Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Осмотическая реакция яйцеклеток эмбрионов млекопитающих при криоконсервации

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Безуглый, Николай Дмитриевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава П. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Материалы и методы

§1. Объекты исследования

§2. Методика изучения проницаемости.

§3. Замораживание эмбрионов и ооцитов крупного рогатого скота

П. Результаты и обсувдение

§1. Осмотическая реакция клеток в растворах различного состава и осмомолярности

§2. Изучение проницаемости мембран яйцеклеток и эмбрионов мыши, кролика и коровы к ди-метилсульфоксиду, глицерину, воде, ионам натрия.

§3. Осмотическое поведение эмбрионов и яйцеклеток млекопитающих в растворах криопротек-торов.

§4. Дегидратация эмбрионов и яйцеклеток млекопитающих при замораживании.

§5. Криоконсервация эмбрионов и ооцитов крупного рогатого скота

ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

МАТЕМАТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ.

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Осмотическая реакция яйцеклеток эмбрионов млекопитающих при криоконсервации"

ХХУ1 съезд КПСС наметил пути интенсивного развития сельского хозяйства нашей страны в 1980-1990 гг. Среда основных задач сельскохозяйственного производства стоит вопрос об увеличении продукции животноводства. Значительно ускорить развитие этой отрасли сельского хозяйства позволит внедрение е практику животноводства трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных и, в первую очередь, крупного рогатого скота. Разработка этого метода в СССР названа в. качестве одной из важнейших задач, стоящих перед животноводством (Постановление общего собрания АН СССР ОТ 6-7 декабря 1978 г.).

Пересадка эмбрионов с сочетанием метода гормональной суперовуляции открывает в скотоводстве реальные перспективы для получения от одной коровы-донора не 10 телят за жизнь, а от нескольких десятков до сотен, что позволит значительно увеличить темпы селекции по материнской линии. Роль данного метода может значительно возрасти из-за его потенциальных возможностей. Использование огромного резерва ооцитов при условии созревания их in (Уit го и дальнейшего плодотворения иг tiilro или in oivo может на несколько порядков, увеличить репродуктивный потенциал.

Внедрение трансплантации в практику животноводства ставит проблему замораживания и длительного хранения эмбрионов и яйцеклеток сельскохозяйственных животных для решения задач синхронизации полоеых циклов доноров и реципиентов, проверки матерей по качеству потомства, создания крупных зональных донорских центров, транспорта биологического материала на любые расстояния {C.Pofye , 1977, SWi&nut оле/АМите , 1978, KLe/w-^ensen , 1980).

Эмбрионы млекопитающих требуют медленных скоростей замораживания, медленного оттаивания, плавного добавления и удаления криоцротекторов (S.MMMatfe&i- etа£% 1976,1978, Н.И.Сергеев и В.Н.Шихов, 1979, P. /TUtteM-i 1980 и др.). Способ 1фИоконсервации эмбрионов млекопитающих значительно отличается от таковых для других клеток, однако, не определено, какими особенностями строения данных биообъектов это объясняется. Методы замораживания и длительного хранения ооцитов крупного рогатого скота находятся в стадии разработки, не определены оптимальные параметры применения криопротекторов, режима замораживания и отогрева. Применяемые методы криоконсерващщ эмбрионов и яйцеклеток млекопитающих являются, в основном, следствием эмпирических подходов, и поэтому не ясно, е какой степени они оптимальны. Современное состояние теоретической криобиологии показывает особую важность осмотических явлений в криобиологических процессах: при повреждениях температурным шоком (Ф.И.0сташко,1963), при дегидратации клетки с понижением температуры , повреждении внутриклеточным льдом , во время добавления и удаления криоцротектора в среду для криоконсервации (Е.А.Гор-диенко и Л.В.Бронштейн, 1974). Недостаточная изученность теоретической стороны этого вопроса и отсутствие приемлемой методики изучения проницаемости цитоплазматических мембран нв позволяли изучить роль осмотических процессов при криоконсервации эмбрионов и яйцеклеток млекопитающих.

В связи с этим, целью работы было исследование осмотического поведения яйцеклеток и эмбрионов млекопитающих при криоконсервации для уцрощения режима их замораживания и способа применения 1фиоцротекторов.

Познание механизмов одиоповреждений и разработка на этой основе оптимальных способов криозащиты обеспечат прогресс в области создания технологии криоконсервации эмбрионов и яйцеклеток млекопитающее.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Безуглый, Николай Дмитриевич

- 168 -ВЫВОДЫ

1. Временные характеристики нормы реакции клеток в растворах различного состава и (или) осомоллрности зависят от концентрации осмотически активных веществ:

Г.Г. Длительность уравновешивания клетки с раствором возрастает с уменьшением концентрации нецроникающих веществ во внеклеточной среде, с увеличением концентрационного шага и начальной концентрации в клетке проникающих веществ;

1.2. Длительность сжатия клетки меньше длительности разбухания.

2. Пассивный транспорт воды и глицерина зависит от стадии развития женской половой клетки и возраста эмбриона:

2.1. Удельная проницаемость к глицерину скачкообразно возрастает после оплодотворения яйцеклетки и при дроблении блас-томеров и у ранней морулы превышает в 50 раз таковую у яйцеклетки, что связано с формированием системы облегченной диффузии глицерина при развитии эмбриона.

2.2. Зона пеллюцида ооцитов, полученных из фолликулов димаметром I* 3 мм, соединена с цитоплазматической мембраной,и они вместе составляют единую мембранную систему клетки. Зона пеллюцида ооцитов из цредовуляторных фолликулов, яйцеклеток и эмбрионов не обладает избирательной проницаемостью к низкомолекулярным соединениям.

2.3. Удельная проницаемость к воде постоянная на всех стадиях развития ооцита и эмбриона, что говорит об одинаковой структурной организации цитоплазматической мембраны яйцеклетки и зародыша ранних стадий развития.

3. Норма реакции яйцелеток и эмбрионов в растворах хлористого натрия относительная и зависит от концентрации этого вещества:

3.1.Растворы хлористого натрия до 0,8 М оказывают 0безЕ0-живающее действие на клетки, не вызывая изменений цитоплазмати-ческих мембран;

3.2. Цитоплазматическая мембрана теряет избирательную про ницаемость в растворах хлористого натрия выше 0,8 М. Повреждение клеток "эффектами раствора" при субоптимальных скоростях замораживания возможно в результате потока растворенных во внеклеточной среде веществ внутрь клетки и осмотического шока при оттаивании;

3.3. Уменьшение объема клеток в гипертонических растворах хлористого натрия говорит о целостности цитоплазматической мембраны и служит тестом определения жизнеспособности яйцеклеток и эмбрионов млекопитающих.

4. При ступенчатых методах применения криопротекторов изменения клеточногоо объема оптимально соответствует норме реакции при увеличении концентрационного шага и длительности ступени при насыщении и уменьшении их при выведении с каждой ступенью.

5. Особенности криоконсервации эмбрионов млекопитающих объясняются спецификой транспорта воды и криопротекторов через цит опла зматич е ские мембраны:

5.1. Медленные скорости замораживания обусловлены низкой удельной проницаемостью цитоплазматических мембран к воде, большим значением энергии активации транспорта еоды и малым поверхностио-сбъемным отношением.

5.2. Искусственная инициация кристаллизации необходима для увеличения Бремени обезвоживания эмбрионов при замораживании.

5.3. Ранняя бластоциста является критическим возрастом эмбриона для замораживания, так как на более ранних стадиях осмотические процессы происходят как в скоплении изолированных и клеток возможно применение методов, разработанных для взвесей клеток, на более поздних стадиях необходима разработка методов, как для органов и тканей.

6. Осмотические процессы определяют параметры режима снижения температуры и методов применения криопроекторов при крио-консервации эмбрионов и ооцитов крупного рогатого скота:

6.1. Длительность двухступенчатой процедуры снижения температуры короче в 5-10 раз длительности замораживания с постоянной скоростью вследствие более быстрой дегидратации клеток.

6.2. Применение сахарозы в гипертонических концентрациях предотвращает превышение меткой нормы реакции и в несколько раз ускоряет выход криопротектора из клетки, что позволяет проводить выведение криопротектора в одну ступень.

6.3. Двухступенчатая процедура снижения температуры приемлема для замораживания ооцитов крупного рогатого скота цри выдержке 30 мин при -25°С и быстром оттаивании в водяной бане.

Практические предложения

1. Методика волюмометрии пригодна для изучения осмотической реакции эмбрионов и яйцеклеток млекопитающих в растворах низкомолекулярных соединений.

2. Результаты физико-математического моделирования и экспериментального изучения осмотического поведения клеток могут быть использованы в лабораториях по криобиологии для определения повреждающих факторов при криоконсервацгш и разработки методов криозащиты, а также в учебных вузах в курсах по общей биофизике для более детального изучения пассивного транспорта низкомолекулярных соединений.

3. Двухступенчатая процедура снижения температуры для замораживания, одноступенчатое выведение криоцроектора с использованием гипертонических растворов сахарозы рекомендуется для использования в лабораториях, занимающихся трансплантацией и 1фиоконсервацией эмбрионов.

4. Данные по влиянию оплодотворения и дробления на транспорт воды и глицерина, о роли зоны пеллюцида в црошщаемости яйцеклеток и зародышей могут быть использованы в учебных вузах в курсах по эмбриологии.

5. Автоматическая установка црограммного замораживания рекомендуется для криоконсервации биологических объектов, требующих медленных скоростей снижения температуры.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Безуглый, Николай Дмитриевич, Харьков

1. Арганенко В.А., Федорова Л.И. Криоконсервирование эритроцитов. В кн.: Криоконсервирование клеточных суспензий. Киев: Наук.думка, 1983, с.79-98.

2. Белоус A.M., Бонадаренко В.А., Бондаренко Т.П. Молекулярные механизмы повреждений биомембран при воздействии низких температур. В кн.: Механизмы криоповреждений и криозащиты биологических структур. Киев: Наук.думка, 1974, с.3-6.

3. Белоус A.M., Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П. Биохимическая модификация биомембран как причина гибели клеток при низкотемпературном консервировании. Криобиология и криомедици-на, 1978, вып.4, с.3-6.

4. Белоус A.M., Бондаренко В.А., Бондаренко Т.П. Молекулярные механизмы криоповреждений биомембран. Итоги науки и техники. Сер. ВИНИТИ. Биофизика, 1978, 9, с.80-113.

5. Берштейн А.Д., Петропавловский А.В. Влияние неэлектролитов на переживание сперматозоидов (сообщ. Ш). Бюлл. экспериментальной биологии и медицины, 1937, т.Ш, в.1, с.41-43.

6. Бронштейн В.Л., Розанов Л.Ф. Начальное переохлаждение как фактор повреждения при замораживании клеточных суспензий. -В кн.: Криобиология и криомедицина, 1977, вып.З, с.26-29.

7. Бронштейн И.Н., Семендяев К.А. Справочник по математике. -М.: Наука, Лейпциг: Тойбнер, 1981, с.312-314.

8. Бугров А.Д. Разработка теории и практики криоконсервации спермы быков-производителей. Автореферат диссерт.доктора биологических наук, Харьков, 1983, с.19-24.

9. Вепринцев Б.Н., Ротт Н.Н. Консервация генетических ресурсов, Пущино, 1980, с.70.

10. Гордиенко О.И. Барьерно-транспортная функция мембран эритроцитов при комбинированном воздействии низких температур и ультразвуковых колебаний. Автореферат дис.канд.биол. наук, Харьков, 1983, с.13-17.

11. Гордиенко Е.А., Бронштейн В.Л. К механизму лизиса. I Математическая модель. В кн.: Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины, Киев, Наук.думка, 1974, с.13-15.

12. Гордиенко Е.А. Бронштейн В.Л. К механизму лизиса. П Приложение к криобиологии. В кн.: Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины, Киев,: Наук.думка, 1974, с.15-18.

13. Гордиенко Е.А., Бронштейн В.Л., Козьмин Ю.В. Особенности внутриклеточной кристаллизации в эритроцитах. В кн.: Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины, Киев,: Наук, думка, 1974, с.10-12.

14. Гордиенко Е.А., Иткин Ю.А., Ишков Г.С. Кинетика обезвоживания в tv компонентных растворах веществ, не проникающихв клетку. В кн.: Механизмы криоповреждения и криозащиты биологических структур, Киев: Наук.думка, 1977, с.14-16.

15. Гордиенко Е.А., Иткин Ю.А., Ишков Г.С. Кинетика обезвоживания клеток в многокомпонентных средах при наличии проникающего через мембрану вещества. В кн.: Механизмы криопов-реждений и криозащиты биологических структур, Киев: Наук, думка, 1977, с.16-17.

16. Гофман Ю.В., Справочник по физике. Киев: Наук.думка, 1977, с.556.

17. Дриняев В.М., Яшин В.К., Головчанский О.Н., Газарян К.Г., Карнаухов Н.К., Утешев В.И. Оценка жизнеспособности с помощью флуоресцентных зондов. Заявка на изобретение, приоре-тетная справка №32512, ИБР АН СССР, Пущино, 1982.

18. Иткин Ю.А., Бронштейн В.Л., Гордиенко Е.А. Анализ процессов кристаллизации и обезвоживания клеточных суспензий. в кн.: Криобиология и криомедицина, 1975, вып.1, с.40-42.

19. Иткин Ю.А., Гордиенко Е.А., Бронштейн В.Л. Физико-математический анализ механизмов криоповредений и криозащиты клеток.-В кн.: Актуальные проблемы криобиологии. Киев: Наук.думка, 1981, с.300-343.- 197

20. Иткин Ю.А., Гордиенко Е.А., Бронштейн В.Л., Марцевич В.И. Механизмы криоповреждений и криозащиты клеточных суспензий. В кн.: Криоконсервация клеточных суспензий. Киев: Наук.думка, 1983, с.30-43.

21. Иванов П.В., Ковальский И.Д. Цитология. Гистология. Эмбриология. М.: Высшая школа, 1976, с.75-93.

22. Кузнецова Н.А., Милованов В.К., Нейман О.В., Нечаев В.Д., Скаткин Н.П. Искусственное осеменение рогатого скота. -М.: Сельхозгиз, 1932, с.528.

23. Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. Теория упругости. М.: Наука, 1965, с.133-138.

24. Левин В.Н., Араманович И.Г. Уравнения математической физики. М.: 1969.

25. Левченко Э.Н., Даренко Р.П., Протасов В.Н. Криоконсервация ооцитов крупного рогатого скота. Тезисы докл. ХХХШ ежегодной конференции ЕАЖ, 1982, Л., с.II.

26. Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии.- Л.: Наука, 1972.

27. Лозина-Лозинский Л.К. Мультифакторная теория криоповреждений, Цитология. 1983, 7, с.87-95.

28. Лопатки М.И. Метод замораживания семени баранов при температуре -183, -196°С. Животноводство, 1962, №10,с.86-88.

29. Максимов Н.А. О вымерзании и холодностойкости растений. Экспериментальные и критические исследования. Известия С. - Пб.Лесного института, 1913.

30. Мамлеев Р.С. Генетические аспекты использования яйцеклеток коров и их цитогенетический анализ при культивировании и оплодотворении вне организма. Автореферат дис.канд.биол. наук, Л., 1981, с.4-12.

31. Мартыненко М.И. Эмбриональная смертность у сельскохозяйственных животных. Киев: Колос, 1964, с.73-81.

32. Недельский Г.Т., Рождественская М.А., Михнович Е.П. и др. Разработка оптимальных режимов криоконсервации эритроцитов. В кн.: Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины. Киев: Наукова думка, 1976, с.164-167.

33. Новиков А.Н., Олейник С.Т., Левченко Э.Н. Иницирование льдообразования при криоконсервации эмбрионов млекопитающих. В кн.: Криобиология и криомедицина, 1980, вып.10, с.16-19.

34. Осташко Е.Ф., Андреев В.А. Некоторые аспекты замораживания спермы млекопитающих и птиц.Материалы совместного заседания Евр. общ. криобиологов с АН УССР, Харьков, 1983.

35. Осташко Ф.И. О природе холодового удара живчиков.-Сборник работ НИИ® Лесостепи и Полесья УССР. Искусственное осеменение с.-х. животных, Харьков, 1963.

36. Осташко Ф.И. Причины и механизм холодового удара клеток. Международный сельскохозяйственный журнал, 1964, Ю,с.106-109.

37. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. К.: Урожай, 1968, с.248.

38. Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное хранение спермы производителей. К.: Урожай, 1976, с.255.

39. Осташко Ф.И. Криоконсервация зародышей. В кн.: Воспроизведение стада. К.: Урожай, 1981, с.87-101.

40. Осташко Ф.И. Криоконсервация половых продуктов. В кн.: Криоконсервация клеточных суспензий. К.: Наукова думка, 1983, с.183-194.

41. Осташко Ф.И., Бугров А.Д. Размораживание спермы быков в кипящей воде. Тез.докл. на ХХХШ ежегодной конф.ЕАЖ, Л., 1982, с.5.

42. Осташко Ф.И., Лопатко М.И., Бугров А.Д. Теория и практика глубокого охлаждения и длительного хранения спермы.- 199

43. Молочное и мясное скотоводство. Респ. межв.тем.научн.сб., 1966, вып.7, с.3-13.

44. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Введение в криобиологию. Киев: Наук.думка, 1975, с.343.

45. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус A.M., Калугин Ю.В. Крио-протекторы. Киев: Наук.думка, 1978, с.204.

46. Рэ Л. Консервация жизни холодом. М.: Медгиз, 1962,с.175.

47. Сергеев И.И., Шихов В.Н. Криоконсервация эмбрионов крупного рогатого скота. Животноводство, 1979, №7, с.37-41.

48. Сергеев И.И., Некрасов A.JI., Овчинникова А.В., Букарова В.И., Смыслова Н.И. Суперовуляция, получение, криоконсервация и пересадка эмбрионов крупного рогатого скота. -Животноводство, 1983, №10, с.20-22.

49. Смирнов И.В., Сохранение семени сельскохозяйственных животных посредством глубокого охлаждения. "Советская зоотехния", 1949, №4.

50. Смит 0. Биологическое действие замораживания и переохлаждения. М.: Изд-во иностранной литературы, 1963, с.509.

51. Фаррант Д. Пересмотр некоторых криобиологических цонцеп-ций. В кн.: Криобиология и криомедицина, К.: Наук.думка, 1977, вып.З, с.12-21.

52. Хватов Б.П. Оплодотворение и ранние стадии развития зародышей сельскохозяйственных животных. Симферополь: Крым-издат, 1954, с.54.

53. Цуцаева А.А. Криоконсервация клеточных суспензий. К.: Наук.думка, 1983, с.3-12.

54. Шраго М.И. Криопротекторы. В кн.: Криоконсервация клеточных суспензий. -К.: Наук.думка, 1983, с.40-51.

55. ЭрнСт JI.K., Янушка А.Л., Свиридов В.Е. и др. Культивирование фоликулярных ооцитов коров. Доклады ВАСХНИЛ,1979, №4.

56. Эрнст Л.К., Свиридов В.Е., Мамлев Р.С. и др. Динамика созревания ооцитов коров. Доклады ВАСХНИЛ, 1980, №6.

57. Эрнст Л.К., Голубев А.К., Макарова З.Н. и др. Культивирование эмбрионов из ооцитов коров. Доклады ВАСХНИЛ, 1982, №12, с.26-28.

58. Эрнст Л.К., Голубев'А.К., Кудрявцева И.В. Перспектива развития и практическая значимость исследований по трансплантации эмбрионов и клонированию млекопитающих. Сельскохозяйственная биология, 1978, №5, с.659-563.

59. Эрнст Л.К., Голубев А.К., Макарова З.Н. и др. Получение потомства из дозревшей и оплодотворенной in vitro яйцеклетки коровы. Вестник с.-х. наук, №7, 1983, с.77-85.

60. Anderson. Е», Ducibella Т», Ukena Т», Sc Karvonsky М» Ultrastruc-tural developmental changes. In: The freezing of mammalia n embryos.General discussion.Ciba Found. Symp., Amsterdam: Elsevier,1977, P. 226-228.

61. Asahina E. Intracellular freezing and frost resistanse in egg cells of the sea urchin.-Nature, 1961, 191, p.1263-1265».

62. Asahina E., Shinada K,, & Hisada J. A stable state of frozen protoplasm with invisible intracellular ice crystal obtained by rapid cooling.- Exp. cell res., 1970, 59, p.3^9-358.

63. Baker H. The intracellular pressure of Nitella in hypertonic solutions and its relationship to freezing injury.- Cryobiology, 1972, 9, p.283-288.

64. Bank H. Freezinginjury in tissue culture cells as visualized by freeze-etching.- Exp. cell res., 1974, 85, N4, p.367-376.

65. Bank H. & Maurer R.R. Survival of frozen rabbit embryos.- Exp. cell res., 197^, N89, p. 188-196.

66. Bank E. & Mazur P. Visualization of freezing damage.- J.cell biol., 1973, 57, p.729-742.

67. Biggers J.D. Borland R.M. & Powers R.D. Transport mechanism in the preimplantation mammalian embryos.- In: The freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp.), Amsterdam:Elsevier, 1977, p. 129-15**.

68. Biggers J.D., Whitten W.K. & Whittingham D.G. The culture of mouse embryos in vitro.- In: Methods in mammalian embryology, San Francisco: Freeman and Company, 1971» p.86-116.

69. Brinster R.L. A method for in vitro cultivation of mouse ovafrom two cell to blastocyst.- Exp. cell res., 1963, N32, p.205-2C8.

70. Cassou R. Instruments de Medecine Veterinaire, France, 1972, p.&3-96.

71. Chang M.C. The effect of low temperatures on fertilized rabbit ova in vitro and the normal development of ova kept at low temperatures for several days., J.Gen. Physiol., 1948, 31» p.385-410.

72. Cunnigham E.P. The use of egg transfer techniques in genetic improvment.-Egg transfer in cattie.Luxembourg,Commision of the Europian Communities, 1976, p.3^5-35^.

73. Dick D.A.T. The permeability of water into chick heart fibroblast in tissue culture.- Proc.R. Soc. Lond. Biol. Sci., 1959,p. 43-52.

74. Dick E.G., Dick D.A.T. & Bradbury S. The effect of surface microvilli on water permeability of single toad oocytes.- J.Cell Sci», 1970, 6, p. 451-476.

75. Diller K.R. Intracellular freezing: effect of extracellular supercooling.- Cryobiology, 1975, N12, p.480-485.

76. Edwards E.G. & Steptoe P.C. The relevance of the frozen storage of human embryos in clinical practice.- In: The freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp.), Amsterdam: Elsevier,1977, p.235-250.

77. Ericson B. Development and senensence of. the postnatal bovine ovary.- J. Anim. Sci., 1966, 25, N3, p.800805.

78. Farrant J., McGann L.E. 8c Knight S.C. Posible mechanism of protection against freezing damage by subzero temperatures.-Cryobiology, 1974, V.II,N6,p.548.

79. Farrant J., Lee H. & Walter C.A. Effects of interaction between cooling and thawing condition on survival of cells. In: The freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp„), Amsterdam: Elsevier, 1977, р.ад-68.

80. Farrant J., Walter C.A., Lee H. & McGann L.E. Use of the two-step cooling procedures to examine factors influencing cell survival following freezing and thawing.- Cryobiology, 1977, V.I/f. N3,p.273-286.

81. Farrant J., & Woolgar A.E. Cryoprotective additives and hypertonic hemolysis.- Cryobiology, 1970, V.7, N1, p.56-60.

82. Final general discution.- In: The freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp.), Amsterdam: Elsenier, 1977, p. 317-323.

83. Jackowcki S.C. & Dumont J.N. Surface alterations of the mouse zona pellucida and ovum following in vitro fertilization : correlation with the cell cycle.- Biol. Reprod., 1979, N20,, p.150-161.

84. Jackowski S.C. & Leibo S.P. Response of fertilized mouse ova to freezing and thawing as a function of permeability by glycerol.-Cryobiology, 197^, N13, p.6/16.

85. Katchalsky A. & Currant P.F. Non-equilibrium thermodynamics.-S.I.: Harvard Univ. press, I9&5, 3V7p.

86. Katchalsky A. , Kedem 0., Klebansky K. & Vrez A. Flow properties of blood and other biological systems.- N.Y.: Pergaman press,1968, 250p.- ш

87. Kedem О. & Katchalsky A. A thermodynamic analysis of the permeability of biological membranes to non-electrolytes.- Biochem. et biophys. acta, 1958, V.27, N2, p.229-2^6.

88. Kedem 0. & Katchalsky.A. A physical interpretation of the pheno-menological coefficients of membrane permeability.- J.Gen. Physiol., I96l,V.*f5, N1, p.Iif3-I79.

89. Knutton S.D., Jacson j.m., Graham j.m., Hicklem K.j. & Pasternac C.A. Microvilli andcell swelling.- «ature, 1976, n262, p.5

90. Kruuv j., rrim j. & Kanagawa H. The effect of puncturing the zona pellucida on freeze-thaw survival of bivine embryos.- Can. j. Anim. sci., 1979, 59, N3, p.623-626.

91. Lehn-Jensen H. Bovine egg transplantation. Preservation of embryos.-Word. Vet. Med., 1980, 32, p.523-532.

92. Lehn-Jensen H. & Greve T. Low temperature preservation of cattle blastocysts.- Theriogenology, 1978, V.9, N4» p»3I3-3I9.

93. Leibo S.P. Preservation of mammalian cells and embryos by freezing.-In: Les colloques de l1Institute national de la sante et de la Recherche medicale, V.62, Cryoimmunology, Paris: Inserm,, 1977,p. 3H-334.

94. Leibo S.P. Fundamental cryobiology of mouse ova and embryos.- In: The freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp.),Amsterdam: Elsevier, 1977, p.69-94.

95. Leibo S.P. Water permeability and its activation energy of fertilized and unfertilized mouse embryos. J. Membrane Biol., 1980,p.208-221.

96. Leibo S.P., Mazur P., Farrant j., Hanna H.G. & Smith L.H. Effects of freezing on marrow stem cell suspensions: interaction of cooling- 205 and warming rates in the presence of PVP, sucrose, and glycerol Cryobiology, 1970, Кб, p.315-322.

97. Leibo S.P. 8c Mazur P. The role of cooling rates in low temperature preservation.- Cryobiology, 1971, N8, p.447-452»

98. Leibo S.P., Mazur P. & Jackowski S.C. Factors affecting survival of mouse embryos during freezing and thawing.- Exp. Cell Res., 1974, N89, p.79-88.

99. Leibo Б.Р., McGrath J.J. & Cravalco E.G. Microscopic observation ol intracellular ice formation in mouse ova as a function of cooling rates., Cryobiology, 1975, N12, p.579-587.

100. Levin R.L., Cravalco E.G. & Huggins C.E. The effect of hydration on the water content of human erythrocytes.- biophys.- J., 1976, 1,16, p.I4II-I426.

101. Levin. R.L., Cravalco E.G. 8c Huggins C.E. Water transport in a cluster of closely-packed erythrocytes at subzero temperatures.-Cryobiology, 1977, hlk, p.546-558.

102. Levin K.L. £c Miller T.W. An optimum method for the introduction and removal of permeable cryoprotectants: isolated cells.- Cryobiology, 1981, V.I8, N1, p.32-48.

103. Levitte J.A sulfhydryl-disulfide hypothesis of frost injury and resistance in plants.- J. Theor. Biol., 1962, 143, p.355-359.

104. Ling G.R. & Tien C.L. Analysis of cell freezing and dehydratation.-ASME Pap., 1969, 69-WA/HT) 31.

105. Lovelock J.E. The haemolysis of human red cells by freezing and thawing.- Biochem. et biophys. acta, 1953, «10, p.414-426.

106. Lovelock J.E. The mechanism of the protective action of glycerol against haemolysis by freezing and thawing.- Biochem. et biophys. acta, 1953, Nil, p.28-36.

107. Lovelock J.E. Physical instability and thermal shock in red cells.-Nature, 1954, 173, p.659-667.

108. Lovelock «J.E. 8c Bishop ri.W.H. Preservation of freezing damage toliving cells by dimethylsulfoxide.- Mature, 1959, 183, p.1344-1350.

109. Luyet B. & Keane J. A critical temperature range apparently characterized by sensivity of bull semen to high freezing velocity. Biodynamica, 1955, 7, p.281-292.

110. Lyon M.F., tt'hittingham D.G. & Glenister P. Long-term storage of frozen mouse embryos under increased background irradiation.- In: The freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp.), Amsterdam: Elsevier, 1977, p.273-290.

111. Mansoori C.A. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures.- Cryobiology, 1965, V.I2, p.34-45.

112. Maurer R.R. & Haseman J.K. Freezing morula stage rabbit embryos.-Biol. Reprod., VI4, p.147-152.

113. Mazur P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and likelihood of intracellular freezing.- J. Gen. Physiol., 1963, V.47, P.347-369.

114. The role of cell membrane in the freezing of yeast and other single cells.- Ann. N.Y. Acad. Sci., 1965, V.I25, p.175-182.

115. Mazur P. Causes of injury in frozen cells.- Fed.Proc. Fed.Amer.

116. Soc. Exp. Biol., 1965, V.24, p.213-215.

117. Mazur P. Physical and chemical basis of injury in single-celled microorganisms subjected to freezing and thawing.- In: Cryobiology, London: Acad, press, 1966, p.2I3-El5.

118. Theoretical and experimental effect of cooling and warming velocity on the survival of frozen and thawed cells.- Cryobiology, 1966, V.3, N2, p.181-192.

119. Mazur P. Cryobiology: the freezing of biological systems.-Science, 1970, VI68, H5I35, p.939-949.

120. Mazur P. The role of intracellular freezing in the death of cells cooled at supraoptimal rates.- Cryobiology, 1977, V.I4, N3,p.252-273.

121. Mazur P. Slow freezing injury in mammalian cells.- In: The freezing of mammalian embryos (Ciba found. Symp.), Amsterdam: Elsevierr 1977, P.I9-U8.

122. Mazur P. Fundamental aspects of the freezing of cells, with emphasis on mammalian ova and embryos.- IX Intern. Uongr. Anim. Keprod. & A.I. , Madrid, 1980, p.99-114.

123. X3k* Mazur P. & Schmidt j.J. Interactions of cooling velocity on thesurvival of frozen and thawed yeast.- Cryobiology, 1968, 5, p.I-17,

124. Mazur P., Farrant J., Leibo S.P.,& Chu ji.m.Y. Survival of hamster tissue culture cells after freezing and thawing.interaction between protective solutes and coling and warming rates.- Cryobiology, 1969, V.6,NI, p.1-9.

125. Mazur P., Farrant J"., Leibo S.P. & Chu E.M.Y. Freezing and thawing of Chinese hamster cells: interactions between optimum cooling velocity for survival and the nature and concentration of protective additives.- Exp. Kematol., 1969, V.18,p.31-32.

126. Mazur P. & Miller E.H. Permeability of the human erythrocytes to glycerol in 1M and 2M solutions at 0°C or 2o°C.- Cryobiology, 1976, VI3, p.507-522,

127. Mazur P. & Miller fi.H. Survival of the frozen-thawed human red cells as a function of the permiability of glycerol and sucrose.-(jryobiology, 1976, V.6, p.523-536.

128. Mazur P., Kemp J.A. & Miller R.H. Survival of fetal rat pancreases frozen to -78 and -I96°C. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, V73* p.4105-W09.

129. Mazur P. & Miller R.H. The use of permeability coefficients in predicting the osmotic responce of human red cells during the removal of intracellular glycerol.- Cryobiology, 1976,V.13» p»652-653.

130. Mazur P., Leibo S.P. & Chu Е.М.У. A two-factor hypothesis of freezing injury.- Exp. Cell Res., 1972, V.7I, p.345-355.

131. Mazur P. & Rajotte R.V. Permeability of the 17-day fetal rat pancreas to glycerol and dimethylsulfoxide.- Cryobiology, 1981, V.I8, P.I-I7.

132. McGann L.E. Mammalian cell permeability to water and dimethyl-sulfoxide.- Cryobiology, 1979, V.I6, p-591

133. McUrath J.J. The dynamic of freezing and thav.ing mammalian cells: the HeLa cell.- M.5.M.E. Dissertation, Massachusetts Institute of Thechnology, Cambridge, Massachusetts, 1974.

134. McUrath J.J., Cravalco E.G. & Huggina C.E. An Experinemtal comparison of intracellular ice formation and freeze-thaw survival of HeLa cells.- Cryobiology, 1975 V.I2. p.540-550.

135. Meryman H.T. Red cell haemolysis from freezing: alterations in membrane permeability following osmotic stress»- In: Red cell membrane: structure and function, Philadelphia, 1969, p.352-367.

136. Meryman H.T. The exceeding of a minimum tolerate cell volume inhypertonic suspension as a cause of freezing inyury.- In: Thefrozen cell, London: Churchil, 1970, p.51-67.

137. Meryman H.T. Osmotic stress as a mechanism of freezing injury.-Cryobiology, 1971, V.8, 149, p.489-500.

138. Meryman H.T. The cryoprotective agents.- cryobiology, 1971,V7,N7, p.181-190.

139. Meryman H.T. Red cell membrane changes prodused by extracellular cryoprotectans and allied compounds.- Cryobiology, 1971, V.8, N8, p.401-408.

140. Meryman ЕГ.Т. Freezing injury and its prevention in living cells.-Ann. Rev. Biophys. and Bioenerg., 1974, V.3, N4, p.341-363

141. Minezo Y.Hilie sunthetique pour la survie et la maturation des gametes et pour la culture de l'oent feconde.- C.R.Acad, iici.,1976, V.272, N6, p.1967-1970.

142. Mintz B. Experimental study of the developing mammalian eggs: removal of the zona pellucida.- Sci., 1962, V.I38, p.594-595.

143. Miyamoto ЕГ. & Ishibashi T. survival of frozen-thawed mouse and rat embryos in a presence of ethylene glycol.- J. Reprod, Fert., 1977, V.50,p.373-375.

144. Morris G.J. & Farrant J. Effects of cooling rates on thermal shock haemolysis.- Cryobiology, i973, V.IO, p.119-125.

145. Moore N.W. & Bilton R.J. Frozen storage of embryos of farm animals. Progress and implications.- In: The freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp.), Amsterdam: Elsevier, 1977, p.203-234.

146. Oshyama ¥. & Asahina E. Supercooling injury in the cell egg of the sea urchin.- Cryobiology, 1972, V.9, p.22-28.

147. Papanek Т.Н. The water permeability of human RBC's at subzero temperatures.- Ph.D. Thesis, Department of mechanical engineering, «IT, Cambridge, Mass., 1978.

148. Polge C. The freezing of mammalian embryos: perspectives and possibilities.- In: The freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp.), Amsterdam: Elsevier, 1977, p.3-18.

149. Polge C.Smith A.U. & Parkes A.S. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures.- Nature, 1949,1. V.I64, p.666.

150. Pribor D.B. A multifactor theory for action of cryoprotective agents.- Cryobilogy, 1973, V.IO, N6, p.853-860.

151. Pribor D.B. PVP contrasted with dextran and a multifactor theory of cryoprotection.- Cryobiology, 1974, N1, p.60-72.

152. Pushkar N.S., Etkin Y.A., Bronshtein V.L., uordienko E. A. & Kozmin Y.V. On the problem of dehydratation and intracellular crystallization during freezing of cell suspension.-Cryobilogy, 1976, V.I3, p.147-152.

153. Rail W.F. Unpublish data.Cited by P.Mazur in: Slow freezing injury in mammalian cells.In: the freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp.), Amsterdam: Elsevier,. 1977. p.28.

154. Rail W.F., Mazur P. & Souzu H. Physical-chemical basis of the protection of slowly frozen human erythrocytes by glycerol.-Biophys. J., V.23, p.IOI-120.

155. Rail W.F., Reid Lt.S. & Farrant J. Innocous biological freezing during warming.- Mature, 1980, ¥.286, p. 5И-514»

156. Rapatz. B. , Luyet B. & McKenzie A. Effect of cooling and rewarming rates on glyceroled human erythrocytes.- Cryobiology, l975r V.I2. p.293-308.

157. Kotman Б. & Papermaster jb.W. Membrane properties of living mammalian cells as studied by enzematic hydrolysis of fluorogenic esters.-Proc. Nat. Acad. Sci.USA, V.55, p.134-141.

158. Sakai A. Survival of the twig of woody plants at -I96°C.- Nature, I960, 185, P.393-394.

159. Sakai A. Survival of plant tissue at superlow temperatures.Ill. Relation between effectibe prefreezing temperatures and the degree of frost hardiness.- Plant. Physiol., 1965, V./|0, p.882-887.

160. Sakai A. & Jfishida S. Survival of plant tissue at superlow temperatures. IV. Effects of cooling and removal rates on survival.

161. Plant Physiol., 1967, Ч.Ц2, p. I625-I70I.

162. Schneider U. & Hahn J. Bovine embryo transfer in uermany.-Theriogenology, 1979»V.II, p.63-80.

163. Shilling E., Smidt D., Sacher В., Petac D. & Kaschab S.E. Diagnosis of the viability of early embryos by fluorescence microscopy.- Ann. Biol. Anim., niochem., Liophys., 1979, V.9SN5,p. 1625-1626.

164. Silvares O.M., Cravalco E.G., Toscano W.M. & Huggins C.E. The thermodynamics of water transport forbiological cells during freezing.-J. Heat Transfer, Trans., ASME , V.97, p.582-588.

165. Smith A.U. Effects of low temperature on living cells and tissues In: Biological Applications of freezing and drying. Chap.I. ed Harris R.J.C., N.Y., Acad, press, 1954, p.9-90.

166. Smorag Z. Some factors affecting embryo storage in laboratory animals. Discussion.- In: The freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp.), Amsterdam: Elsevier, 1977, p.I08-II0.

167. Smith A.U. Behaviour of fertilized rabbit embryos exposed to glycerol and to low temperatures.- Nature, 1952, V.I70, p.374-375»

168. Smorag Z., Katska L. & Wierchos E. Some factors affecting the viability of mouse and cattle embryos frozen to -40°C before transfer to liquid nitrogen.- Animal Reprod. Sci., 1981, V4, HI, p. 65-72.

169. Taylor A.C. The physical state transition in the freezing of living cells.- Ann. N.Y. Acad. Sci., I960, V.85, p.595—609.

170. Toscano W.M., Cravalco E.G., Silvares O.M. & Huggins C.E. The thermodynamic of intracellular ice nucleation in the erythrocytes.- J. Heat Transfer, Trans. ASME, V.97, p.326-332.

171. Trounson A.O., Willadsen S.M., Rowson L.E.A. & Newcomb R. The storage of cow. embryos at room temperature ana at low temperatures.- J. Reprod. Fert., V.46, 1976, p.173-176.

172. Tsunoda Y. & Sugue T. Survival of rabbit eggs preserved inplastic straws in liquid nitrogen.- J. Reprod. Fertil., 1977, V.49, P. I73I74.

173. Tsunoda Y., Sugue Т., Parcening Т.Л. & Chang M.C. In vitro fertilization of mouse and hamster eggs after freezing-thawing. Experimentia, V.32, p. 223-22i(.

174. Viera F.L., Sha'afi R.I. & Solomon A.K. The state of water in human and dog red cell membranes.- J .Gen.Physiol., 1970,V.55, p.451-466.

175. V/hittingham D.G. Survival of mouse embryos after freezing and thawing.- Mature, 1971» V.233, p. 125-126.

176. V/hittingham D.G. Embryo bank in. the future of developmental genetics.- Genetics,V.78, p.395-402.

177. V/hittingham D.G. Low temperature storage of mammalian embryos.-In: Basic aspects of freeze preservation of mouse strains. Stuttgard: Gustav-Fisher Verlag, p.45-55.

178. V/hittingham D.G. Survival of rat embryos after freezing and thawing.- J. Reprod. Fertil., V.43, p.575-578.193.- V/hittingham D.G. Fertilization in vitro and development to term of unfertilized mouse oocytes previoesly stored at -I96°C.

179. J. Reprod. Fertil., 1977, V.49, p.89-94. 194- V/hittingham D.G. & Adams C.E. Low temperature preservation of rabbit embryos.- J. Reprod. Fertil., 1976, V47, p. 269-274.

180. Whittingham D.G. & Anderson E. Ultrastrudtural studies of frozen thawed mouse embryos.-J. Reprod. rertil., 1976, V.48, p. 137-140.

181. V/hittingham D.G. & V/hitten W.K. Long term storage and aerial of frozen mouse embryos.- J. Reprod. Fertil., 1974» V.36,p.433-435.

182. V/hittingham D.G., Leibo S.P. & Mazur P. Survival of mouse embryos frozen to I96°C and - 268°C., Sci., 1972, V.I87, p.411-414.

183. Whittingham D.Q. Some factors affecting embryo storage in laboratory animals.- In: The freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp.), Amsterdam: Elsevier, 1977, p. 108-128.

184. Whittingham D.H., Wood H.J., Farrant J., Lee H. & Halsey J.A. Survival of frozen mouse embryos after rapid thawing from -I96°C. J. Reprod. Fortil., 1979, V.56, p.II-2I.

185. Willadsen S.M. Factors affecting the survival of sheep embryos during deep freezing and thawing.- In: The freezing of mammalian embryos (Ciba Found. Symp.), Amsterdam: Elsevier, 1977, p.175-190

186. Willadsen S.M., Polge C., Rowson L.E. A. & Moor R.M. Deep freezir® of sheep embryos.- J. Reprod. Fertil., 1976, V. 46, p.151-154.

187. Wilmut I. & Rowson L.E.A. Experiments on the low temperature preservation of cow embryos.- Vet. Rec., V.92, 1973, p.686-690.

188. Wilmut I., Polge C. & Rowson L.E.A. The effect on cow embryos of cooling to 20, 0, and -I96°C.- J. Reprod. Fertil., 1975, V.45, p.409-411.

189. E06. Wood M.J. & Farrant J. Preservation of mouse embryos by two-step freezing.- Cryobiology, 1980, V.I7, p.178-180.1. Лесостепи и1. ШЕНКО1. АКТ

190. А.Д.БУГРОВ К. Б. ПЕ НЕДЕРА