Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности белково-протеиназного комплекса зерна амаранта

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности белково-протеиназного комплекса зерна амаранта"

ГОСЭДАРСТВЕНННИ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИЙ ПО БЙС0ЕМ9 ОБРАЗОВАНИЮ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

Р Г Б ОД

2 1 АВГ 1995 На правах рукописи

ТРАОРЕ НИССИ

УДК: 57?.112.7:604.644.33(043.3)+ 884.64!.19;582.663С043.3)

ОСОБЕННОСТИ БЕЛКОВО-ПРОТЕИНАЗНОГО

КОМПЛЕКСА ЗЕРНА АМАРАНТА

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискании ученой степени кандидата биологических наук

Москпа-1995

Работа выполнена в Московской Государственной Академии пищевых производств.

Научный руководитель; Доктор технических наук, профессор Карпиленко Г.П.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук,

профессор Мосолов В.В.; Кандидат биологических наук, доцент Шаненко Е.Ф.

Ведущая организация - Всероссийский центр по оценке качества сортов сельскохозяйственных культур.

Защита состоится 1395 г. в __|_0- час.

на заседании диссертациониого Совета К.063,51,06 при Московской ордена Трудового Красного Знамени Государственной Академии Лицевых Производств по адресу;

125080, Москва, Волоколамское шоссе, 11.

С диссертацией моино ознакомиться в библиотеке МГАПП. Автореферат разослан ''¿й,,_А.!С\^-сМи995 г.

Ученый секретарь диссертационного

Совета, кандидат биол, наук, доцент Т.Г. Генералова

о

- 3 -

ОБЩйЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

йктцальносгь тени". Протеолитические Ферменты и ингибиторы протеаз играют ватную роль в целом ряде -технологически* процессов. Достаточно хорошо изучен« протеолитические Ферменты и-их ингибиторы основных зерновых культур , используемых в хлебопекарной промышленности. Многие протеазырастительного происхоядения выделены в виде высокоочищенных препаратов, их свойства хорошо изучены. Что касается протеаз и ингибиторов протеаз зерна аыаранта, сведения'о них в литературе практически зтсугствуит. 3 свете использований иики амаранта в качестве сырья а пищевой промышленности, з частности - добавки при выпечке пвеничкого хлеба, изучение белково-протеяназного понгазкса зерна амаранта представляется весы/а актуалышм.

Цель и задачи исследования. Цельв работн является изучение комплекса протеолитических формантов и ингибиторов протеаз, выделенных из зерна амаранта.

Б соответствии с темой исследования были поставлены сле-дупцие задачи:

- выделение и характеристика протеаз амаранта, извлекаемых дистиллированной водой и 0„35^ раствором Ка4С03';

- исследование протеолитичеекого комплекса зерна амаранта с использованием гель-хроматографии;

а

- выделение ингибиторов собственных протеаз из зерна амаранта и их характеристика;

- исследование влияния активаторов "и ингибиторов на протеолитические ферменты амаранта;

- изучение взаимодействия протеаз и ингибиторов протеаз из зерна амаранта и пиеницй.

Научная новизна. Проведением комплексных исследований протеолитических ферментов установлено наличие в зерне амаранта двух групп протеолитических ферментов: первой - извлекаемой дистиллированной водой, и второй - извлекаемой 0,352 lucitiuiiuM На2С0з.

В водорастворимой фракции обнаружены четыре типа проте-аэ, проявляющих активность ири рН 4.25, 5,10. '/.20 и 8,10. Среди протеаз, извлекаемых 0,35'Л раствором На^СО^, показано наличие пяти типов протеаз имеющих оптимум pli при 5,65, 6,05, 6,40, 6,?5 и 7.50.

С помощью гель-хроматографии на колонках с сефадексом G-IOO и G-75 определены молекулярные массы исследуемых ферментов .

Из зерна амаранта выделено два типа белковых ингибиторов.

Изучено взаимодействие исследуемых протеаз амаранта и трипсина с белковыми ингибиторами, выделенными из этого зерна.

С помощь» автолиза установлено, что в смеси муки амаранта и пщеничной муки имеет место слояное взаимодействие протеаз и ингибиторов собственных протеаз зерна амаранта и пшеницы.

Практическая значимость работы. Полученные в ходе проведенных исследований результаты расширяют представление о

л

комплексе протеолитических Ферментов и их ингибиторов зерна амаранта.

Результаты работы открывают качественно новый подход •1 ри использовании муки амаранта в пищевой промышленности.

Апробация работы.Материалы работы были дологзни на рас -

ширенном заседании кафедры биохимия и зерноведения Московской Государственной Академии пищевых производств (1995) и Юбилейной научной конференции, посвященной памяти Я.Н.Куприна (Москва. 1995).

Публикации. По материалам диссертации о публиковано 2 работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введе-

ния, обзора литературы, материалов и методов исследований,

экспериментальной части, выводов и библиографии. Работа из-101

лояена на^траницах машинописного текста, содержит ¡2 таблиц и 13 рисунков. Список литературы включает 224 источника, из которых 120 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Экспериментальная часть.

Работа выполнялась на кафедре биохимии и зерноведения Московской Государственной Академии пищевых производств.

1». 1. Объекты и методы исследований.

Исследования проводили на. зерне амаранта сорта "Спартак" урожая 1391 года.

При исследовании были-использованы как общепринятые методы анализа, так и специальные: спектрофотометрия и гель-хроматография.

Все работы с ферментами проводились с учетом' законов кинетики ферментативных реакций. Их активность определялась по начальной скорости реакции при насыщающей концентрации субстрата.

Выделения ингибиторов проводили по Йль-Рахиунц (ингиби-

- 6 -

тор I) и Ибрагимову (ингибитор II).

1.1. Определение' оптимума рН протеолитических ферментов амаранта

Для определения влияния реакции среди на активность протеолитических ферментов амаранта использовали ферментные растворы, полученные путем экстракции протеаэ дистиллированной И 0 и 0,35Я раствором НагС0д,

Определение влияния рН среди на активность протеаз амаранта, извлекаемых диет. Н20 проводили в диапазоне рН от 3.0 до 9,0.

Определение влияния рН среды на активность протеаз амаранта, извлекаемых 0,352 раствором На^СО^, проводили в диапазоне рН от 5,0 до 9.0.

При определении активности протеаз амаранта в качестве субстрата использовали 0,5Х раствор бычьего альбумина.

В результате проведенных исследований установлено, что максимальная протеолитическая активность проявляется при рН 4,25, 5,10, 7,20 и 8,10. В кислой зоне рН наибольшей активностью обладавт протеазы, имеющие оптимум рН при 5,10. В щелочной зоне рН активность протеаз наиболее ярко выранена при рН 7.20.

При определении влияния рН среды на активность протеаз амаранта, извлекаемых 0,35Х раствором НагС93. выявлено пять значений рН, при которых наблюдается максимальная протеолитическая активность. Четыре из них расположены в кислой и слабокислой среде (5,65; 6,05; 6,40; 6,75) и одчо в слабощелочной среде при рН 7,5.

Таким образом, иойно говорить о наличии в зерне амаранта четырех типов протеаз, извлекаемых диет Иг0, и пяти типов протеаз, извлекаемых 0,35?. раствооом На,СО,.

2 о

!.2. Фракционирование протеаз амаранта на сефадексе &-75 и й-100

Исследования по разделению протеолитических ферментов проводили с покощьй колоночной хроматографии на сефадексах С-?5 и й-100. Фракционирований подвергли водорастворимую Ферментную вытяжку и вытяяку, полученную экстракцией протеаз -0,35% раствором НааС0?.

Оценку Фракций, обладающих геополитической активностью, по молекулярной массе осуществляли по калибровочный кривум.

При фракционировании протеаз, извлекаемых диет. г^О, установлено, что исследуемые протеаза имеют различая по молекулярным массам. Максимальная активность протеаз с оптимумом рН 5,40 наблюдается эо Фракции, которой соответствует молекулярная й'асса "23000 Д. Протеазы, имение оптимум рН при 7.20« элюируются во фракции, с молекулярной массой 61500 Д. Лротеаза с оптимумом рН 8,10 икевт молекулярную массу около .30000 Д. Что касается протеаз с оптимумом рН 4,25, то они элюируются во фракции сразу после выхода свободного объема. Последующая гель-хроматография этик протеаз на колонке с се-фадексом 5-100 тзкае не позволила определить их молекулярную массу, что позволяет сделать вывод о тон, что нрогеаза, имеющие оптимум рН при 4,25. имеют молекулярную массу, превышает, 'ш 100опо д.

с -

Ирогеаэи. иэрлеиаемые 0, ï раствирии tldzCtíj. Фракфш-нирииали lia нилинке с еефа;;е! ом i00. При определении ак тчинисти & jísujiycMiiX при pif 5,65 установлено, что

иротс-гзи ари гти» значении pH. имеют дна иаксанума. соот-bun 1ьувкид 570Ö0 Л и 38000 ft. Ири определении сшпшиисти iipofsai при . pH 6,öS актиьность иритеаз обнаружена ьо фрак-цшг, '.иотоегстьуиией 57000 Я я фракции, цитируй соответстау-sT мелекулзрна* aact-t, ЗЬООО Д. При определении актиьнисги притек при pH 5,40 такае наолвдает^й дви пике актииносги, каторин ^иотиететииет иояейь'ларнае «accs SbööO и 52000 Д. При psi b.?5 ¡и0Л|)р.автся только uwíh пик иитииностк с милеку-длрнок иассий 43000 й. ¡Ipü ¡.-йредалйнйн здтишшсти uporeai lip и ptí p-jíiiíu» ?,'jû HdhcHUdiibiiuVt актйьнисть на&лвдается öu фракциях с яи^е.чуяярнийи насс^и Ö50ÖÖ v. 5700Ù ft.

ciuilctubjïaiine данных. на|.чштеркэувикх распределение ис-.лскускух ¡ipcreaa, 5«эеяек<1бичл O.'ibZ pdCTBupua Sj^CÜ^, по «KfSeKyjiSPHUH «iâtCoK, ilÜJL4'JiJ»ef нредиолинить. чтс Наличие дьух. (1и«оь âtcTHbhUCU! протеа* ь ходе ииределеиаи up* Ш S.üí»; ü.O'j: ó,40 и ?.5C ооусла&лено их ьэ<1И«нш< щжсдтстояек е ферментном pacTbuptí. В силу лиги иилни считать, что nj/ofca-Ji¡ г иптиауиом pli 5.В5 иик»г кияекулириу» «jcco TliüOO Л, ¿ ■jíiTHKijiíüK pii ü.05 - 57000 Д. Для приfem, ¿шсецпл очтшу« ¡¡И нря о,40 и 7.50. с out bfc ti'tl* вшш иовбдесб ьсризшшвй sSbfitfttfci; молекуларнае «ассы 52010 Д к bSOûû Д.

i Л. Исследование ш;ншш» амгиьато^и и »uruöinupou

на протезу ачариига

& uâbuîe в зачеиве ингизширос sipo г си з dsi-jpdíira ис

пользопаяй раствор ЗЛ70 с клнцентк.цией 0,2-10 Я и раствор

.у

ПХНВ при коипеитръпт 0,М0"!1. В качегтзе активатора ис-пользовзля 0.5Х расттр аистеинэ.

Результату определения пиияния ПХЙБ на активность протеаз акаранта при рН 4.25; 5.10; 7,20 и 8.10 представлен'! в таблице 1. Из приведенных в ней результатов видно, ч при рН 4,25 увеличение концентрации от 0.1-¡О^й до О,*!-}' М приводит к снияенив активности до 37У. от исходной. При Н 5.10 до 65Х. Наибольвее снияение активности протеаз из б я "ается яри рН 7,20. При зток значении рН остаточная активность чс-гавляет ЪШ от исходной. Протеазн акаранта. извлекаемые диет. при рН 8,10 не реагирует на добавление ПХМ5, что

свидетельствует об отсутствии ингибируюдего эффекта. На основании полученных результатов можно сделать вывод о той, что тиоловие группы наиболее ва*нн для Ферментов, проявлявших активность при рН 4.25 я 7,20.

Й таблице 2 представлены результата определения влияния ЗДТА на активность исследуемых протеаз амаранта. Наибольвее ингибирование при добавлении ЭДТЙ наблюдается при рН равном 5.10, остаточная активность протеаз при концентрации 1-10 К составила ЗЬХ. При рН 8.10 остаточная активность протеаз при этой концентрации составила 56Х от исходной. Максимальное снияение активности протеаз при рН 4,25 и 7.20 наблядается при концентрации ЭДТЙ 0.6-10*И. Последующее увеличение концентрации не приводит к далькейоему ингибированию. Такии образом. наибольаук зависимость от аеталлов прозвдяпт протеазы при рН 5,10 и 8,10.

Определение влияния цистеина на активность протеаз акаранта при различных значениях р!! (таблица 3) показало нали-

Влияние 1ШБ на активность протеаз амаранта, извлекаемых диет. Н,0

ПХЫБ Активность, Остаточная

рн 0,1- ю"аи ¿"г® активность,

мл У.

0 0,145 100

1 0,070 48

4,25 2 0,065 44

3 0,060 41

' 4 0,060

5 0,055 3?

0 0,085 100

1 0,065 76

5,10 2 0,065 76

3' 0,065 76

4 0,065 76

5 0,055 65

0 0,220 100

1 0,120 54'

'/,20 0 и 0,100 45

3 0,090 41

4 0,085 38

5 0,080 36

0 0,055 100

1 0,050 91

8,10 ? 0,055 100

0,050 91

4 0,050 91

5 0,055 100

о

- И -

Влияние ЗДТЙ на активность протеаз амаранта, извлекаемых диет. Н20

ЗДТЙ Активность, Остаточная

рн 0,2« 10"* Й л А ¿яа активность»

йл У.

1 0 0.150 100

1 0,135 80

4.25 э 0.П5 76

3 0.095 63

4 0.095 63

0.100 66

' 0 0.130 100

! 0.110 85

5.10 г 0.070 54

3 0,060 46

4 0.055 42

5 0.050 38

. 0 0.120 100

о 1 0.105 87

7,20 2 ; 0,100 • 83

3 0,100 83

4 \ .олоо 83

5 0,090 75

0 N 0,160 >ч 100

1 0,110 4 09

8.10 2 0.105 65

3 0,100 ^ 03 .

4 0,095 59

5 0,090 56

Влияние цистеина На активность протеаз амаранта, извлекаемых диет. Н20

0.5* Активность, Активность

рН цистеин, от исходной.

мл У.

0 0,040 100

1 0,050 125

4,25 2 0,050 125

3 0,070 175

. 4 0,090 225

5 0,150 375

0 0,080 100

. i ■ 0,080 100

5,10 2 0,080 100

3 0,080 100

4 0,100 125

5 0,105 131

0 0,075 100

1 0,075 100

7,20 2 0,080 106

3 , 0,080 .106 •

4 л 0,100 133

5 0,120 160

0 0,080 100 .

1 0,080 100

8,10 2 1 0,075 94

3 0,080 100'

4 \ 0,080 100

5 0,080 100

чие максимального активирующего эффекта при рН 4,25 (увеличение активности в 3,75 раза) и при рН 7,20 (увеличение активности в 1,6 раза). При рН 8,10 добавление цистеина не приводит к увеличению активности.

Таким образом, мо*но сделать вывод о вероятной принад-леяности протеаз амаранта, извлекаемых диет. Н^О оптимумом рН 4,25 и 7,20 к тиоловым. Для поддеряания активности протеаз с оптимумом рН 5,10 и 8,10 важную роль играют ионы металлов.

.Влияние ПХМБ на активность протеаз амаранта, извлекаемых 0,352 раствором Иа2С0л. проводили при рН, соответствующим их оптимальным значениям. Полученные результаты представлены в таблице 4. Максимальный ингибирующий эффект от

добавления ПШ наблюдается при рН 6,05, При концентрации--2

0,5-10 Н остаточная активность от исходной составила 39*. При рН 5,65 сни!ение активности наблюдается до концентрации

-а

0,3-10 Я. Ост-\*"шя активность при этом составила 822. Аналогичная картина наблюдается и при остальных значениях рН. Снияение^ активности составило от 212 ( рН 6,75) до 252 (рН 7,50). Таким .образом, значительный ингибирующий эффект ПХМБ (612) отмечен только при одном значении рН» соответствующем 6,05, ,

X '

Результатц определения влияния ЗДТА на активность протеаз амаранта (таблица 5) свидетельствуют о существенном ин-гибирующем эффекте при рН 6,05 (остаточная активность 482) и при рН 5,65 (остаточная активность 532), При остальных значениях рН ингибп: :»щий эффект ЗДТй менее выраяен. При рН 6,40 остаточная активность снижается до 642. При рН 6,75 и 7,50 ингибирование ЗДТЙ выраиено еще слабее, при этом оста-

Влияние ПХНБ на активность протеаз амаранта, извлекаемых 0,352 раствором На2С03

ПХНБ , Активность, Остаточная

рК О.ЫО'^М. д Ьгея активность.

мл г

0 0,282 100

1 0,235 83

5.65 2 0.230 82

3 0,235 83 .

4 0,230 82

5 0,230 82

0 0.280 100

1 0,123 44

6,05 2 0.118 42

3 0.115 41

4 0.115 41

5 0.110 39

• 0 0.327 100

1 0.2?0 83

6.40 2 0.265 81

' 3 0.260 79

4 0.250 76

5 0.250 76

0 '0.285 100

i ' 0.240 84

6,?5 2 0.230 81

. 3 0.228 80

4 0.230 . 81

5 0.227 79

0 0.100 100

1 0.145 81

7.50 2 0.140 78

3 ; 0.135 75

4 0.143 79

5 0.135 : 75

Влияние ЗДТА на активность протеаэ амаранта, извлекаемых 0.35Х раствором Na^CO^

ЗДТА . Активность, Остаточная

' рН 0,2*10"* й, дйгм активность,

мл У.

0 0,282 100

1 0,155 55

5,65 2 0,150 53

3 0,150 53

4 0.150 53

3 0.150 53

0 0.280 100

1 0,205 73

6,05 2 0,290 68

3 0.187 67

4 0.160 57

5 0,135 48

0 0,327 100

1 0,225 69

6,40 2 0,215 66

3 0,210 64

4 0,210 64

5 0,210 64

0 0,285 100

I 0,225 79

6,75 г 0.222 78

3 0.220 77

4 0.220 77,

5 0,220 77

0 0,180 100

1 0,158 88

7.50 2 0,157 87

3 0,155 86

4 0,135 75

5 0,130 72

точная активность составила соответственно 77 и 71'/.. Учитывая близкие значения оптим^мов-вН протеаз, извлекаемых 0,352 раствором Иа2С03, иоано говорить о существенной роли ЗДТА только для протеаз амаранта с оптимумом рН 6,05, так как только е атом случае наблюдается снижение активности до концентрации ЭДТП 1.0-1 о-^ м.

В таблице 6 приведены данные, полученные при определении влияния добавок цистеина на активность протеаз амаранта, извлекаемых 0,352 раствором На2С03. Активирующий эффект цистеина обнаружен только при значениях рН 5,65 и 6,05, Однако, в численном выражении он значительно ни»е чем для протеаз, извлекаемых диет. Н,0. При других значениях рН активирование протеаз незначительно, либо отсутствует полностью (при рН 7,50).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что активность протеаз амаранта, извлекаемых 0,352 раствором Ла^СО^, менее зависима от используемых в навей работе ингибиторов (ИХИБ и ЗДТА), а такие от присутствия в инкубационной среде цистеина.

Для определения активности ингибиторов собственных протеаз использовали Ферментные вытякки, полученные путем экстракции протеаз из зерна амаранта диет, . Нг0 и 0,352 раствором С0Л. В работе использовали ингибиторы I и II, выделенные из зерна амаранта.

Результаты, характеризующие влияние ингибиторов 1 и II

на собственные протеазы амаранта, извлекаемые диет. Н2 0,

С

приведены в таблице 1, Полученные данные свидетельствуют о неоднозначном отношении исследуемых ферментов к ингибитору I и 11. Наибольший ингибипующий эффект наблюдается при взаимо-

Влияние цистеина на активность протеаз амаранта, извлекаемых 0,352 раствором Na2C0j

0,52 Активность, Активность

рН цистеин. Д A2gQ от и :ходной.

мл 2

0 0,280 100

1 0,28? 102

5.65 2 0,288 103

3 0,292 104

4 0,330 117

5 0,382 136 .

0 0,280 100

1 0,290 104

. 6.05 2 0,300 107

3 0,325 116

4 0,350 125

5 0,380 136

0 0,327 100

1 0,355 108

6.40 2 0,355 108

3 0,360 110

4 0,360 110

5 0,365 112

0 0,285 100

1 0,280 " 98

6,75 2 0,285 100

3 0,295 103

4 0,298 104

5 0,295 • 103

0 0,180 100

1 0,180 100

7,50 2 0,175 • 97

3 0,170 95

4 0,175 97

5 0,170 95

Определение активности ингибиторов собственных протеаз амаранта, извлекаемых диет, Н.О

Тип ингибитора рН Активность д ^¿ео Остаточная активность., 7.

4,25 контроль опыт 0,125 0,050 100' 40 1

Ингибитор I 5,10 контроль опыт 0.130 0,085 Л юо 65

7,20 контроль опыт 0,125 0,060 100 40

8,10 контроль опыт 0,115 0,060 100 52

. 4,25 контроль опыт 0.125 0,080 100 64

Ингибитор II 6.Ю контроль опыт 0,130 0,100 100 77

7,20 контроль опыт 0,125 0,095 100 76

8,10 контроль опыт 0,?15 0,190 100 78

действии протеаз. извлекаемых диет. Н,0 с ингибитором I. При этом максимальное ингибирование наблюдается для протеаз, имеющих оптимум рН 4.25 и 7.20. их активность в этих случаях составила 40* от исходной. Протеазы с оптимумом рН 5,10 и 8,10 ингибировались ингибитором I в меньшей степени, остаточная активность составила соответственно 65 и 522. В еще меньшей степени ингибирующий эффект проявлялся при взаимодействии исследуемых протеаз с ингибитором II. При этом рН 4,25 остаточная активность составила 642. При рН 5,10; 7.20 и 8,10 значения остаточной активности протеаз находились на уровне 76 - 782.

В таблице 8 приведены данные, характеризующие взаимодействие с ингибитором I и II протеаз амаранта, выделенных 0,352 раствором Иа^СОз. При проведении исследований установлена иная картина взаимодействия этих протеаз с ингибиторами. Наибольшее сродство исследуемых протеаз наблюдается по отношению к ингибитору II. Максимальный ингибирующий эффект наблюдается при рН 5,65; 6,75 и 7.50 (остаточная активность протеаз составила 15. 16 и 15'/.). При рН 6,05 и 6,40 остаточная активность составила 30 и 28'/.. При проведении реакции с ингибитором I ингибирующий эффект был значительно ниве. Только при рН 7,50 активность протеаз при взаимодействии с ингибитором I сниаается до 422. Наименьшее ингибирование наблюдалось при рН 5,65 и 6,05 (остаточная активность составила 83 и 862).

Таким образом, исследование взаимодействия собственных протеаз амаранта с ингибиторами I и II показало, что ингибитор 1 имеет большее сродство к притеазам, извлекаемым диет. 11^0, и наоборот. ингибит( II имее. большее сродство к про-

Определение активности Ингибиторов собственных протеаз амаранта, извлекаемых 0,35'/ раствором

Тип ингибитора

Ингибитор

Ингибитор II

ЙК ТИВГГОС ть Остаточная ,

ри ЛЙ^/Т активность, ?

*

5,(55 контроль 0. !2о 100

опыт 0.100 83

6,05 контроль 0.105 100

опыт • о.оэз и 1

6.40 контроль 0.115 1 100

опыт 0.060 52 ! X

6.75 контроль 0.110 ! 100 |

опыт 0,070 64

7,50 контроль 0.165 100

опит 0.070 42

5.65 контроль 0,120 100

опыт 0.016 15

6,05 контроль 0,105 100

опыт 0,032 30

0,40 контроль 0,115 100

опыт 0,032 28

6.75 контроль 0.110 100

опт 0.018 16

7,50 контроль 0,(1)5 100

опыт и.025 15

геаэаи, изалекаемии 0. ib раствори« Ha^CUj. При эти« установлено. что притеази, различавшийся по оптямуму pH, имени су-нественные различия и по отношению как к ингиоитиру I , гак и ч ингибитору П.

1.4, Ьяиннне икгиоитиров притмз из зерна аысшанга hâ dkth&iîucïi, трипсина

Ингибнтори cuóCTUaiitiux притеаз, ииделешшч hj jupus амаранте, били ислидьзоианы & «„еуаи ипнтои ни их в*вимодей>.-таня -j трипсином. i} результату нроьедвнмьх «питие oujíü уста ииилени. что шшшитири сиостьенных иритваэ, виделешше из ieiifíj, окаjuij.jar ингибируиаье илияние на триисиг. ¡1ри згом кед-актер действия зткх ингибчтирив различен, Мнгиоируклцо*

дей; гвии йш'ибитира п ¡jupdsthu oüjielí сильно . чвк! иш иои

rup¿i I .

i.ti. йзслшодейсгяие nputuoj и ингиоитирив иригеаз ИЗ лурна dMapàûïà И нмвиицы

Ит-павьку ляеоипикарние дистиинстьа ниепичний муки им pcHeKiíert'á e*¡ селково-притеши jrum комилексом. >ииио*нег -»ri-алучис-кяе Ää'je'jTBä пменячний ауки при диоайлинии муки м* раны «бдялоалеяи анвс«к»ем в имецичнуы mjay штгч-л! - ччги óhíú|iuij аиаранта С целы- »иналеийя азаммноги йлиуни* ¡id.не áí и mirnÖHTüiiuu npaieo?, >:оиерн.щихся g .»spifft пшеницы и ам.зрантй, бил пооввде« лвтилиз различных снстйь»: ! i I,/ г пайничной нуки » î 00 m ¡ц-ur. !f,,Q; ¿i 0.3 г j»gs« áHdííaiiTCi ! J ыл да I! О'

\ - 22 -

3) 1.7 г пшеничной муки + О.ЗЖмуки амаранта + 100 мл диет.

Автолиз проводили в течение 60 мин. с использованием муки амаранта сорта "Спартак" и семи образцов зерна пшеницы сорта "Мироновская 808", отличающихся своими хлебопекарными достоинствами. Интенсивность автолиза оценивали по поглощению при 280 нм. Поскольку при выпечке пшеничного хлеба муку амаранта добавляют до 152, в наиих опытах было использовано то яе соотношение пиеничной муки и муки амаранта, что и при выпечке хлеба. В результате автолиза было установлено, что автолитическая способность муки амаранта значительно выше ав-толитической способности исследуемых образцов пшеничной муки. При проведении автолиза смеси пшеничной муки и муки амаранта суммарный эффект был ниже автолитической способности, наблюдаемой при проведении гвтолиза только муки амаранта, Прирост поглощения при 280 нм занимает проненуточное полояе-ние между значениями, полученными при автояйзе только муки амаранта и пшеничной муки: Отсутствие суммарного эффекта при проведении автолиза в системе, содериащей пшеничную муку и муку амаранта, возиоино объяснить взаимным влиянием ингибиторов собственных протеаз. содержащихся как в пиеничной, так и в муке амаранта. Для выяснения наличия этого эффекта было проведено определение влияния на активность протеаз, извлекаемых 0,352 раствором НааС0 из пшеничного зерна, ингибиторов 1 и П. выделенных из зерна амаранта. Полученные результаты

показали, что ингибитор I и ингибитор II в значительной мере

О

подавляют' активность протеаз пшеничного зерна.

¡',;ки1'| порезом, полученные результаты свидетельствуют о ь')!:. чти !! формировании качества пшеничного хлеба, выпекае-';1 * г1 * , диоввленивм муки амаранта, еакндв роль могут игрлть

кан протеазы, так и ингибиторы протеаз, содержащиеся н муки амаранта,

.выводи

1. Проведены комплексные исследования протиолитичесиих ферментов и ингибиторов протеаз, выделенных из зерна амаранта,

2.Установлено наличие в зерне амаранта двух групп прите-олитических ферментов: растворимых в дистиллированной воде и извлекаемых 0,35Х раствором NaâC03.

Показано, что:

- водорастворимые, протеазы проявляв: свою активность при pli 4,25, 5,10, 7,20 и 8,10;

- протеазы, извлекаемые 0,352 раствором На2С0^, имеют опти-'мум рН при 5,65, 6,05, 6,40, 6,75 и 7,50.

3. С помощью гель-хроматографии на колонках с сефадек-сом G-75 и G-100 выявлены различия исследуемых протеаз по молекулярным массам.

4. Изучено влияние ПХМБ, ЗДТА и цистеина на активность исследуемых протеаз.

Установлено, что;

- среди водорастворимых протеаз наибольший ингибирующий эффект ПХМ5 наблюдается при рН 4,25 и 7,20, максимальное влияние ЗДТА при рН 5,10 и 8,10. Активирование цистеином наиболее характерно для протеаз с оптимумом рН 4,25 и 7.20.

- для протеаз. извлекаемых 0.35Х раствором Na2C03, максимальный ингибирующий эффект ПХМУ » ЭДТА наблюдается при рИ

6,05. Активирование цист'еийяь^отмечено при рН 5,65 и 6,05.

5. Из зерна амаранта выделены два типа ингибиторов собственных протеаз: ингибитор 5 (по методу Аль-Рахмуна) и ингибитор II (по Ибрагимову). При исследовании этих ингибиторов выявлены различия во взаимодействии ингибиторов I и II с протеазами амаранта.

6. Установлено, что ингибиторы собственных протеаз зерна амаранта оказывают влияние на активность трипсина.

7. Проведенный автолиз муки амаранта, пшеничной муки и смеси муки амаранта и пшеничной муки свидетельствует о слой-ном взаимодействии протеаз.и ингибиторов собственных протеаз зерна амаранта и пшеницы.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы.

1. Карпиленко Г.П., Траоре И. Особенности белково-протеиназ-ногс комплекса амаранта. - М.: сб. ЦНИИТЗИ "Хлебпродин-форм", 1995, выпуск I, с.11,

2. Карпиленко Г.П., Траоре К. Использование муки амаранта в качестве улучиителя хлебопекарных свойств пшеничной муки. - М.: Тезисы юбилейной научной конференции "Управление свойствами зерна в технологии муки, крупы и комбикормов". 1995, МГйПП. с.31.

SUMMERY

There «ara mada complex researches, of ensyn»- proteolltlc and , „inhibitors proteaeea^mada from tho amarant grain.

Thero was. eetabliohed tha prasenca- of protsaasa - in tha ...amarant grain,differ from each other by .dieenlve ,and optimum pH. With tho help of gel-chromatography there, were reveal , differences of researches proteases in . jnolecular , ®a<sa. It .waci learned the influence activators and inhibitor. ' for activity . protsaoeoi.. From tha sraln of amarant there.were distinguished tuo typaa of inhibitors. own ■ proteases. It la learned the role of proteases and their, inhibitors with addition of.amaranfe flour . in -flour of wheat.

Отпечатано в типографии МГЛПП. Формат 60 x 84/16. Обьеи 1.63 п.л. тир. 100. Заказ № 86 12508(1, г. Мосза Волоколамске« ш.11