Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Осмотический анабиоз спермиев барана и быка при высушивании спермы

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Осмотический анабиоз спермиев барана и быка при высушивании спермы"

ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДША ТРУДОВОГО

КРАСНОГО ЗНАМИМ ■ АКАДВМИ СЕЛЬСК0Х03Я1'1СТВЕННиХ НАУК им. В.И.ЛЕНИНА

ШНОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

Украинокий научно-исследовательский институт

физиологии и биохимии сельскохозяйственных кивотншс

На правах рукописи

КУР АВЕЛЬ Михаил Петрович

УДК 636.082.453.53:636.32/.38:633.22/. 28

ОСМОТИЧЕСКИЙ АНАБИОЗ СПБРМИЕВ БАРАНА И БЫКА ПРИ ВЫСУШИВАНИИ СПЕРМЫ

03.00.13 - физиология человека и кивотных

Автореферат

дисоертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Львов 1989

Работа выполнена на кафедре разведения и воспроизводства сельскохозяйственных «швотных Украинской ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии.

Научный руководитель:

Заолукенный деятель науки УССР, доктор биологических наук, профессор Смирнов И.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Чухрий Б.Н. доктор биологичеоких наук Смолянинов Б.В.

Ведущая организация - Украинокий н^учно-исоледовательокий инотитут по племенному делу в животноводстве.

^1989 года в " $ " чаеев а К 020.14.01 в Украиноком научно-нооледоввтельокоы инотитуте физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных.

Адрес институте: 290034, г.Львов, 34, ул.Оотровского, 38.

С дисоертацией мокко ознакомиться в библиотеке Украинского НИИ физиологии и биохимии сельскохозяйственных кивотиых.

Автореферат разоолвн "С^УНг^&Ь-Л 19в9 года.

/

Ученый омфетарь опецивлизжрованного

оовета, кандидат биологичеоких наук Н.Н.Вольский

> »-«игпп бЫБВИ 1 |

!

--л | ОБЩАЯ ХЛРАКТГРИСШХЛ РАБОТЫ

- - .4 > , Iи. :' »

работа. Еироко применяем;"! в большинстве стран мира особ хранения спермы при температуре гадкого азота имеет некото-е недостатки: необходимость постоянного снабкения станций и пунк-в искусственного осеменения еидким азотом, высокую стоимость крио-нного оборудования, гибель в процессе крноконсервации до сперев. Все это вынуждает к поиску новых способов длительного хране-я спермы. Одним из них является консервация ее путем высушивания. Хотя по этому вопросу ведутся работы уяе в течение трех десяти-тий, в литературе имеются лишь единпчггле сообщения, не содержа-е каких-либо рекомендаций по практическому применению метода. Ос-вная причина этого - отсутствие теоретических исследований в дан-й области. Необходимо более детально изучить процесс высушивания ерш, чтобы выяснить причины и закономерности гибели спермиев на зных его этапах.

Цель и задачи исследований. Учитывая большую сложность данной эблемы, мы не ставили своей целью дать окончательную разработку эсоба высушивания, а ограничились только изучением некоторых под-цов к ее решению. На данном этапе результаты этих исследований рут принести значительную пользу при дальнейшей разработке мето-з консервации спермы путем высушивания. Были поставлены следующие конкретные задачи:

- изучить действие на спермин барана и быка гипертонических и ютонических растворов солей и Сахаров;

- изучить явление осмотического анабйоза при разбавлении спермы )творами различной осмолярности и при - высушивании спермы;

- изучить с помощью электронной и световой микроскопии механизм зцифической деформации спермиев в гипотонических раотворах;

- на основании изучения скорости удаления води из спермы выяс- . гь связь этого фактора о показателями кизнеспособности спермиев;

- изучить влияние гидратации обезвоженной спермы- на показатели ¡неспособности спермиев и выяснить черты сходства и различия мек-дейотвием высушивания и действием осмотических факторов;

- выяснить влияние высушивания и действия растворов различной голярности на содержание ДНК в спермиях;

- разработать и апробировать экспериментальную готановку для >филизации спермы и выяснить возможности и эффективность лиофи-шции сперма барана.

Научная новизна работы. I. Впервые изучены закономерности осмо-[еского анабиоза спермиев при прямом высушивании спермы. 2. Впервые доказано полное сходство действия высушивания с ~ей-¡ием гипертонических растворов на спермин, что открывает еозмон-:ть использования таких растворов в модельных опитях при рззра-

ботке практических методов рыоушивония спермы.

3. Установлено, что спермин барана и быка способны выдерживать довольно значительные колебания осмотического давления.

4. Установлено, что процесс высушивания спермы на начальном этг пе протекает с довольно больной скоростью, причем испаряется, в о< новном, свободная вода. Затем обезвоживание замедляется, что связ! но с затрудненным испарением связанной воды в клетках.

5. Выяснена зависимость подвижности и перекиваемости спермиев от степени обезвоживания спермы.

6. Впервые расшифрован механизм специфической деформации сперм] ев, являющейся важным диагностическим признаком, характерным для гипотонических растворов.

7. Впервые установлено, что изотонические растворы солей, прим няемые при гидратации высушенной спермы, приобретают характер гит тоничеоких растворов.

8. Впервые установлено, что спермин, находящиеся в состоянии о> мотического анабиоза, не скрашиваются 5^-ным водным раствором эоз: на, что является доказательством сохранения их жизнеспособности.

9. Доказано, что при высушивании спермы и воздействии гипер- и гипотонических растворов в спермиях снижается содержание ДНК.

10. Сконструировано экспериментальное устройство для лиофилиза ции термочувствительных биоматериалов.

11. Доказана возможность лиофилизации спермы барана.

Практическая ценность работы. Исследования, в основном, носили

поисковый характер, и их результаты представляют интерес, прежде всего, для разработки теоретических основ обезвоживания спермы. Усовершенствованный метод окраски спермы эозином, можно рекомендо вать для использования в научных исследованиях, а также для практ ческого применения на станциях искусственного осеменения.

Разработанное устройство для лиофилизации термочувствительных биоматериалов может быть рекомендовано для высушивания спермы животных.

Апробация работы. Материалы дисоертации обсуждены и получили одобрение на научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Украинской с.-х. акадей • (1980, 1882, 1985); на научно-технической конференции: Инженерные вопросы КРИО- и СВЧ техники в медицине - шифр Р87-287 (Киев, 198";

Структура и объем диссертации. Дисоертация состоит из введения обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, предложений и описка литературы, включающего 254 наименования, в том числе 45 на иностранных языках. Работа изложена на 190 страт цах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 18 рисунков.

- 3 -

МАТЕРИМ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена иа кафедре разведения и воспроизводства сель-кохозяйстветшх животных Украинской сельскохозяйственной академии на бывшей Центральной опытной станции искусственного осеменения г.Броварн, Киевской обл.) в 1977-1988 гг.

Исследования проводились на сперме 18 баранов порода прекос и сканийской тонкорунной и 24 бшсов черно-пестрой порода.

Осмотический анабиоз спермпев изучали путем определения динамики смотического давления в сперме, а такке по косвенным показателям: э изменению подвижности спермиев в зависимости от осмолярности сре-а, количеству деформированных и кивих спермиев, скорости обесцвечи-эния метиленового синего. Специфическую деформацию спермиев изучал в окрашенных и не окрашенных мазках и но микрофотографиях, полу-знных с помощью световой и электронной микроскопии.

Высушивание нативной и разбавленной с перш проводили в квадрат-га тарелочках, изготовленных из алшшшевой фольги толщиной 18 мик-ш, размерами 10 х 10 х 3 км и массой 40-50 мг. Высушивание осуше-гр.ляли в трех режимах: I) на воздухе при температуре лаборатории; I в эксикаторе над хлоридом кальция; 3) в эксикаторе над фосфорным ггидридом. Каши группа состояла из 10 образцов. Через каадхис пол-юа взврпипали на аналитических весах по одной тарелочке, чтобы оп-гделить степень обезвоживания. Затем тарелочку опускали в стеклян-й флакон, содержащий I мл изотонического раствора цитрата натрия, юле тщательного вымывания из тарелочки подсушенной спермы определи подвигаость спермиев и ставили на хранение при комнатной тем-¡ратуре или при 30-40°С. Через кавдый час в образцах разбавленной гермы исследовали подвикность спермиев до прекращения поступательно движения. Аналогичная методика была использована и при высуши-1нии спермы при температуре 2-4°С. Частные методики проведения не-1Торых опытов изложены при описании их результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ I. Действие на спермки гипертонических и гипотонических раство-в солей и Сахаров. Осмотический анабиоз спермиев. В процессе вышивания спермы происходят значительные осмотические сдвиги, изу-ние которых необходимо для более глубокого понимания механизмов причин гибели спермиев при их консервации.

Какдый эякулят, полученный от барана, делили на несколько частей разбавляли в отношении 1:10 растворами глюкозы, лактозы, сахаро-, хлорида натрия и цитрата натрия, имевшими осмотическое давление О, 250 и 300$ от изотонического (100$). Разбавленную сперму хра-ли при температурах 18-20°С, 30° и 40°С. Подлинность сперш:ем овзряли через I, 5, 10, 15, 30, 60 минут и далее через кагднй час,

_ 4 -

выражая в процентах прямолинейно движущихся оПермиев.

В результате исследований выяснялось, что в гипертонических (200$) растворах лактозы, сахарозы и цитрата натрия остаются лишь единичные прямолинейно движущиеся спермин (ЕЛ) или только спермин с колебательными движениям:; (Ж). В более концентрированных растворах спермин погибали полностью (Н). В гипертоническом (200$) растворе хлорида натрия наблюдалось в отдельных эякулятах сохранение подлинности до 15$ спермиев.

Совершенно иные закономерности были установлены при изучении действия гипертонических растворов глюкозы (табл.1). В первые мину ты после разбавления спермы такими растворами подвижность спермиев снижалась почти до нуля. Но затем наблюдалось постепенное частичное ее восстановление. По-видимому, в данном случае вначале шел место своеобразный осмотический стресс спермиев, после чего происходило их "привыкание" к условиям гипертонической среды.

Скорость и характер восстановления подвижности зависели от двух факторов - концентрации глюкозы в растворе и температуры окрукающе среды. Чем выше была температура, при которой хранилась сперма, те быстрее происходило восстановление подвижности спермиев. Своеобраз ное воздействие гипертонических растворов глюкозы на спермин объяс няется, по—видимому, способностью молекул глюкозы быстрее проникат внутрь спермиев, тогда как молекулы дисахаридов и солей проникают через мембрану спермия значительно медленнее. Поэтому в гипертонических растворах этих вешеств создается резкий перепад осмотическо го давления, вызывающий обезвоживание и гибель спермиев. В растворах же глюкозы осмотический градиент быстро выравнивается, и значи тельная часть спермиев сохраняет подвижность.

Повышение температуры ускоряет движение молекул и способствует более быстрому их проникновению в протоплазму спермиев. При темпе! туре 18-20°С этот процесс протекает значительно медленнее, причем при концентрациях в 250 и 300$ от изотонической восстанавливает де кение лишь небольшая чаоть спермиев. Однако и в таких условиях не вое неподвижные опермии мертвы. В дополнительном опыте было обнарз жено, что при выдерживании (в течение 15-20 мин) спермы в термостг те при 40°С, подвижнооть спермиев значительно возрастает (до 30 и более процентов). Это означает, что при комнатной температуре в гз -пертоничеоких растворах честь спермиев находится в состоянии глубокого осмотического анабиоза. Чтобы вывести спермии из такого сос таяния, недостаточно кратковременного нагревания спермы до 40°С, I требуется более длительная выдержка образца при такой температуре,

Результаты наших исследований показывают, что при изучении осш

I. Динамика подвингости {%) спермиев барана под действием гипертонических растворов глюкозы и температуры

•ре-: Температура хранения, °С

я :--———--

ра-: 18 - 20 : 30 : 40

е- ;------

ия,: величина изоосмолярности, % ин :---—----

100 : 200 : 300 : 100 : 200 : 300 : 100 : 200 : 300

I 61,8 Ж Н 56,7 ЕП Ж 42,6 Ш Ж

15 65,8 ЕП н 60,9 42,6 ЕП 48,6 43,4 3,0

60 61,2 12,6 н 55,0 53,3 29,3 36,2 37,4 17,0

120 57,0 29,9 н 44,1 50,9 37,6 26,8 33,2 16,0

180 55,2 37,4 ж 36,7 45,9 38,5 16,8 26,8 12,0

240 51,4 37,6 ЕК 21,7 43,3 35,9 10,9 20,8 9,0

300 48,5 38,6 Ж 8,3 35,0 25,0 7,0 15,2 5,0

360 43,5 36,8 К1 ЕП 30,0 20,0 4,2 9,0 2,0

420 40,4 33,0 ЕП Ш 16,7 10,9 1,8 5,0 ЕП

$80 33,9 28,6 2,0 ЕП 5,9 4,8 ' Ш 2,6. ЕП

540 29,3 25,6 2,6 Ж 2,6 3,5 Ш ЕП Н

300 23,9 21,4 3,0 н ЕП ЕП ЕП Ш Н

360 19,4 14,4 ЕП н ЕП ЕП ЕП н н

720 13,9 9,6 ЕП н Ж Н И1 И н

780 9,4 5,8 Ж н Н Н ЗС н н

¡40 6,0 ЕП Н н Н Н Н н н

[ческих воздействий на сперши, следует учитивать не только кон-

гнтрацию растворенных веиеств в среде, но и их специфические осо-шности, в частности, способность молекул и ионов более шш менее гстро переходить из внешней среда в протоплазму спермиев. Кроме •го, необходимо учитывать также температурный фактор, влияющий на ярость осмотических процессов в сперших. Пренебрежительное относи е к роли этих факторов может привести исследователя к совериен-| ошибочным выводам.

Опыты по изучению дейотвия на спермин гипотонических растворов казали, что по мере сникения осмотического давления в среде, • еныпается и процент подвижных спермиев. Однако, здесь выявляется вая закономерность: значительная часть движущихся спермиев пре-рпевает специфическую деформацию, впервые исследованную И.В.Смир-вым (1963, 1964). Наши опыты позволили внести некоторые уточнения изменения в эту гипотезу: в частности, расшифрован механизм воэ-кновения деформации спермиев в растворах о пониженным осмотиче-им давлением. Была также несколько усовершенствована технике, оп-

ределения процента деформированных спермиев: вместо препарата "раздавленная капля" предложено использовать мазки сперма как не окрашенные, так и окрашенные чернилами пли 5$-ным водным раствором эозина. Окрашивание чернилами усиливает резкость изображения спермпев а окрашивание 5$-ным водным раствором эозина, кроме того, позволяет дифференцировать живых и мертвых спермиев. Все три способа приготовления мазкоп дают приблизительно одинаковые результаты (табл.2).

В растворах разных веществ процент деформированных спермиев варьирует. Так, при 60-минутной экспозиции и 50$-ноЙ концентрации в растворе глюкозы деформируется 21,3$ спермиев, сахарозы - 25,2$, лактозы - 28,3/о, цитрата натрия - 34,9$ и хлорида натрия - 50,8$. Повышение процента деформированных спермиев в растворах солей объяс няется, по-видимому, тем, что соли активизируют подвижность спермие благодаря чему создаются условия для более быстрой деформации.

При уменьшении гипотонии (в 65$-ных растворах) процент деформированных спермиев быка резко повышается: в растворе хлорида натрия с 17,1$ до 45,4$, в цитрат» натрия - о 34,1$ до 48,4$. В растворах же Сахаров уменьшение гипотонии приводит, наоборот, к уменьшению процента деформированных спермиев. Такие различия моиго объяснить большей скоростью движения спермиев в растворах солей по сравнению о растворами Сахаров. Наличие прямой связи между процентом деформации и скоростью движения спермиев подтверждено и в опытах по влиянию температуры окружающей среды. При повышении температуры от 20 до 40°С скорость движения спермиев значительно возрастает и одновременно увеличивается процент деформированных спермиев.

Использование световой и электронной микроскопии дало возможность раскрыть механизм деформации спермиев. В начале процесса на каудальной части тела опермия под воздействием гипотонического раствора происходит отслаивание клеточной мембраны, которое затем переходит на краниальную часть хвоста. Разбухшая и отслоившаяся мембрана подтягивает хвоот спермия к концевой части тела, причем возникает не резкий перелом, а небольшая петля. Образуется своеобразный мешок, заполненный продуктами распада протоплазмы.

Деформация происходит именно в этой части спермия потому, что при сокращениях хвоста, обусловливающих движение спермиев, каудаль-•ная часть тела, оставаясь неподвижной, испытывает наибольшие механические напряжения. Это обстоятельство объясняет, почему деформируются только движущиеся спермин, а также почему наибольший процент деформированных спермиев наблюдается при сравнительно небольших степенях гипотонии (50-65$ от изотонической концентрации). Воздействие на спермин более значительных отклонений от изотонии приводит спермой к быстрой гибели, и деформация просто не успевает произойти.

2. Зависимость процента деформированных спермаев барана от продолжительности воздействия гипотонических растворов и способа окраски мазков, Mim

Продолжитель-: Гипотонические растворы (50$-ная концентрация от изотонии) ность воздей-:--

глюкозы : сахарозы : лактозы : цитрата натрия: хлорида натрия

OUB у шиП •

Мазки, окрашенные чернилами

5 18,0 - 1,3 20,5 ± 1,2 14,0 ± 1,8 21,0 ± 2,0 34,8 ± 1,5

10 18,8 ± 1,4 20,4 ± 1,4 18,9 ± 1,1 21,1 ± 2,0 36,4 ± 1,6

15 18,9 - 1,3 22,1 ± 1,0 26,3 ± 0,9 32,0 ±1.0 48,7 ± 1,8

30 21,1 ± 1,4 23,1 ± 1,6 26,0 ± 1,5 30,5 ± 0,9 48,9 ± 1,3

60 21,3 ± 0,7 25,2 ± 0,9й 28,3 t 0,8я5 34,9 ± 0,9** 50,8 ± 0,9?

Мазки, окрашенные эозином -

60 23,5 i о;э ' 27,1 ± 1,0 27,2 ± 0,9 31,5 ± 0,6 49,6 ± 0,6

Неокрашенные мазки

60 21,4 ± 0,9 28,2 ± 1,0 23,7 ± 0,8 32,1 ±1,2 46,2 - 0,9

Примечание. Разница между процентом деформированных спершев в зависимости от продолжительности воздействия раствора (5 и 6D минут): зе - Р-=0,01; я* - Р-* 0,001.

_ 8 -

Появление в сперме деформированных спермиев является безошибочным свидетельством того, что на каком-то этапе обработки спермы имело меото воздействие на, спермин гипотонической среды.

2. Влияние высушивания на подвижность и переживаемость спермиев баране и быка. Из таблицы 3 видно, что наиболее быстро вода испаряется в первые 2 часа высушивания. Через 2,5 часа процесс высушивания замедляется. После 4,5 часа высушивания в образцах спермы всех трех групп опыта испарялось от 79 до 83$ первоначально содержащейся воды. По-видимому, в начале и в середине процесса высушивания испаряется так называемая свободная вода, не связанная с молекулами бед ков и других веществ в сперме. Оставшаяся в сперме связанная вода удаляется с большим трудом,и скорость ее испарения весьма невелика.

Быстрее всего происходит потеря воды нсд фосфорным ангидридом, ' несколько медленнее - над хлоридом кальция и еще медленнее - без использования адсорбента. Однако разница между результатами трех способов высушивания оказалась небольшой.

Подвижность спермиев снижается пропорционально проценту удаленной воды, а также зависит от скорости обезвоживания спермы. Так, после получасового высушивания на воздухе в обводненной сперме содержалось 60/? подвижных спермиев, при высушивании над хлоридом кал| ция - около 57,3$ и над фосфорным ангидридом - 54,7$. После I часа высушивания процент нормальных спермиев падал соответственно до 51,3, 43,7 и 39,3$. После 2,5 часов высушивания на воздухе, когда оперма теряла более половины воды, около 37,3$ спермиев еще сохраняли способность к нормальному прямолинейному движению. При такой же степени обезвоживания над хлоридом кальция число нормальных спермиев составляло 36,7$, а над фосфорным ангидридом - 28,0$.Полная гибель спермиев при высушивании на воздухе наступала через 4 чаоа, а над адсорбентами - через 3,5 часа. К этому времени сперма теряла от 76,1 до 78,9$ воды.

Гибель спермиев на первых этапах высушивания, очевидно, объясни ется повышенным осмотическим давлением в результате испарения воды из плазмы спермы. На последующих стадиях высушивания к действию этого фактора добавлялась дегидратация белков и других органических соединений в протоплазме спермиев.

При анализе данных о переживаемости спермиев после высушивания гидратации было обнаружено,что подвижность спермиев при добавлении раствора цитрата натрия восстанавливалась не сразу, а через 1-2 ча са хранения разбавленной спермы в условиях комнатной температуры. Эта закономерность проявлялась особенно ярко при больших степенях обезвоживания спермы. Например,после высушивания на воздухе в тече

з. зависимость подвижности и переживаемости спермиев барана от потери воды в процессе высушивания спермы на вездухе, М ± и

Продол-:Поте-: китель-:ря : ность :воды,: высуши-:

Подвижность спермиев после высушивания и разбавления, по -ный0^" -честь

часам хранения, %

:казатель :час -:пережи-

вания, час : % : 0 : I • ; 2 ; з ; 4 ; 5 ; 6 } 7 ; 1 в : 9 |ю :ваемости, :усл.ед. :

0,5 11,0 +0|9 59,2 +3'2 60,0 +2,4 57,3 +2,4 53,0 +3,1 48,7 +4,0 44,7 +3,4 38,3 +3,4 31,0 +3,5 23,0 +2,9 17,3 +3,0 1С,3 +2,5 404 +31 10,9 +0,5

1,0 23,8 ±1)7 44,2 +3,5 51,3 +2,6 48,3 +2,3 40,0 +2,7 37,0 +3^5 33,0 +3,7 27,0 +3,0 22,0 +2,8 19,0 +2,9 12,3 +2,6 8,0 +2,2 309 +25 10,3 +0,5

1,5- 34,0 ¿1,6 33,9 +3,0 42,7 +1,9 41,0 +2,8 36,7 +1Д 31,7 +2,2 25,0 +2,2 21,3 +2,2 15,7 +2,0 11,0 +1,8 6,0 +1.4 2,3 +1,2 235 +16 № +0,4

2,0 45,0 +1,2 25,6 +3,1 35,7 +3,1 37,3 +2,2 33,7 +3,0 28,3 +3,0 23,0 +3,0 16,7 II,3 7,7 +2,2 5,3 +2,4 2,7 +0,8 203 +21 8,4 +0,4

2,5 53,6 16,9 +3,2 36,7. +3,7 37,3 +2,9 36,7 +3,4 28,7 +3,5 23,3 +3,3 17,7 +2,9 9,3 +2,5 5,3 +1,8 2,3 +1,0 1,0 +0,6 184 +24 7,8 +0,4

3,0 61,2 +1|5 9,0 +2|9 27,7 +4,7 33,3 +3,8 27,3 +3,3 21,7 +2)3 14,0 +2,6 9,3 +2,4 5,0 +1,9 3,0 +1.4 1,3 +1,0 ЕП 144 +21 6,3 +0,6

3,5 69,1 +1*5 1,3 +0,7 6,0 +2,5 9,3 +2,4 9,7 +2,6 7,3 +2,0 4,0 +1,3 2,0 +1,0 1,3 +1,7 1,3 ±1.7 ш И1 39 +10 3,2 +0,8

4,0 76,1 +1,2 Н Н ' Н Н Н Н Н Н Н н Н - -

4,5 79,0 +0*9 н Н н Н Н н Н Н н н н - -

5,0 80,9 +0^7 • н н н Н Н н Н Н н н н - -

I

<а

I

нив 3 чаоов подвижность опермиев ооотавляла сразу же после разбавления около 9$, через I час она повыоилаоь до 21,%, через 2 часа -до 33,3$. Наиболее вероятная причина этого явления - осмотический анабиоз спермиев, обусловленный потерей воды и дейотвием повышенных концентраций Сахаров и оолей в плазме опермы.

В дополнительных опытах было установлено, что при потере спермой 20-40$ воды 3$~ный раствор цитрата натрия теряет свойства изотонического раствора по отношению к спермиям. После разбавления этим раотвором мы наблюдали появление значительного числа (10-25$) спермиев, претерпевших характерную деформацию. В данном случае происходила адаптация спермиев к изменившемуся в сторону гипертонии осмотическому давлению в окружающей жидкой среде,и 3/ь-шй раствор цитрата натрия стал для них гипотоническим раотьором. Экспериментально была проверена достоверность этого предположения. Оказалось, что щи разбавлении спермы, потерявшей 20-30$ воды, гипертоническим (на 2030$ выше изотоничеокой концентрации) раствором цитрата натрия, деформация опермиев не происходила. Отоюда следует, что растворы, которые в обычных условиях очитаются изотоническими, на самом деле становятся гипотоническими для обезвоженных спермиев. И, наконец, на разных этапах высушивания и обводнения спермии могут подвергать«! воздействию как гипертонических (в начальной стадии высушивания), так и гипотоничеоких растворов (в процессе гидратации материала).

В нативной сперме, сохраняемой в условиях комнатной температуры, может накапливаться молочная кислота, под действием которой половые клетки переходят в' состояние кислотного анабиоза. Для разрешения вопроса, какой вид анабиоза имеет место при высушивании спермы - ос мотический или кислотный, - был поставлен специальный опыт, который показал, что в процессе высушивания спермы рН почти не изменялся, а поэтому возможность проявления кислотного анабиоза исключается.

Добавка желтка при высушивании спермы не внесла существенных изменений в процесс обезвоживания, однако число деформированных спермиев уменьшалось, что является подтверждением роли желтка как осмотического буфера.

Следующая серия опытов имела целью изучить влияние температуры окружающей среды на результаты высушивания. Сперму барана, разбавленную желтком и глюкозо-цитратно-желточным разбавителем, высушивали при комнатной температуре на воздухе и в холодильнике при температуре 2-4°С. Выяснилось, что высушивание при пониженной температуре значительно замедляет процеос обезвоживания. Так, например, после одного часа высушивания спермы при комнатной температуре потеря воды составила 25,7%, а при 2-4°С - 14,4$; через три часа соответ-птчепно 60,6 и 34,1$.

- II -

В опыте, проведенном на сперме быков, применялось непосредственное определение осмотического давления в малых объемах спермы. Установлено, что осмотическое давление по мере высушивания спермы изменяется в том же направлении, что и потеря воды (табл.4). Однако рост осмотического давления значительно опережает (в 2-3 раза) интенсивность процесса обезвоживания. При высушивании на воздухе за первый час из спермы испарялось 18,2$ воды, а осмотическое давление возрастало на 37,8$; через два часа - соответственно 31,6 и 67,8$; через три часа - 42,6$ и 99,2$. Эту разницу можно объяснить тем, что прибор, по-видимому, регистрирует осмотическое давление только в жидкой фазе спермы, в которой обезвоживание происходит быстрее, чем во всем образце спермы.

Анализируя данные таблицы, легко заметить, что в процессе высушивания спермы проявляется осмотический анабиоз. На всех этапах высушивания подвижность спермиев после часового хранения выше, чем сразу после разбавления спермы изотоническим раствором.

Данные таблицы 5 свидетельствуют о хорошо выраженной зависимости подвижности спермиев от степени обезвоживания. Разница в подвижности после получасового высушивания составляла 6,4$, через час - 10,9$, полтора - 17,2$, два - 21,3$ и через 2,5 часа - 25$.

Изменение дыхательной способности спермиев происходило несколько по-иному. Повышение уровня дыхания после часовой выдержки разбавленной цитратом натрия спермы (а это является основным признаком того, что спермин находились некоторое время в состоянии анабиоза), было хорошо выражено только после двух часов высушивания. При меньшей продолжительности высушивания происходило не улучшение этого показателя, а, наоборот, некоторое понижение. Это различие зависело, по-видимому, от глубины анабиотического состояния клеток. При высушивании в течение двух часов и более спермин переходили в состояние глубокого осмотического анабиоза и, чтобы вывести их из этого состояния, требовалось продолжительное время. При более коротких сроках высушивания анабиоз был менее глубоким и дыхательная способность спермиев восстанавливалась почти сразу же после разбавления.

В исследованиях было установлено, что процент живых спершеп бчл значительно выше, чем процент подвижности в раздавленной капле. По-видимому, не окрашиваются не только движущиеся спермии, но и спермин, находящиеся в состоянии осмотичеокого анабиоза.

3. Влияние высушивания спермы на содержание в спермиях ДНК.Спер-му быков высушивали при комнатной температуре и определили содержание в спермиях ДНК при помощи сканирующего цитоспектрофотометра МУФ-5. Установили, что содержание ДНК практически не изменяется на протяжении перпых двух часов высушивания. В интервале 3,0-3,5

4. Динамика осмотического давления и подвижности спершев в процессе высушивания спермы быка, М - ш

Продол-: Потеря воды, % :Осмотическое дав-: Осмотическое : Подвижность спермиев, %

китель-: :ление, атм. : давление, в % :-

ноеть : : : к начальному : после разбавле-: через I час

высуши-: : " : : ния : хранения

вания, :-

час :на воз-:над ад- :на воз-: над ад- :на воз-:нсд ад- :на воз-: над ад-:на воз-: над ад-:духе :сорбен- :духе : сорбен- :духе :сорбен- :духе : сорбен-:духе : сорбен-: :том : : том : :том : : том : : том

0,0 - - 7,20± 0,12 - 100 100 74,6* 1,3 - 74,6* 1|3 -

0,5 II,5± 0,8 14,9± 0,9 8,40± 0,23 9,26± 0,26 116,7 128,6 61,5* 2,9 55,8* 3,1 68,1± 2,4 65,8* 1;э

1,0 18,2± 1,7 24,9± 1,4 9,92± 0,35 10,69*. 0,28 137,8 148,5 48,5* 2,6 41,2* 2,7 59,6* 2,2 53,I* 2,7

1,5 24, 1|9 34,5± 2,4 Ю,70± 0,44 13,08± 0,55 148,6 181,7 34,6* 3,5 28,5* 3,1 48,9* 2,9 42,3* 2,9

2,0 31,6± 2,6 42,7± 2,8 12,08± 0,44 14,37± 0,54 167,8 199,6 25,4± 3,9 15,8* 3,4 32,3* 4;е 30,0± 4,2

2,5 38,0± 4,6 53,1± 3,8 13,зй 0,70 17,61* 1,02 185,4 244,6 21,2* <з 8,1* 311 30,4* 5^5 15,4* 5|1

3,0 42,6* 2,9 60,8± 3,7 14,34± 0,87 19,43* 1,35 199,2 269,9 II, 5* 3|2 2,3* 1,7 23,9± 5,0 6,5* 3,3

3,5 49,5± з:? 66,7± 2,5 15,70± 1,09 21,16* 1,35 218,1 293,9 6,9* 2,1 ЕП 17,7* 4,1 3,1* 1|8

4,0 53,5± 3,5 73,3± 3,0 17,38± 1,34 23,16* 1,36 241,4 321,7 3,5* Н 10,8* 2,5 Н

4,5 61,8± 3,5 78,0£ 2,7 19,42± 2,07 - 269,7 - ЕП Н -ЕП н

5,0 70,0± 1,9 Я2,9± 2,1 - - - - Н Н Н н

5. Динамика потери воды, подвижности, процента живых и дыхательной способности спермиев барана в процессе высушивания спермы, М 2 т

Показатель

:Продолкитель-:

:ность хране- :-

:ния (час) пос: :ле разбавле- : О :ния раствором:

Продолжительность высушивания, час

0,5

1,0 : 1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

Потеря воды,

Время обесцвечивания мети-ленового синего, мин

О

Г

17,7± 21,1- 38,5± 52,9± 59,6± 68,5± 75,9± 81,2± 0,6 0,8 1,2 1,2 1,3 1,5 1,1 0,7

Подвижность спермиев, % 0 72,7± 1,0 37,7± 3,7 25,5± 3,2 15,5± 2,2 6,4± 2,1 1,8± 1.0 Ж Н Н

I - 44,1- • О 36,4± 3,5 32,7± 4,2 21, 3,3 26,8± 4,1 15,0± 5,0 3,2± ¿,2 Н

Процент живых (не окрашенных) спермиев 0 I 73,8± 2,4 72,7± 72,1± 1.6 68,1± 2,7 69,9± 2^0 64,5± 2,2- 64,6± 3,5 58,5± 2,2 59,7^ 3,2 47,8^ 3,9 51,7± 2,9 23,6± 3,4 27,1± 3*9 12,0± 2,2 16,2± з;1 0 0

24,8±

зи

19,8± 3,1

21,8± 6,1

22, е±

3,6

35,1± 6,7

77,9± 181,4±' 11,6 31,1

25,1± 5.4

25,5± 5,0

26,0± 5,8

28,1=

3,9

31,3± 78,1± 4,7 19,7

с* 1

- 14 -

часа происходит некоторое снижение этого, показателя, а в дальнейшем, начиная с 3 до 5 часов высушивания, содержание ДНК вновь стабилизируется, но на более низком уровне, чем на протяжении первых двух часов высушивания. Такое снижение содержания ДНК происходит при удалении из спермы более половины содержащейся в ней воды..

4. Результаты опытов по лиофилыюй сушке спермы баранов с использованием предложенного устройства. В настоящее время для консервации биологических объектов используют серийно выпускаемые сублимационные установки. Однако, для высусивания спермы они не пригодны, поскольку в большинстве установок температура сублимации материала слишком высока для таких термочувствительных клеток, как спермии. В разработанной нами экспериментальной установке этот недостаток устранен, благодаря чему она пригодна для лиофилизации термочувствительных биоматериалов. Преимуществами нашей установки является также сублимация паров из тонких слоев материала, что позволяет создать развитую поверхность испарения и избежать образования градиентов влажности, силовых напряжений и температурных неравномерностей, как при замораживании, так и при лиофилизации. Важным преимуществом предложенного устройства является также автоматическое поддержание температуры на заданном уровне с помощью электронного измерителя-регулятора температуры.

После получения сперму от баранов разбавляли средой, содержащей 100 мл бидистиллированной воды, 12,27 г лактозы, 5 мл глицерина, 20 мл желтка куриных яиц и 100 тыс.ЕЦ опермосана. Были испытаны 4 варианта лиофилизации спермы: I) в условиях атмосферного давления на протяжении 48 часов; 2) с частичным удалением воздуха (остаточное давление 250 мм рт.от.) на протяжении 24, 48 и 72 часов; 3) при остаточном давлении 0-50 мм рт.ст. на протяжении 24, 72 и 96 часов; 4) при остаточном давлении 0-50 мм рт.ст. оо ступенчатым повышением температуры сублимации на протяжении 24, 48, 72 и 96 чаоов.

Первая серия заключительных опытов имела целью изучить результаты лиофилизации в условиях атмосферного давления на протяжении 48 часов. Наиболее высокий процент подвижных спермиев (25,0) получен при температуре лиофилизации -70°С. Аналогичная закономерность проявлялась ив отношении перекиваемосги спермиев. При -70°С она составляла 75,0 условных единиц, при -60°С - 70,0; при -50°С - 65,3 и при -40°С - 28,4 условной единицы. Чаотичный вакуум (200-250 мм рт. ст.) ускоряет процесс обезвоживания, а более глубокий (остаточное дпвление 0-50 мм рт.ст.) ускоряет его в еще большей степени.

В четвертой серии опытов была применена ступенчатая лиофилизация при оотат'ичном давлении 0-50 мм рт.ст. Образцы опермы первой группы высушивали последовательно по 24 часа при температурах -70, -60, -50,

и -40°С, а второй - в течение 24 часов при температуре -70°С, а затем 48 часов при -40°С. Образцы третьей и четвертой групп после 24-часового высушивания в условиях температуры -70°С обезвоживали при -40°С соответстветю 72 и 96 часов (табл.6).

6. Результаты ступенчатой лиофилизации спермы барана при остаточном давлении 0-50 мм рт.ст.

Температура субли--.Потеря мации (Ог\ и продсг.воды,

Подвижность спермиев (%) после гидратации, по часам хранения

лкительность высу»: плавания спермы,чао: -70: -60: -50: -40: % 0 : I : 2 3 4 : 5

24 24 24 24 47,6 20,0 15,0 8,3 8,3 5,0 3,3

24 0 0 48 53,7 16,7 11,7 10,0 6,7 5,0 ЕП

24 0 0 72 60,8 11,7 6,7 6,7 3,3 ЕП ЕК

24 0 0 96 68,2 6,7 5,0 5,0 ЕП Ж Н

При температуре -70 С сублимация водяных паров происходит медленнее, чем при более высоких температурах, но зато при этой температуре процессы кристаллизации исключаются. С повышением температуры (особенно до -40°С) обезвоживание ускоряется, но вместе о тем возрастает вероятность вредного воздействия на спермин повреждающих факторов (рекристаллизации и, возможно, осмотических сдвигов).Однако, данные таблицы показывают, что ступенчатое высушивание не дало ожидаемых результатов. Так, например, при последовательном повышении температуры от -70 до -60, -50 и -40°С сперма потеряла 47,6$ воды. Точно такой же процент потери воды (47,1) получен при непрерывном высушивании спермы при температуре -70°С в течение 96 часов.

ВЫВОДЫ

1. Проявление осмотического анабиоза спермиев барана,наблюдающееся в гипертонических растворах и определяемое по степени восстановления их подвижности, зависит от природы растворенного вещества и связано, по-видимому, с неодинаковой проницаемостью клеточной мембраны для его молекул и ионов.

2. Скорость и характер восстановления подвижности спермиев зависят от котдентрации растворенного вешества и от температуры окружающей среды. С повышением температуры восстановление подвижности спермиев ускоряется. Это связано,очевидно, с ускорением движения молекул и ионов,что способствует более быстрому проникновению их в протоплазму спермия и восстановлению осмотического равновесия между клеткой и жидкой фазой спермы.

3. В гипотонических растворах при небольших отклонениях от изотонии значительная.часть движущихся спермиев претерпевает опедафячг-

- 16 -

окую деформацию. Электронная микроскопия показала, что характерный перегиб спермия происходит не в точке соединения тела с хвостом, а в каудальной части тела, которая во время движения спермия испытывает наибольшие механические напряжения. Непосредственной причиной дьфюрмации является набухание и отслоение мембраны спермия, в результате чего хвост спермия подтягивается к его телу и спермий как бы складывается вдвое. Деформированный спермий продолжает свое движение в прежнем направлении, но с отогнутыми назад головкой и телом. С повышением температуры процесс деформации ускоряется и число деформированных спермиев растет,что связано с ускорением движения.

Появление деформированных спермиев является безошибочным свидетельством того, что на каком-то этапе обработки спермы имело место воздействие на спермли гипотонической среды.

4. В процессе прямого высушивания спермы барана и быка на воздухе и над адсорбентами установлено, что наиболее быстро вода испаряется в первые два часа высушивания. Обезвоживание сперш п этот период происходит за счет свободной воды. Оставшаяся связанная вода удаляется с большим трудом и скорость обезвоживания падает.

5. По мере удаления вода из сперш снижаются подвижность и пере-живаемость спермиев. Так, после испарения 50$ воды около трети спермиев сохраняют способность к восстановлению прямолинейного движения, а при удалении около 70$ воды наступает полная их гибель. Увеличение скорости высушивания приводит к ухудшению показателей подвижности и переживаемости.

6. В опытах по высушиванию сперш наблюдалось четкое проявление осмотического анабиоза: спермин восстанавливали подвижность не сразу после гидратации образцов высушенной сперш, а через 1-2 часа. Этот факт указывает на сходство действия на спермпи высушивания :.; действия гипертонических растворов. Опыты по разбавлению сперш растворами разной концентрации можно применять в качестве модельных при разработке практических методов ее высушивания.

7. Появление деформированных спермиев после гидратации высушенной спермы является свидетельством того, что изотонический раствор цитрата натрия приобретает свойства гипотонического по отношению

к обезвоженным спермиям, адаптировавшимся к повышенным концентрациям солей и Сахаров. Этот факт необходимо учитывать при разработке технологии высушивания сперш.

8. Осмотическое давление, определенное при помощи микроосмометра, растет примерно в два раза быстрее, чем процент обезвоживания сперш при высушивании. Это является следствием того, что прибор определяет осмотическое давление только в оставшейся после высушивания жидкой фазе спермы, а обезвоживанию подвергается весь объем спетой, включая протоплазму половых клеток.

- 17 -

9. Спермин, находящиеся в состоянии осмотического анабиоза, не окрашиваются раствором эозина, что является доказательством сохранения ими жизнеспособности. Это, никем ранее не описанное явление, следует учитывать при оценке качества спермы.

10. Высушивание (а такЕе разбавление спермы гипер- и гипотоническими растворами) оказывает влияние на ядерные структуры клетки, что проявляется в снижении содержания ДНК в спермиях.

11. Сконструированное оригинальное устройство для лиофильной суши термочувствительных биоматериалов,в том числе и спермы,отличается от существующих простотой и возможностью избевсать образования градиентов влажности, силовых напряжений, температурных неравномерностей, а также позволяет использовать развитую поверхность испарения образца

оперш. Важным преимуществом предложенного устройства является также автоматическое поддержание заданной температуры. Устройство зарегистрировано как изобретение (15 1334007 с приоритетом от 10 декабря 1985 г.).

12. Доказана принципиальная возможность лиофилизации спермы барана с использованием разработанной установки. Результаты лиофилизации спермы зависят от температуры сублимации и величины вакуума.который ускоряет процесс. Наибольшее количество жизнеспособных спермиев сохраняется при температуре сублимации спермы -70°С.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

При разработке новых способов разбавления и хранения о перш следует учитывать явление осмотического анабиоза спермиев, глубина которого зависит от природы и концентрации растворенных веществ я от температуры окружающей среды.

При научных исследованиях в области консервации половых клеток специфическую деформацию спермиев, обусловленную действием гипотонической среды, можно рекомендовать в качестве теста.

Ввиду полного сходства действия высушивания спермиев о действием на них гипертонических растворов, последние можно использовать для модельных опытов.

При определении процента живых спермиев путем дифференцирующей окраски раствором эозина, необходимо учитывать, что неподвижные опермии, находящиеся в состоянии осмотического анабиоза, не окрашиваются эозином.

Высушенную сперму следует гидратировать растворами о повышенной концентрацией солей и Сахаров, поскольку изотонические растворы для обезвоженных спермиев приобретают характер гипотонических сред.

Сконструированное устройство для лиофильной сушки термочувствительных биоматериалов рекомендовать для использования в научных и практических целях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Г. г^уравель М,П. Деформация опермиев барана в гипотонических растворах (яз.укр.) // В1сник о.-г. науки. - 1981. - И 12. - С.61.

2. ЖУравель М.П. О действии гипертонических растворов на опермии // Животноводство. - 1932. - № I. - С.50.

3. Смирнов И.В., Куравель М.П. Влияние высушивания спермы барана на ее качество // Животноводство. - 1982. - К 7. - С.47-48. (Доля участия автора 70$).

4. Смирнов И.В., Куравель М.П. Осмотический анабиоз при высушивании спермы //Овцеводство. - 1983. - ü 7. - С.37-38. (Доля участия автора 70$).

5. Яуравель М.П. Изменение активности и перекиваемости спермиев барана в процесое высушивания спермы // Сб.науч.тр.: Разведение и воспроизводство сельскохозяйственных животных на Украине /УСХА. -К., 1984. - С.30-34.

6. Журавель М.П., Товма A.A., Дунский С.А., Игнятенко В.М.,Впнни-чук Д.Т. Устройство для лиофпльной суики термочувствительных материалов // Положительное решение по заявке ■№ 4010556 с приоритетом от 10.12.85 г. и зарегистрировано как изобретение № 1334007 от 1.05.87 г. (Доля участия автора 30$).

7. Смирнов И.В., З^уравель М.П., Кушнир В.М. Подвижность и переживае-мость спермиев быка после высушивания спермы (яз.укр.) //ВГсник о.-г. науки. - 1986. -Мб,- С.52-54.(Доля участия автора 60$).