Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Идентификация генотипов амаранта для селекции и семеноводства системой физиолого-биохимических методов

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Родюк, Наталия Ивановна, Москва

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР

На правах рукописи

РОДЮК Наталия Ивановна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОТИПОВ АМАРАНТА

ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ И СЕМЕНОВОДСТВА СИСТЕМОЙ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Специальность: 06.01.05. - селекция и семеноводство

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Научные руководители;

академик РАСХН,

доктор сельскохозяйственных наук,

профессор В.Ф.Пивоваров,

доктор биологических наук А.И.Ротарь.

МОСКВА-1998

СОДЕРЖАНИЕ

1. Введение....................................................................................1

2. Обзор литературы........................................................................5

2.1. Происхождение, ботаническая характеристика и систематика рода Amaranthus L.............................................................................5

2.2. Хозяйственно-биологическое значение амаранта в физиолого-биохимическом аспекте................................................................8

2.3. Современное состояние селекции и семеноводства амаранта.................12

3. Материал и методы......................................................................17

3.1. Материал..................................................................................17

3.2.Условия и методика проведения полевых опытов................................19

3.2.1. Техника проведения полевых экспериментов...................................19

3.2.2..Почвенно-климатические условия................................................20

3.2.2.1. Погодные условия..................................................................20

3.2.2.2. Почва..................................................................................22

3.3. Методы анализа химического состава и питательной ценности растений амаранта..................................................................................24

3.4. Метод электрофореза глютелиновой фракции белка амаранта...............26

3.5. Методы культивирования амаранта in vitro.......................................28

4. Результаты и обсуждения..............................................................30

4.1. Биохимическое изучение вегетативной массы и зерна различных видов и коллекционных образцов амаранта.................................................30

4.2. Изучение выриабильности электрофоретических спектров глютелиновой фракции белка амаранта...............................................................48

4.3. Изучение амаранта вкультуре in vitro...............................................60

5. Выводы.......................................................................................80

6. Предложения и рекомендации........................................................84

7.Список литературы......................................................................85

Приложения...................................................................................99

1 .ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Амарант - высокопродуктивное, устойчивое к неблагоприятным факторам высокобелковое кормовое растение, которое может внести значительный вклад в кормовой баланс стран СНГ (Girenko, 1993; Micu, Rotari, Portas, 1993; Lukashov, Sagitov, Santykov, 1993; Sapharov, 1992) и Западной Европы (Nalborzyk, 1992; Huska, 1992).

При создании благоприятных условий роста и развития, суммарная урожайность зеленой массы и семян достигает 1200-1400 ц/га. Амарант не имеет ограничений в использовании, хорошо поедается всеми видами животных в свежем и переработанном виде, может использоваться как сырье для получения кормового и пищевого белка, лекарственных препаратов, пищевых и технических красителей (Чубенко, Головин, 1991; Чернов, 1992; Пивоваров и др., 1995).

За высокую народно-хозяйственную ценность, продуктивность и адаптационные возможности амаранта эксперты Продовольственной комиссии ООН (ФАО) признали его важнейшей культурой будущего века (Амарант, 1990).

Для эффективного использования амаранта в народно-хозяйственных целях необходимо располагать широким разнообразием чистого селекционного материала этой культуры. Успешная разработка селекционно-семеноводческого процесса любой культуры определяется проведением, в первую очередь, всестороннего изучения генотипов, используемых в качестве исходного селекционного материала, что включает исследование их физиологических особенностей, биохимическую оценку и др.

Объемная литературная информация, характеризующая физиолого-биохимические особенности амаранта (Чернов, 1993; Makus,1990; Jusbekov, Magomedov, 1992), создает серьезную основу для систематизации научных представлений селекционера о возможностях физиолого-биохимического изучения исходных селекционных форм амаранта на базе таких современных

методов как: соматический эмбриогенез, биохимическая оценка питательной ценности, анализ генетической чистоты используемых генотипов с помощью молекулярного маркирования (белка, ДНК). Такой подход, несомненно, позволит ускорить решение одной из актуальнейших проблем по интродукции амаранта в практику сельского хозяйства - возможности создания новых, высокопродуктивных и высококачественных коммерческих гибридов этой культуры.

Поэтому цель настоящей работы состояла в системном изучении возможностей современных физиолого-биохимических методов исследования генотипов амаранта.

Для реализации поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1) проследить тканевую, онтогенетическую и генотипическую изменчивость химического состава вегетативной массы и зерна различных видов и коллекционных образцов амаранта, с последующим определением направления их дальнейшего использования;

2) изучить вариабильность электрофоретических спектров глютелиновой фракции белка различных видов и коллекционных образцов амаранта;

3) изучить зависимость каллусообразующей способности и соматического эмбриогенеза от видовой принадлежности, типа экспланта и действия фитогормонов, а также определить эффективность соматического эмбриогенеза в получении растений-регенерантов.

Научная новизна. Впервые показана возможность классификации изученных видов и коллекционных образцов амаранта по пищевому и кормовому направлениям - на базе дифференцированного подхода к изучению тканевой, онтогенетической и генотипической изменчивости химического состава вегетативной массы и зерна данной культуры.

Впервые установлено, что в качестве молекулярных индикаторов отбора коллекционных образцов амаранта следует рассматривать молекулярные формы глютелиновой фракции из электрофоретической области медленной и быстрой миграции - в зависимости от видового происхождения. Экспериментально доказана возможность экстраполирования указанной закономерности на анализ электрофоретических спектров белка коллекционных образцов амаранта с неустановленными источниками происхождения (по видам).

Предложена система методических разработок с учетом специфики культуры амаранта в условиях асептической культуры. Показано, что повышение доли цитокининов в гормональном комплексе питательной среды является удобным субстратом для проявления морфогенетической реакции листовых эксплантов по интенсивному каллусогенезу, накоплению сырой массы каллуса и формированию соматических эмбриоидов с достаточно высоким уровнем регенерационной способности.

Теоретическая и практическая ценность. При интродукции и анализе селекционного материала амаранта рекомендовано, кроме оценки по химическому составу составных органов этой культуры, проводить определение питательной ценности исследуемых образцов и паспортизацию по биологической ценности белка (БЦБ).

На основе электрофоретического изучения глютелиновой фракции белка различных видов и коллекционных образцов амаранта разработан электрофоретический эталонный спектр, на базе которого составлена расчетная формула электрофоретического спектра белка каждого из изученных образцов амаранта.

Смоделирована схема поиска филогенетических связей на уровне белковых маркеров между коллекционными образцами с неидентифицированным источником происхождения и исходными видами амаранта.

Рекомендовано в качестве улучшения методических приемов культивирования селекционно-генетических образцов амаранта в условиях in vitro использовать ряд регуляторных факторов:

- по составу питательной среды - измененный фитогормональный комплекс в сторону увеличения доли цитокинина (по отношению к ауксину);

- по типу экспланта - листовую ткань;

- по генотипу - виды амаранта с высоким уровнем регенерационной способности соматических эмбриоидов - A.caudatus, A.deflexus и A.cruentus.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Физиолого-биохимические характеристики тканевой и онтогенетической изменчивости биохимических показателей вегетативной массы и зерна амаранта позволяют классифицировать изучаемые формы амаранта в различных направлениях народнохозяйственной значимости этой культуры.

2. Молекулярное маркирование с использованием глютелиновой фракции белка является инструментом для выявления молекулярных индикаторов отбора коллекционных образцов амаранта и их генезис.

3. Физиологическая специфика морфогенеза амаранта в асептической культуре и его регенерационная способность служит основой разработки методических приемов культивирования селекционного материала амаранта в условиях in vitro.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Происхождение, ботаническая характеристика и систематика рода

Amaranthus L.

Амарант возделывался с незапамятных времен народами, населявшими Центральную и Южную Америку, - главным образом из-за его съедобных семян. В Империи Ацтеков амарант был неотъемлемой частью каждодневной пищи мексиканских низших классов. Его большую ценность демонстрировали огромной ежегодной данью (1500 тонн) Ацтекскому Императору. Также семена амаранта использовали при совершении некоторых жестоких обрядов. Кровь приносимых в жертву людей смешивалась с мукой амаранта для получения изображений Ацтекских богов, которые торжественно распределялись Ацтекскими жрецами среди людей. Во время колонизации Америки испанская церковь, борясь с языческой религией коренного населения, запретила этот обряд, и любой человек, выращивающий амарант, приговаривался конквистадорами к смерти. Даже его обычное употребление в пищу было наказуемо. К двадцатому веку амарант почти полностью исчез из посевов (Brucher, 1989; Estrada-Lugo, 1991).

Выжил амарант лишь на незначительных площадях - в изолированных и труднодоступных местах. В 30-е годы нашего столетия Н.И.Вавилов при обследовании флоры Центральной Америки обратил внимание на эту культуру и включил ее в список первоочередных кормовых (Вавилов, 1987). Однако, возрождение амаранта началось в конце 70-х годов XX века. Начался интенсивный обзор уцелевших культурных, а заодно и диких видов амаранта. Их всестороннее изучение проводится по следующим направлениям: ботанике, агрономии, биохимии и биотехнологии, питании, переработке и реализации продуктов из амаранта. Особенно широко ведутся работы в ряде научно-исследовательских институтов и университетов США, стран Центральной и Южной Америки, Индии и др. стран (Amaranth, 1989).

В 1975 году Национальной Академией Наук США амарант отнесен к важнейшим продовольственным культурам, а эксперты Продовольственной Комиссии ООН (ФАО) признали амарант важнейшей культурой будущего века (Амарант, 1990).

По современной классификации семейство амарантовых - Amaranthaceae - относится к классу двудольных (Dicotylédones), к порядку гвоздичных (Caryophyllales) и включает 65 родов и около 900 видов (Жизнь растений, 1982). Наиболее распространен и известен род амарант - Amaranthus. В мире известно около 90 видов амаранта, из них 17 - в странах Старого Света, 14 - в Австралии и 56- в Америке. В числе последних - 10 видов двудомных и 46 однодомных, из которых 29 встречаются в Северной Америке и 33 в Центральной. Род Amaranthus - это обширный род, объединяющий широко известные сорные растения (щирица), декоративные, пищевые и кормовые. Многие виды амаранта введены в культуру (Чернов, 1992).

Огромное разнообразие видов и свободная межвидовая переопыляемость амаранта значительно затрудняет его систематизацию. Фрагментарное описание видов привело к созданию многочисленных ботанических ключей рода Amaranthus L. Были предложены различные классификации: по признаку половой системы, по способу раскрытия плода, по форме соцветия, по форме листа, по форме листочков околоцветника женских цветков. Однако виды амаранта отличаются высокой степенью изменчивости морфологических признаков в зависимости от условий произрастания, следовательно предложенные классификации оказались неприемлемыми (Прокофьев, Хируг, Чернов, 1995).

Большинство авторов за основу составляемых ими классификаций амаранта берут классическую систему А.Тэллунга (цит.по Прокофьев, Хируг, Чернов, 1995). Эта систематическая классификация представлена в виде сложной иерархической лестницы. В начале приведены основные морфологические признаки для совокупных (общих) видов, затем проводится

разбивка на подвиды и расы. Расы, в свою очередь, разбиваются на подрасы и в пределах каждой подрасы выделены характерные формы и группы одного морфологического признака. Похожую классификацию приводит С.Пристер (цит.по Прокофьев, Хируг, Чернов, 1995), но наряду с типичным выделением в каждой систематической группе, автор выделяет и нетипичные по данному морфопризнаку формы.

Во "Флоре СССР" приведены морфологические признаки 12 видов амаранта, два из которых (А.саисЫш Ь. и А.рашсикШБ Ь.) являются культурными (Васильченко, 1936). В работе Е.В.Вульфа (1969) к культурным отнесено 7 видов амаранта: А.ЬНШш, А.саиёаШБ, А.рашсиЫш, А.сИдЫиз, A.Mantegazzianus, А.Бртозш, А.1:псо1ог. С.П.Черепановым (1981) к роду АтагапШиэ Ь. отнесено 16 видов, в том числе два культурных - А.саиёаШБ Ь. и А.сгиепШБ Ь.

В 1983 году Р.Саудерсон и Р.Бекер обобщили данные по систематике амаранта. По их мнению культурные представители рода АтагапШш Ь. могут быть отнесены к трем основным видам (А.саиёаШБ, А.сгиепШБ, А.Ырос1юп<Масш) и огромное количество сортообразцов есть результат их скрещивания и отбора.

С учетом вышеизложенных критериев А.В.Прокофьевым с соавторами (1995) был проведен систематический анализ 117 образцов амаранта, полученных из разных регионов страны и мира. Учитывая высокую пластичность видов амаранта, были выявлены наиболее консервативные морфопризнаки - форма прицветников и форма цветков околоцветника. Путем классического отбора были получены две формы: А.саискШз-^етшрюайхз и gibbsus. Выявлена характерная форма А.сгаепШз, сходная с описанием П.Ашерсона и П.Гребнера (цит.по Прокофьев, Хируг, Чернов, 1995) .

Итак, традиционные методы идентификации, которые были использованы для классификации рода АтагапАш Ь., в значительной степени зависят от условий среды и, следовательно, недостаточно точны.

Принципиально новые возможности для идентификации видов амаранта открылись с разработкой ряда методов прикладной молекулярной биологии, таких как: электрофорез изоферментов, белковый электрофорез и RAPD-метод (Smith, 1992; Молекулярно-биохимические аспекты, 1993). Использование таких современных методов является достаточно перспективным направлением, но целесообразно эти исследования проводить в комплексе с изучением морфо-физиологических параметров, что позволит более успешно вести селекционно-семеноводческий процесс этой культуры.

2.2. Хозяйственно-биологическое значение амаранта в физиолого-

биохимическом аспекте Культурные виды амаранта, благодаря своим физиолого- биохимическим особенностям, широко используются во многих странах как пищевое (семена и листья) и кормовое растение (зеленая масса)-(Чернов,1992; Covas, 1994).

При изучении химического состава различных видов амаранта было установлено, что в семенах содержится 16-18% белка, 60% крахмала и до 8% жира (Kulakov, 1991; Safarov, Ruzibayev, Rakhimova, 1993).

Одной из привлекательных черт амаранта является содержание в нем белка, которое в среднем, относительно более высокое, чем у зерновых злаковых (Проблемы повышения качества зерна, 1977; Рядчиков, 1978). Большая часть белка зерна (около 65%) содержится в зародыше и семенной оболочке и только 35% - в эндосперме (Earle et al., 1946; Bradbury et al., 1956). Белок амаранта отличается к тому же высокой экстрактивностью. Рассматривая белковые фракции зерна амаранта нужно отметить, что количество альбуминов варьирует от 19 до 23%, глобулинов от 18 до 21%, спирторастворимых проламинов от 1,7 до 2,7%, а глютелинов от 42,5 до 46,5% (Bressani, 1989).

Белок амаранта обладает высокой питательной ценностью, которая обусловлена оптимальным соотношением всех аминокислот, включая незаменимые (Чернов, 1992). По данным ряда авторов (Betschart et al., 1981;

Saunders, Becker, 1984; Teutonico, Knorr, 1985), белок амаранта является хорошим источником лизина, триптофана и серосодержащих аминокислот. В противоположность этому зерновые злаковые бедны в лизине, а кукуруза является дефицитной и в триптофане.

По усвояемости белок амаранта лишь немного уступает белку сыра (Bressani, 1990), а высокое содержание незаменимых в питании человека аминокислот делает амарант желательным компонентом многих продуктов, которые начали уже выпускаться промышленностью ряда стран. Зерно амаранта используется для изготовления сладостей (Suaroz Ramos et al., 1991; Yue, Sun, 1997), печенья, каш, хлеба (Delgodillo et al., 1991; Bressani, Benavides, 1990).

В настоящее время в США производится и продается в диетических