Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Основные генетические группы Mycobacterium tuberculosis в Самарской области

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Основные генетические группы Mycobacterium tuberculosis в Самарской области"

На правах рукописи

Концевая Ирина Сергеевна

ОСНОВНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ГРУППЫ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS В САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ

03.02.07 — генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 АПР 2014

Уфа - 2014

005547558

Работа выполнена на кафедре биологической химии, биотехнологии и биоинженерии ФГБОУ ВПО «Самарский государственный университет» и в бактериологической лаборатории ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер имени Н. В. Постникова»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Мавзютов

Айрат Радикович

доктор медицинских наук, профессор

Макурина Ольга Николаевна

доктор биологических наук, профессор

заведующий кафедрой фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет МЗ РФ

Маркушева Татьяна Вячеславовна

доктор биологических наук, доцент

руководитель группы генетики микроорганизмов ФГБУН Институт биологии Уфимского научного центра РАН

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО Северный государственный медицинский университет МЗ РФ

Защита диссертации состоится «29» мая 2014 г. в «16:00» часов на заседании Диссертационного совета Д 002.133.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН

С диссертацией можно ознакомиться на сайте ИБГ УНЦ РАН (ibg.anrb.ru/dissov.html) и в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН

(Уфа, просп. Октября, д. 71), с авторефератом - на сайте ВАК РФ

E-mail: molgen@anrb.ru

Автореферат разослан « Ь » Cj'flJuUX^ 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н.

С. М. Бикбулатова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Туберкулез (ТБ) остается важной проблемой

здравоохранения во всем мире и Российской Федерации в частности. Самарская

область относится к регионам России с неблагоприятной обстановкой по

туберкулезу, где уровень заболеваемости в 2011 году (78,5 случаев на 100 тыс.

населения) превышал средний показатель по стране (73,0 случая на 100 тыс.

населения) (Аналитический обзор МЗ РФ, 2011). Около 20% всех впервые

выявленных заболевших и 60% получавших лечение в прошлом пациентов в

Самарской области инфицированы штаммами микобактерий с множественной

лекарственной устойчивостью (Balabanova et al., 2006). Серьезной проблемой

является также рост заболеваемости ТБ с обширной лекарственной

устойчивостью, вызванным микобактериями, дополнительно устойчивыми к

фторхинолонам и инъекционным препаратам, особенно в сочетании с ВИЧ-

инфекцией (Balabanova et al., 2011). Преобладающей генетической группой

штаммов, циркулирующей в Самарской области, является группа Beijing

(Балабанова, 2006). Она характеризуется высокой степенью внутригрупповой

гомогенности, а также повышенной вирулентностью, патогенностью и

ассоциированностью с лекарственной устойчивостью (Степаншина, 2007;

Дымова, 2008; Baranov et al., 2009; Nodieva et al., 2010; Маничева, 2011; Лац,

2012; Дымова, 2013).

Генетические факторы играют ключевую роль в формировании важных в клинико-эпидемиологическом отношении свойств патогена, включая лекарственную устойчивость, вирулентность и повышенную способность к трансмиссии. Изучение особенностей генетики возбудителя туберкулеза, включая его принадлежность к той или иной генетической группе и закономерности формирования лекарственной устойчивости и повышенной вирулентности, является необходимым звеном в комплексе мер борьбы с туберкулезом и его трансмиссией и разработки новых методов его диагностики, лечения и профилактики.

К настоящему времени имеются лишь единичные данные по популяционно-генетической структуре штаммов Mycobacterium tuberculosis,

циркулирующих в Самарской области, распространенности различных генетических групп и их ассоциированности с лекарственной устойчивостью и вирулентностью.

Цель работы: выявление генетической структуры популяции и закономерностей циркуляции и распространения основных генетических групп M. tuberculosis в Самарской области, а также их ассоциаций с вирулентностью и устойчивостью к противотуберкулезным препаратам.

Задачи исследования:

1. С помощью методов молекулярного генотипирования определить основные генетические группы и кластеры штаммов M. tuberculosis, циркулирующие в Самарской области.

2. Выявить закономерности распространения генетических групп и кластеров штаммов M. tuberculosis в районах Самарской области и медицинских учреждениях, где пациенты проходят лечение от ТБ.

3. Выявить закономерности трансмиссии штаммов M. tuberculosis, устойчивых к противотуберкулезным препаратам, включая штаммы с множественной и обширной лекарственной устойчивостью и установить их ассоциированность с генетическими группами и кластерами M. tuberculosis.

4. Провести анализ полиморфизмов в генах M. tuberculosis, ассоциированных с вирулентностью: генов фосфолипазы С (plcA, plcB, plcC), липазы (lipR), поликетидсинтазы (pksl5/l) и сенсорной гистидинкиназы (dosT), выявить закономерности их связи с генетическими группами и кластерами M. tuberculosis, а также чувствительностью к противотуберкулезным препаратам.

Научная новизна. В настоящей работе впервые проведено масштабное исследование популяционно-генетической структуры штаммов M. tuberculosis, циркулирующих в Самарской области. Продемонстрировано преобладание штаммов генетической группы Beijing и штаммов Евро-Американской линии, а также появление штаммов генетических групп EAI и Delhi/CAS, ранее не зарегистрированных в регионе. Показана неравномерность распространенности кластера Samara4 и ряда мелких кластеров группы Beijing по медицинским

учреждениям, а также ассоциации между проживанием в крупных городах и риском заражения штаммами Beijing, а в сельской местности — со штаммами других групп. Выявлены ассоциации лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам с генетической группой Beijing и рядом наиболее крупных ее кластеров, в частности Samara4, Samara24 и Samara 16. Обнаружены ассоциации между полиморфизмами в гене plcA и генетической группой LAM (кластерами Samara227 и Samara228), в генах dosT и pksl5/l и всей группой Beijing, а также в гене lipR с большинством кластеров групп Ghana, Cameroon, Uganda и S. Установлены ассоциации между полиморфизмами в генах dosT и pks¡5/l и лекарственной устойчивостью, а также в генах plcA и lipR и лекарственной чувствительностью.

Научно-практическая значимость. На основании материалов диссертации нами внесены предложения по совершенствованию методов лабораторной диагностики туберкулеза, которые могут быть использованы в работе ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер имени Н.В. Постникова» и иных противотуберкулезных учреждений. В целом результаты работы по выявлению ряда генетических групп, закономерностей их циркуляции и ассоциированности с лекарственной устойчивостью могут быть использованы в качестве основы для оптимизации методов диагностики, профилактики и лечения пациентов Самарской области и других регионов Российской Федерации, включающей в себя своевременную коррекцию схем химиотерапии, совершенствование инфекционного контроля для борьбы с трансмиссией наиболее вирулентных штаммов микобактерий, а также разработку долговременной стратегии по борьбе с туберкулезом.

Сведения о распространенности определенных генетических групп и их ассоциированности с лекарственной устойчивостью могут быть использованы для разработки и апробации новых методов лабораторной диагностики туберкулеза фирмами-изготовителями диагностикумов. Полученные нами теоретические данные об ассоциированности различных типов полиморфизмов в геноме М. tuberculosis могут послужить основой дальнейших исследований, направленных на изучение эволюции и популяционной генетики бактерий комплекса М. tuberculosis.

Результаты работы могут быть использованы при чтении спецкурсов на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на II Всероссийской научной конференции с международным участием «Научное творчество XXI века» (Красноярск, 2010); Международной научно-практической конференции "Теоретические и прикладные проблемы науки и образования" (Курск, 2010); семинаре Joint NIAID-ISTC Workshop 'Research Opportunities in ТВ Drug Discovery and Diagnosis' (Москва, 2010); 21-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям ECCMID 2011 (Милан, Италия, 2011); 32-м ежегодном конгрессе Европейского сообщества микобактериологов ESM 2011 (Любек, Германия, 2011); Международной научно-практической конференции "Физиологические механизмы адаптации живых систем" (Сухум, 2011); II Международной научно-практической конференции «Социальные и медико-биологические вопросы адаптации» (Курск, 2011); Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования» (Курск, 2012); 17-ой Международной Путинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций, и 5 статей в зарубежных журналах, включенных в международные системы цитирования Pubmed, Scopus и др.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 161 листе, содержит 14 рисунков и 38 таблиц. Список литературы включает 247 источников, из которых 174 — зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. Объектом исследования служили 1304 изолята М. tuberculosis, выделенных из мокроты пациентов с бактериологически подтвержденным диагнозом туберкулез легких, проходивших стационарное или амбулаторное лечение в противотуберкулезных учреждениях г. Самары и Самарской области, набираемых в течение одного года. Из них у 807 (61,89%) пациентов ТБ был выявлен впервые, а 497 (38,11%) пациентов получали противотуберкулезное лечение в прошлом.

Обработку мокроты, выделение чистых культур микобактерий и их идентификацию, а также тесты на лекарственную чувствительность проводили с использованием системы автоматизированных жидких питательных сред ВАСТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) в соответствии с рекомендациями производителя (Siddiqi et al., 2006) и Приказом №109 (МЗ РФ, 2003). Выделение ДНК из изолятов производили методом нагревания с хлороформом (Yates et al., 2002). Молекулярно-генетический анализ ДНК изолятов включал 4 этапа. 1. Сполиготипирование с гибридизацией на мембранах с нанесенными олигонуклеотидными пробами (Kamerbeek et al., 1997). 2. Генотипирование по 9-ти и 17-ти локусам VNTR для штаммов группы Beijing (VNTR 1982, 2163В, 3232, 4052, MIRU 10, 23, 26, 31, 40) и штаммов остальных групп (VNTR 1982, 3232, MIRU 2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40, ETR-A, В, С) соответственно (Supply et al., 2000; Smittipat et al., 2005; Supply et al., 2006). 3. Выявление делеций и вставок в генах plcA, plcB, plcC и lipR (Tsolaki et al., 2004; Talarico et al., 2005) методом ПЦР со специфическими праймерами с последующим электрофорезом на агарозном геле. 4. Анализ полиморфизмов в генах pksl5/l и dosT методом пиросеквенирования (Clarke, 2005). Кластерный анализ проводили с использованием программы Bionumerics v. 6.1 (Applied Maths, Ghent, Бельгия). Генетические группы штаммов определяли с помощью всемирной базы данных MIRU-VNTR/?/!« (http://www.miru-vntrplus .org/MIRU/index.faces) на основании данных сполиготипирования и VNTR-типирования.

Статистическую обработку результатов генотипирования и выявление значимых ассоциаций проводили при помощи программы WINPEPI (Abramson,

2011). Для сравнения распределения генетических групп М. tuberculosis среди штаммов, объединенных общими фенотипическими признаками, использовали критерий согласия Пирсона (%2). Для сравнения распределения генетических групп М. tuberculosis использовали показатель соотношения (RR) с 95%-ным интервалом достоверности (CI). Для оценки разрешающей способности и вариабельности отдельных локусов VNTR использовали индекс Хантера-Гастона (Hunter et al., 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Распространенность генетических групп М. tuberculosis по районам Самарской области Важнейшей генетической характеристикой возбудителя туберкулеза в РФ и, в частности, в Самарской области является высокая степень гомогенности популяции с преобладанием штаммов генетической группы Beijing (Медведева, 2004; Балабанова, 2006; Огарков, 2007; Baranov et al., 2009; Вязовая, 2011; Жданова, 2012а; Лац, 2013) и высокие уровни кластеризации, свидетельствующие об активном эпидемическом процессе (Нарвская, 1999; Норкина, 2003; Мокеева, 2005; Сивков, 2006; Марьяндышев, 2007).

В исследованной нами выборке 71,6% составляли штаммы группы Beijing, при этом доля штаммов групп Евро-Американской линии (Haarlem, LAM, S, Uganda, Ghana, Cameroon, URAL и X) составила 23,2%. Наибольшее количество штаммов Евро-Американской линии, обнаруженных в Самарской области, относилось к группам LAM (8,9%) и URAL (7,5%). Штаммы остальных генетических групп встречались значительно реже (0,3-5,7%). Принадлежность к генетической группе 7 штаммов (0,5%) не была определена использованными в исследовании методами (рис. 1).

Uganda URAL x 1 9% 7 5%

Л

. Неклассифи-рованные 0,5%

- Beijing 71,6%

Рис. 1. Распределение генетических групп в исследованной выборке

М. tuberculosis

На основании результатов многолокусного VNTR-типирования был проведен кластерный анализ штаммов, при этом штаммы группы Beijing и остальные штаммы анализировались раздельно. Кластером считались два и более изолята с неразличимыми профилями VNTR. Из кластерного анализа исключили 50 штаммов (3,8%) в связи с неполными данными по профилю VNTR. Общий уровень кластеризации составил 81,6% (1024 из 1254 штаммов), при этом уровни кластеризации среди двух групп были достоверно различны, составив в группе Beijing 87,7% (790 из 901 штаммов), а среди остальных генетических групп - 66,3% (234 из 353 штаммов) (RR=1,323, 95% С1=1,22-1,43). В обеих группах для дальнейшего анализа нами были выделены по 5 кластеров, содержащих наибольшее количество штаммов (табл. 1 и 2).

Таблица 1 - MIRU-VNTR профиль 5 крупнейших кластеров штаммов,

принадлежащих генетической группе Beijing

Кластер (количество штаммов) Число повторов в локусах

MIRU VNTR

10 23 26 31 40 2163b 3232 1982 4052

Samara4 (п=253) 3 5 5 5 3 6 12 8 6

Samara24 (п=103) 3 5 7 5 3 6 14 6 7

Samaral2 (п=54) 3 5 5 5 3 6 14 8 8

Samara 17 (п=40) 3 5 5 5 3 6 12 8 8

Samaral6 (п=34) 3 5 5 5 3 6 15 8 8

Таблица 2 — MIRU-VNTR профиль 5 крупнейших кластеров штаммов, не принадлежащих генетической группе Beijing

Кластер (количество штаммов) Число повторов в локусах

МПШ ETR

2 4 10 16 20 23 24 26 27 31 39 40 А В С

Samara255 (п=18) 2 2 7 2 2 5 1 1 3 2 2 3 4 2 5

Samara227 (п=17) 1 2 4 3 2 5 1 5 3 2 2 4 2 2 2

Samara205 (п=13) 2 2 4 3 2 5 1 4 3 3 2 3 2 2 3

Samara228 (п=12) 1 2 4 3 2 5 1 5 3 2 2 5 2 2 2

Samara20l (п=12) 2 2 5 3 2 5 1 5 3 3 2 3 3 2 3

Наиболее крупные кластеры в группе Beijing (Samara4, Samara24, Samaral2, Samaral7 и Samaraló) насчитывали от 34 до 253 штаммов, при этом их доля составила 53,7% от общего количества штаммов Beijing (табл. 1). Кластеры в группе штаммов, не относящихся к Beijing, были существенно мельче, при этом на долю пяти крупнейших из них (Samara255, Samara227, Samara205, Samara228 и Samara201) пришлось лишь 20,4% всех штаммов группы (табл. 2). Наблюдаемые высокие уровни кластеризации свидетельствуют об активной трансмиссии штаммов в Самарской области, особенно штаммов генетической группы Beijing.

Полученные данные о распределении групп и уровнях кластеризации штаммов согласуются с предыдущими результатами исследований как в других регионах России (Baranov et al., 2009; Makinen et al., 2011; Вязовая, 2011; Chernyaeva et al., 2011; Маничева, 2011; Mokrousov et al., 2012; Огарков, 2012; Савилов, 2013), так и в Самарской области (Drobniewski et al., 2005; Балабанова, 2006; Balabanova et al., 20116). Следует отметить, что доля штаммов Beijing в структуре популяции М. tuberculosis в Самарской области за последнее десятилетие выросла с 62,0% в 2001-2002 гг. (Drobniewski et al., 2005) до 67,9% в 2005 г. (Николаевский, 2005) и до 71,6% в 2008-2009 гт.

Проведенный нами анализ выявил ряд различий в распространенности генетических групп М. tuberculosis по медицинским учреждениям и районам проживания, при этом проживание в городах было ассоциировано с риском заражения штаммами группы Beijing, а в сельской местности - штаммами

других групп. Достоверные различия в распространенности по районам были выявлены для кластеров Samara227 и Samara228, не относящихся к Beijing (Х2=59,566, р=0,003 и х2=61,044, р=0,002 соответственно), а также кластера S amara 17 (х2=47,66, р=0,047) и всей группы Beijing в целом (%2=48,470, р=0,040). По медицинским учреждениям достоверно различалась распространенность кластера Samara4 группы Beijing (х2=29,448, р<0,005), а также группы мелких кластеров штаммов, не относящихся к Beijing (х2=16,015, р=0,042).

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что за эпидемический процесс отвечает не генетическая группа в целом, а лишь несколько крупных кластеров внутри нее. Одной из причин распространенности штаммов группы Beijing может являться трансмиссия штаммов в медицинских учреждениях вследствие недостаточных мер инфекционного контроля. Это подтверждается выявленным нами преобладанием кластеров Samara4 (х2=8,574, р=0,003) и Samara24 (%2=6,1бЗ, р=0,013) группы Beijing среди пациентов, получавших лечение в прошлом.

Генетические характеристики лекарственно-устойчивых и чувствительных штаммов М. tuberculosis в Самарской области

Одной из особенностей эпидемиологии ТБ в РФ являются постоянно растущие уровни распространения штаммов, устойчивых к основным и/или резервным противотуберкулезным препаратам (Balabanova et al., 2011а; Воробьева, 2012; Жукова, 2012; Леликова, 2013; Корецкая, 2013). Туберкулез с множественной (МЛУ) и обширной лекарственной устойчивостью (ОЛУ) характеризуется значительно более длительными сроками лечения, неудовлетворительными результатами лечения и высокой смертностью, особенно в сочетании с ВИЧ-инфекцией (Migliori et al., 2007; Shah et al., 2007; Balabanova et al., 201 la).

Результаты проведенных нами исследований продемонстрировали высокие уровни лекарственной устойчивости среди изолятов, циркулирующих в Самарской области, включая МЛУ и ОЛУ, при этом распространенность различных типов устойчивости значительно различалась в группах впервые

выявленных и получавших лечение в прошлом пациентов с преобладанием устойчивых форм среди последних (рис. 2).

Рис. 2. Различия профилей лекарственной чувствительности штаммов, выделенных от впервые выявленных (А) и получавших лечение в прошлом пациентов (Б).

Полученные нами данные по уровням устойчивости в Самарской области дополняют ранее опубликованные данные (Drobniewski et al., 2005; Balabanova et al., 2006; Balabanova et al., 20116) и показывают значительный рост уровня распространенности лекарственно-устойчивых штаммов, особенно штаммов с МЛУ: с 17,5% среди новых случаев и 34,0% среди получавших лечение в прошлом пациентов в 2002-2003 гг. (Balabanova et al., 2006) до 37,7% и 66,6% соответственно в 2008-2009 гг.

Анализ распространенности лекарственной устойчивости в генетических группах и кластерах штаммов М. tuberculosis был проведен отдельно среди впервые выявленных пациентов и пациентов, получавших лечение в прошлом.

Среди впервые выявленных пациентов распространенность лекарственной устойчивости среди генетических групп оказалась неравномерной: статистически значимые ассоциации были зарегистрированы для групп Beijing, Haarlem, LAM и URAL (х2=14,955, р<0,001; х2=15,095, р=0,002; х2=35,033, р<0,001 и %2=10,014, р=0,018 соответственно). При этом среди штаммов группы Beijing гораздо чаще встречались устойчивые штаммы (70,0%; 87,5% и 97,0% штаммов с моно- и полирезистентностью, МЛУ и ОЛУ соответственно), тогда как в группах Haarlem, LAM и URAL превалировали лекарственно-чувствительные штаммы. Анализ распространенности штаммов с МЛУ (включая ОЛУ) относительно всех остальных типов устойчивости подтвердил различия в распределении группы Beijing (RR=0,646, 95% CI=0,59-0,70), Haarlem (RR=3,891, 95% CI=l,78-8,52), LAM (RR=3,631, 95% CI=l,95-6,76) и

URAL (RR=2,531, 95% С 1=1,33-4,81). В свою очередь, генотип Beijing, в отличие от штаммов Евро-Американской линии, был ассоциирован практически со всеми профилями лекарственной устойчивости: полностью чувствительными (RR=0,408, 95% С1=0,34-0,49), МЛУ без ОЛУ (RR=3,158, 95% С1=2,28-4,38), ОЛУ (RR=13,082, 95% С1= 1,79-95,50), не-МЛУ, включая полностью чувствительных (RR=0,533, 95% С1=0,49-0,58) и МЛУ, включая ОЛУ (RR=3,441, 95% С1=2,50-4,73), при этом наблюдались положительные ассоциации с лекарственной устойчивостью и отрицательные - с лекарственной чувствительностью.

Полученные нами данные в целом подтверждают ранее опубликованные результаты для Самарской области и других регионов РФ, где показана выраженная ассоциированность генотипа Beijing с устойчивостью к противотуберкулезным препаратам, в первую очередь изониазиду и рифампицину (Степаншина, 2007; Дымова, 2008; Baranov et al., 2009; Brown et al., 2010; Nodieva et al., 2010; Маничева, 2011). Причиной данной ассоциации среди штаммов Beijing, распространенных на территории России, по-видимому, является наличие у резистентных к изониазиду и рифампицину штаммов определенных мутаций (в частности, S315T в гене katG и в кодоне 531 гена rpoB) (Drobniewski et al., 2005; Nikolayevskyy et al., 2007; Дымова, 2008; Mokrousov et al., 2009), однако генетическая природа данных ассоциаций неизвестна. В несколько меньшей степени с генотипом Beijing ассоциирована устойчивость к фторхинолонам и инъекционным препаратам, в основном обусловленная мутациями в генах gyrA, gyrB и rrs. Эти точечные мутации возникают спорадически (Mokrousov et al., 20086; Kontsevaya et al., 2011; Casali et al., 2012) и, таким образом, не вносят вклад в трансмиссию лекарственно-устойчивых штаммов. Остальные типы мутаций, обуславливающих развитие устойчивости к стрептомицину, пиразинамиду и другим препаратам, по-видимому, в значительно меньшей степени ассоциированы с генотипом.

В формирование лекарственной устойчивости штаммов, выделенных от ранее лечившихся пациентов, значительный вклад вносят клинико-эпидемиологические факторы, которые могут привести к селекции устойчивых штаммов в результате неправильного лечения. В группе ранее лечившихся

пациентов нами обнаружены достоверные различия в распространенности штаммов с различными профилями лекарственной устойчивости внутри генетических групп Beijing и LAM (х2=31,284 и %2=18,688, р<0,001). Как и среди впервые выявленных пациентов, штаммы Beijing значительно реже встречались среди лекарственно-чувствительных штаммов (RR=0,745, 95% 0=0,65-0,85), тогда как LAM был распространен в данной группе гораздо чаще (RR=3,429, 95% С1=1,82-6,45). Анализ генетических характеристик штаммов с различными типами устойчивости выявил различия практически для всех групп устойчивости, кроме групп моно- и полирезистентных штаммов и штаммов с ОЛУ.

Полученные данные об ассоциированности различных типов устойчивости с отдельными кластерами хорошо согласуются с результатами наших исследований по распространенности отдельных кластеров в Самарской области. Статистически значимые ассоциации зарегистрированы для кластеров Samara4 (у2= 107,299, р<0,001), Samara24 (х2=27,932, р<0,001), Samaraló (у_2= 14,402, р=0,002) группы Beijing, а также в группах малых (не относящихся к крупнейшим пяти) кластеров (у_2=45,274, р<0,001) и уникальных (х2=39,762, р<0,001) штаммов, не относящихся к Beijing. Крупнейшие кластеры генетической группы Beijing Samara4 и Samara24 более распространены в группе штаммов с МЛУ (включая ОЛУ), нежели среди чувствительных штаммов или штаммов с моно- и полирезистентностью (RR=0,164, 95% С1=0,11-0,25 и RR=0,252, 95% С1=0,14-0,45). Группы уникальных и малых кластеров штаммов, не относящихся к Beijing, достоверно превалировали среди лекарственно-чувствительных штаммов (RR=3,480, 95% 0=1,92-6,32 и RR=4,193, 95% С1=2,44-7,21).

Анализ показал, что имеются достоверные различия распространенности всех типов устойчивости среди кластеров штаммов (х2=28,430, р=0,012 для группы моно- и полирезистентных штаммов, х2=36,413, р=0,001 для группы ОЛУ, х2=141,185, р<0,001 для группы полностью чувствительных, х2=130,351, р<0,001 для штаммов с МЛУ без ОЛУ). Распространенность штаммов с МЛУ (включая ОЛУ) достоверно отличалась от таковой для штаммов без МЛУ (включая полностью чувствительных) (х2=174,109, р<0,001).

Полученные нами данные подтверждают имеющиеся представления о генетической неоднородности группы Beijing и о том, что ассоциированность с лекарственной устойчивостью является характеристикой отдельных генотипов внутри группы Beijing (нередко ассоциированных с определенными географическими зонами), а не группы в целом (Brown et al., 2010). По-видимому, это подтверждает гипотезу о сочетанной эволюции возбудителя туберкулеза и человека, связанной, в том числе, с миграциями отдельных групп людей (Mokrousov, 2008а). На основании наших исследований можно сделать вывод о том, что в Самарской области преобладают штаммы современных групп Beijing, родственные штаммам, распространенным в Китае и странах Юго-Восточной Азии.

В Самарской области наблюдается активная трансмиссия устойчивых штаммов, в особенности штаммов с МЛУ, что обусловлено, вероятно, более длительным периодом лечения и нахождения в медицинских учреждениях инфицированных ими пациентов, более низкой приверженностью лечению и недостаточным уровнем инфекционного контроля на стационарном и амбулаторном этапах лечения. Трансмиссия чувствительных штаммов в Самарской области выражена в меньшей степени, что может объясняться относительно быстрой излечиваемостыо инфицированных ими пациентов, коротким периодом пребывания в стационарах и меньшей степенью контактов с другими пациентами и здоровыми людьми.

Среди пациентов, получавших лечение в прошлом, были обнаружены достоверные различия в распределении между профилями устойчивости кластера Samara4 (х2= 15,201, р=0,002), Samaral7 (х2=7,909, р=0,048), Samara227 (Х2=10,544, р=0,014), а также мелких кластеров группы Beijing (х2=Ю,185, р=0,017) и He-Beijing (х2=28,968, р<0,001).

Кластер Samara4 и мелкие кластеры Beijing достоверно чаще встречались в группе МЛУ (включая ОЛУ) (RR=0,463, 95% С1=0,29-0,74 и RR=0,653, 95% С1=0,46-0,92). Напротив, мелкие кластеры He-Beijing и штаммы с неполным профилем VNTR более распространены среди не-МЛУ штаммов, включая полностью чувствительных (RR=3,444, 95% С1=1,99-5,97 и RR=6,000, 95% С1=1,65-21,87).

Нами были обнаружены достоверные различия в распространенности кластеров штаммов в группах полностью чувствительных, штаммов с МЛУ без ОЛУ, не-МЛУ (включая полностью чувствительных) и МЛУ (включая ОЛУ) (-/>74,706, х2=44,100, yv2=61,769, ^=61,769 соответственно, р<0,001).

Полученные данные подтверждают обнаруженные ранее закономерности относительно трансмиссии в медицинских учреждениях кластера Samara4, относящегося к группе Beijing и ассоциированного с МЛУ. Напротив, роль внутрибольничной передачи в трансмиссии штаммов, не относящихся к группе Beijing, незначительна.

Генетический полиморфизм генов, ассоциированных с вирулентностью, среди штаммов М. tuberculosis в Самарской области К настоящему времени в геноме М tuberculosis идентифицирован ряд генов, ассоциированных с повышенной вирулентностью и участвующих в процессах синтеза компонентов клеточной стенки, ряда ферментов, метаболизме липидов, а также окислительно-восстановительных процессах, обеспечивающих внутриклеточное паразитирование микобактерий и их выживание в условиях недостатка кислорода и питательных веществ. Наличие полиморфизмов в таких генах может повлечь за собой фенотипические изменения, влияющие на вирулентность микроорганизма (Sherman et al., 2001; Boon et al., 2002; Constant et al., 2002; Raynaud et al., 2002; Voskuil et al., 2003; Reed et al., 2004; Boshoff et al., 2005; Sheline et al., 2009).

В данном исследовании мы проанализировали наличие и распределение в популяции М. tuberculosis Самарской области штаммов с полиморфизмами в генах pic A, plcB, plcC (в комплексе с геном plcD кодирующих фермент фосфолипазу С), lipR (кодирующем фермент липазу), dosT (кодирующем сенсорную гистидинкиназу, входящую в состав двухкомпонентной регуляторной системы комплекса DosR) и pksl5/i (кодирующем фермент поликетидсинтазу). Исследовались вставки последовательностей IS6110 в генах фосфолипазы С, крупные делеции в гене липазы lipR (рис. 3), вставки размером 1-6 и 7 п.н. в гене поликетидсинтазы pksl5/l и мелкие делеции в гене гистидинкиназы dosT(рис. 4).

жтт~-

ч г гас & 1

1

il lJ;:Jjj.j rll

Рис. 3. Электрофореграмма Рис. 4. Пример пирограммы. результатов анализа гена

lipR, ассоциированного с вирулентностью. WT - дикий тип, фрагмент размером 3600 гт.н.; MUT - мутантный тип, фрагмент размером 720 п.н.

А — последовательность дикого типа (GACGÇGTCGAATCCTACGGACAGCCCTGGT). Б — мутантная последовательность (GACGTGTCGAATCCTACGGGCAÇCCCTGGT).

По данным ряда исследователей, некоторые полиморфизмы в генах вирулентности ассоциированы с определенными генетическими группами (Reed et al„ 2007; Caws et a!., 2008; Thwaites et al., 2008; Krishnan et al., 2011). Природа таких ассоциаций неясна, так как указанные полиморфизмы не являются синонимичными, находятся под эволюционным давлением и имеют фенотипическое выражение.

Среди штаммов в Самарской области полиморфизмы в генах plcA, plcB, plcC, lipR, dosT и pksl5/l встречались в 35 (3,0%), 2 (0,2%), 6 (0,5%), 142 (15,6%), 979 (75,1%) и 956 (74,1%) штаммах соответственно. Распространенность полиморфизмов среди различных генетических групп характеризовалась выраженной неоднородностью. Статистически значимые различия были обнаружены для полиморфизмов в генах plcA (х2=35 3,944 для дикого и х2=340,988 для мутантного типа, р<0,001), dosT (-£= 1063,803, р<0,001), pksl5/l (х2= 1044,451 для дикого типа и х2=Ю22,534 для вставки 7 п.н., р<0,001) и lipR (х2=244,037 для дикого и х2=259,554 для мутантного типа, р<0,001), в то

время как существенных различий в распространенности полиморфизмов в генах plcB и plcC обнаружено не было. Наличие полиморфизмов в генах dosT и pksl5/l было ассоциировано с принадлежностью штамма к генетической группе Beijing (RR=7,070, 95%CI=5,35-9,34 и RR=7,784, 95%CI=5,79-10,46), в которой они имелись у 99,4% и 98,4% штаммов соответственно. Мутации в гене plcA наблюдались, главным образом, среди штаммов группы LAM (п=30, 35,7%), а в гене lipR - в группах Ghana, Cameroon, Uganda и S (RR=7,017, 95%CI=5,57-8,85).

Наши данные относительно ассоциированности полиморфизмов в генах pksl5/l и dosT с генетической группой Beijing, а также plcA с группой LAM хорошо согласуются с ранее опубликованными данными (Constant et al., 2002; Gagneux et al., 2007; Dubiley et al., 2007). В то же время, данные об ассоциированности дикого типа гена lipR со штаммами, принадлежащими к принципиальной генетической группе 2 (Cameroon, Uganda, X, Haarlem и LAM) (Sheline et al., 2009), в нашем исследовании на территории Самарской области не подтвердились.

Анализ распространенности полиморфизмов среди кластеров штаммов М. tuberculosis выявил значимые различия для полиморфизмов в тех же генах, что и анализ по генетическим группам: plcA (х2=397,592 для дикого и Х2=406,803 для мутантного типа, р<0,005), dosT (£=\078,96, р<0,005), pksl5/1 (%2=1031,404 для дикого типа и х2= 1008,738 для вставки 7 п.н., р<0,005) и lipR (х2= 153,438 для дикого и х2= 155,313 для мутантного типа).

Хотя большинство исследуемых штаммов имели интактный ген plcA (96,9%), вставки в данном гене достоверно чаще встречались у штаммов Samara227 и Samara228 группы LAM, чем у всех остальных штаммов (RR=40,035, 95%С1=24,24-66,12). Низкая распространенность лекарственной устойчивости в штаммах этих кластеров и потенциально сниженная вирулентность вследствие мутаций в гене фосфолипазы С позволяет предположить наличие компенсаторных механизмов, обусловивших сравнительно широкое распространение данных штаммов в Самарской области.

В группах уникальных штаммов и мелких кластеров, относящихся к Евро-Американской линии, полиморфизмы в гене lipR встречались достоверно

чаще (более 40%), чем в среднем по популяции (не более 10%) (RR=6,098, 95%С1=4,44-8,38). По всей видимости, ген lipR играет незначительную роль в трансмиссивной способности штаммов. Ассоциированные с генетической группой Beijing полиморфизмы pksI5/I и dosT, вероятно, не являются кластерспецифическими и могут считаться генетическими маркерами данной группы, что ранее было показано для других популяций (Constant et al., 2002; Gagneux et al., 2007; Fallow et al., 2010).

Анализ распространенности полиморфизмов в генах plcA, plcB, plcC, lipR, dosT и pksl5/1 в группах штаммов с различными профилями лекарственной устойчивости продемонстрировал ассоциации для тех же генов (plcA, lipR, dosT и pksl5/\). Полиморфизмы генов pic А и lipR достоверно чаще встречались среди полностью чувствительных штаммов и штаммов с моно- и полирезистентностью (RR=2,557, 95%С1=1,25-5,24 и RR=2,291, 95%С1=1,60-3,28 соответственно). Напротив, вставки размером 7 п.н. в гене рЫ5/1 (RR=0,727, 95%С1=0,64-0,83) и однонуклеотидные замены в гене dosT (RR=0,724, 95%С1=0,64-0,82) встречались чаще в группе штаммов с МЛУ и ОЛУ. Полностью чувствительные штаммы и штаммы с моно- и полирезистентностью достоверно чаще имели интактный тип гена рЫ5/1 (RR=2,841, 95%С1=2,22-3,64). Более мелкие вставки (1-6 п.н.) чаще наблюдались в группах штаммов с МЛУ и ОЛУ (RR=0,000, 95%С1=0,00-0,74).

Таким образом, лекарственная устойчивость штаммов в целом статистически достоверно ассоциирована с полиморфизмами в генах dosT и pksl5/l, в то время как лекарственная чувствительность ассоциирована с дикими типами генов dosT и pksl5/l и полиморфизмами в генах plcA и lipR. Однако ассоциации лекарственной устойчивости с генами вирулентности, скорее всего, носят опосредованный характер, являясь в первую очередь ассоциациями с теми или иными генетическими группами.

Наши данные в целом подтверждают существующие представления о том, что вирулентность и лекарственная устойчивость являются важными факторами в эпидемическом процессе М. tuberculosis, но механизмы их влияния различны. Вирулентность штаммов играет роль в заражении ТБ, тогда как лекарственная устойчивость непосредственно участвует в трансмиссии

заболевания, обеспечивая более длительное и массивное бактериовыделение и тем самым повышая вероятность заболевания других людей от пациента, инфицированного устойчивым штаммом. Скорее всего, и вирулентность, и лекарственную устойчивость можно рассматривать как факторы эволюционного успеха определенных групп M. tuberculosis, в частности, группы Beijing.

ВЫВОДЫ

1. С помощью методов типирования по локусам VNTR и сполиготипирования выявлены основные генетические группы и кластеры штаммов M. tuberculosis, циркулирующие в Самарской области. Установлено, что генетическая структура популяции M. tuberculosis в Самарской области характеризуется значительной гомогенностью. 71,6% штаммов принадлежали генетической группе Beijing, 23,2% составляли группы Евро-Американской линии; на группы EAI и Delhi/CAS приходилось по 0,1%. Уровни кластеризации среди штаммов генетической группы Beijing были достоверно выше (87,7%), чем у штаммов других генетических групп (66,3%).

2. Показано, что генетические группы микобактернй распространены на территории Самарской области неравномерно, при этом проживание в городах ассоциировано с риском заражения штаммами группы Beijing, а проживание в сельской местности — штаммами других групп. Неравномерная распространенность кластеров генетической группы Beijing (Samara4 и мелких кластеров) в медицинских учреждениях и преобладание кластеров Samara4 и Samara24 среди пациентов, повторно проходивших курс противотуберкулезной терапии, свидетельствует о значительной роли трансмиссии данных штаммов в стационарах вследствие длительного пребывания пациентов и недостаточных мер инфекционного контроля.

3. Установлено, что штаммы внутри групп генетически неоднородны и различаются по способности к трансмиссии. Основной вклад в эпидемический процесс вносит ограниченное число крупнейших кластеров (Samara4, Samaral2, Samaralô, Samaral7, Samara24, Samara227 и Samara228), в основном принадлежащих генетической группе Beijing.

4. Выявлено, что для кластеров Samara4, Samara24 и Samaraló характерны выраженная ассоциированность с устойчивостью к противотуберкулезным препаратам и их активная трансмиссия в медицинских учреждениях Самарской области. Лекарственно-чувствительные штаммы входят в состав малых кластеров или являются уникальными, что свидетельствует о незначительных уровнях их текущей трансмиссии.

5. У штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в Самарской области, обнаружены ассоциации между полиморфизмами в гене plcA и генетической группой LAM (кластерами Samara227 и Samara228), в генах dosT и pksl5/l и группой Beijing, а также в гене lipR с большинством кластеров групп Ghana, Cameroon, Uganda и S. Взаимосвязь между полиморфизмами в генах, ассоциированных с вирулентностью, и чувствительностью к противотуберкулезным препаратам носит опосредованный характер, связанный с неодинаковой распространенностью лекарственной устойчивости среди отдельных генетических групп и кластеров штаммов микобактерий.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Балабанова, Я.М. Использование автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 в диагностике лекарственной устойчивости к резервным препаратам в г. Самаре / Я.М. Балабанова, И.М. Федорин, H.A. Маломанова, Ф. Дробниевский, В.В. Николаевский, X. Сун, Ю.А. Машкова, Т.Г. Симак, И.С. Концевая, O.A. Игнатьева, С.А. Миронова // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2009. - № 10. - С. 63-70.

2. Концевая, И. С. Изучение устойчивости к противотуберкулезным препаратам у Mycobacterium tuberculosis в Самарской области / И. С. Концевая, О. Н. Макурина, Я. М. Балабанова // В мире научных открытий. - 2010. - № 4. -С. 51-52.

3. Концевая, И.С. Молекулярная эпидемиология туберкулеза: задачи, методы, перспективы / И.С. Концевая, В.В. Николаевский, Я.М. Балабанова // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 2011. — № 1. — С. 3-10.

Публикации в зарубежных журналах

4. Kontsevaya, I.S. Evaluation of Two Molecular Assays for Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis Resistance to Fluoroquinolones in High-Tuberculosis and -Multidrug-Resistance Settings / I. Kontsevaya, S. Mironova, V. Nikolayevskyy, Y. Balabanova, S. Mitchell, F. Drobniewski // Journal of Clinical Microbiology. - 2011. -T. 49. - № 8. - C. 2832-2837.

5. Balabanova, Y. Survival of civilian and prisoner drug-sensitive, multi-and extensive drug- resistant tuberculosis cohorts prospectively followed in Russia / Y. Balabanova, V. Nikolayevskyy, O. Ignatyeva, I. Kontsevaya, С. M. Rutterford, A. Shakhmistova, N. Malomanova, Y. Chinkova, S. Mironova, I. Fedorin, F. Drobniewski // PLoS One. - 2011. - T. 6. - № 6. - C. e20531.

6. Casali, N. Microevolution of extensively drug-resistant tuberculosis in Russia / N. Casali, V. Nikolayevskyy, Y. Balabanova, O. Ignatyeva, I. Kontsevaya, S. R. Harris, S. D. Bentley, J. Parkhill, S. Nejentsev, S. E. Hoffner, R. D. Horstmann, T. Brown, F. Drobniewski // Genome Res. - 2012. - T. 22. - 4. - C. 735-745.

7. Allix-Béguec, С. Proposal of a Consensus Set of Hypervariable Mycobacterial Interspersed Repetitive-Unit-Variable-Number Tandem-Repeat loci for Subtyping of Mycobacterium tuberculosis Beijing Isolates / C. Allix-Béguec, С. Wahl, M. Hanekom, V. Nikolayevskyy, F. Drobniewski, S. Maeda, I. Campos-Herrero, I. Mokrousov, S. Niemann, I. Kontsevaya, N. Rastogi, S. Samper, L. H. Sng, R.M. Warren, P. Supply // J Clin Microbiol. - 2014. - T. 52. - № 1. - C. 164-72.

8. Casali, N. Evolution and transmission of drug-resistant tuberculosis in a Russian population / N. Casali, V. Nikolayevskyy, Y. Balabanova, S. R. Harris, O. Ignatyeva, I. Kontsevaya, J. Corander, J. Bryant, J. Parkhill, S. Nejentsev, R. D. Horstmann, T. Brown, F. Drobniewski // Nat. Genet. - 2014. - T. 46. - № 3. - C. 279-286.

Тезисы и статьи в материалах конференций

9. Концевая, И. С. Эпидемиологическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis в Самарской области / И. С. Концевая, О. Н. Макурина, В. В. Николаевский // Материалы международной научно-практической конференции "Теоретические и прикладные проблемы науки и образования". - Курск. - 2010. - С. 146-148.

10. Концевая, И. С. Применение сполиготипирования в эпидемиологии туберкулеза / И. С. Концевая И Материалы международной научно-практической конференции "Теоретические и прикладные проблемы науки и образования". - Курск. - 2010. - С. 148-151.

11. Концевая, И .С. Идентификация мутаций и диагностика устойчивости возбудителя туберкулеза к фторхинолонам с использованием тест-системы GenoType® MTBDRsl в Самарской области / И. С. Концевая // Материалы международной научно-практической конференции "Физиологические механизмы адаптации живых систем". - Сухум. - 2011. — С. 135-139.

12. Концевая, И. С. Распространенность основных генетических групп М. tuberculosis в Самарской области и их ассоциированность с мутациями, связанными с лекарственной устойчивостью к основным противотуберкулезным препаратам / И. С. Концевая // Материалы II Международной научно-практической конференции «Социальные и медико-биологические вопросы адаптации». - Курск. — 2011. — С. 70-72.

13. Концевая, И. С. Применение методов филогенетического анализа при изучении эпидемиологии туберкулеза / И. С. Концевая // Материалы Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования». - Курск. - 2012. — С. 91-93.

14. Balabanova, Y. Epidemiology of Drug Resistant Tuberculosis in Samara Oblast, Russian Federation / Y. Balabanova, V. Nikolayevskyy, O. Ignatyeva, S. Mironova, A. Kovalev, N. Malomanova, Y. Chinkova, A. Rybkina, I. Fedorin, F. Drobniewski // Материалы совместного семинара NIAID-ISTC «Research Opportunities in ТВ Drug Discovery and Diagnosis». — Москва. — 2010.

15. Ignatyeva, O. Genetic analysis of the host-pathogen interaction in tuberculosis ("TB-EURO-GEN") study - progress and current tuberculosis epidemiology / O. Ignatyeva, I. Kontsevaya, Y. Balabanova, V. Nikolaevskyy, S. Mironova, A. Kovalev, A. Isaeva, Y. Chinkova, A. Rybkina, A. Kritskyy, D. Gromova, M. Korobova, A. Shakhmistova, N. Malomanova, I. Fedorin, S. Nejentsev, R. Horstmann, S. Hoffner, F. Drobniewski // Материалы 21-го Европейского

конгресса по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям. — Милан.-2011.

16. Allix-Beguec, С. Typing Mycobacterium tuberculosis Beijing isolates with hypervariable MIRU-VNTR loci: a multicentric consensus study / C. Allix-Beguec, C. Wahl, M. Hanekom, S. Maeda, C. Martin, I. Mokrousov, S. Nieman, V. Nikolayevskyy, N. Rastogi, S. Samper, L.-H. Sng, S.-X. Wang, R. Warren, P. Supply // Материалы 32-го ежегодного конгресса Европейского сообщества микобактериологов. — Любек. — 2011. — С. 19.

17. Kontsevaya, I. Performance of the GenoType MTBDRsl assay for rapid diagnosis of extensively drug-resistant tuberculosis in HIV-со infected patients / I. Kontsevaya, O. Ignatyeva, V. Nikolayevskyy, Y. Balabanova, A. Kovalyov, A. Kritsky, O. Matskevich, F. Drobniewski // Сборник тезисов 17-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино. - 2013. - С. 248249.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

МЛУ — множественная лекарственная устойчивость ОЛУ - обширная лекарственная устойчивость ТБ - туберкулез

CI - доверительный интервал (Confidence interval) ETR - точные тандемные повторы (Exact tandem repeats) MIRU - микобактериальные рассеянные повторяющиеся единицы (Mycobacterial interspersed repetitive units) RR - показатель соотношения (rate ratio)

VNTR — вариабельные длины тандемных повторов (Variable number tandem repeats)

Рекламно-производственная компания «Абрис» Бумага офсетная. Печать цифровая. Брошюра. Заказ №5 Тираж 120 экземпляров. Подписано в печать 28.03.2014 г.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Концевая, Ирина Сергеевна, Самара

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

04201457661

УДК 575.17

Концевая Ирина Сергеевна

ОСНОВНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ГРУППЫ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS В САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ

03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Макурина Ольга Николаевна, доктор биологических наук, профессор

Самара 2014

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ...............................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................................11

1.1. Краткие сведения о возбудителе туберкулеза. Лекарственная устойчивость и ее генетические основы..................................................................................................11

1.2. Эпидемиология туберкулеза и распространенность лекарственной устойчивости в мире и Российской Федерации...........................................................15

1.3. Полиморфизмы в геноме М. tuberculosis, их применение в филогенетических и эпидемиологических исследованиях туберкулеза....................................................19

1.3.1. Общие сведения о полиморфизмах в геноме М. tuberculosis........................19

1.3.2. Полиморфизмы в повторяющихся последовательностях и методы молекулярной эпидемиологии.......................................................................................22

1.3.3. Полиморфизмы, имеющие филогенетическое значение,

и методы их анализа........................................................................................................26

1.3.4. Факторы вирулентности микобактерий и их генетические основы................28

1.3.5. Филогенетическая и филогеографическая классификация микобактерий туберкулезного комплекса..............................................................................................32

1.4. Распространенность генетической группы Beijing в мире и Российской Федерации и ее ассоциации с лекарственной устойчивостью....................................34

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................................41

2.1. Объект исследования............................................................................................41

2.2. Методы исследования...........................................................................................43

2.2.1. Бактериологические методы.............................................................................43

2.2.2. Выделение ДНК из изолятов М. tuberculosis..................................................44

2.2.3. Молекулярно-генетические методы................................................................45

2.2.3.1. Типирование по спейсерным олигонуклеотидам (сполиготипирование) 45

2.2.3.2. Типирование по локусам VNTR...................................................................46

2.2.3.3. Анализ полиморфизмов в генахplcA, plcB, plcC и lipR..............................51

2.2.3.4. Анализ полиморфизмов в генахpksl5/l и dosT..........................................53

2.2.4. Статистический анализ данных........................................................................55

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................................56

3.1. РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ГРУПП М. TUBERCULOSIS ПО РАЙОНАМ САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ..................................................................56

3.1.1. Общие данные по генетическим группам и кластеризации штаммов.........56

3.1.2. Распространенность генетических групп в Самарской области...................65

3.1.3. Кластеризация штаммов в районах Самарской области................................66

3.1.4. Кластеризация штаммов, выделенных от впервые выявленных больных и пациентов, получавших лечение в прошлом................................................................71

3.2. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЛЕКАРСТВЕННО-УСТОЙЧИВЫХ И ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ШТАММОВ М TUBERCULOSIS В САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ........................................................................................................................74

3.2.1. Распространенность лекарственной устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам в Самарской области.........................................74

3.2.2. Распространенность лекарственной устойчивости среди различных генетических групп М. tuberculosis в Самарской области..........................................77

3.2.3. Неоднородность генетических групп и ассоциированность отдельных кластеров с лекарственной устойчивостью..................................................................89

3.3. ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ВИРУЛЕНТНОСТЬЮ, СРЕДИ ШТАММОВ М. TUBERCULOSIS В САМАРСКОЙ ОБЛАСТИ......................................................................................................................101

3.3.1. Ассоциированность полиморфизмов геновplcA,plcB, plcC, lipR, dosTи pksl5/l с генетическими группами М. tuberculosis....................................................102

3.3.2. Ассоциированность полиморфизмов генов plcA, plcB, plcC, lipR, dosT и pksl5/I с кластерами М. tuberculosis............................................................................110

3.3.3. Ассоциированность полиморфизмов генов pie A, plcB, plcC, lipR, dosT и pksI5/l с устойчивостью к противотуберкулезным препаратам..............................117

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................................123

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................129

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................131

Приложение А. Распространенность генетических групп М. tuberculosis по медицинским учреждениям Самарской области................................................................162

Приложение Б. Распространенность генетических групп М. tuberculosis по адресам проживания пациентов..................................................................................................164

Приложение В. Распространенность кластеров штаммов М. tuberculosis по районам проживания пациентов в Самарской области............................................................169

Приложение Г. Распространенность кластеров штаммов М. tuberculosis по медицинским учреждениям Самарской области................................................................175

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

МБТ - микобактерии туберкулеза

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

ОЛУ - обширная лекарственная устойчивость

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ТБ - туберкулез

CI - доверительный интервал (Confidence interval)

DR - регион прямых повторов (Direct repeats)

ETR - точные тандемные повторы (Exact tandem repeats)

IS - инсерционная последовательность (Insertion sequence)

LSP - полиморфизм длинных последовательностей (Lagre sequence polymorphism) MIRU — микобактериальные рассеянные повторяющиеся единицы (Mycobacterial interspersed repetitive units) RR - показатель соотношения (rate ratio)

SNP - однонуклеотидная замена (Single nucleotide polymorphism)

VNTR — вариабельные длины тандемных повторов (Variable number tandem repeats)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Туберкулез остается важной проблемой здравоохранения во всем мире и Российской Федерации в частности. В 2012 году в России было зарегистрировано 97542 новых случая этого заболевания, а показатели смертности составили 12,4 на 100 тыс. населения. Согласно классификации Всемирной организации здравоохранения, Российская Федерация является страной с высокими уровнями распространенности туберкулеза, в том числе лекарственно-устойчивых его форм (WHO, 2008). Так, уровни заболеваемости туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью среди впервые выявленных пациентов достигают 20% от общего количества. Самарская область относится к регионам России с неблагоприятной обстановкой по туберкулезу, где уровень заболеваемости в 2011 году (78,5 случаев на 100 тыс. населения) превышает средний показатель по стране (73,0 случая на 100 тыс. населения) (Аналитический обзор МЗ РФ, 2011). Около 20% всех впервые выявленных заболевших и 60% получавших лечение в прошлом пациентов в Самарской области инфицированы штаммами мико-бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (Balabanova et al., 2006). Кроме того, в последнее десятилетие появились и быстро увеличиваются случаи инфицирования больных штаммами микобакггерий с обширной лекарственной устойчивостью.

Согласно исследованиям, преобладающей генетической группой штаммов, циркулирующей в Самарской области, является группа Beijing (Балабанова, 2006). Оно характеризуется высокой степенью внутригрупповой гомогенности, а также, по мнению многих исследователей, повышенной вирулентностью, патогенностыо и ассоциированностью с лекарственной устойчивостью.

Микобактерии туберкулеза, как и другие инфекционные патогены, тесно взаимодействуют с человеком на уровне индивидуума и популяции во времени и пространстве. Для разработки мер борьбы с туберкулезом и его трансмиссией необходимо точно определять принадлежность штамма к той или иной генетической группе, изучать закономерности формирования лекарственной устойчивости и повышенной вирулентности бактерий, а также ассоциированность указанных механизмов с генетическими факторами патогена. Кроме того, изучение свойств ге-

нетической группы и ассоциированности ее с определенными формами туберкулеза и с устойчивостью к лекарственным препаратам поможет в будущем разрабатывать и внедрять новые методы диагностики, а также способы лечения и профилактики туберкулеза.

К настоящему времени имеются лишь единичные данные по структуре популяции Mycobacterium tuberculosis в Самарской области, а также по закономерностям распространения различных генетических групп и их ассоциированности с лекарственной чувствительностью штаммов и их вирулентностью.

В связи с вышеизложенным, были определены цели и задачи данного исследования.

Цель работы - выявление генетической структуры популяции и закономерностей циркуляции и распространения основных генетических групп М tuberculosis в Самарской области, а также их ассоциаций с вирулентностью и устойчивостью к противотуберкулезным препаратам.

Задачи исследования:

1. С помощью методов молекулярного генотипирования определить основные генетические группы и кластеры штаммов М. tuberculosis, циркулирующие в Самарской области.

2. Выявить закономерности распространения генетических групп и кластеров штаммов М. tuberculosis в районах Самарской области и медицинских учреждениях, где пациенты проходят лечение от ТБ.

3. Выявить закономерности трансмиссии штаммов М. tuberculosis, устойчивых к противотуберкулезным препаратам, включая штаммы с множественной и обширной лекарственной устойчивостью и установить их ассоциированность с генетическими группами и кластерами М. tuberculosis.

4. Провести анализ полиморфизмов в генах М. tuberculosis, ассоциированных с вирулентностью: генах фосфолипазы С (plcA, plcB, plcC), липазы (lipR), поликетидсинтазы {pksl5/l) и сенсорной гистидинкиназы (dosT), выявить закономерности их связи с генетическими группами и кластерами М. tuberculosis, а также чувствительностью к противотуберкулезным препаратам.

Научная новизна исследования. В настоящей работе впервые проведено масштабное исследование популяционно-генетической структуры штаммов М.

tuberculosis, циркулирующих в Самарской области. Продемонстрировано преобладание штаммов генетической группы Beijing и штаммов Евро-Американской линии, а также появление штаммов генетических групп EAI и Delhi/CAS, ранее не зарегистрированных в регионе. Показана неравномерность распространенности кластера Samara4 и ряда мелких кластеров группы Beijing по медицинским учреждениям, а также ассоциации между проживанием в крупных городах и риском заражения штаммами Beijing, а в сельской местности - со штаммами других групп. Выявлены ассоциации лекарственной устойчивости к противотуберкулезным препаратам с генетической группой Beijing и рядом наиболее крупных ее кластеров, в частности Samara4, Samara24 и Samaraló. Обнаружены ассоциации между полиморфизмами в гене plcA и генетической группой LAM (кластерами Samara227 и Samara228), в генах dosT и pksl5/l и всей группой Beijing, а также в гене lipR с большинством кластеров групп Ghana, Cameroon, Uganda и S. Установлены ассоциации между полиморфизмами в генах dosT и pksl5/l и лекарственной устойчивостью, а также в генах pic А и lipR и лекарственной чувствительностью.

Научно-практическая значимость работы. На основании материалов диссертации нами внесены предложения по совершенствованию методов лабораторной диагностики туберкулеза, которые могут быть использованы в работе ГБУЗ «Самарский областной клинический противотуберкулезный диспансер имени II.В. Постникова» и иных противотуберкулезных учреждений. В целом результаты работы по выявлению ряда генетических групп, закономерностям их циркуляции и ассоциированностью с лекарственной устойчивостью могут быть использованы в качестве основы для оптимизации методов диагностики, профилактики и лечения пациентов Самарской области и других регионов Российской Федерации, включающей в себя своевременную коррекцию схем химиотерапии, совершенствование инфекционного контроля для борьбы с трансмиссией наиболее вирулентных штаммов микобактерий, а также разработку долговременной стратегии по борьбе с туберкулезом.

Сведения о распространенности определенных генетических групп и их ассоциированности с лекарственной устойчивостью могут быть использованы для разработки и апробации новых методов лабораторной диагностики туберкулеза фирмами-изготовителями диагностикумов. Полученные нами теоретические дан-

ные об ассоциированности различных типов полиморфизмов в геноме М. tiiberculosis могут послужить основой дальнейших исследований, направленных на изучение эволюции и популяционной генетики бактерий комплекса M. tuberculosis.

Результаты работы могут быть использованы при чтении спецкурсов на биологических факультетах университетов, в медицинских ВУЗах и на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Генетическая структура популяции M. tuberculosis в Самарской области характеризуется значительной гомогенностью, при этом 71,6% штаммов принадлежат группе Beijing, штаммы Евро-Американской линии составляют 23,2%; на группы EAI и Delhi/CAS приходится по 0,1%. Уровень кластеризации среди штаммов группы Beijing достоверно выше (87,7%), чем у штаммов других генетических групп (66,3%).

2. Генетические группы микобактерий распространены на территории Самарской области неравномерно, при этом проживание в городах ассоциировано с риском заражения штаммами группы Beijing, а в сельской местности — штаммами других семейств. Неравномерная распространенность групп кластеров группы Beijing (Samara4 и мелких кластеров) в медицинских учреждениях и преобладание кластеров Samara4 и Samara24 среди пациентов, получавших лечение в прошлом, свидетельствует о значительной роли трансмиссии данных штаммов в стационарах вследствие длительного пребывания пациентов и недостаточных мер инфекционного контроля.

3. Штаммы внутри генетических групп генетически неоднородны и различаются по способности к трансмиссии. Основной вклад в эпидемический процесс вносит ограниченное число крупнейших кластеров (Samara4, Samara 12, Samara 16, Samaral7, Samara24, Samara227 и Samara228), в основном принадлежащих группе Beijing.

4. Для кластеров Samara4, Samara24 и Samara 16 характерны выраженная ассоциированность с устойчивостью к противотуберкулезным препаратам и их активная трансмиссия в медицинских учреждениях Самарской области. Лекарственно-чувствительные штаммы входят в состав малых кластеров или являются уни-

кальными, что свидетельствует о незначительных уровнях их текущей трансмиссии.

5. У штаммов М. tuberculosis, циркулирующих в Самарской области, обнаружены ассоциации между полиморфизмами в гене plcA и группой штаммов LAM (кластерами Samara227 и Samara228), в генах dosT и pks!5/l и группой Beijing, а также в гене lipR с большинством кластеров групп Ghana, Cameroon, Uganda и S. Взаимосвязь между полиморфизмами в генах, ассоциированных с вирулентностью, и чувствительностью к противотуберкулезным препаратам носит опосредованный характер, связанный с неодинаковой распространенностью лекарственной устойчивости среди отдельных генетических групп и кластеров.

Публикации и апробация результатов работы: по теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций, и 5 статей в зарубежных журналах, включенных в международные системы цитирования Pubmed, Scopus и др.; 2 статьи приняты в печать в журналы, рекомендованные ВАК для защиты кандидатских и докторских диссертаций. 9 публикаций представлены в виде тезисов и статей в материалах международных и российских научно-практических конференций.

Результаты исследования были представлены на российских и международных конференциях: II Всероссийской научной конференции с международным участием «Научное творчество XXI века» (Красноярск, 2010), Международной научно-практической конференции "Теоретические и прикладные проблемы науки и образования" (Курск, 2010), семинаре Joint NIAID-ISTC Workshop 'Research Opportunities in ТВ Drug Discovery and Diagnosis' (Москва, 2010), 21-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям ECCMID 2011 (Милан, Италия, 2011), 32-м ежегодном конгрессе Европейского сообщества микобактериологов ESM 2011 (Любек, Германия, 2011), Международной научно-практической конференции "Физиологические механизмы адаптации живых систем" (Сухум, 2011), II Международной научно-практической конференции «Социальные и медико-биологические вопросы адаптации» (Курск, 2011), Международной научно-практической конференции «Теоретические и прикладные про-

блемы современной науки и образования» (Курск, 2012), 17-ой Межд