спектрально-фяуоресцаятгсгэ исоледсадпия бэлкоз альбугано-гло-булияового комплекса таяяэ'свидетельствовала о некоторых изиепэна-ях физино-хпмичеокпх свойств баллов кутазтщх генотипов. В НК-опек-трах исследуекых й.^букяноз нгблгдле:,г;е полом поглсзэ.тая амид I (1652-1660 см"1) а П (1535-1544 а."-5) ~гсс~о рззрепеЗн для протеинов с&'.чпцг. и мутаптгглх аналогов. Полое-зкпз уэкспмумов изгоняется в зависимость о? пркро*а беязсзсго препарата, что иозет Нить овязаяо яак с рззлзчвв.ч долнт;зст£еяя:н соотяогаяле:.; тирозияоглх п трзптофаногух covaiKoa, гол л о утарэнке« мэпопмуга воглокенлл з результате воздпйстгсш на хрогофорлио оиогека лрсцосооз ззаикодойот-Б11л бзлкссой :4з:?рс:!олзкул! о аебэаковцки векзогаага. йяуооэсцеагкю характеристики водорао1.-,орп;."«с ¿•-¡«ко,' опредсд/.ег/кв трчпто$лйо->7'.5 $луорс£ором, 1;од'хлехлд1:.п укпзошпда эксе заколсмсраости.

Ревев уотанозлено, что л пльбунаяпх кукуругн oncfi;<-2 эдвоо зо-аикеио содержание асглрагинозоа этолога ц пошго.чо оодерганяо

аланкаа, . зтионана, валпна. Повышенное подерганио аспарагиновой кислоты определило лнтерос к изучении ферментов, учаотвугадих в es синтезе - аыииотрано^'-разаи.

Ашивнорть Ферментов пе'реатяшювания протеина в зерне к.укуцу-at, ра^щчних .е^отипов. Исоледов .шя активности аминотрансфераз в алИумг-шх исходной и высок з1зиновой форм кукуруз:/ позволило выявить некоторое закономерности, характернее для эндосг^рмовых мутаций типа о2. Нами установлено, что ь зрелом зерне юысоколизиновой кукурузы активность аопартатамкнотраноферазы повышена в 1,4-2 paya, а ала..лнаыинотраноферазы в 2,0-^,5 раза пс оравк нап с ой шой фор. ja (табл. I).

Таблица I

Удельная актпвнооть фе; ментов »юреамшишования в зерне ^.сходной и мутантноР кукурузы (нмоль пирувата/мг белка мин ) *

Гоьохкп кукурузы Год ропродулдаи

1933 ISS4 1985 1986 1987

Асчртатамгчотрансферазг

А-204 +/+ 12,45 9,13 10,41 9,33 . • 15,86

А 204 02/сЙ ' 24,95- 16,28 7,80 22,22 * 25,18

W 155 + /+ 9,20 10,32 е.13 ' 6,06 V ,18

w 150 02/ей 19,33 19,90 14,23 10,44 • II.S7

vi 9 +/+ 10,12 10,42 12, II 17,33 11,70

v.í 9 02/о2 16,12 . 17,40 19,73 26,44 21, Ы

« 64 + А . 14,86 ' 16,30 12,35 5,33 14,30

V 64 о2/сй 2^,44 28,29 20,26 9,77 23,65

Лланина «яшотра г,сфер а за

А "04 + А . 20,43 18,34 19,31 21,09 26.20

Л 204 о2/о2 55,36 '12,54 52,52 81,46 68,18

w 155 + А 9,36 11,43 10,32 6,06 12,20

• 155 о2/сй 28,17 37,71 36,12 22,'18 56,12

v;f э + А 9,18 7,41 9,48 8,33 10,90

Vif 9 с£Г'ей 27,17 23,78 29,3*. 24,71 42,60

Ь4 +А 12,48 12,77 ' 8Д2 4,22 10,82

w 64 о2/о2 37,04 39,60 28,41 14,22 27,24

* Значения доверительных интервалов для каждого статистического ряда не превышало 5% от средних .■

Введете в генотип кукурузг генов su2 и v/x такт приводило к повышении актианоотя ферментов переаминирования. В0личипк 'дельной активноота ААТ и АЛТ в опейя-2 генотипе сравнимы о актавноотя-т ооответотвущих *ерменто' для каждой изучаемой линии, ощерявшей генн 5и и

Р геторозиготпнх по гену опейк-2 формах куиур: а we обнаруяэ-но значительного повышения активности аспартат- у олапкнамипотран'.; фзраз, как это отмзчнлг ъ в гомозиготном мутар'т.см гзнотлпе.

Найдонше разлачая по урозвь активности ферментов пзреямапиро-ванил, г'лвленные в зрелом зерно, оо.\-ранялись н протяженяг всего периода созревания зерновки.

Harm установлено, что'«езду показателями активноота ферментов парзаминированая кукуруза, различной би'югкчеояоа "еннооти зерна оувдотвувт корреляционные зависимости. Так, коэффициент реляции между удельной антиэьоотьв аспарт; 'аианотран^ерасм походной и т-ооколизановой кукурузы равеи 0,91. Между активностью ртаяивакино-трайсфрраза походной и мутаятной onefe«-2 кукурузы таиаа наблюдалась линейная зависимость (г = 0,89). Установлена ио^ожител*чая корреляция меаду активностью аопартатаминотрансфоразц а-оодергаиием лизина з зерне (г з 0,78-0,87), меаду актизноотью ААТ ц'г^яачоством асппрэ-гиновой киолоты в альбуминах (г= 0,67-0,91).

Полиморфизм спартатам-чотрансферазы в зерне кукурузы различных генотипов. Изучение общей античное л ферментов переаминироэания не раскрывает всех причин, вязивапцих 'кзмэпения энзима а мутант sx растениях. Поэтому нами было проведено изучение ns {ермзвтноге ■ счектра аспартатамянот^ансферазы.

У изучаемых нами линий кукурузы опектр'ААТ зерна ооотсвт яь трех характерных изоферментов: митохондраального, цитоплазматачес' йоге и глиокоисоыального, ксторче имеют различную водвианоить при электрофорезе и связана о определенной оубклат-чней фракцией.

Сравнительное изучение изофермзнтн' ""о опектра аопартатамино-траноферазц показало, что в мутантныл ртотениях происходит количественно перераспределение олекулярных форм зпзима, о увеличение содержания глиокоиоомальной фракции.

С одержана о аг 'явного белка мятохондраальной иэ"фор?я£ составляло у мутаптного образца 8,» против 12? у обычного; дитоплаг"этичео-'•зй - 9% против 16%; глноксисо'ляьной - 83% гпотив 72*.

Изоферментннй спектр А/ф в процессе онтогенеза претерпевает изменение и полностью формируется ч 29-му дя:о с зрзват.зерноЕчх, достигая максимального содержания активного белка a изоОлрмах.

¥ _ __ _ _ — — — _ ___ — — —. — — А(Л_2

I

с □ п в ЕЭЕЭЕЗЕЗтаШ!

□ О □ □□ 1

' I 2 3 4 Б 6 Ч В 9 10 II 12 13 14 15

Рио. 4. ИвофвриентЕьгЯ опектр ААТ швллчшг данай кукурузы (л оку о Ля*-3 - иитохопдряальпая; лояуо А^-й - растворимая; локуо Айг-1 - глиокоиооцальная)

I - « 155 +7+; 2 - н 155 с2/сй; 3 Э +/+; 4 -М 9 о2/сС: 5 - А 204 +/+; 6 - А 204 о2/сСг 7 -V 64А +/+; 8 - « 64А <£/<£; 9 - о2/с£зи.2/аи21 10 - Г 23 о2/о2 7«*

И - оЬ 43 ог/(й зи 2/пи 2; 12 - А 293". о2/о2 2/3и 2; 13 - МК о2/о2 а и 2/ Зи 21 14 - А 632 сй/сКаи 2/ Зи 15 - А 619 о2/о2 а« 2/5и 2

В тканях оозрззащого зерна набладается закономерность, уотансшлвн-ная для зрелого зерна, т.о. изыеняотоя ооотношзнае белко в взсфор-изх и увеличивается содержание гяиолоасоиадьноа фракция, что согласуется с дойными'по определению ойдой активности форыента в процессе онтогеноэа. Увеличение активного бедка в гдаог.овсоыох способствует ацифаквцаи среда,' что облегчает функционирование гидролитических ферментов (Ксдугина, 1980) в коррелирует о повияоппоА актав-ноотьв иротеиназ в ыутаитвоы генотппо.

Методом изоолектрофокуоировашш па плаокше било установлено (рис., 5), что кагдая аз пзоформ содержат 2-3 субъедашщы. Изозлект-раческие точка компонентов глвоковоогтьной и цатоалазыатическоП взофорц находятся в узкой интервале рН 5,35-6,35, тогда как цито-хондриалышй изофермент прздотавлеп тропя субъедашщами о р1 8,08,2. Било обкаругено, что оубъедишшн кыевт разлч-и.у э ферментатив-нум активность. В ыутантнцх генотипах проаоходьу перераспределение активного бежа в оубгеданицах, чю оказцвается на общей актиьнооти. Денная закономерность отмечено не только у гомозиготных,но и у гетерозиготных с2 мутантах (рис. 6).

Таким образом, повнпепная активность фермента в мутантшх растениях обусловлена как количественным перераспределением изоформ ААТ с увеличение» содержания глиоксиоомальноЗ фракции, так и изменениями в соотношении активного белка в субъедашщах азозимов.

Рндаление и физико-химические? свойства аспартатамппотрансфера-зы из обычной и кутантной кукурузы. Для дальнейшего выяснения при-

Рис. 5. ЙЭО альбумпноп мзлячлшс ляизЗ пулуруэн (а гиотохямичео-хяи скрсятванием m ЛАТ):

I - V 155 +А ; 2 - я 155 <2-<Й; 3 - ЯГ 3 «7+ ; 4 - wf 9 o2/cß; 5 - Л 204 */V : б - Д 204 а2/сй; 7 - ff fil +Л ; 8 - W cß/cß; 9 - » 64 о2/о2 su 2/3U 2; 10 - Г 23 о2/о2 их Дх j

II - oh 43 02/с2 3u 2/3u 2 : Т2 - А ?95 о2/о2 Зи 2/Яи 2; 13 - Мк 02/С2 «и 2/Зи Й; 14, ~ Л 623 о2/с2 Зи 2/Su 2;

15 - А 619 о2/о2 зи 2/зи 2

Ркс. Г>. Лепситограм'од компонентов попяртата'.'шютрпноГеразц различиях генотиьов линии w 155 поело изоэлектроЯскупировплия:

1 - • м ; 2 - м-3 --МЙ02; 4 - о2о2сй

чин "овцшзиноЯ активности.АЛТ в зерне мутантн>'1 кукуруаы проведено выделение и изучение физик о-химических свойств препаратов энзимив в оравни'1.зльноы аопек'те. Оонолные атадии очиотки приведеш в табл. 2.

Табл* .а 2

Очистка яспартатаминотх :нсферазы ев зерна кукурузы (200 г муки): I - А 204 +/+; 2 - А 204 с2/с<?

Стад„л

Сумма; :шя активность

Удельная активность, Ч/нг белка

Выход, % Очистка

Экстракция (1:6 трис НСI рИ 0,6)

36940 61300 32,40 4^,00 100 100

86 86

Осаждение .

(40-75$ нас; д.) .31815 5^720 65,00 96.60

Ионнообменная хроматография

I О 04М ИвС!

Г.о

2,0

1,0 1,8

П 0,1 М Ма01

14125 22605 ИЗО 1650 38 37 4780 9240 126 230 13 15

35,00 36 ,п 3,0 5.0

Количество выделенного фермента из мутантной кукуруаы и его удельная активность были несколько гыше, ч*м у Зычной. Изоэлектро-фс успровшше . репарата показало присутствие изоформ ААТ с р1 5,1, 6,0 и 6,3.- Компонек-'а о р1 6,3 были выделены в гомогенном .состоянии методом препаративного "зоэлектрофокусирован я из различных генотипов кукурузы. Молекулярная маооа полеченных компонентов, по данным ге ь-фильтрации на С-100, составила 78000 для обычной кукурузы и мутантной 76000. Исследования компонентного состава ААТ методом электрофореза я присутствии додецилсульфата натри (при вос-стаг влинии и без воостановлегчн 2-меркаптоэтанолом) свидетельствуют о том, что молекула фер-знта соотояла из двух одинаковых по-липе..хидкых цгчей с 3900С для обычной кукурузы " 38Ш0 для мутантной. Проба о реактивом Эллкана оказала наличие одной свободной зн -группы в молекулах анализируемых компонентов. Аспаргат-а^нотра-■ афера за из различных генотипов имела одинаковый оптимум рН 8,018,5. Аминокислотный состав ААТ, выделенной из обычной и мутантной кукурузы, характеризовался высоким содержанием остатков лпзшш и других незаменимых аминокислот, низким - пролина и глицина (т^бл. 3).

Изучение спектральных свойо в лрепаратог аснартатаминотранофе-р&оы . жазал^, что ро^ фермента имели с "отите спектры в видимой и

Та йгг.цэ 3

Аггапогшологныа соотгя компонентов оспартагмхнотрапофзрягы обачноЯ и оппйк-2 фор?! кузуруп!

Чаоло сстоткся

Аыяпсяясяота ■ -----

А 204 +/+ А 204 с2/сС

Лпвяп 17 22

Гастидг.я 16 20

Аспярлгшюзал кислота 33 34

Трсогшн С 7

Серии Ц 10

Гдутаиавовая кколота 45 44

Про лнн 15 9

Ада пап 17 16

Гяляан 20 13

1/2 цаотая 3 3

Воянп 16 16

Мвтиоиия 3 2

ИзолеЯдиа II 12

Л ой1нл 19 25

Тирозип 13 15

Фениладанад 22 19

Обзее количество остатков 291 283

Молекулярная насоа 29000. 37900

ближней ультрафиолетовой областях о характерными мзкоимукамп, обусловленными овязаяпны о бедном пирддокоаль-Р; при 430 нм (рН 5,3) а 354 ям (рН 8,0). Каждая молзкула энзим о оде рта л з да а молекулы пи-ридоксаля. При изучении опвктров флуоресценции отпечено пекоторсо изменение квантового выхода флуоресценции у компонентов ЛАТ лсходно,кукурузы ( цв 0,070), по сравнении с мутантной ( 0,030), что свидетельствует о разной степени экранирования остатков флуоро-форов в белковой молекуле. Рассчитангае значения аннаотрошш флуоресценции для этих белков (0,060-0.066) невелики и варьируют а зависимости от генотипа.

Таким образом, сравнение результатов исследований овидетальо вует о наличии значительных различий в физико-хп.здческих сэоЯотвзх индивидуальных белков аспартатаминотрансферазн ваооколизинотй кукурузы по сравнению с обычной формой.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для селекционной практики предложено два новях зкспреоо-мато-де обнаружения мутавтгшх опейк-2 форм кукуруш при ыасоовой оценка селекционного материала:

- по повышенной октквноота оданинаминотраноферазы1в зерне;

- по пониженной активности аспартаташшотрансферавы в вегетативных органах кукурузы в процесса созревания еерновки (Авт. свид. СССР Я 1472000, опубл. Бюл. 15.04Л989 г.).

Показана перспективность проведения селекционных исследований га основе отбора форы кукурузы с высокий содержанием лизина в индивидуальных компонентах легкорастворвмых белков.

ШВОДЫ

1. Суммарные легкорастворимые белки мутантной кукурузы по оравнонию о обычной характеризуются измененным компонентным, пептидным, аминокислотным составом, спектрально-флуоресцентными характеристиками, интенсивным накоплением белков о М 10000-13000, 23000, 56000 , 76500.

2. Альбумины верна ьыооколизиновой кукурузы обладают повышенной в 1,5-2 раза сктввноотыэ аопартатаминотраноферазы и в 2-3 раза аланинаминотранофераза,-

3. Показано, что. активность ферментов переаминирования в альбуминах обычной и мутантной кукурузы связаны между собой линейной зависимостью. Изменение активности аыинотранофераз в созревающем

о зерне мутантов сопряжено о повышением активнооти протеиназ.

4. В мутантяоы генотипе изменяется полиморфизм аопартатамино-трансферазы, происходит как количественное перераспределение молекулярных форм знзима и увеличение содержания более активной глиок-сиоомальной фракции, так и изменение соотнесения активного белка в субьедишщах изофермептов.

5. Выделены индивидуальные компоненты ААТ обычной и мутантной кукурузы. Установлено их различие по аминокислотному составу, молекулярной масое, спектрально-флуоресцентным характеристикам, пространственной структуре.

6. Повышенная активность ААТ в зерне опейк-2 кукурузы обусловлена рядом факторов;

- увеличением на 20% содержания фермента в выооколизиновой кукурузе по сравнению с обычной;

- количественным перераспределением изсформ энзима и увеличением содержания (Змее активной глиоксисоыальпсД фракции;

- изменением соотношения активного белка в субъединицях изо-

ферментов.

7. Разработано два теота па шявление мутантных форм кукурузы

по уровкв активности ферментов переамянарования.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАНИЯ ПО ТЕМЕ ДИССКРТАШ"!

1. Коцюбинская Н.П., Бильчук B.C., Мяроа О.Г. и др. Изучение активности ферментов а ингибитора трипсина з прсцеоое созрегапия зерна кукурузы // Тез. докл. Второго Всясосзн. совец. по физиологии кукурузы. - Днепропетровск, 1994. - С. 91.

2. Использование белков кок маркеров генома при ооздянии выосяолп-зиновых мутантов /А.В.Винлаченко, Н.П.Коцвбяяокоя, Л.В.Шупра.чо-Е8, В.С.Бильчук, Н.И.Штеменко: Тез. докл. У оъсэ^а Всеооиз. общества генетиков и селекционеров. - М., 1987. - Т. 4, ч. I. -С. 80-81.

3. Бпдьчук B.C., Василия Е.М., Коцюбинская Н.П. и др. Сравнительная характеристика альбуминов пиходшх п мутантных ферм кукурузы // !,Материалы У Всесовз. конференции молодых ученых по проблемам кукурузы. - Днепропетровск, 1907. - С. 241.

4. Бильчук B.C. Влияние fiyTOUTirjx генов на активность и изофермеат-ный спектр аминотрансфераэ кукурузг: // Биохимические аспекты действия мутантных геноэ на белки кукурузы: Сб. пауч. тр. -Днепропетровск, ДГУ, I9C9. - С. 63-79.

5. Биохимические методы диагностики качества зерна /А.Н.Винниченко, Ю.В.Донченко, И.л.Филоник, В.С.Бильчук, Н.П.Конибинская: Матори-алн Всесосз. конф. "Диагноотика-89". - Куйбышев, I960. -

С. 35-:;G.

6. ¿еденко B.C., Филоник И.А., Бильчук B.C. и др. Биохимические методы идентификация эндоспермовых мутантов кукурузы // Методы интенсификации селекционного процесса. - Одесса, 1990. - С. 66-67.

7. Коцюбинская П.П., Бильчук B.C., Виннпченко АЛ. и др. Характеристика ферментов переаминированкя у мутантов кукурузы с измененным аминокислотным обменом // Тез. докл. науч.-техн. конф. "Проблем; азотистого метаболизма". - Волгоград, 1990. - С. Г;2.

8. Коцкбинснш H.Ü., Бильчук B.C., Шупранова Л.В. Генэтпчос..и? контроль пножеотвешмх форм асппртатаминотрансферазц у внооксли-~1и:-:г,ч.ч путлш'ол // Тез. док.т; УП Всеооюзн. симп. ".'.олекуляг!1ке

гензтвчеекгх птодсссов". - V.cckh», 12'. Г. - о. i г-г».

9. Федшмо B.C., Бьльчук B.C., Стружко B.C. и др. Спектроокопия белков кукурузы. II. Альбуианы П Хшшя природных соединений.-1<>Л. - й 4. - С. 546i-553.

Iü. Вишшчеяко А.H., Бильчук B.C., Феденхо B.C. и др. Спектральные характеристики функционально активкцх белков кукуруза // Тез. докл. УП конф. но опектроскопии баополиыеров. - Харьков, 1991. - С. 44-45.

11. Б!льчук B.C. Актшш1сть та ф1зиио-х1и1чн1 влаотивост! фериен-т1в азотного oöulny-npa ендо- I екэогенному вплив! // Тез. П Укр. б1ох!ы. зЧзду. - Kuli), 1992. - Т. 3. - С. 5.

12. Бильчук B.C., Кгцябинзкая И.П., Щупранова Л.В. Изменение функционально активных белков зерна как результат экспрессии иу-тантного геноыа кукурузы // Тоз. докл. Второго Всеоовзн. общества физиологов растений. - M., 1992. Ч. П. - С. 26.

13. Yiixniohsnko Л.П., KotcuMnakay а II .Ft, Bilohuk V.S., ?llonik I.A. L'itro¿en cotcb olien «iiiycjo end serine protease inhibitors of high lytiina Balee // Abo 19th PE33 Bsetlas.-PoEo, 19Ü9, P. 196.

14. iiilohuk V.O., Kotsybinckegra K.P. Identifieatlon of tha hijjh lyciue Kidit ferns tooardino to (uspcz-tato ouinotrслвГегasa f о at иг a о // J. Coll. Blooh. Зцр. - 1990. - HE. P. 347«

15. Koteybinskeya Н.У., Bilohuk V.S. íijohbnloa of the protoin Kutuiity tmd ßulity regulction in r.nlso grain of tha high lyoine nut ante //J. Call. Bioohsn. Sup. - 199O.-R. 518, , P. 351.

16. Bilohuk Y.S., Kotoybiteknya H.P. QurilltatiTe and guantita-tiva ohungao of the Wetcr-Golt soluble protein in high lysine mutant of Eaize // Abs. 20 FEBS 1:0eting .-Bude?out, > 1990.-P. 175.

A.o. Л 1472000. Способ оценки селекционного материала кукурузы но выявление гена оиейк-2 П Винниченко А.Н., Коцюбинская Н.П., Донченко Ю.В., Зинченко Н.Г., Бильчук B.C. // Открытия, Изобретения. 15.04.89. Булл, й 14.